CN103923909A

CN103923909A - 人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法

Info

Publication number: CN103923909A
Application number: CN201310014700.1A
Authority: CN
Inventors: 张文驹; 陈子易; 程舟; 陈家宽
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2014-07-16

Abstract

本发明属于中药技术领域，涉及中药材的鉴别方法，具体涉及人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法。本发明提供了能够特异性识别人参与西洋参的DNA分子标记，所述的DNA分子标记分别位于Seq.No.1～5的DNA序列中的（SSR）位点上，根据上述序列设计5对引物，对人参和西洋参的DNA模板进行PCR扩增，每一对引物都能分别扩增出特异性识别人参和西洋参的PCR产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测这些长度不一的产物，从而快速鉴别人参与西洋参。本方法所需样品少，不受产品形态的限制，对样品的DNA长度要求不高，PCR稳定且重复性好。

Description

人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，涉及中药材的鉴别方法。具体涉及人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法。

背景技术

人参（Panax ginseng C.A.Meyer）和西洋参(Panax quinquefolius L.)均为目前我国应用最广泛的重要中药材，属多年生宿根草本植物五加科（Araliaceae）人参。研究显示，人参分布于我国东北、俄罗斯远东地区及朝鲜等地；西洋参原产于北美低山地区，我国引种成功后在东北、华北、华中和康滇四大栽培区均有栽种。现有技术公开了人参和西洋参药性差异较大，但形态相似，尤其是国内栽培的人参与栽培西洋参很难根据形态特征准确鉴别，两者的粉末更是难以区别。因此市场需求一种不依赖于形态特征的鉴别人参与西洋参的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供重要中药材的鉴别方法，具体涉及人参与西洋参的特异性分子标记，及其鉴别方法，尤其是一种不依赖于形态特征的鉴别人参与西洋参的方法。

本发明提供了能够特异性识别人参与西洋参的DNA分子标记，所述的DNA分子标记分别位于Seq.No.1～5的DNA序列中的（SSR）位点上，所述的Seq.No.1，Seq.No.2，Seq.No.3，Seq.No.4和Seq.No.5DNA序列上分别具有一个简单重复序列（SSR）位点，通过该序列位点能够特异性地识别人参和西洋参；

进一步，本发明提供了基于上述DNA分子标记的快速鉴别人参与西洋参的方法，其中，根据上述序列设计5对引物，对人参和西洋参的DNA模板进行PCR扩增，每一对引物都能分别扩增出特异性识别人参和西洋参的PCR产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测这些长度不一的产物，从而快速鉴别人参与西洋参。

更具体的，本发明的快速鉴别人参与西洋参的方法，其特征在于，其包括，

1，特异性扩增人参与西洋参的简单重复序列（simple repeat sequence，简称SSR）位点的引物序列；本发明从大量含有SSR位点的人参序列中筛选出含有SSR位点的5条DNA序列，分别为Seq.No.1，Seq.No.2，Seq.No.3，Seq.No.4和Seq.No.5，这些SSR位点用于特异性地区别人参与西洋参；

2，利用上述的引物鉴别人参与西洋参：

根据上述5条人参DNA序列，设计5对多聚酶链式反应（polymerase chainreaction，简称PCR)引物，其序列分别为Seq.No.6和Seq.No.7，Seq.No.8和Seq.No.9，Seq.No.10和Seq.No.11，Seq.No.12和Seq.No.13，Seq.No.14和Seq.No.15；

用Seq.No.6+Seq.No.7对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，PCR退火温度52℃，结果显示，人参能产生181bp长的PCR产物，而西洋参不能产生PCR产物；

用Seq.No.8+Seq.No.9对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度55℃，结果显示，人参只能产生一条203bp长的PCR产物，而西洋参则能产生191bp和203bp长的两条PCR产物；

用Seq.No.10+Seq.No.11对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度57℃，结果显示，人参能产生一条243bp长的PCR产物，而西洋参则产生235bp长的PCR产物；

用Seq.No.12+Seq.No.13对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度57℃，结果显示，人参只能产生一条184bp长的PCR产物，而西洋参则能产生166bp和157bp长的两条PCR产物；

用Seq.No.14+Seq.No.15对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度57℃，结果显示，人参能产生251bp和273bp两条PCR产物，而西洋参则不能产生PCR产物。

本发明的实施例中，对人参与西洋参进行鉴定：

1）取待鉴定样品0.05克，用高盐低PH法提取样品的总DNA；

2）取25~50ng待检样品的DNA，从上述的5对引物中任选3对，按

各对引物特定的退火温度进行PCR扩增，每一对引物设置3次重复和空白对照；

3）聚丙烯酰胺凝胶电泳检验PCR产物的大小；

4）根据所选引物对产生的PCR产物的大小和表1所提出的标准，对样品的属性做出判断。

本发明的上述鉴定中，

选择引物对（Seq.No.6+Seq.No.7）、引物对（Seq.No.14+Seq.No.15）和其它任何一个引物对进行PCR扩增，可以用琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果显示，采用前两个引物对扩增西洋参的DNA，不能获得任何产物，而扩增人参的DNA，将获得表1所示的产物；用其它3对引物分别扩增人参和西洋参的DNA均将获得如表1所示的大小不一的产物；

表1.用于人参、西洋参鉴定的5对PCR引物及产物大小

所选3对引物扩增的结果都符合上述标准，才能判断样品属于人参还是西洋参。

本发明的优点有：

所需样品少，不多于0.005克，也不受产品形态的限制，不论样品是形态完好还是已被粉碎，或加入其它物质，只要DNA不被严重破坏均能按本发明的方法进行鉴定；此外，本发明所述的引物对序列较长，而扩增的产物则不超过280bp，因此对样品的DNA长度要求不高，PCR稳定且重复性好。

附图说明

图1引物对（Seq.No.6+Seq.No.7）扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电泳图，共35个样品和一个空白对照（标为-），M为DNA分子大小标记（mark）；其中，样品名称和来源是：1-4：新宾栽培西洋参；5：抚松大马牙；6：通化大马牙；7：通化二马牙；8：集安二马牙；9：二马牙(新宾)；10-11：集安长脖；12-13：集安圆芦；14-15：集安竹节芦；16-17：集安林下参；18-19：桓仁移山参；20-24：加拿大栽培西洋参（龙宝）；25-29：美国栽培西洋参；30-31：加拿大栽培西洋参（神象）；32-33：宽甸石柱参；34-35：韩国高丽参。

图2是引物对（Seq.No.8+Seq.No.9）扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电泳图，样品编号与图1相同，其中12号样品的PCR反应体系被西洋参DNA污染，重复实验不再出现191bp的产物，证明12号样品并非例外。

图3是引物对（Seq.No.10+Seq.No.11）扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电泳图，样品编号与图1相同。

图4是引物对（Seq.No.12+Seq.No.13）扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电泳图，样品编号与图1相同。

图5是引物对（Seq.No.14+Seq.No.15）扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电泳图，样品编号与图1相同。

具体实施方式

实施例1

从不同产地和市场收集大马牙、二马牙、长脖、圆芦和竹节芦5种常见人参农家品种样品以及移山参、林下参、石柱参和高丽参样品51份，从美国、加拿大以及中国辽宁收集西洋参样品16份（材料如表2所示）；

采用改良的高盐SDS法提取样品的总DNA，从较少材料中获得高质量的DNA；

PCR扩增，PCR反应体系如下：总体积20μL，含有约20ng基因组DNA，正向引物和反向引物各0.25μmol/L，1×反应缓冲液，1.0mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTP，1U Taq酶，用DEPC处理水补充体积至20μL，另用去离子水代替模版DNA作为阴性对照；

PCR扩增程序如下：PCR反应在Applied Biosystem^TM2720 Thermal Cycler扩增仪上进行，反应参数为：94℃预变性1min，根据各对引物具体设定的Ta温度40s，72℃40s，35个循环，72℃5min补平，反应产物在4℃下保存；

按如下程序进行PCR产物检测：PCR反应产物上样于4%聚丙酰胺凝胶(每板胶含3.6g尿素，17mL去离子水，3mL10×TBE溶液，4.5mL40%Arc-Bis溶液，0.3mL10%(NH3)2S2O2溶液，14μL TEMED)，上样量为5μL，凝胶放置在含有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中进行电泳，电压500V，电泳时间为100min。凝胶由0.1%AgNO3溶液染色10min后，用1.5%NaOH和0.4%甲醛混合液显色15min。以数码相机拍照记录，用Smart View^TM Plus生物电泳图像分析软件（上海复日科技有限公司）计算片段大小；

结果显示：每一对引物扩增51份人参样品，无一例外均具有表1所示的人参特有的PCR产物（其中，在用Seq.No.8+Seq.No.9扩增一份园芦样品时，出现西洋参特有的产物，重复实验多次都不再出现这一产物，证明此次实验被西洋参DNA污染，该样品并非例外）；扩增16份西洋参样品，所有样品均出现了西洋参特有的PCR产物。

表2本发明所用人参和西洋参材料

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 185

<212> DNA

<213> Panax ginseng

<400> 1

tacatttgct tgcttgattt ctcctcctcc ttcttccttc cttccatgga tggatcttgg 60

tttcatgaaa gtcaaaatcc cttctccctc ttctcttgaa gtggccgaac tcctctctct 120

ctctccctct ctctcttttc ctcttagcaa cttggaaggg taaaagagat gaaagaaaga 180

agaaa 185

<210> 2

<211> 203

<212> DNA

<213> Panax ginseng

<400> 2

tgcccccttt tgttttctca atgctttgat attgtgacaa agcctttttt atttttttgt 60

cctttttttg ggtactgtat taatgttacc gctgttcttt aggaggaaaa aagtagaaac 120

taagtcatac taaaattgat tcgacagttg gctggaccat catgcaaaat tcaggattca 180

tcagcgacta aagaaaatat gga 203

<210> 3

<211> 231

<212> DNA

<213> Panax ginseng

<400> 3

atcaaacgaa ttcacggaca gaaatttgat ttttactatt cattattgtg caatgaaata 60

ttctaataaa acaaaaacct taaataaaat ataatatatt ctatttataa tctaataaaa 120

aaaacataat atatatatat atatacatat atatatatat ataacaacac atgttatatt 180

aaaaaaatca cccgtgacaa ccttcagact ttccttcccc catattcatt t 231

<210> 4

<211> 180

<212> DNA

<213> Panax ginseng

<400> 4

aagtttggca gaaggtaagg gagggatgga taaatgtaat gacccaatat tattattatt 60

attattatta ttattattac atgttgctct acacgtggcg gatgatgatc tttaactgac 120

tggactggac tacactagac tagactagac attgtccccg aacccaaaca gtgccgtctt 180

<210> 5

<211> 240

<212> DNA

<213> Panax ginseng

<400> 5

ctaagcagtg gaagtcaaac acatcttcta aatgaagatg aacttacatg ctgaaatcta 60

tatgtgcagg tatatatata tatatgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcgtgtg tggactatat 120

atacacaact gtgtagtaca cagtcactta tggcgatatt tttttggaga tatagcgacg 180

gttcaaccgt cgccatagac cagaatagct atagcgacag tttacccatc gctatagccc 240

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

tacatttgct tgatttctcc t 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

tttcttcttt ctttcatctc tt 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物

<400> 8

tgcccccttt tgttttctc 19

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 9

tccatatttt ctttagtcgc tgat 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物

<400> 10

atcaaacgaa ttcacggaca ga 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 11

aaatgaatat gggggaagga aagt 24

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 12

aagtttggca gaaggtaagg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 13

aagacggcac tgtttgggtt 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 14

ctaagcagtg gaagtcaaac a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 15

gggctatagc gatgggtaaa 20

Claims

1.含有人参与西洋参的特异性分子标记位点的如Seq.No.1，Seq.No.2，Seq.No.3，Seq.No.4和Seq.No.5所示的DNA序列。

2.基于权利要求1所述的DNA序列的PCR引物对，其序列组合为：Seq.No.6和Seq.No.7，Seq.No.8和Seq.No.9，Seq.No.10和Seq.No.11，Seq.No.12和Seq.No.13，Seq.No.14和Seq.No.15。

3.一种鉴别人参与西洋参的方法，其特征在于，包括：特异性扩增人参与西洋参的简单重复序列位点的如权利要求2所述的引物序列，利用所述的引物鉴别人参与西洋参，其包括步骤：

1）取待鉴定样品，用高盐低PH法提取样品的总DNA；

2)取待检样品的DNA，从所述的引物对中任选其中3对，按各对引物特定的

退火温度进行PCR扩增，每一对引物设置3次重复和空白对照;

3)根据所选引物对扩增的PCR产物大小对样品的属性做出判断。

4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述各引物对的判断标准如表1所示：

表1.用于人参、西洋参鉴定的5对PCR引物及产物大小

所选3对引物扩增的结果均符合上述标准时，判断样品属于人参或西洋参。