CN103826459B - 蛋白质诱导的多能细胞技术及其用途 - Google Patents

Abstract

通过下述生成蛋白质诱导的多能干细胞的方法：使用QQ‑蛋白质转导技术将细菌表达的重编程蛋白质递送到起始体细胞的核内，重复几次细胞重编程循环用于产生重编程蛋白质诱导的多能干细胞，将所述重编程的细胞移动到无饲养者培养基内用于扩增，和扩增且传代全皿中的所述重编程的细胞用于生成同质piPS细胞。还提供的是使用这种方法形成的piPSC细胞及其用途。

Description

蛋白质诱导的多能细胞技术及其用途

发明背景

1.技术领域

本发明涉及蛋白质转导及其用途。更具体而言，本发明涉及蛋白质诱导的多能干细胞（piPSC）技术及其应用，所述piPSC技术在一周内以接近100%的转换效率生成高品质piPS细胞。本发明还涉及无饲养者piPSC培养条件和无需集落挑选和克隆扩增的全皿扩增及其应用。

2.相关技术描述

胚胎干（ES）细胞是衍生自胚胎的干细胞。对于目前技术状态，人胚胎干细胞系的制备需要破坏人胚胎，产生关于人ES细胞研究的有争议的伦理问题。ES细胞通过两个区别性质不同于其他类型的细胞：多能性和无限的自我更新。在限定条件下，ES细胞能够无限制地更新自身，允许ES细胞用作研究和再生医学的有用工具，因为我们可以产生无限的ES细胞用于连续研究或临床用途。ES细胞还能够分化成三个主要胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层和中胚层，包括成体体内超过220个细胞类型。多能性使ES细胞不同于成体组织中发现的成体干细胞；虽然ES细胞可以生成体内的所有细胞类型，但成体干细胞是多潜能的，并且仅能够产生在这个组织类型内的有限数目的细胞类型。

ES细胞疗法可以用于再生医学和组织替代物用于损伤或疾病治疗，例如血液、免疫系统和不同疾病相关遗传疾病、癌症、心血管疾病、青少年糖尿病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病、伤口愈合、类风湿性关节炎、脱发、耳聋、失明、肌萎缩侧索硬化、肌营养不良和脊髓损伤。除了干细胞疗法的伦理关注外，还存在与异体干细胞移植相关的移植物抗宿主病的技术问题。因为用于再生医学的ES细胞来自人胚胎，所以当对个别患者执行ES细胞移植用于疾病治疗时，免疫排斥始终是重大问题。ES细胞的其他潜在用途包括早期人发育的探索、遗传疾病的研究、毒物学测试和药物筛选的体外系统。

用于培养ES细胞的过程是非常繁重的。通过将内细胞团转移到塑料实验室培养皿内分离人ES细胞。培养皿的内表面一般由饲养层：小鼠胚胎皮肤细胞包被，所述小鼠胚胎皮肤细胞已如此处理，使得它们将不分裂，而是提供ES细胞与之附着的粘性表面。饲养细胞还将营养素释放到培养基内。研究者已设计出无需小鼠饲养细胞生长胚胎干细胞的方法。这是显著的科学进展，由于小鼠细胞中的病毒或其他大分子可能传递给人细胞的危险。

关于ES细胞扩增的过程也是非常耗时的。ES细胞形成菌落。通常，ES细胞扩增首先是选择个别ES细胞集落，并且随后扩增所选集落。这显著减慢ES细胞扩增，并且如果所选集落含有基因突变，则可以引起更高的突变率。

在2006年，Shinya Yamanaka及同事显示使用逆转录病毒将四种转录基因：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc引入小鼠成纤维细胞内，可以生成展示多能性的经诱导的多能干细胞（iPS细胞）。这是革命性发现，因为首次显示体细胞可以再编程回到ES样细胞。iPS细胞被认为在许多方面等同于天然ES细胞，例如特定干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、拟胚体形成、畸胎瘤形成、有活力的嵌合体形成、无限的自我更新性质和可辨性。然而，它们与天然多能干细胞的关系的完全程度仍有待评价。

认为iPS细胞技术是更少伦理争论的，因为这种技术允许无需人胚胎而生成多能干细胞。这种技术还可以允许生成患者特定ES细胞系，其可以潜在用于细胞替代治疗以治疗多种人疾病，且允许由具有多种遗传疾病的患者生成ES细胞系，并且将提供研究这些疾病和用于药物筛选的无价模型。

在2007年，几个团体显示经由四基因逆转录病毒递送由小鼠成纤维细胞生成的iPS细胞产生有活力的嵌合体。这些团体使用Nanog用于检测iPS细胞，指示Nanog是细胞多能性的主要决定子。然而，c-Myc是致癌的，并且20%的嵌合小鼠发展癌症。在后期研究中，Yamanaka报道iPSC可无需c-Myc而生成。该过程花费很多时间并且不够有效，但所得到的嵌合体不发展癌症。

同样在2007年，由人体细胞生成iPS细胞，代表用于iPS细胞技术的里程碑。然而，使用的病毒转染系统将基因插入宿主基因组中的随机位置上，并且产生关于这些iPSC的潜在治疗应用的主要关注，因为产生的细胞可能易于形成肿瘤。为了克服这些危险，腺病毒用于将必要的四种基因转运到小鼠皮肤和肝细胞的基因组内，导致与胚胎干细胞等同的细胞。因为腺病毒不与靶向的宿主组合任何其自身基因，所以消除产生肿瘤的危险，尽管这种方法仍未对人细胞进行测试。Yamanaka及几个其他实验室自那以后已证实重编程可以经由质粒完成，完全无需任何病毒转染系统，尽管效率极低。

在2009年5月，通过Ding和Kim的实验室的两个报告报道小鼠和人iPS细胞（piPSC）通过四种蛋白质的直接递送生成，所述四种蛋白质由四种重编程基因编码，从而消除关于病毒的需要或人体细胞的遗传修饰。近期报告进一步显示iPSC可以使用mRNA生成mRNA诱导的iPS细胞（riPSC）。这解决了与个人化的基于干细胞的医学有关的最有挑战的安全障碍，并且允许科学家制备piPS细胞而无需遗传改变它们。因为蛋白质的确最终降解，所以到它们用于实验或治疗时应不存在其在细胞中存在的痕迹，代表iPS细胞技术中的重大突破。

尽管全世界密集的研究努力，目前的iPS细胞技术仍具有四个重大问题：1.低效；2.耗时；3.复杂和昂贵；和4.质量问题。

目前的iPS细胞技术仅将0.001-1%体细胞转换成iPS细胞。对于使用病毒载体的基因递送，取决于不同起始体细胞，从体细胞到iPS细胞的转换效率可以达到0.1-1%。使用胚胎成纤维细胞作为起始细胞，转换效率达到～1%；然而，使用成体体细胞，转换效率<0.1%。对于使用非病毒方法的基因递送，这个转换效率<0.1%。关于人蛋白质诱导的iPS细胞的转换效率极低，仅达到0.001%。

另外，目前的iPS细胞技术包括基因递送和蛋白质递送，通常花费4-8周以完成人体细胞成为iPS细胞的重编程，并且需要多个循环的基因转染或蛋白质递送。这使得目前的iPS细胞技术成为复杂和昂贵的技术。此外，由目前的iPS细胞技术生成的iPS细胞的质量在类似人ES细胞方面是有问题的。这些重大技术问题阻断iPS细胞进行其人临床应用。

引起目前的iPS细胞技术的这些重大问题的主要原因是由于基因递送的和蛋白质递送的技术挑战，这具有低效率和对于多重基因/蛋白质递送难以控制递送基因的化学计量学的缺点。对于iPS细胞生成，必须将四种基因或四种蛋白质同时递送到体细胞的核内，以打开起始“干细胞基因表达”且沉默“体细胞基因表达”的细胞内自动调节回路，从而体细胞可以转变成胚胎干样细胞。

通常已知目前的基因递送技术包括病毒载体和非病毒方法具有用于同时四种基因递送的低效率问题。此外，不能保证所有四种基因都以相等化学计量学递送到细胞内。在大多数情况下，取决于使用的不同递送媒介物，四基因递送是随机的。为了解决这个问题，已开发了将所有四种基因都插入一个病毒载体内的备选方法，在每种基因之间具有不同接头。在这种情况下，仅需要一个病毒载体以被递送到体细胞内用于iPS细胞生成，增强递送效率。然而，即使使用这种方法，最大的iPS细胞转换效率对于成体体细胞仅实现～1%，并且对于胚胎体细胞可以达到<5%。

除了基因递送的低效率外，这种方法还具有另一个问题：耗时。一旦重编程基因已递送，它们就随机运输到细胞内，并且仅小部分的基因可以达到核。然而，仅具有位于核内的递送基因的那些体细胞可以重编程，以生成iPS细胞。这进一步显著降低iPS细胞转换效率。为了解决这个问题，已执行反复的基因转染，以增强递送基因的核掺入的随机概率，这是耗时的。递送基因开始表达花费7-14天，并且观察到非iPS细胞集落形成花费～30天。为了完成重编程，通常花费4-8周以由人成体体细胞生成iPS细胞。

对于蛋白质诱导的细胞重编程，必须将蛋白质递送到成纤维细胞的核内。Ding和Kim的实验室都通过将细胞穿透肽（CPP，9R-11R）加入C末端内来改造重编程蛋白质。尽管CPP融合法将重编程蛋白质递送到细胞内，但的确存在基于CPP的蛋白质递送的几个重大缺点：

（1）CPP融合物具有改变重编程蛋白质的性质/功能的高危险。

（2）CPP具有低蛋白质递送效率。

（3）CPP递送的蛋白质对细胞内蛋白酶是敏感的，因为CPP是基于肽的，引起递送蛋白质的降解。

（4）CPP不具有对核的靶向能力用于蛋白质起始重编程。

一旦蛋白质在细胞溶质内，如果它们未正确折叠，细胞内蛋白酶就首先设法降解它们。对于经受住细胞内蛋白酶降解的那些蛋白质，它们将随机撞击不同细胞内区室，并且仅极小部分的蛋白质可以达到核，以起始蛋白质诱导的重编程。为了增强重编程蛋白质的核定位概率，Ding和Kim的实验室都采用蛋白质递送的反复循环（7-10个循环）。

这些重大缺点引起体细胞转换成iPS细胞的极低效率（<0.005%）。此外，蛋白质起始的成纤维细胞成为iPS细胞的重编程花费很长时间。在Ding的论文中，观察到来自小鼠胚胎成纤维细胞的iPS细胞集落形成花费5周，这与人成体成纤维细胞相比较重编程为iPS细胞容易得多。当人新生儿成纤维细胞由Kim等人用于生成iPS细胞时，观察到iPS细胞集落花费8周。

如上文讨论的，递送效率的缺乏、核靶向的缺乏/细胞内运输的随机性质以及目前基因和蛋白质递送技术的长过程使得非常难以控制生成iPS细胞的质量。这通过几个近期报告证实，指示新近生成的iPS细胞展示与人ES细胞的那些不同模式的基因表达。然而，在50-60次传代后，iPS细胞展示与人ES细胞非常相似的基因表达模式。基于这个结果，连续重编程概念已在iPS细胞的连续传代过程中提出。不幸的是，还观察到在以后传代（50-60次传代）时，iPS细胞展示与起始体细胞相比较的重大染色体变化，使得不能使用这些iPS细胞用于人临床应用。

因此，开发iPS细胞技术将是有利的，所述iPS细胞技术可以在数天内以接近100%的转换效率由人成体体细胞生成高品质iPS细胞。

发明概述

根据本发明提供了piPSC技术，其可以使用细菌表达的重组重编程蛋白质直接由不同起始体细胞生成高品质piPS细胞。

本发明提供了利用QQ-蛋白质递送技术的piPSC技术，其允许重编程蛋白质在递送后第一小时内直接进入人体细胞的核内的靶向递送。这在12小时内开始体细胞的细胞重编程，并且在一周内完成细胞重编程以生成piPS细胞。

本发明提供了以接近100%的转换效率由成体成纤维细胞及其他体细胞生成小鼠、大鼠和人piPS细胞的piPSC程序。

本发明提供了由许多不同的体细胞生成高品质iPS细胞的程序，所述体细胞包括小鼠原代成纤维细胞、成体小鼠成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人原代成体成纤维细胞、人成体角化细胞和人羊水。

本发明还提供了由不同的患病体细胞生成高品质iPS细胞的程序，所述患病体细胞包括大鼠肿瘤细胞例如9L-神经胶质瘤细胞、小鼠转移性乳腺癌细胞例如4T1-细胞、人乳腺癌细胞系例如MDA-MB-231、人脑瘤细胞系例如U87和U251-神经胶质瘤细胞、人原代4期GBM细胞、具有apoE3或apoE4同种型的来自阿尔茨海默患者的人原代成纤维细胞。

本发明提供了简单且仅涉及体细胞与重编程蛋白质的一步温育的piPSC技术，所述重编程蛋白质为四种重编程蛋白质（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）、或三种重编程蛋白质（Oct4/Sox2/Klf4）、或两种重编程蛋白质（Oct4/Sox2）、或仅一种重编程蛋白质（Oct4）。

本发明还使用其他重编程蛋白质组合例如Sox2、Oct4和Nanog（SON），加上常规Yamanaka的四种转录因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc），以在1周内以接近100%的效率生成piPSC。因为Klf4和c-Myc是致癌蛋白质，并且SON因子是关于多能性的主要调节物，所以使用SON因子的细胞重编程可以显著减少突变率，并且显著增强生成的piPSC的质量，所述piPSC对于人临床应用是安全的。

本发明描述了无饲养者piPSC培养条件，其集中于单层piPSC培养物用于piPSC的长期自我更新。这种无饲养者piPSC培养条件避免小鼠饲养层，并且解决所生成的piPSC的可能交叉物种污染的重大安全关注，用于未来安全的人临床应用。

本发明描述了单层全皿传代法，其消除常规iPS细胞生成和扩增的集落选择和克隆扩增，显著增强生成的piPS细胞的质量且加速piPS细胞扩增。

本发明的这些及其他目的、优点和特点通过参考目前实施方案和附图的描述将得到更全面理解和了解。

附图简述

本发明的其他优点通过参考下述详述将更容易了解，如下述详述当与附图结合考虑时变得更好理解一样，在所述附图中：

图1是描述本发明的方案的流程图，显示这种piPSC技术的每个步骤的概要。图1还给出在细胞重编程中使用的四种重编程蛋白质的浓度。图1进一步描述细胞重编程循环。

图2，A：显示用于产生四种重编程蛋白质的细菌表达方法，包括常规IPTG诱导法和高细胞密度IPTG诱导法。这些方法包括在细菌表达中使用的关键步骤和参数。右上图是在细菌表达中使用的培养基的最佳化配方的表格。B：显示用于Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的纯化重编程蛋白质的SDS-PAGE和蛋白质印迹。四种重编程蛋白质的细菌表达得率是80-120mg/升。

图3：在重编程蛋白质包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc QQ-递送1.5小时后，人新生儿成纤维细胞的免疫染色的荧光图像，显示递送蛋白质的核定位。实验条件显示于上图中。因为在蛋白质递送过程中对于成纤维细胞获得荧光图像，所以重编程蛋白质可以在细胞的细胞溶质和核中观察到。

图4：使用针对几种多能性标记的抗体的免疫染色的时程实验。使HNF与QQ-修饰的四种因子一起温育12小时，并且随后转到常规培养基另外108小时。在24、48、72和108小时，制备单层细胞用于免疫染色。在核和细胞溶质位置中在24小时用Oct4染色的细胞内观察到荧光信号。然而，细胞溶质Oct4在48小时显著减少，并且在72小时仅在核中观察到且具有减少的荧光强度。在108小时，核染色再次显著增强。这个数据首次表明在72小时控制在核内的内源Oct4基因表达和QQ-递送的内源Oct4降解的转变。在108小时恒定的内源Oct4表达指示通过四种重编程蛋白质诱导的细胞重编程的维持，这通过其他多能性标记包括ALP、Nanog、Rex1和Tra-160的免疫染色加以证实。明确的是，这些多能性标记的荧光信号在24小时观察到，并且在以后时间点变得强得多，指示这些多能性基因的内源表达在24小时开始，并且在以后时间点良好维持。Rex1和TRA1-60的强荧光染色指示晚期多能性标记的内源蛋白质表达，表明蛋白质诱导的细胞重编程可能在4-5天内完成。这个结果通过在6-8天时的大量集落形成的观察加以证实（插图）。

图5：A：在用四种蛋白质重编程后六天的piPSC集落的显微图像，显示在无饲养者培养基中的这个小视区中的许多piPSC集落。一般而言，在一个细胞培养皿中观察到500-1500个piPSC集落。B：一个piPSC集落的放大视图，显示清晰边缘。C-F：使用ALP作为早期多能性标记的重编程程序的最佳化。C：将人新生儿成纤维细胞（HNF）不含重编程蛋白质培养24小时，充当阴性对照。这个小图仅显示通过DAPI染色的HNF核，不含ALP染色。D：使HNF与四种重编程蛋白质一起培养3小时，并且随后转到不含重编程蛋白质的培养基。E：使HNF与四种重编程蛋白质一起培养5小时，并且随后转到不含重编程蛋白质的培养基。F：使HNF与以较低蛋白质浓度（0.5μg/ml）的四种重编程蛋白质一起培养24小时。将样品用ALP试剂盒处理用于酶促反应，并且以红色荧光染色用于ALP蛋白质表达。小图C-F指示可以最佳化重编程条件，用于来自HNF的piPS细胞的最佳转换效率。仅～30%的细胞显示在D中的强ALP染色，而剩余细胞显示无ALP染色或弱ALP染色。当执行5小时蛋白质重编程时，明显更多的细胞（60%）显示强ALP染色，尽管仍观察到具有弱ALP染色和无ALP染色的细胞（40%）。实验条件通过使HNF与更低浓度的四种重编程蛋白质一起温育24小时进行最佳化（F）。基本上每一个细胞在这种条件下都是ALP阳性的，表明每一个单细胞的细胞重编程得到起始，并且在这种单循环重编程条件下能够生成piPS细胞。

图6：A，在#33重编程的第一次传代时的piPSC集落的皿（左）和加框区域的放大视图，显示红色piPSC集落。集落用ALP（红色）染色。B，如每个小图中标记的，使用不同多能性标记的单一免疫染色（左图）和双重免疫染色（右）的单层piPSC的荧光图像。对于双重染色，我们仅考虑当表面和核标记都是阳性时的阳性染色的细胞。对于仅核或表面标记是阳性染色的那些细胞，我们将它们视为阴性的。还执行且展示使用起始HNF的免疫染色的阴性对照。ALP和SSEA4是表面标记，而Oct4、Sox2、Nanog和Rex1是核标记。C，显示基于六种单一染色（左）和三种双重染色（右）的piPSC技术的转换效率的条形图。通过手动计数超过300个细胞的阳性和阴性染色，计算转换效率。在每个条上方，上面的红色数字是转换效率，并且下面的蓝色数字是计数用的计算相应转换效率的细胞数目。

图7：对30%piPSC（第4次传代）和70%HNF的细胞混合物，使用六种多能性标记（如标记的）用于免疫染色的内部对照实验的荧光图像，显示阳性染色细胞的预期稀释度。右下：具有单层细胞的两个集落的荧光图像，显示集落和单层细胞对于ALP和SSEA4都是阳性染色的。

图8：使用单集落传代法所生成的piPS细胞的多能性的表征。简言之，在细胞重编程完成后，选择具有清晰边缘的单个集落（A），并且使用无饲养者条件再传代三代。注意到这个单个集落在传代后几天开始丧失清晰边缘，并且该细胞在细胞增殖过程中从集落中排除。一旦细胞达到汇合，就将细胞移出且传代到新皿内，在第二天形成许多边缘清晰的集落。然而，细胞在其增殖过程中重复上述过程。这些是从集落中排除的观察到的细胞（绿色箭头），而其他集落维持清晰边缘（白色箭头）（B）。使用相同多能性标记，例如对于Oct4和Nanog，对边缘清晰的集落（C1和C3）和从集落中排除的单层细胞（C2和C4）执行免疫染色。显而易见的是两类细胞都是阳性的，表明它们是piPSC样细胞。我们还不挑选任何集落而传代全皿细胞共三代。我们随后比较这两个单集落传代的细胞与全皿单层细胞传代，并且在使用六种多能干细胞标记的免疫染色中未观察到差异。

图9：使用ALP、Oct4、Nanog、SSEA4、Tra1-60和Rex1，在我们的无饲养者培养条件下，#19重编程（6.5个月，使用全皿单层细胞传代法）的第30次传代的piPSC集落免疫染色的荧光图像。用DAPI标记核。

图10：在我们的无饲养者piPSC培养条件下，使用全皿传代法，来自第6次传代时（50天）的第19次细胞重编程的piPSC集落免疫染色的荧光图像。简言之，通过移出全皿中的细胞并且传代到两个皿内，将全皿传代，而无需挑选单个集落。传代的皿第二天形成数百个集落。在第6次传代时，使用免疫染色表征这些piPS细胞，包括piPSC集落和单层细胞。使用六种多能性标记，包括ALP（早期标记），Oct4、Nanog、SSEA4（中期标记），Rex1和Tra1-60（晚期标记）。阴性对照使用HNF用SSEA4抗体显示。HNF仅显示单个细胞而无集落形成。该图显示所生成的piPSC集落对于所有六种多能性标记都染色阳性，表明所生成的piPSC集落是多能干细胞。

图11：使用全皿单层细胞传代法扩增的piPS细胞的表征。A：右：与起始HNF的那些相比较，在传代1和传代5时，对于iPS细胞中的基因表达的Stem CellPluripotency Arrays热图（log2）。单个实时RT-PCR进一步用于证实阵列数据。左：评价在1和5次传代时的piPSC和HNF细胞中的Oct4、Sox2和Nanog基因表达的qRT-PCR的条形图。相对基因表达代表相对于HNF细胞那种的倍数变化（log2）。B：对于HNF（第17次传代）和piPSC（第10次传代）执行SKY染色体分析，显示在所生成的piPS细胞和亲本HNF细胞之间相同的核型。C：关键多能蛋白质的蛋白质印迹结果，包括piPSC（第5次传代）和起始HNF（右）的三种主要调节物（Oct4、Sox2和Nanog）和一种晚期多能性标记（Rex1）。看家蛋白质（肌动蛋白）显示等量piPSC和HNF细胞用于这些蛋白质印迹。D：piPSC（～85%，第#33次重编程，第2次传代）和NHF（～15%）的Nanog基因的脱甲基化。

图12：使用全皿传代法扩增的piPS细胞的分化能力。上：piPSC的体外自发分化。免疫染色图像显示在第14天时的所有三个胚层，包括神经（A，巢蛋白，外胚层）、肌肉和内皮样（B，结蛋白，中胚层）和内胚层样细胞（C，AFP，内胚层）。下：A：piPSC至神经谱系的体外特异性分化的荧光图像。A，神经元（Tuj1+，白色箭头）。B，I型星形细胞（GFAP+）。C，II型星形细胞（GFPA+）。D，少突胶质细胞（O1+）。F，神经干细胞（Sox2+）。G，神经干细胞（巢蛋白+）。在所有小图中都观察到显著细胞形态差异。然而，在下图中的A、B、C、D中的细胞展示典型的神经元/星形胶质细胞/少突胶质细胞形态，并且在F、G中的细胞展示典型的神经干细胞形态，证实免疫染色不是假阳性的。

图13：A：畸胎瘤形成（1）。全皿传代法用于生成足够的piPSC用于畸胎瘤形成。在第3次传代（25天）时，将piPSC悬浮于含有10%FBS的DMEM中。将SCID（NxGen Biosciences）小鼠用二乙醚麻醉，并且将细胞悬液注射到肾囊和肌肉下。肿瘤在第四周时明确可见（A），并且在第六周时手术解剖。piPSC注射的肾与不含注射的肾相比较（B），明确显示piPSC注射的肾的扩大。C：用于使用全皿传代法的畸胎瘤形成的piPS集落和单层细胞的免疫染色的荧光图像。还显示了使用起始HNF使用SSEA4的相同免疫染色的阴性对照（右）。使piPSC集落分解成单层细胞，并且随后执行免疫染色。结果指示基本上每一个细胞对于所有六种多能性标记都展示阳性染色，表明使用全皿传代法的高转换效率。仅将200,000个piPS细胞移植到裸鼠的肾囊内。

图14：A：畸胎瘤形成（2）。在第六周时，将动物手术解剖。将肾组织样品在含有4%甲醛的PBS中固定，并且在石蜡中包埋。将切片用苏木精和伊红（eosin）（H&E）染色。对于衍生自piPS细胞的畸胎瘤形成执行H&E染色。在细胞移植到SCID小鼠的肾囊下之后，畸胎瘤由单个注射部位良好发展。所得到的畸胎瘤含有代表外胚层、中胚层和内胚层分化的多种组织。组织载玻片的组织学数据指示这些畸胎瘤含有来自所有三个主要胚层的组织，包括神经组织和表皮组织（外胚层）、横纹肌和软骨（中胚层）、和肠样上皮组织（内胚层），证实使用全皿传代生成的piPS细胞在体内显示出多能性。

图15：衍生单个患者的piPS细胞可以用于生成用于该患者的疾病模型。简言之，原代皮肤成纤维细胞可以经由皮肤活组织检查得自患者，并且这些成纤维细胞可以通过四种重编程蛋白质的递送用于生成piPS细胞。所生成的piPS细胞可以扩增或导致成体干细胞的特异性谱系，其可以进一步分化成患病组织。因此，这些细胞可以用于生成疾病模型，因为它们由具有特定疾病的单个患者生成。因此，可以在关于这个个体患者的皿中研究这种特定疾病。

图16：piPS细胞可以用于药物筛选和药物毒性测试，如该图中举例说明的。对于具有遗传疾病的那些患者，可能必须采取包括通过同源重组的遗传修复的额外步骤。

图17：piPS细胞可以用于基于患者的干细胞疗法。简言之，原代皮肤成纤维细胞可以得自患者，并且这些成纤维细胞可以通过四种重编程蛋白质的递送用于生成piPS细胞。所生成的piPS细胞可以扩增或导致成体干细胞的特异性谱系。这些piPS细胞和成体干细胞可以移植到个别患者内，以治疗特定疾病，对于具有遗传疾病的那些患者，可能必须采取包括在患者移植前通过同源重组的遗传修复的额外步骤。

发明详述

本发明提供了蛋白质诱导的多能干细胞（piPSC）技术。本发明提供了这种piPSC技术的用途，所述piPSC技术可以使用细菌表达的重组重编程蛋白质直接由不同起始体细胞生成高品质iPS细胞。

本发明的piPSC技术是简单的且仅涉及体细胞与重编程蛋白质的一步温育。重编程蛋白质可以是本领域技术人员已知能够执行所述功能的任何蛋白质。此类蛋白质的例子包括但不限于四种重编程蛋白质（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）、或三种重编程蛋白质（Oct4/Sox2/Klf4）、或两种重编程蛋白质（Oct4/Sox2）、或仅一种重编程蛋白质（Oct4）。

本发明的piPSC技术还使用其他重编程蛋白质组合例如Sox2、Oct4和Nanog（SON），或Nanog/Oct4，或仅Nanog，加上常规Yamanaka的四种转录因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc），以生成piPSC。因为Klf4和c-Myc是致癌蛋白质，并且SON因子是关于多能性的主要调节物，所以使用SON因子的细胞重编程可以减少突变率，并且显著增强生成的piPSC的质量，所述piPSC对于人临床应用是安全的。

本发明的piPSC技术利用QQ-蛋白质递送技术，其允许重编程蛋白质在递送后前一小时内直接进入人体细胞的核内的靶向递送。这在12小时内开始体细胞的细胞重编程，并且在一周内完成细胞重编程以生成piPS细胞。另外，该程序以接近100%的转换效率由成体成纤维细胞及其他体细胞生成小鼠、大鼠和人piPS细胞。

piPSC技术提供了通用程序，其不仅可以使用Yamanaka的因子或SON因子用于有效生成蛋白质诱导的多能干细胞，还可以广泛用于使用不同组的重编程蛋白质由成体体细胞生成成体干细胞，例如神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞和造血干细胞，以及转分化以直接生成心肌细胞、神经元、棕色脂肪细胞、胰岛素分泌细胞及其他类型的终末分化的细胞。

piPSC技术可以用于由许多不同的体细胞生成高品质iPS细胞，所述体细胞包括但不限于：健康动物的小鼠原代成纤维细胞、成体小鼠成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人原代成体成纤维细胞、人成体角化细胞和人羊水。高品质iPS细胞还可以由不同的患病体细胞生成，所述患病体细胞包括但不限于：大鼠肿瘤细胞例如9L-神经胶质瘤细胞、小鼠转移性乳腺癌细胞例如4T1-细胞、人乳腺癌细胞系例如MDA-MB-231、人脑瘤细胞系例如U87和U251-神经胶质瘤细胞、人原代4期GBM细胞、具有apoE3和apoE4同种型的来自阿尔茨海默患者的人原代成纤维细胞。

本发明描述了无饲养者piPSC培养条件，其集中于单层piPSC培养物用于piPSC的长期自我更新。这种无饲养者piPSC培养条件避免小鼠饲养层，并且解决所生成的piPSC的可能交叉物种污染的重大安全关注之一，用于未来安全的人临床应用。

本发明描述了用于piPSC的长期自我更新和扩增的新piPSC传代法：全皿传代，因为这种piPSC技术的转换效率达到接近100%。这种新piPSC传代法集中于单层piPSC的传代和扩增，并且它是简单和快速的。它还避免了在细胞重编程过程中的集落选择、集落挑选和克隆扩增，可以显著减少突变率，并且显著增强生成的piPSC的质量，所述piPSC对于人临床应用是安全的。

本发明可以用于生产大量细菌表达的重组重编程蛋白质，包括但不限于：Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog、BMP4及其他重编程蛋白质。

更具体而言，本发明基于QQ-蛋白质转导技术和体内重折叠技术，如通过引用并入本文的共同未决的美国专利申请12/128,320中公开的。QQ试剂具有将多种蛋白质以接近毫摩尔浓度同时或连续递送到细胞内的能力，和将蛋白质靶向递送到正确的细胞内区室内的能力，另外，QQ-试剂保护蛋白质不受细胞内的蛋白酶。递送的蛋白质正确重折叠且通过细胞内机制翻译后修饰，并且遵循与其内源对等物相同的细胞内运输和分泌途径。因此，QQ-蛋白质转导是生理学相关的蛋白质转导技术。

本发明通过QQ-试剂配方的最佳化，使QQ-蛋白质递送延伸至piPS细胞技术。新配方有效将重编程蛋白质递送到起始体细胞的核内。相应地，用新配方修饰的靶蛋白质的量可以通过改变QQ-组成进行调整，以对于用于细胞重编程的特定重编程蛋白质获得进入不同体细胞内的最佳递送效率。

本发明还提供了细胞重编程可以在QQ-蛋白质递送后数小时内起始，因此多能性基因在这个时间段过程中开始被内源的直接实验证据。另外，本发明还提供了细胞重编程可以在QQ-蛋白质递送后1周内完成，因此完成的重编程标记的基因在这个时间段过程中开始内源表达的另外实验证据。

本发明的方法和产物是最佳化重编程蛋白质的组成和浓度的有效和可行方法，用于最佳化使用QQ-蛋白质递送所生成iPS细胞的质量。

另一个利益是此处呈现的piPSC技术使用重编程蛋白质生成组织特异性piPS细胞，而无需亲本细胞的遗传操作。此外，这种piPSC技术使用“SON”蛋白质（主要ESC调节物）用于细胞重编程，并且去除致癌的KLF4和c-MYC蛋白质，解决用于可能的个人化疾病疗法的未来人临床应用的重大安全障碍。

piPSC技术可以用于人临床应用中，包括再生医学和细胞替代疗法，来自具有遗传病症的个别患者的iPS细胞库的生成，基于来自个别患者的piPS细胞的疾病模型和不同药物的功效测试，所述不同药物包括小分子药物、蛋白质药物、DNA药物、RNA药物、碳水化合物药物和基于脂质的药物。

本发明描述了这种piPSC技术在人临床应用中的应用，以治疗不同人疾病，包括但不限于癌症、心脏病、中风、糖尿病、肥胖、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、心肌梗塞、肌营养不良、CMT-1A、脊髓损伤、外伤性脑损伤、学习缺陷、缺牙、伤口愈合、骨髓移植、骨关节炎、类风湿性关节炎、脱发、失明、耳聋、克罗恩氏病和遗传疾病及其他相似疾病。

最重要的是，已实现大于85±4%的转换效率。所生成的piPSC展示人胚胎干细胞（hESC）的特征，并且可以在无饲养者条件下稳定且同质扩增6个月。这些piPSC还具有在体外和体内分化成三个胚层的潜力。

这种piPSC技术的此类效率基于现有技术QQ-蛋白质递送技术。QQ-试剂保护递送的蛋白质不受通过细胞内蛋白酶的降解，并且具有基于由递送的蛋白质携带的信号序列对特异性细胞内区室的靶向能力。QQ-递送应用于蛋白质诱导的HNF细胞重编程，这在1周内以大于85±4%的转换效率生成piPSC。此类高转换效率允许消除在细胞重编程过程中的集落选择和用于维持纯piPSC群体的克隆扩增，从而急剧加速piPSC生成和扩增的整个程序。使用无饲养者条件开发单层piPSC传代方法用于扩增所生成的piPSC。这种piPSC技术还可以通过减少在常规集落挑选和克隆扩增过程中的突变率，显著增强用于安全人临床应用的piPSC的质量。

本发明的piPSC技术包括极高效率的细菌表达方法和用于细菌表达的培养基的配方，所述细菌表达方法可以用于以极高得率（80-120mg/升）产生纯重编程蛋白质。这显著减少这种piPSC技术的成本。

本发明的piPSC技术利用体内蛋白质重折叠技术，其使用QQ-蛋白质递送技术将细菌表达的重编程蛋白质直接递送到体细胞内，用于通过哺乳动物细胞折叠机制的重折叠。因此，这种piPSC技术省略复杂和低效的细菌表达的重编程蛋白质的体外蛋白质重折叠步骤，因此使得这种piPSC技术成为更简单和廉价的技术。

本发明的piPSC技术利用QQ-蛋白质递送技术，以将重编程蛋白质直接递送到体细胞的核内，以开始且维持细胞重编程。已显示这种piPSC技术可以在QQ-蛋白质递送后1.5小时内将重编程蛋白质特异性递送到基本上每一个单个体细胞的核内。

本发明的piPSC技术还可以在蛋白质递送后的前24小时内开始细胞重编程，并且细胞重编程可以在5天内完成以生成piPS细胞，其首次证实细胞重编程不是随机过程，而是确定和可重复的使用QQ-蛋白质递送技术由体细胞生成piPS细胞的过程。

本发明的piPSC技术包括无饲养者的细胞培养条件，以传代所生成的piPSC。本文描述的是这种无饲养者条件的详细程序，并且还报道在形状和形态中的潜在集落变化。使用这种无饲养者条件，所生成的piPS细胞的超过30次传代已成功地经过超过6个月。

本发明的piPSC技术描述了显著不同于常规传代法的传代法，所述常规传代法挑选单个集落用于传代。因为这种piPSC技术将接近100%体细胞转换成piPS细胞，所以开发了将全皿的细胞传递到新皿内用于传代的全皿传代法。这允许避免集落挑选和克隆扩增，并且可以显著减少所生成的piPS细胞的突变率。这解决了生成足够piPS细胞用于应用的重大问题，并且可以显著增强用于安全人临床应用的piPS细胞的质量。

本发明的piPSC技术表明用于开发用于个体患者的疾病模型的程序。这是允许在皿中研究人疾病的这种piPSC技术的重要应用。

本发明的piPSC技术表明用于个体患者的药物筛选和药物毒性测试的程序。这是这种piPSC技术的另一个重要应用，其潜在允许在个别患者基础上在皿中开发新药物。

本发明的piPSC技术表明基于患者的干细胞疗法以治疗人疾病，包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、中风、学习缺陷、外伤性脑损伤、伤口愈合、脊髓损伤、骨关节炎、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、多部位癌症、糖尿病、肌营养不良、心肌梗塞、肌萎缩侧索硬化、脱发、失明和耳聋。这是这种piPSC技术的最重要应用，其潜在允许我们在个体患者的基础上治疗多种人疾病。

开发三种技术以解决先前可用或目前的iPSC技术的最具挑战性的问题。这些技术包括有效的细菌表达系统，允许克/升数量的纯重组蛋白质生产；使用哺乳动物细胞的细胞内折叠机制有效重折叠细菌表达的蛋白质的体内蛋白质重折叠技术；和对特异性细胞内细胞器包括核具有靶向能力的QQ-蛋白质转导技术。

使用第一种技术，以80-120mg/一升表达的得率制备了细菌表达的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc蛋白质，其通过蛋白质印迹加以证实。这使得重组重编程蛋白质便宜得多且是能承受的。第二种技术–体内蛋白质重折叠技术允许省略由Ding等人采用的体外重折叠步骤，其是低效、昂贵和复杂的。一般地，这种方法使用QQ-蛋白质递送技术将细菌表达的蛋白质递送到哺乳动物细胞内。细胞内折叠机制可以有效重折叠细菌表达的蛋白质。

第三种技术是先进的QQ-蛋白质递送技术，其具有几个特点，确保这种蛋白质递送技术的生理学关联性：

（1）QQ-试剂与蛋白质非共价结合，并且不将标签加入递送的蛋白质中。

（2）QQ-试剂掩蔽/保护递送的蛋白质不受细胞内蛋白酶（高代谢稳定性）。

（3）基于由递送的蛋白质携带的序列定位信号，QQ-试剂将蛋白质特异性递送到其靶区室（靶向能力）。

（4）QQ-试剂具有高效率的蛋白质递送，最高达毫摩尔（mM）细胞内浓度。

QQ-试剂是基于聚乙烯亚胺（PEI）的混合物（cocktail），具有其他关键成分，例如脂质和增强子。它们可以配制用于特定应用。QQ-试剂与递送蛋白质非共价结合，这在递送蛋白质的表面上包被QQ-试剂层。这掩蔽蛋白质不受细胞内蛋白酶降解。一旦在细胞内，QQ-试剂OOES就与递送的蛋白质逐渐解离。QQ-试剂的这些独特特点使得递送的蛋白质与其在细胞内的内源对等物无法区分。一旦递送的蛋白质达到其靶向区室，细胞的机制就表现得如同它们是内源对等物一样。证实QQ-递送的蛋白质在细胞内正确折叠且翻译后修饰，并且它们遵循与其内源对等物相同的细胞内运输和分泌途径。

通过引用并入本文的QQ-蛋白质递送技术和体内蛋白质重折叠技术的专利申请已于2008年5月28日提交。这三种先进技术解决了目前的iPSC技术的重大问题。这允许开发piPSC技术，用于使用重编程蛋白质在1周内以接近100%的转换效率由许多不同体细胞生成高品质iPS细胞。此外，iPSC技术是简单和能承受的技术。

更具体而言，使用现有技术QQ-蛋白质递送技术，将细菌表达的重组重编程蛋白质直接递送到基本上每一个起始人新生儿成纤维细胞（HNF）的核内。重组重编程蛋白质通过细胞内折叠机制正确重折叠，并且在蛋白质递送后24小时开始细胞重编程。这种细胞重编程得到良好维持，并且可以在1周内完成。所生成的piPSC展示人胚胎干细胞（ESC）的特征，可以在无饲养者条件下稳定且同质扩增超过30代，并且具有在体外和体内成为三个主要胚层的分化潜力。最重要的是，这种piPSC技术以大于85±4%的转换效率由HNF生成piPSC。此类高重编程效率可以显著增强所生成piPSC的质量，所述piPSC对于未来人临床应用是安全的。

包括下述实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解实施例中公开的技术代表由本发明人发现的技术和组合物，以在本文公开的实施方案的实践中良好起作用，并且因此可以视为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解可以在公开的具体实施方案中作出许多变化，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本文公开的实施方案的精神和范围。

实施例

材料与方法

质粒构建。将四种基因Oct4（NP_002692）、Sox2（NP_003097）、Klf4（NP_004226）、Nanog（NM_024865.2）和c-Myc（NP_002458）亚克隆到sHT-pET30a细菌表达载体内，其中短his标签：'HHHHHHSS'替换长his标签。因子Xa（IEGR）切割位点在短his标签和编码基因之间。细菌表达载体的序列通过DNA测序加以证实。

蛋白质表达和纯化。将重编程蛋白质的DNA构建体各转化到大肠杆菌（E.Coli）菌株BL-21（DE3）内。选择单个集落用于细菌蛋白质表达。在短暂最佳化后，通过0.5mM IPTG诱导蛋白质表达并且在18℃下继续培养16小时。将细胞收获在含有6M尿素的结合缓冲液中，并且超声处理三次。根据手册伴随修饰，使用His-Bind Resin柱（Novagen）纯化重组蛋白质。纯化蛋白质针对水透析且冻干成蛋白质粉末。

QQ-修饰。将重编程蛋白质溶解于具有2M尿素的50mM磷酸钠pH7.4中。QQ-试剂基于配方新鲜制备。简言之，QQ-试剂是聚乙烯亚胺（PEI）2,000（2K，0.2-1.0mg/ml）和DOTAP/DOPE（25-50μg/ml）的混合物。通过使QQ-混合物与蛋白质（Oct4/Sox2：1mg/ml；Klf4/c-Myc：0.5mg/ml；Nanog：1mg/ml）在室温下混合4小时或在冷室中混合过夜，执行重编程蛋白质的QQ-修饰。

细胞培养和细胞重编程。HNF在35X10-mm细胞培养皿中培养，直至在具有10%FBS的DMEM培养基中70-80%汇合（5×10⁴细胞）时。QQ-修饰的重编程蛋白质也与具有10%FBS的DMEM培养基（Invitrogen）混合，并且在室温下温育10分钟。Oct4、Sox2和Klf4的终浓度是0.2-0.5μg/ml，而c-Myc是0.02-0.05μg/ml。为了起始重编程，将细胞培养基替换为重编程培养基（具有10%FBS、0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基）。蛋白质浓度如下逐渐减少：在循环1中，Oct4/Sox2/Klf4是0.5μg/ml，并且c-Myc是0.05μg/ml。在循环2中，蛋白质浓度减半。在循环3中，蛋白质浓度进一步减半。每个循环含有与QQ-修饰的蛋白质的3-12小时温育，加上不含重编程蛋白质的12-21小时温育。在3个循环后，细胞在具有20%KSR、0.1mM2-ME、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸的DMEM培养基（补充有10ng/ml bFGF（Stemgent））中培养用于重编程后培养48小时。保存这个48小时重编程后培养基作为条件培养基。在重编程后培养结束时，细胞完全汇合。在重编程后培养后的汇合皿将在无饲养者条件下促进集落形成。

在无饲养者条件下的piPSC生成。将新皿（0.2%明胶包被的）用条件培养基预处理15分钟。使用胰蛋白酶（0.05%）将重编程的细胞解离为单层细胞悬液，并且转移到新皿内。使细胞在含有Knockout DMEM的培养基中培养，所述Knockout DMEM具有20%KSR（Invitrogen）、10ng/ml bFGF、0.2mM2-ME（Sigma）、0.1mM非必需氨基酸（Invitrogen）和2mML-谷氨酰胺（Invitrogen）。第二天，观察到数百个边缘清晰的集落。当皿是80-90%汇合时，每5-7天传代细胞。为了比较piPSC群体的多能性，挑选单个piPSC集落用于传代（单集落传代）或传代半个皿的细胞（全皿传代）。使用两种传代法继续细胞扩增一直到第10次传代（2个月），并且执行免疫染色。在piPSC传代过程中，通过将一半培养基替换为新鲜的无饲养者培养基，每隔一天更换培养基。每隔一周制备无饲养者培养基并且将其维持在冷室中。

重编程蛋白质的剂量相对于piPSC集落形成。不同浓度的重编程蛋白质用于生成piPSC集落。在每个蛋白质浓度时一式三份地执行两循环重编程。在重编程和重编程后温育（48小时）后，将全皿传代到60x15mm皿内。在第2次传代开始在显微镜下计数集落数目共连续三天。

重编程蛋白质的核靶向。在实验前一天将HNF种植到4个孔内。使HNF与QQ-修饰的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（1-μg/ml）单独地一起在37℃下温育1.5小时。将细胞用PBS洗涤3次，并且用4%甲醛固定，随后用PBS洗涤3次。将细胞封闭且用含有0.2%曲拉通的2%绵羊血清渗透化2小时，并且与具有2%绵羊血清PBS的一抗一起在冷室中温育过夜。将细胞用1%血清洗涤3次，并且随后与二抗（1:300稀释度）一起在室温下温育2小时。使用1%血清-PBS将细胞洗涤3次，并且实施荧光成像。

人干细胞多能性基因阵列分析。使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion，USA）在第1次和第5次传代时，从HNF和iPSC中提取总RNA。含有92种定义明确的验证基因的Stem Cell Pluripotency Arrays（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）用于基因表达分析。根据制造商的方案执行逆转录反应、实时RT-PCR和数据分析，以获得Ct值。简言之，使用来自High Capacity cDNA Archive Kit（Applied Biosystems）的随机引物，分别由1.0ug总RNA逆转录cDNA。在ABI Veriti Thermal循环仪（AppliedBiosystems）上执行RT-PCR。使500ng cDNA与Universal PCR Master Mix/储库混合，对于每种样品两个储库。将样品特异性PCR混合物装载到Stem CellPluripotency Array上，每个储库100ul。在离心后，随后在7900HT系统（AppliedBiosystems）上运行TaqMan阵列，用于定量实时PCR分析。使用SDS软件版本2.3和RQmanager1.2（Applied Biosystems），应用自动基线设置和0.05的阈值，计算原始Ct值。对于阵列数据分析，仅考虑具有等于或低于36的Ct值的那些miRNA。将原始Ct值输入RealTimeStatMiner4.2（Integromics，Inc.）内。选择GAPDH作为内源对照基因，以测定候选基因的相对表达。选择HNF的基因表达作为校准物，以鉴定差异表达的piPSC的特异性标记。计算-ΔΔCt，并且用分层聚类执行热图分析。单个实时RT-PCR进一步用于证实阵列数据。

实时RT-PCR。根据制造商的说明书，使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion，USA），从人新生儿成纤维细胞和piPSC（第1次和第5次传代）中分离总RNA。对于每个RT反应，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒（Applied Biosystem，USA），将200ng RNA用于cDNA合成。PCR反应在HT-7900系统中完成。结果是一式三份测量的平均值，并且针对对照基因GAPDH标准化。使用比较阈值循环法计算靶基因的相对表达。通过计算-ΔΔCt生成表达差异。

蛋白质印迹。纯化蛋白质或piPSC裂解产物通过10%SDS-PAGE在还原条件下分离，并且点到硝酸纤维素膜上。针对人Oct4（Santa Cruz）、Sox2（Santa Cruz）、KLF4（R&DSYSTEMS）和c-Myc（R&D SYSTEMS）的抗体用于检测蛋白质。分别使用针对小鼠IgG（SantaCruz）、兔IgG（Santa Cruz）和山羊IgG（Sigma）的二抗。通过SuperSignal West PigmoChemiluminescent Substrate（Thermo Scientific，USA）检测蛋白质信号。

拟胚体（EB）形成和自发体外分化。将piPSC胰蛋白酶消化成单层细胞，并且在低粘附平板（Corning）上在具有10%FBS、含有0.1mM2-ME的DMEM培养基中悬浮培养。在几天中在悬液中观察到EB。对于自发分化，每2天更换培养基，共10–15天。通过用所示抗体的代表性谱系特定标记的免疫染色检查自发分化。对于特定神经谱系分化，在EB形成后的第3天时将培养基更换为神经诱导培养基：含20ng/ml神经生长因子的具有5%FBS的DMEM（PROSpect）。对于特异性心肌细胞谱系分化，在EB形成后的第3天时将培养基更换为特异性培养基。

细胞化学和免疫荧光测定法。根据制造商执行ALP测定法（Vector Red ALP底物试剂盒I）。使用用于多能性和分化标记的标准方案执行免疫细胞化学。简言之，将piPSC和HNF种植到8孔培养室中，并且用4%多聚甲醛（Sigma）固定，用PBS洗涤三次。将细胞在0.2%tritonX和5%绵羊血清（Sigma）中在室温下温育2小时。接下来，使细胞与一抗一起在4℃下温育过夜：干细胞标记抗体试剂盒（R&D Systems，1:300）、抗Tra-1-60（Stemgent，1:300）和抗Rex1（Stemgent，1:300）用于多能性标记。对于体外分化，使用Tuj1（Covance，1:500）、巢蛋白（Millipore，Neural Stem cell Characterization Kit，1:10）、MF20（DevelopmentStudies Hybrioloma Bank，Super，1:300）、APF（Thermo Scientific，1:200）、结蛋白（Thermo Scientific，1:300）和Brachyury（Santa Cruz，1:300）。在1%血清PBS中洗涤三次共10分钟后，使细胞与二抗（在2%血清PBS中1:400）一起在室温中温育2小时：AlexaFluor555驴抗山羊IgG（1:2000，Invitrogen）、Alexa Fluro488驴抗兔IgG（1:2000，Invitrogen）和Alexa Fluro488驴抗鸡IgG（1:2000，Invitrogen）。使用DAPI协作封固剂（cooperated mounting medium）（VactorLab）通过DAPI检测核。使用ApoTom（Zeiss）Ax10plan2成像系统获得荧光图像。

畸胎瘤形成。全皿传代用于扩增piPSC用于畸胎瘤形成。在第3次传代时，将piPSC悬浮于含有10%FBS的DMEM中。将SCID或无胸腺Balb/c小鼠（NxGen Biosciences）用二乙醚麻醉，并且将细胞悬液注射到肾囊和肌肉下。肿瘤在第四周时明确可见，并且在注射后的第六周时手术解剖。将组织样品在含有4%甲醛的PBS中固定，并且在石蜡中包埋。将切片用苏木精和伊红染色。

DNA甲基化研究。使用DNeasy Blood&Tissue Kit（Qiagen，Valencia，CA）从HNF和piPSC中分离基因组DNA，并且通过超声进行断裂，以将DNA剪切成小片段（大小400-1000bp）。使用由制造商建议的方案，使用MethylMiner Methylated DNA Enrichment Kit（Invitrogen），经由与人MBD2蛋白质的甲基-CpG结合结构域结合，从断裂的基因组DNA中分离甲基化的DNA。使用StepOne Plus Real time PCR系统（Applied Biosystems）执行qRT-PCR，以对于甲基化DNA样品各自测定Nanog基因启动子区序列的Ct值，其中使用一对引物（Nanog基因启动子区：-1519至1498和-1307至-1327）用于扩增192bp DNA片段。作为内部对照，还使用用于扩增154bp DNA片段的一对引物（外显子5），对于甲基化的DNA样品各自测定β-肌动蛋白基因的Ct值。HNF中的Nanog基因启动子区DNA的水平计数为100%，并且使用StepOne软件v2.1（Applied Biosystems），piPSC中的Nanog基因启动子区DNA的水平计数为相对于HNF那种的倍数变化。

SKY分析。细胞培养和染色体制备：在秋水仙酰胺(colcemid)（0.1μg/ml）2小时处理后收获细胞。在常规低渗处理后（0.4%KCl，37℃10分钟），用3:1甲醇:乙酸（3x）固定染色体制剂，并且通过风干法制备载玻片。在胃蛋白酶处理和用甲醛固定后，对载玻片实施脱水。随后使染色体载玻片在70%甲醛和2x SSC中变性，并且与变性的人涂抹探针（SKYPaint）在37℃下杂交经过48小时。在一系列载玻片洗涤步骤后检测信号。DAPI信号也用于显现染色体/核。使用CCD相机随机捕获具有良好杂交质量的50个有丝分裂图。在图像采集后，染色体用Applied Spectral Image软件进行核分型（karyotyped）。

结果

简单的piPSC方案。这种piPSC技术含有制备细菌表达的重编程蛋白质、QQ-修饰和1-5个细胞重编程循环的步骤，其中取决于不同起始细胞（图1）。近期报道有效的细菌表达方法（图2A），允许对于Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc由一升细菌表达产生80-120mg纯重组蛋白质（图2B）。因为细菌表达的重组蛋白质可能不正确折叠，所以体外蛋白质重折叠方法用于通过Zhou等人的先前piPSC方案中，所述先前piPSC方案是低效的并且需要另外的纯化步骤。然而，近期开发了体内蛋白质重折叠技术，其使用QQ-蛋白质递送将细菌表达的重组重编程蛋白质直接递送到哺乳动物细胞内，在其中细胞内折叠机制有效重折叠蛋白质。piPSC方案应用这种体内蛋白质重折叠技术的原理。使用QQ-蛋白质递送将四种重编程蛋白质递送到HNF的核内，用于重折叠且作用于起始细胞重编程（图3）。每个重编程循环是24小时：使HNF与四种重编程蛋白质一起温育3-12小时，允许蛋白质递送到细胞内，随后转到常规细胞培养基内12-21小时（图1）。

对于蛋白质诱导的细胞重编程，需要递送的转录因子达到核，以开始细胞重编程。QQ-递送的重编程蛋白质在递送后1.5小时达到基本上每一个细胞的核（图3）。递送的蛋白质还在细胞溶质中观察到，因为在蛋白质递送过程中执行荧光成像。这个结果显示蛋白质诱导的细胞重编程可以在蛋白质递送后数小时内开始。证实蛋白质诱导的HNF细胞重编程在前24小时内开始，并且在5天内完成，如通过使用晚期多能性标记例如Rex1和Tra1-60的免疫染色判断的（图4）。这通过在第8天时的细胞重编程皿中的集落形成进一步证实（图4）。

piPSC方案的最佳化。蛋白质浓度首先使用碱性磷酸酶（ALP）阳性集落数目作为用于最佳化的标准进行最佳化。数据指示对于高浓度重编程蛋白质的低转换效率。当使用5μg/ml蛋白质浓度时，仅发现少数ALP阳性集落。更低的浓度生成更多的ALP阳性集落，其中以0.25-0.50μg/ml的重编程蛋白质浓度在5天内生成最多的ALP阳性集落（表1）。这个结果受公开的人胚胎干细胞（hESC）数据支持，指示在ESC内的Oct4浓度是关键的，因为更高的Oct4浓度引起ES细胞分化，而更低的Oct4浓度未能维持多能性。此外，c-Myc是致癌蛋白质，其可以引起更高的突变率，并且在高细胞内浓度时参与肿瘤生成。四种重编程蛋白质的最佳化浓度对于生成的piPS细胞的质量是关键的。QQ-蛋白质递送允许我们控制在HNF的核内的递送蛋白质浓度（表1），允许蛋白质浓度的快速最佳化。

还执行细胞重编程方案的最佳化。重复仅具有一个重编程循环的最初方案（3小时重编程），并且在循环结束时使用抗ALP抗体将细胞免疫染色。仅～30%的HNF显示强ALP染色（图5D）。作为对照，用不含重编程蛋白质的常规培养基培养24小时的HNF显示无ALP染色（图5C）。当执行5小时重编程时，显著更多的细胞（～60%）显示强ALP染色（图5E）。HNF用四种重编程蛋白质（0.1μg/ml）的24小时连续培养指示基本上每一个HNF细胞都是ALP阳性的（图5F），表明可能极高的细胞重编程转换效率。这个数据提供允许QQ-蛋白质递送在蛋白质诱导的细胞重编程中的能力的直接证据。

最佳化的piPSC方案通常递送以1:1:1:0.1比率的Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc，对于第一个循环对于Oct4使用0.5μg/ml的蛋白质浓度，并且其后在循环中蛋白质浓度减半。通常执行1-5个重编程循环，取决于起始人体细胞。对于HNF，2-3个重编程循环足以生成piPS细胞。在重编程结束时，将培养基转变为含有FGF（10ng/ml）的无饲养者维持培养基共2天。将细胞移出并且转移到新皿内，所述新皿用条件培养基预处理10分钟。用一半条件培养基和一半新的无饲养者维持培养基培养细胞。在第5-6天时，观察到许多边缘清晰的集落（图5A和5B）。整个皿含有来自10⁵个起始细胞的500-1500个piPSC集落。在使用来自小鼠ES细胞的蛋白质提取物的近期研究中，相似的piPS样细胞也在5天内制备，但具有低得多的效率。

高转换效率。这种piPSC技术给出来自人体细胞的piPSC的高转换效率。许多集落通常在第一次或第二次传代中获得。在图6A中，左图显示在皿中的许多集落。集落用红色ALP试剂盒染色；右图显示加框区域的放大视图，展示红色ALP染色的piPSC集落。为了评价转换效率，有意由集落制备单层piPSC，并且使用ALP、SSEA4、Nanog、Oct4、Rex1和Sox2抗体对单层细胞执行免疫染色（图6B）。还对起始HNF执行免疫染色，显示阴性染色（图6B）。为了评估转换效率，在荧光成像后以双盲方式对于阳性和阴性染色的细胞（>400个细胞）评分最少10个随机选择的视野，以使主观解释降到最低。随后通过阳性染色的细胞/总计数细胞的比率计算转换效率。在图6C中，右图显示结果，指示平均重编程效率在80-91%之间。这个结果与先前时程一致，表明这种piPSC技术可以以85±4%转换效率的平均值生成piPSC。在先前时程实验中，还证实对于使用QQ-蛋白质递送的相似细胞重编程方案88±2%转换效率的平均值（表2）。

为了证实这个结果，使用三对多能性标记执行双重免疫染色：SSEA4/Oct4、Tra1-60/Nanog和Tra1-60/Oct4（表面/核标记）。在图6B中，右图展示这些二重染剂的例子，其中Oct4/Nanog为红色，Tra1-60为绿色，并且DAPI为蓝色。仅当核和表面标记都显示阳性染色时，才视为阳性piPSC。再一次，结果证实～80%转换效率（图6B，右图）。为了进一步验证免疫染色是真阳性的，使用六种多能性标记对细胞混合物执行内部对照实验，所述细胞混合物含有30%piPSC和70%起始HNF。数据指示阳性染色细胞的预期稀释度（图7），提供对高转换效率的另外支持。

此类高转换效率表明集落选择在细胞重编程以生成piPS细胞的过程中可能是不需要的，并且克隆扩增在piPSC扩增过程中可能是不需要的。近期报告指示通过使用不同多能性标记的流式细胞术，人ESC在相似无饲养者条件下的长期培养仅含85-94%hESC群体。这个结果类似于此处报道的转换效率，表明piPSC法生成接近纯的piPSC群体。

使用集落挑选和全皿传代执行实验。首先，挑选单个边缘清晰的集落（图8A），并且置于无饲养者条件内。注意到这个单个集落经过几天开始丧失其清晰边缘，并且细胞展开成单层。这也由Rodin等人注意到：当在相似的无饲养者条件下置于小块中时，纯hESC展开成单层。一旦细胞达到汇合，就将它们移出且传代到新皿内。第二天形成许多边缘清晰的集落，并且piPSC通常迁移出集落（绿色箭头），而一些集落维持清晰边缘（白色箭头）（图8B）。这些迁移细胞形成单层细胞，其可以充当用于剩余集落的饲养细胞。使用Oct4和Nanog抗体执行边缘清晰的集落（图8C1和8C3）和单层细胞（图8C2和8C4）的免疫染色。数据明确指示两类细胞都是阳性染色的，表明集落和单层细胞都是piPSC。用全皿传代重复相同程序，并且观察到相同结果。对于全皿传代，数据指示80-90%的细胞对于六种多能性标记具有阳性免疫染色（图6C），表明在这些条件下在两种传代方法之间无差异。

piPSC的表征。使用全皿传代，所生成的人piPSC已在无饲养者培养条件下稳定且同质扩增超过30代共6个月（图9）。它们形成其形态与hESC无法区分的集落。这些piPSC集落占优势地表达ESC标记，包括ALP、Oct4、Nanog、SSEA4、Rex1和Tra1-60（图10）。作为对照，使用起始HNF执行相同免疫染色，显示阴性结果（右，图10）。定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析证实与HNF的基因表达相比较，在第5次传代时在piPSC中显著增强的多能性基因的内源基因表达，包括Oct4、Sox2、Nanog（图11A）。注意到这些主要多能性调节物的基因表达展示在第一次传代时（第6天）的较少增强，但在第5次传代时（第22天）的较大增强，指示在细胞重编程后多能性发展的时间依赖性。为了验证多能性蛋白质表达，执行piPSC的蛋白质印迹，并且与起始HNF细胞相比较。结果指示对于四种多能性标记包括Sox2、Oct4、Nanog和Rex1的piPSC的显著蛋白质表达。Sox2、Oct4和Nanog是三种主要多能性调节物，并且Rex-1是晚期多能性标记。相比之下，起始HNF细胞未展示这四种多能性标记的蛋白质表达。作为对照，看家蛋白质肌动蛋白展示在piPSC和HNF之间相等的蛋白质表达水平（图11C）。Nanog基因的DNA甲基化分析揭示Nanog的启动子区在piPSC中显著脱甲基化，而相同区域在亲本HNF细胞中致密甲基化（图11D）。这个结果提供生成的piPSC展示这个主要多能性调节物的启动子的后生调节的进一步证据，表明在生成的piPSC中合适的后生细胞重编程。在生成的piPSC和亲本HNF之间不存在核型变化（图11B），指示在亲本HNF和子代piPSC之间无重大染色体变化。

体外和体内分化。为了检查所生成的piPSC的发育潜力，执行体外分化和体内畸胎瘤形成。使用悬浮培养法在1-2天内形成拟胚体（EB）。这些EB在体外容易地分化成三个主要胚层，包括外胚层衍生物（表达Nastin和Pax6的细胞）、中胚层衍生物（表达结蛋白和Brachyury的细胞和成熟跳动心肌细胞）和内胚层衍生物（表达AFP的细胞），如通过免疫染色证实的（图12，上）。适当的阴性对照已对于使用亲本HNF的免疫染色执行，显示阴性免疫染色。当EB在导致神经谱系的专门培养基中培养时，这些EB在1-2周将其形态容易地改变成神经细胞的典型形态，包括神经元、星形细胞和少突胶质细胞。免疫细胞化学分析证实对于Tuj1（图12，下A）、GFAP（图12，下B、C）和O1（图12，下D）阳性的这些神经细胞类型的存在。还在早期时间观察到神经干细胞（NSC），如通过用Sox2（图12，下F）和巢蛋白（图2，下G）的阳性染色证实的。

当piPSC移植到裸鼠的肾囊内时，在6周内观察到畸胎瘤形成（图13A和B）。得自全皿传代的第三次传代的piPSC用于移植。在移植前，使用具有六种多能性标记的免疫染色表征这些piPSC。再次，有意制备单层piPSC用于免疫染色（图13C）。结果指示基本上每一个细胞都展示对于所有六种多能性标记的阳性染色。将约200,000个piPSC移植到裸鼠的左肾囊内。在植入后三到四周时，在小鼠的左胁腹区中观察到结样形成。在六周时处死小鼠。组织载玻片的组织学数据指示这些畸胎瘤含有来自所有三个主要胚层的组织，包括神经组织和表皮组织（外胚层）、横纹肌和软骨（中胚层）、和肠样上皮组织（内胚层）（图14），证实生成的piPSC在体内显示出多能性。这个结果进一步提供高转换效率的体内验证，因为用全皿传代扩增所生成的piPSC能够有效生成畸胎瘤。

近来，将Yamanaka的四种重编程因子替换为其为主要多能性调节物的Sox2、Oct4和Nanog，以生成piPS细胞。我们的数据再次指示87±3%的极高转换效率（表3）。这种新重编程蛋白质混合物消除Yamanaka的因子中的致癌蛋白质Klf4和c-Myc，生成的piPS细胞将具有更高的质量且使肿瘤生成降到最低。

讨论

本文公开的piPSC方案应用现有技术QQ-蛋白质递送技术，其解决与目前的iPSC技术相关的技术挑战。首先，QQ-试剂与递送的蛋白质非共价结合，并且伪装它们使其不受细胞内蛋白酶降解，确保递送的蛋白质维持其天然形式和代谢稳定性。最重要的是，QQ-递送的蛋白质具有基于其序列定位信号特异定位于靶向的细胞内区室的能力。这些特点允许递送的蛋白质与内源蛋白质无法区分，细胞机制如同它们是内源对等物一样起作用，证实QQ-蛋白质递送技术的生理学关联性。

使用QQ-蛋白质递送，在1.5小时内将细菌表达的重组重编程蛋白质直接递送到HNF的核内（图3），允许省略低效的体外蛋白质重折叠步骤。细胞内蛋白质折叠机制直接重折叠QQ-递送的重编程蛋白质，使得这种piPSC方案成为快速、简单和廉价的程序。QQ-蛋白质递送能够将四种重编程蛋白质有效递送到基本上每一个HNF的核内，表明由HNF生成piPSC的可能的高转换效率。数据进一步指示细胞重编程可以在QQ-蛋白质递送的24小时开始，并且在48-72小时过程中良好维持，并且在QQ-蛋白质递送后5天内完成（图4）。这显著加速piPSC生成的程序，证实QQ-蛋白质递送技术的允许能力。

为了以高转换效率生成piPSC，必须有效实现人体细胞的发育基因沉默和多能性基因激活。这要求重编程蛋白质有效递送到核内，用于与不同基因的不同启动子和阻遏区相互作用。QQ-蛋白质递送满足这个需求，并且将重编程蛋白质靶向递送到几乎每一个HNF的核内，导致来自起始HNF85±4%的piPSC转换效率。这生成接近纯的piPSC群体，其类似于在相似无饲养者条件下在hESC的长期自我更新过程中的纯hESC群体。此类高转换效率消除在细胞重编程和克隆扩增过程中的集落选择。开发全皿传代，生成均匀的单层piPSC群体，其对于减少长期自我更新过程中的分化是关键的。同质单层piPSC的使用还提供更可控制的条件用于设计分化条件，当它们置于专门谱系诱导培养基中时，具有驱动分化成专门谱系细胞的更同质群体的重大优点。

生成的piPSC是人ESC样细胞，展示显著增强的多能性基因表达，包括三种主要多能性调节物Sox2、Oct4和Nanog（图11A）。这三种主要多能性调节物还展示主要蛋白质表达（图11C）。生成的piPSC展示在体外和体内成为三个主要胚层的分化潜力（图12和14）。事实上，这些piPSC能够有效分化成神经谱系，具有神经元、星形细胞和少突胶质细胞的典型形态（图12，下）。Jaenisch的实验室近期证实通过四种转录因子的重编程是连续随机过程，其中几乎所有小鼠供体细胞在连续生长和转录因子表达后基本上都产生iPSC。然而，这种方法需要8周以生成iPSC，伴随p53/p21途径的抑制或Lin28的过表达。本文公开的piPSC技术证实无需操作任何下游途径的高转换效率。这具有生成的piPSC用于未来安全人临床应用的重大优点。

在使用多种遗传方法中的近期进展已解决目前的iPSC技术的一些挑战。这包括非整合腺病毒、瞬时转染以递送重编程基因、piggyBac转座系统、Cre可切除病毒和基于oriP/EBNA1的附加型表达系统。研究还证实本发明可以替换和/或进一步减少细胞重编程所需的转录因子数目。然而，这些方法仅提供低转换效率，并且还遗传改变细胞，迫使生成的iPSC用于安全人临床应用的重大生物安全问题。目前，仅两篇报道公开具有极低转换效率用于小鼠和人细胞的蛋白质诱导的细胞重编程。本文公开的piPSC技术提供生成人piPSC的有效和快速方法。这种技术直接递送细菌表达的蛋白质用于细胞重编程，使得这种方法简单和廉价。这种piPSC技术的非随机性质使得能够可靠和准确的机械研究细胞重编程。重要的是，这种piPSC技术显著加速以高效率生成患者特异性piPSC的整个过程，允许快速生成一组疾病特异性piPSC作为原材料用于生成用于个别患者的人疾病的替代模型，以获得疾病病理生理学的有价值的了解，以开发新预后生物标记且确保受累细胞类型的连续供应用于药物筛选和开发。

已产生关于使用目前的iPSC方法生成的iPSC质量的重大关注。结果指示在生成的iPSC和人ESC之间的后生变化中的轻微模式差异。不是复原至胚胎样状态，接近iPSC中的染色体尖端和中心的甲基化模式类似iPSC已由其衍生的成体组织中的那些。为了解决这个问题，必须开发有效的细胞重编程方法，其完全复原起始体细胞的后生时钟以回到ESC样状态。此外，大多数目前的iPSC/piPSC方法使用可能增加突变率的癌基因。近期报道的数据证实预先存在的以及在重编程过程中和重编程后发生的新突变促成在目前的hiPSC系中发现的高突变负荷。在细胞重编程过程中的选择、集落挑选和后续克隆扩增可能是促成因素。事实上，如果重编程效率增强至这样的水平，使得不需要集落挑选和克隆扩增，则所得到的hiPSC可以潜在不含突变。本文公开的piPSC技术提供了此类高重编程效率。此外，可能需要新重编程蛋白质例如DNA脱甲基酶或甲基胞嘧啶双加氧酶，以完全复原起始体细胞的后生时钟，本文公开的这种piPSC技术可以用于以高流通量方式筛选这些新重编程因子。最后，因为避免在重编程和集落挑选/克隆扩增过程中繁重的集落选择，其可以生成不含突变的人piPSC，所以这提供显著增强生成的piPSC的质量用于未来安全人临床应用的细胞重编程技术（图15-17）。

本申请自始至终，作者和年份和通过编号的专利参考多种出版物包括美国专利。关于出版物的完全引用在下文列出。这些出版物和专利的公开内容整体通过引用并入本申请，以便更充分地描述本发明所属领域的状态。

本发明已以举例说明性方式进行描述，并且应当理解本文已使用的技术预期具有描述性而不是限制性言语的性质。

显而易见的是，根据上文教导，本发明的许多修饰和变化是可能的。因此，应当理解在本发明的范围内，本发明可以以除具体描述外的其他方式实践。

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Claims (8)

1.一种通过下述生成蛋白质诱导的多能干(piPS)细胞的方法：

使用QQ-蛋白质转导技术将细菌表达的重编程蛋白质递送到起始体细胞的核内；

重复几次细胞重编程循环用于产生重编程蛋白质诱导的多能干细胞；

将所述重编程的细胞移动到无饲养者培养基内用于扩增；和

扩增且传代全皿中的所述重编程的细胞用于生成同质piPS细胞，导致从起始体细胞到蛋白质诱导的多能干细胞的80％至91％的转换效率。

2.根据权利要求1的方法，其进一步包括使用细菌表达系统产生重编程蛋白质。

3.根据权利要求2的方法，其进一步包括使用QQ-试剂修饰所述重编程蛋白质。

4.根据权利要求3的方法，其进一步包括在所述修饰步骤前，用小分子荧光探针体外标记所述重编程蛋白质的步骤。

5.根据权利要求4的方法，其进一步包括监控QQ-蛋白质递送进入所述起始体细胞的核内的效率。

6.根据权利要求1的方法，其提供一般的蛋白质诱导的细胞重编程方法，用于经由转分化由健康和患病动物和人体细胞生成piPS细胞、特定成体干细胞、特定祖细胞和不同体细胞类型，当生成特定成体干细胞、特定祖细胞和不同体细胞类型时，必须使用不同蛋白质混合物。

7.根据权利要求1的方法，用于在允许直接使用所述细菌表达的细胞重编程蛋白质用于动物和人体细胞的细胞重编程中使用，以生成piPS细胞。

8.根据权利要求1的方法，其中将细菌表达的重编程蛋白质递送到起始体细胞的核内包括递送：1)四种重编程蛋白质Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合；2)三种重编程蛋白质Oct4、Sox2和Klf4的组合，或三种重编程蛋白质Sox2、Oct4和Nanog的组合；3)两种重编程蛋白质Oct4和Sox2的组合，或两种重编程蛋白质Oct4和Nanog的组合；或4)仅一种重编程蛋白质Oct4或Nanog。