CN103747798A - 包含聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有一种或多种目的抗原、一种或多种载体蛋白质，以及一种或多种聚阳离子的免疫原性组合物，其中目的抗原用交联的载体蛋白质基质和一种或多种聚阳离子包载，涉及制备此类疫苗的方法，以及疫苗施用的方法。

Description

包含聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物

相关申请的交互引用

本申请要求2011年5月18日提交的美国临时申请号61/487,663的优先权，所述申请的内容在此处以其整体引入作为参考。

发明领域

本发明涉及免疫原性组合物、制备疫苗的方法，以及疫苗施用的方法。特别地，本发明涉及以在交联的载体蛋白质基质中包载的目的蛋白质为特征的蛋白质基质疫苗，其中将聚-L-赖氨酸或其他聚阳离子用于包载抗原的蛋白质基质的形成。

发明背景

针对细菌感染的疫苗接种是重要的医学追求，其代表了几乎推荐给每一个体的预防性医学干预。抗击细菌感染或细菌感染的发病机制的疫苗的设计通常靶向细菌蛋白质，例如由细菌产生的毒素。例如，针对炭疽、白喉和破伤风的疫苗就是这样。另一疫苗方法靶向细菌的外层荚膜，然而包含细菌病原体的荚膜层的许多抗原很少刺激长期免疫应答或者不会刺激长期免疫应答，这复杂化了其在产生有效的疫苗中的用途。荚膜组成了许多细菌的外表面，并通常包含有机化合物如碳水化合物、氨基酸或醇的聚合物。荚膜在化学上是相当不同的。对于基于多糖的荚膜，糖单元可以以多种分子构型连接在一起，并且可以用磷酸、氮、硫酸和其他化学修饰进一步替换。通过抑制微生物被有效吞噬以及被宿主巨噬细胞和多形核白细胞杀死，荚膜可以是毒力因子。

通过介导微生物表面的补体固定（其可以导致细菌裂解或调理作用、被吞噬宿主免疫细胞摄取和杀死），针对荚膜的抗体提供了针对有荚膜生物的有效防御。针对微生物荚膜的最有效抗体是IgG抗体。通常将荚膜抗原分类为非T细胞独立的抗原，因为它们引起不涉及T辅助细胞的免疫应答，并因此不会引起长效免疫记忆应答。然而，蛋白质与荚膜抗原的共价偶联使荚膜抗原变得“T细胞依赖性”，并然后该T细胞依赖性抗原引起辅助型T细胞介导的（T_h依赖性）基于IgG的记忆B细胞或记忆应答。

已经研究了用于使疫苗抗原变得更有免疫原性和理想地更具T细胞依赖性的多种方法。大多数细菌表面多糖是自身具有免疫原性的，并能引起将识别微生物荚膜中天然存在的抗原的免疫应答。然而，当将荚膜多糖单独地用作为疫苗时，它们通常不会促进长期免疫性，其在免疫2岁以下的儿童中也不是非常有效。已经显示，多糖抗原与载体蛋白质的共价连接可以极大地增加多糖的免疫原性，并促进期望的T细胞依赖性免疫应答（或者免疫记忆），所述T细胞依赖性免疫应答（或者免疫记忆）导致宿主针对随后由于携带抗原的微生物感染的保护。例如，未缀合的肺炎球菌疫苗，如Merck的

对个体中侵袭性肺炎球菌疾病是有效的，然而其在引起免疫记忆和可以引起长期免疫性的期望的保护免疫性以及避免重复免疫的必要性方面是无效的（例如，在婴儿中）。缀合物肺炎球菌疫苗如Pfizer的

（Pfizer Inc.，美国）甚至在2月龄的婴儿中显示出高度的免疫原性、诱导T细胞依赖性免疫性，并显示出高度的有效性。

然而，尽管缀合物疫苗免疫性很有希望，但它们生产极其困难且复杂（并且昂贵），这极大地阻止了其在世界范围内需要疫苗接种的地方的配给。例如，就而言，用于提供用于缀合的七种多糖抗原的每一肺炎球菌菌株在生物反应器中培养；收获细胞；提取、纯化多糖，水解至合适的大小；然后将各个抗原与蛋白质载体缀合；再纯化缀合物、与以相似方式制备的另外6种其他多肽-蛋白质复合物（缀合物）混合；并将多重缀合物的混合物最终用明矾佐剂化。据估计，在七价疫苗的生产中，存在200个以上的GMP步骤。

最近，建议将蛋白质基质疫苗作为缀合物疫苗的备选。参见，2008年4月24日公布的美国公开申请号US-2008-0095803（Mekalanos，J.）；2008年2月21日公布的国际专利申请公开号WO2008/021076（Mekalanos，J.）；和2011年3月17日公布的国际专利申请公开号WO2011/031893（Killeen，K.，等人），所述专利申请在此处引入作为参考。不同于共价缀合目的抗原与载体，蛋白质基质疫苗将抗原包载在载体蛋白质基质中，在期望的抗原存在的情况下通过交联载体蛋白质制备所述载体蛋白基质。避免了抗原与载体蛋白质的显著共价连接；相反，在基质形成（交联反应）期间，通过蛋白质载体包载，抗原保持与基质结合。此种蛋白质基质疫苗已经显示出比使用仅抗原制备的疫苗引起更强的免疫原性；并且蛋白质基质疫苗还可以引起用缀合疫苗见到的免疫应答类型（即，诱导T细胞依赖性免疫）。蛋白质基质疫苗的合成不涉及复杂的缀合反应，并且通常需要更少的工艺步骤，这又使得生产蛋白质基质疫苗比生产缀合物疫苗更便宜。

尽管蛋白质基质疫苗提供了几种优点，但通过蛋白质基质疫苗引起的抗原特异性抗体的滴度通常比通过相应的缀合物疫苗引起的滴度低。WO2011/031893教导了通过大小排阻层析分离蛋白质基质疫苗，并且选择用于免疫的含高分子量蛋白质基质颗粒的级分可以导致与通过缀合的多糖疫苗引起的那些滴度相似的滴度。然而，本领域持续存在的技术问题是提供用于产生增加的免疫原性的蛋白质基质疫苗的方法，以开发这项新兴技术的科学前景和生产和成本优势。对于具有增强的免疫原性或效力的改进的蛋白质基质疫苗存在持续的需求。

发明概述

使用根据本发明制备的疫苗实现了蛋白质基质疫苗的有效性和产率的惊人进步，其中将聚-L-赖氨酸（PLL）或另一种聚阳离子用于多糖或其他抗原的包载蛋白质基质的形成。因此，蛋白质基质疫苗的质量和产率不通过抗原的修饰改进，而通过关注用于包载抗原的基质的性质和组成来改进。

本文描述了新的蛋白质基质疫苗，以及通过使用含伯胺的聚阳离子改进使用基质的多糖包载的方法。

本发明的一个实施方案是免疫原性组合物，其包含(1)一种或多种目的抗原，(2)一种或多种载体蛋白质，和(3)一种或多种聚阳离子，其中所述载体蛋白质和任选地所述聚阳离子是交联的，以形成蛋白质基质，并且所述目的抗原是被所述蛋白质基质包载的。通过混合抗原、载体蛋白质和聚阳离子组分，起始交联反应以引起载体蛋白质和/或聚阳离子的交联，可以容易地制备此类组合物。与仅抗原比较，与抗原和载体的混合物比较，以及与没有掺入聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物比较，根据本发明掺入了聚阳离子如α-PLL的蛋白质基质疫苗组合物具有增加的免疫原性。

在优选的实施方案中，免疫原性组合物的一种或多种聚阳离子选自：聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸、聚鸟氨酸、亚精胺、精胺、脱乙酰壳多糖[2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcN）和2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcNAc）的β-(1-4)连接的共聚物]、分支的聚氮丙啶（PEI）、聚胺N7（CAS29320-38-5）和乙二氨基甲基聚苯乙烯（Ethylenediaminomethylpolystyrene）（CAS177987-93-8）。在期望的实施方案中，所述聚阳离子是聚-L-赖氨酸（PLL）。

在其他期望的实施方案中，所述聚-L-赖氨酸是α聚-L-赖氨酸（α-PLL；αPLL）或ε聚-L-赖氨酸（ε-PLL；εPLL）。

在优选的实施方案中，所述组合物由具有直径大于50nm的平均颗粒大小的蛋白质基质颗粒组成。可以通过混合抗原、载体蛋白质和聚阳离子组分，起始交联反应，以引起载体蛋白质和/或聚阳离子的交联，然后处理反应产物，以去除低分子量种类，来容易地制备此类组合物。

本发明的一个实施方案是含有目的抗原和载体蛋白质/聚阳离子基质的疫苗组合物，其中用载体蛋白质/聚阳离子包载抗原，以形成复合物。在本发明的期望实施方案中，抗原/载体蛋白质/聚阳离子基质复合物具有直径大于50nm的平均颗粒大小。在本发明更多期望的实施方案中，复合物具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于500nm、大于1000nm、大于2000nm或者甚至更大（例如，至分离蛋白质基质颗粒的方法的极限）的平均颗粒大小直径。又在本发明更多期望的实施方案中，疫苗组合物的抗原/载体蛋白质/聚阳离子基质复合物将包括直径大于50nm的一定范围的颗粒大小，例如直径50–2000nm或者在该范围内的选择，例如100–200nm、200–400nm、250–500nm、120–1000nm、200–2000nm，以及其他此类颗粒大小范围。又在本发明其他期望的实施方案中，组合物包括具有直径50–150nm的颗粒大小的复合物。

在本发明其他期望的实施方案中，抗原与载体蛋白质的摩尔比为1比10至10比1之间。

在优选的实施方案中，按重量计聚阳离子在反应混合物中的百分比为0.005至0.10%或者0.05mg/ml–0.5mg/ml。

在其他期望的实施方案中，免疫原性组合物还包括两种或两种以上的目的抗原，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或23种以上的目的抗原。

在本发明期望的实施方案中，本发明的蛋白质基质疫苗组合物，当施用给哺乳动物时，在哺乳动物中引起了T细胞依赖性免疫应答（即，在接种疫苗的宿主中产生了免疫记忆）。

在本发明期望的实施方案中，所述目的抗原是多糖。

在本发明其他期望的实施方案中，多糖选自肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）多糖、土拉热弗朗西丝氏菌（Francisella tularensis）多糖、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）多糖、流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）多糖、伤寒沙门菌（Salmonella Typhi）多糖、弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）多糖、沙门氏菌属（Salmonella）物种的多糖、志贺氏菌属（Shigella）多糖或脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）多糖。革兰氏阴性细菌的O-抗原（LPS（脂多糖）的一部分（其是独特的并且通常是用于细菌感染的保护性抗原）也是适合用于本发明的目的抗原。

在本发明其他期望的实施方案中，所述肺炎链球菌多糖选自荚膜3型、4型、6B型、7A型、7B型、7C型、7F型、9A型、9L型、9N型、9V型、12A型、12B型、12F型、14型、15A型、15B型、15C型、15F型、17型、18B型、18C型、19F型、23F型、25A型、25F型、33F型、35型、37型、38型、44型和46型的一种或多种多糖。

在优选的实施方案中，一种或多种载体蛋白质选自白喉类毒素，例如非毒性白喉毒素蛋白质片段CRM197、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）Hcp1蛋白质、大肠杆菌热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白质、李斯特菌溶胞素O、来自全细菌细胞的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原的显性失活抑制剂（DNI）突变体或大肠杆菌β半乳糖苷酶。

在本发明期望的实施方案中，免疫原性组合物包含在载体蛋白质/聚阳离子基质中包载的目的抗原，并且还包括可药用赋形剂。

在优选的实施方案中，本发明涉及制备疫苗组合物的另一种方法。该方法包括(i)混合一种或多种目的抗原、一种或多种载体蛋白质，以及一种或多种聚阳离子和(ii)加入能在载体蛋白质分子之间、同一载体蛋白质分子的不同位点之间和/或载体蛋白质分子和聚阳离子之间形成交联的交联剂，以及(iii)起始交联反应。在其他实施方案中，制备根据本发明的疫苗的方法还包括另外的步骤(iv)任选地从交联反应产物中选择具有直径大于50nm的颗粒大小的复合物。在某些实例中，其中交联剂的反应基团和载体蛋白质的反应位点将在接触的情况下反应，混合和起始步骤(ii)和(iii)将同时发生或者可以认为是一步。此外，可以有利地通过在反应起始步骤之后包括减弱交联反应的步骤，例如通过加入合适的猝灭剂或阻断剂，来淬灭交联反应。

在本发明期望的实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中引起针对目的抗原的免疫应答或者针对感染物给受试者免疫接种的方法，该方法包括给哺乳动物或受试者施用如本文中所述的免疫原性组合物。在优选的实施方案中，哺乳动物是人类。

在本发明其他期望的实施方案中，本发明涉及包含本文中所述的两种或两种以上免疫原性组合物的疫苗组合物。

本发明的其他特征和优点从以下详细描述、附图和权利要求中是显而易见的。

附图简述

图1是显示通过大小排阻层析，用和不用聚-L-赖氨酸（PLL）分离Vi-CRM197PCMV反应物的图。在500mL（90cmx2.6cm）SephacrylS-1000柱上分离仅Vi多糖、含PLL的Vi-CRM197PCMV反应物和不含PLL的Vi-CRM197PCMV。使用Stains-all测定法测定级分中Vi多糖的量。

图2是显示通过大小排阻层析分离Vi-CRM197-αPLL（150-300kDa）PCMV的图。在150mL（30cmx2.6cm）Sephacryl S-100柱上分离PCMV反应物。分别使用Stains-all测定法和microBCA测定法测定级分中Vi多糖和蛋白质的量。阴影框表示合并的并用于在临床前试验中免疫小鼠的级分。

图3是显示通过大小排阻层析分离Vi-CRM197-αPLL（150-300kDa）PCMV的图。在500mL（90cmx2.6cm）Sephacryl S-1000柱上分离PCMV反应物。分别使用Stains-all测定法和microBCA测定法测定级分中Vi多糖和蛋白质的量。阴影框表示合并的并用于在临床前试验中免疫小鼠的级分。

图4显示通过大小排阻层析分离肺炎球菌多糖18C（PPS18C）和PPS18C-CRM-αPLL（15-30kDa）-PCMV的图。在500mL（90cmx2.6cm）Sephacryl S-1000柱上分离PPS18C和PPS18C-CRM-PLL-PCMV。使用蒽酮测定法测定级分中多糖的量，并使用microBCA蛋白质测定法测定蛋白质的量。

图5是显示随着αPLL量的增加，包载的Vi的量增加的图。将4mg/mLVi加入到含0.01%αPLL（150-300kDa）、0.02%αPLL（150-300kDa）或0.04%αPLL（15-30kDa）的PCMV反应物中。加入戊二醛和CRM197后，在500mL（90cmx2.6cm）Sephacryl S-1000大小排阻柱上分离反应物。分别使用Stains-all测定法和microBCA测定法分析级分的多糖和蛋白质。

图6是显示通过大小排阻层析分离分批的三价PPS(PPS4,PPS18C,PPS23F)-CRM197-εPLL PCMV的图。将三种肺炎球菌多糖（1.3mg/mL每一种PPS4、PPS18C和PPS23F）加入到单一PCMV反应物中。在500mL（90cmx2.6cm）Sephacryl S-1000柱上分离反应物。分别使用蒽酮测定法和microBCA分析柱级分的总多糖和蛋白质。阴影框表示合并用于在临床前试验中免疫小鼠的级分。

图7是通过大小排阻层析分离分批的13价PPS-CRM197-αPLL（150-300kDa）PCMV的图。将

缀合物疫苗中存在的13种肺炎球菌多糖加入到单一PCMV反应中（0.3mg/mL的每种多糖）。在500mL（90cmx2.6cm）Sephacryl S-1000柱上分离反应物。分别使用蒽酮测定法和microBCA分析柱级分的总多糖和蛋白质。阴影框表示合并用于在临床前试验中免疫小鼠的级分。

图8是显示通过大小排阻层析分离分批的三价PPS(PPS4、PPS18C、PPS23F)-CRM197-αPLL（150-300kDa）PCMV的图。将三种肺炎球菌多糖（1.3mg/mL每种PPS4、PPS18C和PPS23F）加入到单一PCMV反应中。在500mL（90cmx2.6cm）Sephacryl S-1000柱上分离反应物。分别使用蒽酮测定法和microBCA分析柱级分的总多糖和蛋白质。阴影框表示合并用于在临床前试验中免疫小鼠的级分。

图9显示了通过大小排阻层析分离分批的23价PPS-CRM197-αPLL（150-300kDa）PCMV的图。将仅多糖疫苗

中存在的23种多糖加入到单一PCMV反应中（0.17mg/mL的每种多糖）。在500mL（90cmx2.6cm）Sephacryl S-1000柱上分离反应物。分别使用蒽酮测定法和microBCA分析柱级分的总多糖和蛋白质。阴影框表示合并用于在临床前试验中免疫小鼠的级分。

发明详述

蛋白质基质疫苗和特别地蛋白质荚膜基质疫苗（PCMV）描述于2008年4月24日公布的美国专利申请US-2008-0095803（Mekalanos，J.）；2008年2月21日公布的国际专利申请公开号WO2008/021076（Mekalanos，J.）；和2011年3月17日公布的国际专利申请公开号WO2011/031893（Killeen，K.，等人）中，所述专利申请在此处以其整体全部引入作为参考。这些出版物教导了蛋白质基质疫苗具有典型的PS-蛋白质缀合物疫苗的有效免疫特性，但期望地与缀合物疫苗不同，因为没有偶联目的抗原与载体蛋白质的显著共价结合发生。因此，蛋白质基质疫苗（载体蛋白质基质/抗原复合物）不同于常规缀合物疫苗，其中抗原与载体共价结合。在蛋白质基质疫苗，在载体蛋白质基质内包载目的抗原，如多糖、荚膜有机聚合物或其他抗原。

当病原体的荚膜生物聚合物或多糖包载在交联的蛋白质基质中时，将此类疫苗称为荚膜基质疫苗（PCMV）。如WO2008/021076和US2008-0095803中所述，产生包括基于模式T－独立的荚膜抗原、聚γD-谷氨酸（PGA），以及海藻酸（藻酸盐）和葡聚糖，以及示例性载体蛋白质、显性失活抑制剂突变体（DNI）的PCMV。DNI是炭疽芽孢杆菌的保护性抗原（PA）的突变形式，并通过Benson，等人，Biochemistry，37：3941-3948（1998）的方法产生自大肠杆菌。其他PCMV实施方案，以及大小分级分离PCMV颗粒的益处描述于WO2011/031893中。

本发明涉及通过改进蛋白质基质内抗原的包载，在增强蛋白质基质疫苗组合物的免疫原性和产率方面进行的发现和观察。

为了使本发明更容易理解，如下定义所使用的以下简称和术语。

在本文中，描述为“包含”一种或多种所称的元素或步骤的组合物或方法是开放式的，意为所称的元素或步骤是基本的，但在组合物或方法的范围内可以加入其它元素或步骤。为了简练，还可以理解，描述为“包含”（或其“包含”）一种或多种所称的元素或步骤的任意组合物或方法还描述了“基本上组成为”（或者其“基本上由……组成”）同一所称的元素或步骤的相应的更有限的组合物或方法，意为组合物或方法包括所称的基本元素或步骤，并且还可以包括其他不会实质上影响组合物或方法的基本及新特征的其他元素或方法。还可以理解，描述为“包含”或“基本上组成为”一种或多种所称的元素或步骤的任意组合物或方法还描述了“组成为”（或者“由…组成”）所称的元素或步骤的相应的更有限的以及封闭的组合物或步骤，以排除任何其他未指出的元素或步骤。在本文中所公开的任意组合物或方法中，任意所称的基本元素或步骤的已知或未公开等同物都可以替换该元素或步骤。还可以理解，元素或步骤“选自”指其后列表中的一种或多种元素或步骤，包括任意两种或两种以上列举的元素或步骤的组合。

如本文中所用，术语“施用”与疫苗组合物关联，意为以足以在受试者中诱导免疫应答的剂量给受试者如人类受试者提供疫苗组合物，其中免疫应答导致特异性结合疫苗组合物中含有的抗原（即，在治疗性疫苗中，所述抗原对应于病原体上的抗原性标志物）的抗体的产生。根据待施用的疫苗组合物的剂型以及性质和活性，期望的施用包括肌肉内注射、皮内注射、静脉内注射、腹膜内注射、皮下或经皮注射、吸入或摄入。施用可以包括疫苗的单次施用或者以多次剂量施用疫苗。期望地，设计第二次（“增强”)施用，以增强受试者中抗体的产生，以预防受感染物的感染。疫苗剂量的频率和量取决于疫苗的特异性活性，并且可以容易地通过常规实验测定。

术语“交联”指两个分子、大分子或分子的组合，例如载体蛋白质分子之间或者同一分子的两个位点，例如同一蛋白质的两个氨基酸残基之间或者载体蛋白质分子与聚阳离子分子之间直接地（当使用“零长度”连接体时（产生直接结合））或者通过使用双功能交联剂分子（其形成分子桥或在两个反应位点之间连接）形成共价键。双功能交联剂表现出两个官能团，每一个官能团都能与两个分离的分子中的一个或者在同一分子中的两个分离的基团之间形成共价键（即，在分子如载体蛋白质内形成“环”或“折叠”）。示例性连接剂包括双功能交联剂，其能交联两个载体蛋白质分子和/或两个聚阳离子分子和/或载体蛋白质分子和聚阳离子分子。

如本文中所用，术语“抗原”指抗体或抗体片段特异性结合的任意分子或分子的组合。

如本文中所用，术语“双功能交联剂”或“双功能连接剂”意为具有两个官能团的化合物，每一官能团都独立地能与两个分离的分子、原子或期望待连接在一起的分子集合上的反应基形成共价键。示例性双功能连接剂例如由G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques（Academic Press，1996）和Dick and Beurret，“Glycoconjugates of Bacterial CarbohydrateAntigens，”在Conjugate Vaccines（Cruse和Lewis编辑），Contrib.Microbiol.Immunol.Basel,Karger，1989年，第10卷，第48-114页中描述。期望的双功能连接剂是戊二醛、双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸或二甲基己二酸。

如本文中所用，术语“连接剂”或“交联剂”指能形成连接两个或两个以上分子或者同一分子的两个或两个以上位点的共价化学键或桥接的化合物。期望的连接剂包括例如，戊二醛或式OHC-R-CHO的其他二醛，其中R是1至12个碳原子的线性或分支二价烯烃基部分、1至12个原子的线性或分支二价杂烷基部分、2至12个碳原子的线性或分支二价亚链烯基部分、2至12个碳原子的线性或分支二价亚炔基部分、5至10个碳原子的二价芳族基、3至10个原子的环状系统、–(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂–（其中q为1至4）或者连接两个醛基的直接化学键。连接可以是直接的，不使用连接（桥接）分子。例如，使用碳二亚胺化学物或者酶促地使用催化游离氨基与例如Gln残基的氨甲酰基之间交联的转谷氨酰胺酶（tranglutamidase），可以将例如载体蛋白质中Asp或Glu残基的侧链上的羧基与例如Lys残基的侧链上的游离氨基直接连接。

在引起抗体产生的上下文中，术语“增强”指在第二次暴露于抗原期间发生的记忆B细胞的活化。其还被称为“增强反应”，并且指永久性“二次”记忆免疫应答，导致产生抗体的长期能力。

在疫苗组合物的上下文中，术语“载体蛋白质”指在疫苗组合物中使用的蛋白质，其引起针对其自身和/或与该载体蛋白质和聚阳离子结合的或复合的抗原的免疫应答。在本发明的蛋白质基质疫苗组合物中，在载体蛋白质的基质内包载的抗原相互交联和/或与聚阳离子交联，优选地不存在抗原与基质的显著共价键。在缀合物疫苗组合物中，抗原与载体蛋白质反应，以使抗原和载体蛋白质通过设计相互共价连接。期望地，载体蛋白质含有T辅助细胞识别的表位。“载体蛋白质”的定义还包括多抗原肽（MAP），其是具有多个反应位点的分支肽。期望地，MAP包括赖氨酸（Lys）残基。示例性期望的载体蛋白质包括毒素和类毒素（化学的或遗传的），其可以是突变的，例如以降低致反应力。合适的载体蛋白质包括，例如白喉毒素或其无毒的突变体，例如白喉类毒素、破伤风毒素或其无毒的突变体，例如破伤风类毒素、铜绿假单胞菌外毒素A或其无毒的突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶胞素O（LLO和相关分子）、脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白质、铜绿假单胞菌Hcp1蛋白质、大肠杆菌热肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白质、来自全细菌细胞的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原的显性失活抑制剂（DNI）突变体或大肠杆菌β半乳糖苷酶或者可以交联以形成能包载目的抗原的基质的任意其他蛋白质。

如本文中所用，术语“包载”提及抗原时意为抗原与载体蛋白质和聚阳离子，特别地交联的载体蛋白质的结合或复合，任选地还与聚阳离子分子交联，以形成与抗原形成结合或复合的基质，以使抗原在生理条件下保留在具有载体蛋白质和聚阳离子的复合物中。期望地，在抗原与载体蛋白质/聚阳离子之间不存在显著的共价结合的情况下，在具有载体蛋白质和聚阳离子的复合物中包载抗原。如本文中所用，“不存在显著的共价结合”指不超过50%的抗原与载体蛋白质共价结合。期望地，在蛋白质基质疫苗组合物中，不超过40%、不超过30%、不超过20%、不超过10%或者期望地，不超过5%的抗原与载体蛋白质或聚阳离子共价结合。从以下公开中应当理解，蛋白质基质疫苗设计和产生的目的是避免抗原与载体的费力化学连接，所述化学连接是缀合物疫苗的主要特征。在蛋白质基质疫苗中，抗原在交联基质中通过包载，而不是通过与载体缀合来与载体结合，并且事实上，在一定程度上避免了抗原与载体蛋白质或载体蛋白质/聚阳离子基质的可能交联。在用于制备蛋白质基质疫苗的方法中，抗原包含在意图变得交联的基质组分的混合物中，但通过设计，抗原不参与交联反应或者至少不参与显著量的交联。然而，在抗原存在的情况下实施蛋白质基质形成，导致抗原在不与载体蛋白质基质显著交联的情况下包载在载体蛋白质基质（在本发明的一个实施方案中，或者载体蛋白质/聚阳离子基质）中。

“感染”意为受试者被微生物例如细菌、真菌、寄生虫或病毒侵染。感染可以包括例如，在受试者的身体中或者身体上正常存在的微生物的过度繁殖或者在受试者中或者受试者上正常存在的微生物的繁殖。当受试者的身体中或者身体上存在不期望的（例如病原性的）过量微生物群体时或者当微生物群体的存在在受试者的组织中损伤了细胞或者引起了病理学症状时，受试者遭受了微生物感染。

“感染物”意为引起感染的微生物。

术语“免疫原性”指在受试者中诱导免疫应答的化合物。期望地，免疫应答是涉及IgG抗体产生的T细胞依赖性免疫应答。

术语“微生物荚膜聚合物”指在微生物的荚膜包被中或荚膜包被上存在的聚合物。期望地，微生物荚膜聚合物是有机聚合物如多糖、磷酸多糖、具有N-乙酰基取代的氨基糖的多糖、含磺基化糖、经另一硫酸修饰的糖或者经磷酸修饰的糖的多糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁酸质或脂多糖的O侧链。

当为“聚合物”的一部分时，“单体”指能与类似的单体形成两个或两个以上键合的分子结构，其通常产生重复的单体子结构的链或者一系列分支的连接的链。

“有机聚合物”指由共价连接的单体组成的聚合物，每一单体由碳、氧、氢或氮原子或者磷酸酯或硫酸酯部分组成。期望地，有机聚合物是多糖、磷酸多糖、具有N-乙酰基取代的氨基糖的多糖、或者经硫酸酯修饰的糖、糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁酸质或脂多糖的O侧链。

“多元醇”意为碳水化合物的氢化形式，其中羰基已经还原成伯羟基或仲羟基。示例性多元醇为聚环氧烷（PAO）如聚（亚烷基）二醇（PAG），包括聚甲二醇、聚乙二醇（PEG）、甲氧基聚乙二醇（MPEG）和聚丙二醇；聚乙烯醇（PVA）；聚乙烯共马来酸酐；聚苯乙烯共马来酸酐；葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖；纤维素，包括甲基纤维素、羧甲纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟基丙基纤维素；壳聚糖的水解产物；淀粉如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉；糖原；琼脂糖及其衍生物；瓜尔豆胶；支链淀粉；胰岛素；黄原胶；角叉菜胶；果胶；海藻酸水解产物；山梨醇；葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、古罗糖、木糖、苏糖、山梨糖、果糖、甘油、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖、直链淀粉、支链淀粉的醇；或者单丙二醇（MPG）。

“聚氨基酸”意为通过肽键连接的至少两个氨基酸。期望地，聚氨基酸是含有重复的氨基酸序列或者相同氨基酸（即均聚物）的链的肽。

“聚阳离子”或“聚阳离子的”指携带多个正电荷的任意大分子离子。期望地，聚阳离子具有游离的胺基，例如聚氨基酸聚-L-赖氨酸。其他含有游离胺基的示例性期望聚阳离子包括天然聚合物，如脱乙酰壳多糖（2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcN）和2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcNAc）的β-(1-4)连接的共聚物），其在GlcN残基上含有可以交联并作为阳离子的游离胺基，以及市售的含游离胺基的合成聚合物，如分支的聚氮丙啶（PEI）、聚胺N7（CAS29320-38-5）和乙二氨基甲基聚苯乙烯（Ethylenediaminomethyl polystyrene）（CAS177987-93-8）。

“聚-L-赖氨酸”和“PLL”意为α-聚-L-赖氨酸（α-聚-L-赖氨酸；αPLL）、ε-聚-L-赖氨酸（ε-聚-L-赖氨酸；εPLL；聚[亚氨基[(2S)-2-氨基-1-氧代-1,6-亚己基]]）或其组合和共聚物。聚-L-赖氨酸的赖氨酸残基在羰基和α（α-PLL）或ε（ε-PLL）胺基之间通过肽键连接。期望的聚-L-赖氨酸是α-聚-L-赖氨酸。α-聚-L-赖氨酸是化学合成的，并可以以多种分子量获得，如0.5至300KDa。ε-聚-L-赖氨酸是通过细菌发酵产生的基本氨基酸L-赖氨酸的小型天然均聚物，例如ε-聚-L-赖氨酸可以分离自小白链霉菌（Streptomyces albulus），并且具有大约4000Da的平均分子量。

在本发明的上下文中，“蛋白质基质”是通过交联蛋白质分子形成的多体结构，其在同一蛋白质分子的两个位点之间或者在不同蛋白质分子的两个位点之间形成连接或者直接结合。在本发明的上下文中，“载体蛋白质基质”指通过与载体蛋白质进行交联反应形成的蛋白质基质，其中交联可以在同一载体蛋白质分子中的反应位点之间（导致分子内环或折叠结构）或者在不同载体蛋白质分子上的反应位点之间（导致载体蛋白质聚合物）形成。如本文中所用，术语“载体蛋白质/聚阳离子基质”指通过在载体蛋白质和聚阳离子的混合物中实施交联反应形成的蛋白质基质，其中交联至少在载体蛋白质分子内或之间发生（导致可以在基质中包载聚阳离子的载体蛋白质基质）或者其中交联不仅在载体蛋白质分子内或之间，还在聚阳离子分子内或之间发生（导致包含交联的载体蛋白质和/或聚阳离子单体的基质）。可以控制形成蛋白质基质中交联的程度，包括通过慎重选择交联反应物和考虑单体组分上可用于交联的反应位点、控制用于交联反应的交联剂的量、控制反应时间，以及使用试剂以阻断反应位点或者淬灭交联反应。此类参数的控制将影响可被包载的抗原的量、包载的抗原从蛋白质基质/抗原复合物中解离的速率，以及形成的蛋白质基质颗粒的大小。全部这些性质都会影响本发明蛋白质基质疫苗组合物的免疫原性。

术语“还原席夫碱”指将偶氮甲碱或式R₁R₂C=N-R₃（其中R₁、R₂和R₃通常是含有碳原子的化学子结构）的化合物暴露于还原剂，所述还原剂用氢原子饱和席夫碱的双键。化学还原的方法是本领域技术人员已知的。

如本文中所用，术语“特异性结合”提及抗体或其片段时，意为相对于等量的任意其他抗原，抗体或抗体片段对特定抗原，例如蛋白质或其片段的增加的亲和力。如使用标准方法如酶联免疫吸附测定法（ELISA）所测定，抗体或抗体片段期望地对其抗原具有比对等量的任意其他抗原（包括相关抗原）高至少2倍、5倍、10倍、30倍或100倍的亲和力。

“受试者”意为可以受微生物感染的动物。期望地，受试者是哺乳动物如人类、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、奶牛、绵羊、山羊或马。人类受试者可以是成年人类、儿童、婴儿、小孩或未到青春期的儿童。

“T细胞独立性抗原”指在没有辅助性T淋巴细胞协同的情况下，导致抗体产生的抗原。T细胞独立性抗原可以在没有T淋巴细胞协同的情况下直接刺激B淋巴细胞。示例性期望的T细胞独立性抗原包括荚膜抗原聚γ-D-谷氨酸（PGA）、海藻酸（藻酸盐）、葡聚糖，多糖（PS）、聚氨基酸、多元醇和核酸。

如本文中所用，术语“疫苗”、“疫苗组合物”和“免疫原性组合物”指含目的抗原的任意组合物，当施用给脊椎动物受试者时，其在受试者中引起针对所述抗原的免疫应答。尽管本发明的目的是提供能引起保护性免疫应答（即，能保护接种疫苗的受试者免于天然携带疫苗中所包含的抗原的病原体）的疫苗，但保护性免疫，例如单次施用后，并不是如本文中所用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”的固有性质。

本发明蛋白质基质疫苗组合物并不需要旨在引起免疫应答的抗原与用于形成基质的载体蛋白质和/或聚阳离子之间的共价连接。与缀合物疫苗技术比较，这有利地简化了蛋白质基质疫苗组合物的制备、降低了其制备的成本。已经证实，对于在发展中世界中生产和销售而言，多糖（PS）-蛋白质缀合物疫苗是过分昂贵的。由于每一疫苗所需的高度专门的化学方法以及产生和纯化PS抗原和载体蛋白质二者的成本，所以廉价地生产常规缀合物疫苗是困难的。

根据本发明的疫苗组合物满足了疫苗可以安全地诱导针对以前棘手抗原的免疫性。本文中所述的疫苗组合物可以是单价的（具有诱导免疫应答的单一抗原）或者多价的（具有诱导多重免疫应答的多个抗原）。

其他术语的含义可以通过它们出现的上下文理解或者被本领域技术人员理解，所述本领域技术人员包括有机化学、药理学、微生物学、蛋白质生物化学和免疫学领域的从业人员。

本发明涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含(1)一种或多种目的抗原，(2)一种或多种载体蛋白质，和(3)一种或多种聚阳离子，其中所述载体蛋白质和/或所述聚阳离子是交联的，以形成蛋白质基质，并且所述目的抗原是被所述蛋白质基质包载的。可以容易地制备所述组合物，包括混合抗原、载体蛋白质和聚阳离子组分，然后起始交联反应，以引起载体蛋白质和/或聚阳离子的交联。在蛋白质基质疫苗产生方法的备选实施方案中，组分的添加顺序可以是变化的，尽管通常在加入目的抗原、期望的包载没有发生以及抗原仍保持为解离的组分之前形成交联的蛋白质基质。在优选的实施方案中，将聚阳离子和多糖抗原一起温育，然后加入交联剂，然后加入载体（基质形成）蛋白质。根据本发明，掺入了聚阳离子如α-PLL的蛋白质基质疫苗组合物改进了抗原在蛋白质基质中的包载，与仅抗原或者没有掺入聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物比较，导致了增加的免疫原性。

本发明特别地涉及掺入了聚阳离子的蛋白质荚膜基质疫苗组合物，以及制备和施用此类组合物的方法，以提供针对抗原，特别地T细胞独立性抗原或通常引起弱免疫应答的抗原，例如如多糖（PS）、多元醇、聚氨基酸和其他有机聚合物的免疫力。本发明疫苗组合物具有典型的PS-蛋白质缀合物疫苗的有效免疫特性，但期望地不同于缀合物疫苗，因为目的抗原如PS或荚膜有机聚合物与载体蛋白质/聚阳离子的偶联不需要显著的共价原子结合。相反，目的抗原如PS或荚膜有机聚合物是包载在载体蛋白质/聚阳离子基质中的。例如，可以在可溶性抗原如PS或荚膜有机聚合物存在的情况下，通过将载体蛋白质分子与其自身、与其他载体蛋白质分子和/或聚阳离子共价交联，来形成蛋白质基质。相互高度交联的载体蛋白质和/或聚阳离子可以形成捕获（包载）抗原的基质，并协助抗原递呈细胞摄取抗原，导致刺激B细胞产生抗体。如本文中所示，通过加入聚阳离子如聚-L-赖氨酸，增强了基质内抗原包载的水平，与仅抗原或者没有使用聚阳离子形成的抗原/蛋白质基质复合物比较，导致了PCMV颗粒提高的产率，并又导致PCMV组合物增强的免疫原性。

在概念上，可以以“筛网”的形式显示载体蛋白质/聚阳离子，所述筛网包装了抗原或一系列“细绳上的珠子”，其中以这样类比，抗原是“细绳”，蛋白质或交联的蛋白质/聚阳离子的复合物是“珠子”。如果载体蛋白质环绕抗原，以形成围绕抗原的环或者抗原纠缠在其中的三维筛网，那么抗原就包载在载体蛋白质/聚阳离子基质内。抗原的包载在没有抗原与载体蛋白质共价结合发生的显著交联的情况下，产生了期望数量的与抗原性载体结合的抗原。与用仅抗原或者用于载体蛋白质简单混合的抗原免疫比较，足够数量的抗原和/或通过包载与载体结合的持续性使得蛋白质基质疫苗表现出增强的免疫原性。与市售缀合物疫苗（其中抗原与载体共价连接）比较，根据本发明的蛋白质基质疫苗组合物显示出实现了免疫原性。

在期望的实施方案中，载体蛋白质的分子和/或聚阳离子是共价交联的。例如，共价连接可以含有赖氨酸侧链的（例如，聚-L-赖氨酸上的）伯氨基与天冬氨酸或谷氨酸侧链的（例如，载体蛋白质上的）羧基之间的肽键。在其他期望的实施方案中，可以使用交联剂如式OHC-R-CHO的化合物起始共价交联，其中R是1至12个碳原子的线性或分支二价亚烷基、1至12个原子的线性或分支二价杂烷基、2至12个碳原子的线性或分支二价亚烯基、2至12个碳原子的线性或分支二价亚炔基、5至10个碳原子的二价芳族基、3至10个原子的环状系统、–(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂–（其中q为1至4）或者连接两个醛基的直接化学键。在优选的实施方案中，使用戊二醛作为交联剂或者备选地可以使用诸如间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺或双-biazotized联苯胺,双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯或二甲基己二酸的试剂。尽管在蛋白质基质疫苗组合物的形成中是不需要的，但目的抗原与载体蛋白质可以共价结合，例如由于抗原上存在的未封闭的反应基团或末端氨基或羧基或羟基，例如在一定程度上偶然地形成了交联的载体蛋白质基质。总之，抗原与载体的共价连接不是形成蛋白质基质疫苗的目的。对于本发明的目的，蛋白质基质疫苗是疫苗组合物，其中50%以下的抗原是与载体蛋白质共价连接的。通过考虑能参与交联反应的抗原中的位点的比例，即考虑所使用的交联剂的反应基团、所使用的试剂和其他反应物（例如，载体蛋白质、聚阳离子）的量，以及是否允许交联反应完成（例如，在反应期间是否消耗了全部交联剂），可以通过化学计量计算偶然的抗原交联的量。还可以例如通过质谱分析PCMV组合物的碳水化合物/赖氨酸交联，来测量蛋白质基质疫苗组合物中交联的抗原的量。

在期望的实施方案中，抗原和载体蛋白质/聚阳离子基质是非共价结合的。该非共价结合可以包括疏水相互作用、离子相互作用、范德华相互作用或氢键；或者抗原可以是物理地或者空间地包装在蛋白质基质中的，以防止或者延迟抗原从基质中解离。非共价结合可以包括用蛋白质复合物非共价结合（包载）抗原的物理几何构型。（即，如上类比的“细绳上悬的珠子”）。

可以在任一目的抗原存在的情况下，使用任一多种可能的连接剂交联任一多种可能的载体蛋白质和/或聚阳离子，来制备本发明疫苗组合物。示例性和优选的连接剂、载体蛋白质、聚阳离子和目的抗原如本文中讨论。

多糖（PS）是糖类（糖）的聚合物。来源于微生物荚膜的PS是参与针对有荚膜的细菌病原体如脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、伤寒沙门菌和B型流感嗜血杆菌的保护性免疫的主要抗原组分。使用基于微生物多糖的疫苗免疫的青少年和成人已经成功地降低了疾病负担，但证明在给婴儿和幼儿（即，24月龄以下的儿童）提供保护性免疫中有效性较低。幼儿还没有产生成熟的获得性免疫库，并且T细胞独立性抗原如荚膜PS免疫原性很差，并且在此类年轻的疫苗接受者中不会导致长期的保护性免疫应答（即，免疫记忆应答）。

通过将多糖化学偶联至蛋白质，可以将T细胞独立性抗原如多糖转变成T细胞依赖性抗原。这种方法已知为“缀合”，涉及多糖结构中的原子与“载体”蛋白质中存在的氨基酸的侧链原子之间共价键的形成。此类“缀合物疫苗”可以更优选地促进B细胞成熟和同种型转换的诱导，产生了更高水平的具有正确的抗PS保护性谱的抗体。保护性抗体对其多糖抗原具有高亲和力，并且通常是免疫球蛋白G（IgG）亚类（具有补体固定和调理作用效应子活性的长寿抗体）。

T细胞独立性抗原通常不会刺激持久的免疫力，即产生IgG抗体，但可以刺激产生效力较低、结合较差和更暂时的IgM抗体。因此，仅多糖抗原一般不会产生IgG的增强应答。然而，如果用PS-蛋白质缀合物进行初次免疫，那么多糖会产生增强的应答，因为通过缀合物诱导的记忆细胞已经经程序化以产生IgG。事实上，认为接种疫苗的动物或人类中增强的应答是模拟由于暴露于展示PS的微生物的保护性应答；这种长期记忆对于疫苗在受试者免疫后数年给免疫的受试者提供保护性免疫力中发挥作用是关键的。因此，PS-蛋白质缀合物是有价值的，因为(1)其诱导针对PS抗原的高水平IgG的能力，和(2)其诱导针对PS抗原的记忆免疫应答的能力。仅多糖抗原通常不会显示出这些特性，并因此是较差的抗原。合成缀合物疫苗的困难以及其生产成本减缓了针对许多细菌疾病的缀合物疫苗的研发（其中寻找针对多糖抗原的保护性免疫应答）。

其他T细胞独立性抗原包括氨基酸的均聚物，如聚γ-D-谷氨酸（PGA）和多元醇。大多数生物聚合物是T细胞独立性抗原。由于其化学结构的重复性质（和因此的表位），聚合物可以交联识别它们的B细胞上的免疫球蛋白（Ig）受体。因此，聚合物可以以与多糖相同的方式活化产生抗聚合物IgM的B细胞。例如，氨基酸均聚物——炭疽芽孢杆菌的聚γ-D-谷氨酸（PGA）是免疫原性差的荚膜聚合物，并且也是T细胞独立性抗原。由PGA与蛋白质载体缀合组成的疫苗是高免疫原性的，能诱导抗PGA IgG，以及针对PGA的免疫记忆。因此，就其免疫原性而言，大多数聚合物像PS一样应答，因为它们不能被加工并不能被MHC-II展示，并且因此不能募集T细胞的辅助。在与另一类称为Toll样受体（TLR）的受体相互作用的一些天然存在的聚合物中发现了例外。一旦活化，TLR可以诱导宿主细胞产生细胞因子，并产生获得性免疫应答的改变。一些PS可以与TLR配体共价连接，或者用此类配体污染。例如，脂多糖（LPS）是高免疫原性的PS，并且诱导IgG和记忆应答；LPS的脂质A部分是TLR配体，并负责免疫性质。

常规缀合物疫苗很难廉价地产生，归因于产生和纯化PS抗原和载体蛋白质二者，以及涉及每一多糖-蛋白质缀合的特定化学的成本。通常，在以合理的偶联效率进行缀合化学之前，二者都需要相当的纯。通常，偶联化学必须特别地为多种PS（其对于PS的化学是唯一的）和已经选定的载体蛋白质研发。该偶联化学将功能团引入到PS中，其然后通常可以通过赖氨酸残基的ε氨基侧链与载体蛋白质连接。因此此类偶联基团的PS的化学修饰可以破坏PS上的表位，并引入新的表位（例如，与连接剂或者经修饰的糖基团结合），其重要性只能通过进行仔细的免疫分析才能评估。此外，对于常规PS-蛋白质缀合物疫苗，PS的大小、每一蛋白质载体分子结合的PS分子的数量、选定的载体的性质，以及连接化学的类型都可以影响缀合物疫苗的免疫原性。同样地，例如，在肺炎球菌疾病的情况下，其中90+已知血清型之一都具有不同的PS结构（Bentley等人，PLOSGenetics2（3）：e31262-269，2006），一种缀合方法并不适合于全部血清型。可重复地合成具有可重复的免疫学性质的缀合物疫苗涉及小心地控制PS的大小、每一蛋白质载体分子结合的PS分子的数量、选定的载体的性质，以及连接化学的类型。因此，这又显著地增加了生产缀合物疫苗的成本。

抗生素抗性的出现突出了研发安全且有效的疫苗的紧迫性。要使得疫苗可以广泛可用，特别是对于发展中国家，还需要疫苗的生产是有成本效益的。将来自一种或多种细菌物种的不同血清型的针对许多多糖抗原的组合的缀合物疫苗掺入到儿童免疫方案中将可以在高危人群中简单化疫苗施用。然而，当前的缀合物疫苗技术是没有成本效益的，并因此由于成本过高，实际上组合缀合物疫苗几乎不可能递送给发展中国家。

在期望的实施方案中，本发明免疫原性疫苗组合物是蛋白质荚膜基质疫苗（PCMV），其中将一种或多种细菌荚膜组分包载在交联的载体蛋白质和/或聚阳离子基质中。PCMV可以比缀合物更容易地产生，因为目的抗原如细菌荚膜多糖不需要水解成更小片段并且多个抗原可以同时包载在蛋白质基质中。

因为制备本发明疫苗的方法不需要目的抗原如荚膜多糖的任何化学知识，所以该方法不取决于研发与目的抗原和载体蛋白质的化学相容的交联化学的需求。尽管一些抗原可能与交联剂相互作用，但这应当不会降低疫苗的有效性，因为目的抗原与载体蛋白质的不期望的交联预期具有与缀合物相似的免疫原性特性。然而，在本发明疫苗中，对于疫苗的免疫有效性而言，目的抗原与载体蛋白质的交联并不是必需的。这与常规缀合物疫苗形成了鲜明的对比。本发明疫苗期望地具有至少例如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或甚至100%交联的载体蛋白质，以及不超过例如50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%与载体蛋白质交联的目的抗原。期望地，不超过10%的抗原是与载体蛋白质交联的，并且至少50%的载体蛋白质是交联的。

如本文中所讨论，根据本文中的教导，与由仅抗原、简单的抗原/载体混合物，以及甚至没有掺入聚阳离子的抗原/蛋白质基质疫苗组合物组成的组合物比较，掺入了聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物具有增加的抗原包载和相应的更高的免疫原性。如本文中所讨论，细菌的多糖荚膜是由重复的糖组成，并且许多病原体细菌荚膜都带负电荷。通过电荷排斥或者通过呈递更大更具抑制性荚膜，负电荷可以帮助防止宿主免疫细胞的吞噬作用。Weinger等人，PlosPathogens：5：1-9（2009）。基质蛋白质也可以发生这种相同的电荷排斥，导致弱的多糖包载。为了抵消这种负电荷，可以将聚阳离子例如聚-L-赖氨酸（PLL）加入到PCMV反应物中。例如，如本文中所讨论，将0.04%α-PLL加入到Vi-CRM197PCMV反应物中，使Vi多糖包载从5%增加到了>20%（图1）。

控制颗粒大小可以改进蛋白质基质疫苗的免疫原性。在本发明的期望实施方案中，抗原/载体蛋白质/聚阳离子基质复合物具有直径大于50nm的平均颗粒大小。可以通过任何合适的方法分级分离期望大小的颗粒，包括大小排阻层析（SEC），然后合并较大大小的颗粒，并丢弃更小大小的颗粒和/或未包载的多糖。备选地，可以将具有良好选择的分子量截断的滤膜用于去除较小大小的颗粒，而保留期望大小的颗粒。可以通过本领域已知的方法，例如层析，包括大小排阻层析（SEC）、凝胶过滤层析或凝胶渗透层析完成较低分子量种类（例如，直径<50nm的种类）的去除或者选择包括直径大于至少50nm的颗粒大小的组合物的蛋白质基质颗粒大小。还可以使用凝胶电泳技术。

制备本文中所述的疫苗的方法不会导致目的抗原如荚膜聚合物的大量修饰。抗原通常仍保持相同的状态，可能的修饰是例如减少在聚合物链的末端携带此类基团的PS的还原糖。此类较小修饰不可能影响大多数荚膜PS的免疫原性，因为聚合物中末端糖要比内部残基少100-10,000倍。相反，对于常规缀合物疫苗，通常需要将连接基团引入到抗原如荚膜聚合物中，其作为载体蛋白质共价连接的点。例如，将反应基团引入到PS中可以导致荚膜表位的破坏并产生新的表位，所述新表位在疫苗产品中是不期望的，因为其与宿主自身表位未知的免疫交叉反应性。

制备本文中所述的疫苗的方法比缀合物疫苗技术更不复杂，因为其化学性质仅取决于载体蛋白质（例如，DNI、霍乱毒素B亚基、白喉类毒素、破伤风类毒素或片段C、或大肠杆菌β-半乳糖苷酶）和/或聚阳离子（例如，α-聚-L赖氨酸和ε-聚-L赖氨酸）的交联化学。例如，当与DNI混合时，虽然荚膜聚合物影响了交联的速率，但它不会影响交联的模式或程度，其受所使用的蛋白质、其浓度，以及所加入的交联剂（例如，戊二醛）的浓度控制。可以容易地调整这些参数，从而减少制备疫苗所需的时间和努力，并节省开支。

可以用任一抗原如荚膜聚合物或者具有极少的任一氨基的任一生物聚合物，以及可以交联的任一载体蛋白质和/或聚阳离子，例如不具有在交联或化学反应时会被破坏的关键表位的载体蛋白来制备本文中所述的PCMV组合物的方法。可以在本文中所述的方法中使用的载体蛋白质期望地具有至少2个赖氨酸残基或者可以通过化学修饰解封闭和交联的其他残基。破伤风类毒素是一种可能的载体蛋白质。通过用甲醛（与蛋白质的氨基反应的试剂）处理，使得该毒素为无毒的。其他期望的载体蛋白质包括霍乱毒素B亚基（可从SBLVaccin AB得到）、白喉类毒素或CRM197、破伤风类毒素或片段C（可从Sigma Aldrich得到）、DNI或来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶（可从Sigma Aldrich得到）。

当前的多价缀合物疫苗通过首先合成各个缀合物疫苗，然后将其混合以产生“混合”缀合物疫苗制备（例如，Wyeth七价肺炎球菌疫苗、

GlaxoSmithKline的十价肺炎球菌疫苗和Pfizer的13价疫苗

）。通过在例如用戊二醛或其他交联剂交联载体蛋白质和/或聚阳离子之前，将在化学上不同的抗原例如荚膜有机聚合物混合在一起，或者通过混合分别合成的本发明的特定疫苗，可以将制备疫苗的本发明方法用于制备多价疫苗。这种灵活性提供了优于生产多价疫苗的常规方法（其应当大幅度降低商品的费用）的显著优势。

尽管通过并不预测在抗原分子和载体蛋白质之间产生任何共价键的方法合成这些疫苗的事实，但在实施例中所讨论的本发明示例性疫苗与缀合物疫苗相当。戊二醛典型地通过赖氨酸残基的ε氨基，主要与蛋白质的氨基侧链反应。多糖抗原基本上不与戊二醛或其他醛功能性试剂反应，因为它们含有极少的与戊二醛或醛功能性交联剂（例如，上文所述的OCH-R-CHO）反应的游离氨基（任何氨基侧链一般是乙酰化的）。因此，此类抗原可以很好地适合于PCMV形成，其中不超过50%的抗原是与载体蛋白质直接交联的。如在下文实施例中所示，与缀合物对照良好比较的通过PCMV产生的免疫应答表明，PS分子在分子上被包载在DNI蛋白质分子的交联基质内。

根据非限制性模型，包载的作用为将蛋白质基质疫苗组合物递送给B细胞，所述B细胞通过识别聚合物抗原的Ig受体结合此类基质。一旦摄入到这些B细胞中，该基质以与常规缀合物疫苗相似的方法降解，导致源自载体蛋白质的肽，其展示在B细胞的MHC II型分子上。这从而招募T辅助细胞，并因此导致此类B细胞膨胀并成熟，以成为产生IgG的血浆和对抗原特异的‘记忆’细胞。因此，根据非限制性模型，PCMV在免疫学上与蛋白质-缀合物荚膜疫苗一样发挥作用，但其是不同的，因为PCMV在载体蛋白质和荚膜聚合物之间缺少显著的共价连接。

可以例如在儿科疫苗中，组合使用本发明疫苗组合物，包括PCMV。此外，可将本发明疫苗用于针对例如肺炎球菌感染、链球菌（A组和B组）感染、流感嗜血杆菌B型（“HiB”）感染、脑膜炎奈瑟氏球菌（例如，脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitides））感染的疫苗接种，并且可用作为来自革兰氏阴性细菌（例如，铜绿假单胞菌、野兔热弗朗西丝氏菌（Francisella tularensis）（Thirumalapura等人，J.Med.Microbiol.54：693-695，2005；Vinogradov和Perry，Carbohydr.Res.339：1643-1648，2004；Vinogradov等人，Carbohydr.Res.214：289-297，1991）、志贺氏杆菌属（Shigella）的物种、沙门氏菌属（Salmonella）的物种、不动杆菌属（Acinetobacter）的物种、伯霍尔德杆菌属（Burkholderia）的物种和大肠杆菌）的O抗原疫苗。

在一种或多种目的抗原，例如如本文中所述的那些目的抗原存在的情况下，使用任一连接剂，例如那些在本文中所述的连接剂交联任一载体蛋白质和/或聚阳离子，例如本文中所述的那些载体蛋白质和/或聚阳离子，来制备本发明疫苗。如果使用一个目的抗原，那么认为本发明蛋白质基质疫苗是单价的。如果使用一个以上的目的抗原，那么认为本发明蛋白质基质疫苗是多价的。如果微生物荚膜聚合物或多糖是目的抗原，那么认为本发明蛋白质基质疫苗是蛋白质荚膜基质疫苗（PCMV）。

连接剂

用于交联载体蛋白质和/聚阳离子的交联剂是本领域熟知的，并且包括戊二醛、间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双-biazotized联苯胺。

例如由G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques（Academic Press，1996）和Dick和Beurret，“Glycoconjugates of Bacterial CarbohydrateAntigens，”在Conjugate Vaccines（Cruse and Lewis编著）（Contrib.Microbiol.Immunol.Basel,Karger，1989，第10卷，第48-114页中描述了使用同型双功能或异型双功能连接剂的用于直接交联载体蛋白质的一般方法和部分。例如，具有‘n’个赖氨酸部分的载体蛋白质，在理论上存在‘n+1’个可用于与示例性交联剂的羧基反应的伯胺（包括末端胺）。因此，使用该直接缀合方法，产物限于具有‘n+1’个形成的酰胺键。

在本发明期望的实施方案中使用的连接剂最简单的是连接两个载体蛋白质的键、连接两个聚阳离子的键、连接同一载体蛋白质或聚阳离子的两个位点的键或者连接载体蛋白质和聚阳离子的键。连接剂可以具有线性的、环状的或分支的分子骨架，具有共价结合两个载体蛋白质和/或聚阳离子（(A)和(B)）的侧基。可以将任何给定的载体蛋白质与一种以上的载体蛋白质和/或与聚阳离子连接，以产生其中包载了目的抗原的相互连接的载体蛋白质/聚阳离子的基质。

术语“连接基团”指由连接剂（L）的反应部分与(A)或(B)的官能团组合产生的共价键。连接基团的实例包括但不限于酯、氨基甲酸酯、硫酯、亚胺、二硫化物、酰胺、醚、硫醚、磺胺、异脲、异硫脲、亚氨酸酯、脒、氨基磷酸酯、磷酸二酯、硫醚和腙。

(A)与(B)的连接通过共价方法实现，涉及与位于(A)和(B)上的一个或多个官能团形成键（连接基团）。可用于该目的的化学反应官能团的实例包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基、羰基、硫醚、胍基、咪唑基和酚基，所述全部基团都存在于许多载体蛋白质的天然存在的氨基酸中。

因此，可以使用连接剂（L）实现(A)与(B)的共价连接，所述连接剂含有能与(A)和(B)中存在的此类官能团反应的反应部分。该反应的产物是连接基团，其含有新形成键，连接(L)与(A)和(L)与(B)。例如，(A)的羟基可以与(L)的羧酸基或其活性衍生物反应（见下文），导致酯连接基团的形成。

能与硫氢基反应的部分的实例包括XCH₂CO–型（其中X=Br、Cl或I）的α-卤乙酰基化合物，其对硫氢基显示出特定的反应性，但如例如由Gurd，Methods Enzymol.，11：532（1967）所述，还可将其用于修饰咪唑基、硫醚、苯酚和氨基。还认为N-马来酰亚胺衍生物选择性针对硫氢基，但在某些条件下，可以另外地将其用于与氨基的偶联。如果通过形成二硫键发生连接，那么可将通过转化氨基引入硫醇基的试剂如2-iminothiolane（Traut等人，Biochemistry，12：3266（1973）考虑作为硫氢基试剂。

能与氨基反应的反应部分的实例包括例如，烷化剂或酰化剂。代表性烷化剂包括：

(i)α-卤乙酰基化合物，其在不存在反应性硫醇基的情况下，对氨基显示出特异性，并且为XCH₂CO–型（其中如例如Wong（Biochemistry，24：5337（1979）所述，X=Cl、Br或I）；

(ii)N-马来酰亚胺衍生物，如例如Smyth等人（J.Am.Chem.Soc.，82：4600，1960和Biochem.J.，91：589（1964））所述，其可以通过迈克尔型反应（Michael type reaction）或者通过将羰基加入环中的酰化来与氨基反应；

(iii)芳基卤如反应性硝基卤芳香（nitrohaloaromatic）化合物；

(iv)如例如McKenzie等人（J.Protein Chem.，7：581（1988）所述的芳基卤；

(v)能与氨基形成席夫碱的醛和酮，形成的加合物通常通过还原以产生稳定的酰胺来稳定化；

(vi)环氧化合物衍生物如环氧氯丙烷和双环氧乙烷，其可以与氨基、巯基或酚式羟基反应；

(vii)均三嗪的含氯衍生物，其对亲核基团如氨基、巯基和羟基具有非常强的反应性；

(viii)如例如Ross（J.Adv.Cancer Res.，2：1（1954））所述的上文详述的基于均三嗪的氮丙啶，其通过开环与亲核基团如氨基反应；

(ix)如例如Tietze（Chem.Ber.，124：1215（1991））所述的方形酸二乙酯；和

(x)α-卤烷基醚，如例如Benneche等人（Eur.J.Med.Chem.，28：463（1993））所述，由于醚氧原子产生的活性，其是比正常的烷基卤更有反应性的烷化剂。

代表性氨基反应性酰化剂包括：

(i)异氰酸酯和异硫氰酸酯，特别地芳香衍生物，其分别形成稳定的尿素和硫脲衍生物；

(ii)磺酰氯，其已经由例如Herzig等人（Biopolymers，2：349（1964）描述；

(iii)酰基卤；

(iv)活性酯如硝基苯酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯；

(v)酸酐如混合的、对称的或者N-羧基酸酐；

(vi)如例如M.Bodansky（Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，1984）所述的用于酰胺键形成的其他有用的试剂；

(vii)如例如Wetz等人（Anal.Biochem.，58：347（1974））所述的酰叠氮，例如其中叠氮基使用亚硝酸钠产生自预先形成的酰肼衍生物；和

(viii)如例如Hunter和Ludwig（J.Am.Chem.Soc.，84：3491（1962）所述的亚氨酸酯，其与氨基反应形成稳定的脒。

醛例如如戊二醛和酮可以与胺反应形成席夫碱，其可以有利地通过还原性氨基化稳定化。如例如Webb等人（Bioconjugate Chem.，1：96（1990））所述，烷氧基氨基部分可以容易地与酮和醛反应，以产生稳定的烷氧基胺。

能与羧基反应的反应性部分的实例包括重氮化合物如重氮基醋酸酯和重氮基乙酰胺，如例如Herriot（Adv.Protein Chem.，3：169（1947））所述，其高特异性地反应以产生酯基团。还可以使用羧酸修饰试剂如碳二亚胺，其通过O-酰基脲形成，然后酰胺键形成来进行反应。

根据需要，可以在反应前将(A)和/或(B)中的官能团转变成其他官能团，例如以赋予其他反应性或选择性。用于该目的的方法的实例包括使用试剂如二羧酸酸酐将胺转变成羧酸；使用N-乙酰高半胱氨酸硫内酯、S-乙酰巯基丁二酸酐、2-亚氨基硫烷或含硫醇的琥珀酰亚胺基衍生物将胺转变成硫醇；使用试剂如α-卤代醋酸将硫醇转变成羧酸；使用试剂如乙烯亚胺或2-溴乙胺将硫醇转变成胺；使用试剂如碳二亚胺然后二胺将羧酸转变成胺；以及使用试剂如甲苯磺酰氯然后使用硫代乙酸酯的转酯作用和使用乙酸钠水解成硫醇，将醇转变成硫醇。

在不引入其他连接物质的情况下，根据需要，本发明可以使用所谓的零长度连接剂，其涉及(A)的反应性化学基团与(B)的反应性化学基团的直接共价连接。实例包括这样的化合物，其中(L)表示(A)的氧原子与(B)中存在的羰基或硫代羰基部分的化学键连接，以使连接基团为酯或硫酯。例如，通过碳二亚胺化学作用，可将氨基(A)与羧基(B)连接，产生A-L-B，其中L是与N-R连接的酰胺键或RC(:O)，其中R是来源于相同的或者两个不同蛋白质分子的氨基酸侧链的碳链。最常见的，然而，连接剂包括通过间隔元件连接的如上所述的两个或多个反应性部分。间隔物的存在允许双功能性连接剂与(A)和(B)内的特异性官能团反应，产生这两种化合物之间的共价连接。连接剂(L)中的反应性部分可以是相同的（同型双功能性连接剂）或者不同的（异型双功能性连接剂或者其中存在几种不同反应性部分的异型双功能性连接剂），条件是多种可能的试剂都可以实现(A)和(B)之间的共价连接。

间隔元件通常由链组成，所述链通过1-10个碳原子的线性或分支烷基、1-10个原子的线性或分支杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支烯、2-10个碳原子的线性或分支炔、5-10个碳原子的芳香族残基、3-10个原子的环状系统或者–(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂–（其中n为1-4）有效分离(A)和(B)。

通过连接剂引入的外来物质的性质可以携带最终疫苗产物的药物动力学和/或活性。因此，可以期望引入含有间隔臂的可切割连接剂，所述间隔臂是生物可降解的或者化学敏感的或者掺入了酶促切割位点的间隔臂。

例如，如在PCT公开WO92/17436（因此引入作为参考）中所述的这些可切割连接剂是在体内可容易生物降解的。在一些实例中，在酯酶存在的情况下，连接基团是被切割的，但在该酶不存在的情况下是稳定的。因此，可以有利地连接(A)和(B)，以允许它们通过疾病部位附近的酶活性来缓慢释放。

连接剂可以与式：–(Z¹)_o-(Y¹)_u-(Z²)_s-(R₁₁)-(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p–的生物可降解二酯、二酰胺或二氨基甲酸酯基团形成连接基团，其中每一Z¹、Z²、Z³和Z⁴独立地选自O、S和NR₁₂（其中R₁₂是氢或烷基）；每一Y¹和Y²独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酰基或类似的酸形成基团；o、p、s、t、u和v都独立地为0或1；并且R₁₁是1-10个碳原子的线性或分支烷基、1-10个原子的线性或分支杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支烯、2-10个碳原子的线性或分支炔、5-10个碳原子的芳香族残基、3-10个原子的环状系统、–(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂–，其中q为1-4，或者化学键连接–(Z¹)_o-(Y¹)_u-(Z²)_s-(R₁₁)-(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p–。

用于本发明的示例性期望的连接剂(L)由式I-II之一描述：

–C:O–R₁₃–C:O–  I

–C:O–NH–R₁₃–NH–C:O–  II

其中连接剂与氧原子(A)和(B)的氧原子二者共价连接。因此，式I-II的连接剂(L)通过二吡喃、酯或氨基甲酸酯连接基团与载体蛋白质(A)和(B)连接。在这些实施方案中，R₁₃表示1-10个碳原子的线性或分支烷基、1-10个原子的线性或分支杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支烯、2-10个碳原子的线性或分支烯、5-10个碳原子的芳香族残基、3-10个原子的环状系统、–(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂–，其中n为1-4，或者连接两个氮或两个羰基的化学键。

设计连接剂，以形成具有化学式III的腙连接：

–(Y³)–(Z⁵)_w–R₁₄–C(:X₄)–R₁₅  III

其中Z⁵选自O、S或NR₁₆；R₁₆是氢或烷基；R₁₅选自氢、烷基或杂烷基；Y³选自羰基、硫代羰基、sulphonyl、磷酰基或类似的与(A)的氧原子共价连接的酸形成基团；w是0或1；R₁₄是1-10个碳原子的线性或分支烷基、1-10个原子的线性或分支杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支烯、2-10个碳原子的线性或分支烯、5-10个碳原子的芳香族残基、3-10个原子的环状系统、–(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂–（其中n为1-4）或者连接–(Y³)–(Z⁵)_w–的化学键，并且X₄是导致含酰肼基团的(B)和前体与连接剂II的缩合反应的腙，其中X₄是酮或醛基的氧原子。

载体蛋白质

通常，可以将在生理条件下可以包载抗原的任一载体蛋白质用于本发明。期望地，在抗原和载体蛋白质/聚阳离子基质之间不存在显著的共价连接的情况下，在具有载体蛋白质和/或聚阳离子的交联基质的复合物中包载抗原。不存在显著的共价连接指不超过50%的抗原与载体蛋白质和/或聚阳离子共价连接。在期望的实施方案中，不超过40%、30%、10%或5%的抗原与载体蛋白质和/或聚阳离子共价连接。抗原/载体蛋白质/聚阳离子复合物可以含有另一化合物如明矾。

用于本发明疫苗的载体蛋白质期望地是在受试者中（单独地或者与抗原组合地）引起免疫应答的蛋白质。期望地，载体蛋白质含有T辅助细胞识别的多个MCH II型限制的表位。期望地，表位能在受试者中诱导T_h细胞应答，并诱导B细胞产生针对目的抗原和抗原所来源的微生物的抗体。用于描述本发明的表位包括抗原上的任一决定簇，其负责其与抗体分子或其片段的特异性相互作用。表位决定簇通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。为了具有免疫原性特性，蛋白质或多肽通常能刺激T_h细胞。然而，缺少T_h识别的表位的载体蛋白质也可以是免疫原性的。

通过选择已知引起强的免疫应答（即，高度免疫原性）并含有“通用的”或“广泛的”或“pan DR”辅助T细胞表位的载体蛋白质（参见，例如WO2008/057529），可以用本文中所述的蛋白质基质疫苗组合物处理多种群体的受试者。载体蛋白质期望地是充分外来的，以引起针对疫苗的强免疫应答。通常，使用的载体蛋白质是能刺激针对目的抗原的免疫原性的分子。在期望的实施方案中，载体蛋白质是本来为高免疫原性的载体蛋白质。因此，期望的是具有高度的免疫原性，并能最大化针对与其复合的抗原的抗体产生的载体蛋白质。

用于本发明实施的多种载体蛋白质包括，例如毒素和类毒素（化学的或遗传的），其可以是或者不是突变体，如炭疽毒素、PA和DNI（PharmAthene,Inc.）、白喉类毒素（Massachusetts State Biological Labs；Serum Institute of India，Ltd.）或CRM197、破伤风毒素、破伤风类毒素（Massachusetts State Biological Labs；Serum Institute of India，Ltd.）、破伤风毒素片段Z、铜绿假单胞菌的外毒素A或外毒素A的突变体、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白质（可获自ATCC的菌株（American Type Culture Collection，Manassas，Va.））、铜绿假单胞菌Hcp1蛋白质、大肠杆菌热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白质、提取自全细菌细胞的蛋白质，以及可通过连接剂交联的任一其他蛋白质。期望地，载体蛋白质是霍乱毒素B亚基（可从SBL Vaccin AB得到）、白喉类毒素或CRM197（Connaught，Inc.）、破伤风类毒素或片段C（可从Sigma Aldrich得到）、DNI或来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶（可从SigmaAldrich得到）。其他期望的载体蛋白质包括牛血清白蛋白（BSA）、P40和鸡核黄素。（除非另外指明，示例性载体蛋白质可从Sigma Aldrich通过商业途径得到）。其他示例性载体蛋白质是MAP（多抗原性多肽），其是分支的肽。通过使用MAP，由于多分支的氨基酸残基，最大化了交联密度。对于交联目的，可用于形成MAP的期望的氨基酸残基是（但不限于）在其侧链具有游离氨基的赖氨酸。

当用动物实验时，通常将BSA和钥孔血蓝蛋白（KLH）用作为疫苗研发中的载体。用于治疗性疫苗的制备的载体蛋白质包括但不限于病原体细菌的多种毒素及其类毒素。实例包括白喉毒素和破伤风毒素和可药用的相应类毒素。其他候选物是称为交叉反应物质（cross-reacting material）（CRM）的在抗原性上类似于细菌毒素的蛋白质。用于本发明实施的载体蛋白质还可以包括并不来源于人类并且在任一人类食物物质中不存在的任一蛋白质。

在本发明期望的实施方案中，将形成环样结构的蛋白质用于PCMV产生。此类蛋白质包括铜绿假单胞菌的Hcp1蛋白质、霍乱毒素的无毒性“B亚基”、大肠杆菌的热不稳定肠毒素和志贺样毒素。该环样蛋白质复合物可以形成这样的结构，其中线性PS链穿透到这些环形蛋白质复合物的中央通道中。蛋白质交联后，预测此类复合物是相当稳定的。蛋白质的结构数据提示，这些中央通道足够大，以致PS链可以容易地进入。例如，Hcp1六聚环的中央通道为42埃，其足够宽，以致可以容易地容纳5.5埃宽的几个多糖链（Mougous等人，Science，312（5779）：1526-1530（2006））。备选地，可以在多糖周围组装蛋白质环（例如，从在特定的物理化学条件下天然组装到环中的单体载体蛋白质的亚基中）。可以组装到环中的此类单体蛋白质是本领域已知的，并且包括例如，肺炎球菌溶血素（Walker等人，Infect.Immun.，55（5）：1184-1189（1987）；Kanclerski和Mollby，J.Clin.Microbiol.，25（2）：222-225（1987））、李斯特菌溶胞素O（Kayal和Charbit，FEMS Microbiol.Rev.，30：514-529（2006）；Mengaud等人，Infect.Immun.，55（12）：3225-3227（1987））、DNI、炭疽PA、Hcp1、霍乱毒素B亚基、志贺菌毒素B亚基、鞭毛蛋白，以及本领域已知的和通过多种微生物制备的很多相关分子。

在另一期望的实施方案中，将Toll样受体（TLR）激动剂用作为载体蛋白质。Toll样受体（TLR）活化在塑造获得性免疫应答中是重要的，并且在抗体应答的亲和力成熟、同种型转换和免疫记忆中发挥着作用。霍乱弧菌的鞭毛蛋白（FLA）是TLR激动剂。已经从重组的大肠杆菌中纯化了FLA蛋白质，并在IL-6巨噬细胞诱导测定法中显示为有效的TLR活化剂。此外，称为“肺炎球菌溶血素”的高度保守性肺炎链球菌蛋白质也显示出活化TLR4，并且同时是保护性抗原。因此，也可将该蛋白质用作为蛋白质基质载体蛋白质。

此外，将外膜蛋白质（OMP）混合物（例如，脑膜炎奈瑟氏球菌的OMP）用作为Merck生产的HIB缀合物疫苗的载体蛋白质，并且来自全肺炎链球菌细菌细胞的蛋白质提取物在动物感染模型中显示出至少部分的保护性。在本发明期望的实施方案中，可将这些蛋白质混合物用作为载体蛋白质。

在期望的实施方案中，使用载体蛋白质制备疫苗组合物，所述载体蛋白质具有例如至少两个赖氨酸残基或者未封闭的且可以通过化学修饰交联的其他残基。在其他期望的实施方案中，载体蛋白质是多聚体（例如，含有至少5个亚基的载体蛋白质）。

在另一个实施方案中，将DNI用作为载体蛋白质，因为其是无毒的，在使用前不需要使其毒性降低。此外，DNI的用途是期望的，因为除针对目的抗原引起的保护性免疫应答外，DNI还诱导针对炭疽芽孢杆菌的保护性免疫应答。此外，DNI没有内部二硫键。此类键易于被氢硼化物还原，所述氢硼化物可以变性蛋白质并导致诱导炭疽霉素中和抗体的表位的丧失。

目的抗原

可以将本发明疫苗组合物以及制备和施用此类疫苗的方法用于任一目的抗原，并且特别有利的是使用其自身不具有强免疫原性的抗原。这包括例如大量的多糖、多元醇或聚氨基酸抗原。期望地，目的抗原不携带主要基团（primary group），其可被制备疫苗的方法所使用的化学反应破坏，例如，通过氢硼化物还原破坏抗原二硫键引起的抗原变性。示例性目的抗原包括但不限于有机聚合物如多糖（例如，具有至少18个残基的多糖）、磷酸多糖、具有N-乙酰取代的氨基糖的多糖、含硫酰化糖、其他经硫酸修饰的糖或者经磷酸修饰的糖的多糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁酸、脂多糖的O多糖。示例性目的抗原还包括荚膜有机聚合物，包括那些通过微生物如细菌、真菌、寄生虫和病毒合成的并然后使用标准方法从此类生物来源中纯化的荚膜有机聚合物。示例性目的抗原包括微生物荚膜有机聚合物，包括那些纯化自细菌生物如芽孢杆菌属（Bacillus）的物种（包括炭疽芽孢杆菌）（Wang and Lucas，Infect.Immun.，72（9）：5460-5463（2004））、肺炎链球菌（Bentley等人，PLoS Genet.，92（3）：e31（2006）；Kolkman等人，J.Biochemistry，123：937-945（1998）；和Kong等人，J.Med.Microbiol.，54：351-356（2005））、志贺氏杆菌属（Zhao等人，Carbohydr.Res.，342（9）：1275-1279（2007））、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi）、酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、大肠杆菌（Zhao等人，Carbohydr.Res.，342（9）：1275-1279（2007））和铜绿假单胞菌，和真菌生物如隐球菌属（Cryptococcus）和念珠菌属（Candida），以及许多其他微生物（参见，例如Ovodov，Biochemistry（Mosc.），71（9）：937-954（2006）；Lee等人，Adv.Exp.Med.Biol.，491：453-471（2001）；和Lee，Mol.Immunol.，24（10）：1005-1019（1987））的微生物荚膜有机聚合物。示例性目的抗原还包括自然中不存在的并因此是非生物来源的聚合物。

特定的肺炎链球菌抗原包括多糖荚膜1型（例如，1-g或1-q）、2型（例如，2-g、2-q或2-41A）、3型（例如，3-g、3-q、3-c或3-nz）、4型、5型（例如，5-q、5-c、5-qap或5-g）、6A型（例如，6A-g、6A-cl、6A-c2、6A-n、6A-qap、6A-6B-g、6A-6B-q或6A-6B-s）、6B型（例如，6B-c、6A-6B-g、6A-6B-q或6A-6B-s）、7F型（例如，7F-7A）、7A型（例如，7A-cn或7F-7A）、7B型（例如，7B-40）、7C型（例如，7C-19C-24B）、8型（例如，8-g或8-s）、9A型（例如，9A-9V）、9L型、9N型、9V型（例如，9A-9V）、9V型和14型、10F型（例如，10F-q、10F-ca或10F-10C）、10A型（例如，10A-17A或10A-23F）、10B型（例如，10B-10C）、11F型、11A型（例如，11A-nz或11A-11D-18F）、11B型（例如，11B-11C）、11C型（例如，11B-11C.或11C-cn）、11D型（例如，11A-11D-18F）、12F型（例如，12F-q或12F-12A-12B）、12A型（例如，12A-cn、12A-46或12F-12A-12B）、12B型（例如，12F-12A-12B）、13型（例如，13-20）、14型（例如，14-g、14-q、14-v或14-c）、15F型（例如，15F-cn1或15F-cn2）、15A型（例如，15A-ca1、15A-ca2或15A-chw）、15B型（例如，15B-c、15B-15C、15B-15C-22F-22A）、15C型（例如，15C-ca、15C-q1、15C-q2、15C-q3、15C-s、15B-15C或15B-15C-22F-22A）、16F型（例如，16F-q或16F-nz）、16A型、17F型（例如，17F-n和17F-35B-35C-42）、17A型（例如，17A-ca或10A-17A）、18F型（例如，18F-ca、18F-w或11A-11D-18F）、18A型（例如，18A-nz或18A-q）、18B型（例如，18B-18C）、18C型（例如，18B-18C）、19F型（例如，19F-g1、19F-g2、19F-g3、19F-q、19F-n或19F-c）、19A型（例如，19A-g、19A-或19A-ca）、19B型、19C型（例如，19C-cn1、19C-cn2或7C-19C-24B)、（例如，13-20）、21型（例如，21-ca或21-cn）、22F型（例如，15B-15C-22F-22A）、23F型（例如，23F-c、10A-23F或23F-23A）、23B型（例如，23B-c或23B-q）、24F型（例如，24F-cn1、24F-cn2或24F-cn3）、24A型、24B型（例如，7C-19C-24B）、25F型（例如，25F-38）、25A型、27型、28F型（例如，28F-28A或28F-cn）、28A型（例如，28F-28A）、29型（例如，29-ca或29-q）、31型、32F型（例如，32F-32A）、32A型（例如，32A-cn或32F-32A）、33F型（例如，33F-g、33F-q、33F-chw、33F-33B或33F-33A-35A）、33A型（例如，33F-33A-35A）、33B型（例如，33B-q、33B-s或33F-33B）、33D型、34型（例如，34-ca或34s）、35F型（例如，35F-47F）、35A型（例如，33F-33A-35A）、35B型（例如，17F-35B-35C-42）、36型、37型（例如，37-g或37-ca）、38型（例如，25F-38）、39型（例如，39-cn1或39-cn2）、40型（例如，7B-40）、41F型（例如，41F-cn或41F-s）、41A型（例如，2-41A）、42型（例如，17B-35B-35C-42）、43型、44型、45型、46型（例如，46-s或12A-46）、47F型（例如，35F-47F）、47A型、48型（例如，48-cn1或48-cn2)或GenBank检索号AF532714或AF532715。

特别提及的是制备选自荚膜3型、4型、6B型、7A型、7B型、7C型、7F型、9A型、9L型、9N型、9V型、12A型、12B型、12F型、14型、15A型、15B型、15C型、15F型、17型、18B型、18C型、19F型、23F型、25A型、25F型、33F型、35型、37型、38型、44或46型的肺炎链球菌多糖。

聚阳离子

期望地，可以将具有以游离的伯胺基、仲胺基或叔胺基形式的重复正电荷的任一聚阳离子用于本发明。示例性聚阳离子包括但不限于聚-L-赖氨酸、脱乙酰壳多糖[2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcN）和2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcNAc）的β-(1-4)连接的共聚物]、聚精氨酸和含游离的氨基的商业可得到的合成聚合物，如分支的聚氮丙啶（PEI）、聚胺N7（CAS29320-38-5）和乙二氨基甲基聚苯乙烯（CAS177987-93-8）。

在期望的实施方案中，聚-L-赖氨酸是α-聚-L-赖氨酸或ε-聚-L-赖氨酸。聚-L-赖氨酸的赖氨酸残基在羧基与α（α-PLL）或ε（ε-PLL）胺基之间通过肽键连接。期望的聚-L-赖氨酸是α-聚-L-赖氨酸。α-聚-L-赖氨酸是化学合成的，并可以获得为多种分子量，例如0.5-300KDa。ε-聚-L-赖氨酸是通过细菌发酵产生的基本氨基酸L-赖氨酸的小型天然均聚物，例如ε-聚-L-赖氨酸可以分离自小白链霉菌，并具有大约4000Da的平均分子量。

认为聚阳离子在形成基质疫苗的方法中执行两个功能：1)作为带负电荷的抗原聚合物的平衡离子和2)在含伯胺的聚阳离子和与胺基反应的交联剂情况下，通过与其他聚阳离子分子或载体蛋白质分子形成交联来帮助形成基质。聚阳离子的这些性质都将允许改进蛋白质基质中抗原的包载，从而改进PCMV颗粒形成的产率。这可以在图1中观察到，其中在加入αPLL的情况下，包载在基质中的多糖的量从5%提高到了50%以上。

由于缀合物疫苗的形成还受到抗原与载体蛋白质之间的点荷排斥负影响，所以聚阳离子的使用还可以改进缀合的有效性。由于许多缀合化学涉及通过载体蛋白质的伯胺基（例如，赖氨酸残基）聚合物连接聚合物与载体蛋白质，所以使用不含伯胺的聚阳离子如聚精氨酸对于避免聚合物抗原与聚阳离子的缀合是有益的。然而，还可以将含伯胺的聚阳离子用于辅助制备基质疫苗，其中有意地将多糖与基质共价连接（交联）。改进抗原包载和基质形成所需的聚阳离子的量、大小和类型取决于聚合抗原的组成、负电荷的程度、大小、胺（或其他反应基团）功能性，以及二级或三级结构。此外，如果将一种以上的聚合抗原加入到基质疫苗反应（多价疫苗）中，聚合物之间的相互作用可以影响在改进包载中最好的聚阳离子。这可以在以下实施例5、6、8和9中所示的三价、13价和23价PPS-PCMV实验中观察到。当将具有4000Da平均分子量的ε-PLL用于三价PCMV反应时，PPS4、PPS18C和PPS23F的多糖包载是最适当的，并且尽管与仅多糖比较，改进了多糖抗原的免疫原性，但它们比不上用缀合物疫苗观察到的水平。然而，当将ε-PLL用于制备13价PPS-PCMV时，与三价PPS-PCMV比较，PPS4和PPS18C的免疫原性分别提高了3.4倍和107倍，提示由于13价PPS反应中与其他多糖的相互作用，ε-PLL改进了这两种多糖的包载。三价反应中α-PLL（150-300kDa）的使用进一步改进了PPS4的免疫原性，引起了比13价PPS PCMV引起的GMT高132倍的GMT。然而，制备23价PPS-PCMV中α-PLL（150-300kDa）的使用似乎导致了更少的PPS4包载，因为在该PCMV中PPS4的GMT比三价PPS/α-PLL PCMV少2650倍，提示23价反应中的其他多糖对用α-PLL（150-300kDa）的PPS4的包载具有负影响。通过检查如通过大小排阻层析测定的聚阳离子引起多糖抗原向更高分子量转移的能力，可以经验地测定用于包载每一各个多糖或其他抗原或者多糖或其他抗原组的聚阳离子组分的最佳量、大小（分子量）和组成。可以在本文中所示的和在下文所讨论的几个附图中观察到这种转移，表明抗原与更大尺寸颗粒的结合，因为抗原被包载并且与蛋白质基质结合。

疫苗组合物

可以在例如儿科疫苗中组合使用本发明疫苗组合物，包括PCMV。此外，可将本发明疫苗组合物用于针对例如肺炎球菌感染、流感嗜血杆菌B型（“HiB”）感染、链球菌属（A组和B组）感染、脑膜炎奈瑟氏球菌（例如，脑膜炎奈瑟菌）感染接种，并可用作为针对革兰氏阴性细菌（例如，铜绿假单胞菌、土拉热弗朗西丝氏菌（Francisella tularensis）、志贺氏杆菌属（Shigella）的物种、肠道沙门氏菌血清型、不动杆菌属（Acinetobacter）的物种、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）的物种和大肠杆菌）的荚膜和O抗原疫苗。

疫苗制剂期望地包括至少一种载体蛋白质、一种或多种目的抗原、至少一种聚阳离子，以及可药用载体或赋形剂（例如，磷酸铝、氯化钠、无菌水）。疫苗组合物还可以包括用于增强制剂的免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统、明矾或者本领域已知的其他系统或其他可药用赋形剂。在生理条件下不溶的抗原/载体蛋白质/聚阳离子基质复合物期望地在施用给受试者后减缓抗原释放。期望地在含可药用赋形剂的悬浮液中递送该复合物。然而，抗原/载体蛋白质/聚阳离子基质复合物还可以是在生理条件下可溶的。

通常，对于皮下注射，蛋白质基质疫苗组合物的体积为约0.5ml，对于肌肉内注射，体积为0.5ml，对于皮内注射，体积为0.1ml或者对于经皮肤的施用，体积为0.002-0.02ml。0.5ml剂量的蛋白质基质疫苗组合物可以含有大约2-500μg的用大约2-500μg的载体蛋白质/聚阳离子基质包载的抗原。在期望的实施方案中，在0.5ml剂量中，大约10μg的抗原是用大约10μg的载体蛋白质/聚阳离子基质包载的。抗原与载体蛋白质/聚阳离子的摩尔比率期望地为1比10（例如，1份抗原比2份载体/聚阳离子或者1份抗原比3份载体/聚阳离子等，直到1份抗原比10份载体蛋白质/聚阳离子）至10比1（例如，10份抗原比1份载体/聚阳离子或者9份抗原比1份载体/聚阳离子等）之间。在期望的实施方案中，抗原与载体聚阳离子的摩尔比率为1比1。备选地，按干重计，抗原与载体蛋白质/聚阳离子的比率期望地为1比10至10比1之间（例如，按干重计，1比1）。

由于抗原/载体蛋白质/聚阳离子基质复合物在胃中可以降解，所以期望的是肠胃外施用疫苗组合物（例如，通过皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内或皮内注射）。尽管期望的是通过物理渗透皮层的方法（例如，注射针、气枪或磨擦）进行递送，但本发明疫苗组合物还可以通过透皮吸收施用。

特别地，可以例如通过肌肉内注射、皮内注射或用合适的免疫佐剂经皮免疫来施用本发明疫苗组合物。本发明疫苗组合物可以施用一次或多次，通常包括旨在增强受试者中抗体产生的第二次施用，以防止由于对应于疫苗中包含的抗原的感染物的感染。获得期望的免疫应答或免疫力水平的疫苗的频率和量取决于疫苗的特异性活性，并可以通过常规实验容易地测定。例如，对于婴儿，疫苗方案可以为在大约4至8周间隔每次0.5ml的三次剂量（从第二月龄开始），然后在大约12至15月龄时0.5ml的第四次剂量。对于一些疫苗，第五次剂量期望地在4岁至6岁之间。

尽管通常施用第一次剂量时的年龄为2个月，但可以将疫苗施用给小至6周龄的婴儿。对于成人，在2-8周的间隔给予两次或两次以上0.5ml剂量通常足以提供长期保护。对于成人和11岁以上以前免疫的儿童，期望地每十年给予一次增强剂量。

本发明疫苗组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以储存于冷冻-干燥（冻干）条件，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体。可以在可药用载体例如氢氧化钠凝胶（alumhydroxide gel）、佐剂制备物或盐水中配制本发明的疫苗，并然后例如通过肌肉内注射、皮内注射或用合适免疫佐剂的经皮免疫施用。

本发明还包括含有本文中所述疫苗（例如，PCMV）的试剂盒。本发明试剂盒还可以包括以本文中所述的疫苗接种方法使用试剂盒的说明。

可以通过使用用于在免疫的受试者中测量抗体滴度的标准方法，测定免疫方案的有效性。一般而言，认为大约1μg/ml的平均抗体滴度（期望地IgG滴度）指示了长期保护。

本发明提供了含有用载体蛋白质/聚阳离子基质包载的目的抗原的疫苗组合物、制备该疫苗组合物的方法，以及疫苗施用的方法。已经发现，通过将聚阳离子，例如聚-L-赖氨酸加入到蛋白质基质中，改进了PCMV形成的效率，以及因此其作为疫苗的成本有效性。此外，聚阳离子在改进用于产生常规缀合物疫苗的缀合反应的效率中也是有益的，其中聚合物抗原与载体蛋白质共价结合，因此制备了更具成本有效性的缀合物疫苗。简言之，如本文中所教导，掺入了聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物与仅由抗原或包载在不含聚阳离子的载体蛋白质基质中的抗原组成的组合物比较，具有增加的免疫原性。认为在含聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物中改进的免疫原性是由于改进了多糖抗原在蛋白质/聚阳离子基质中的包载，与相同剂量的不含聚阳离子的疫苗比较，其允许疫苗剂量中更高水平的抗原。如本文中所讨论，细菌的多糖荚膜由重复的糖组成，并且对于许多病原体细菌而言，这些荚膜携带净负电荷。荚膜的负电荷可能会排斥基质蛋白质，导致差的多糖抗原包载。为了抵消该负电荷，可以将聚阳离子，例如聚-L-赖氨酸（PLL）加入到PCMV反应中。此外，通过形成其他PLL分子或载体蛋白质分子之间的交联，含聚阳离子如PLL的伯胺还可以帮助基质形成。

尽管以下实施例描述了在蛋白质基质疫苗的形成中使用聚阳离子的实施方案，但也可以在常规缀合物疫苗的产生中类似地使用聚阳离子的有益用途。

通过提及特定的实施例、实施方案和附图，下文描述了本发明，其目的是说明本发明而不是限制其范围。不应将以下实施例理解为限制。

实施例1：Vi-CRM197-αPLL PCMV

使用来自肠道沙门氏菌血清型Typhi作为抗原，使用无毒的白喉毒素CRM197作为载体蛋白质（在Matrivax Research and DevelopmentCorporation，Boston,MA，美国制备），以及α-聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）作为聚阳离子，研究了在基质疫苗组合物中添加聚阳离子的作用。

Vi是由在C-3可变的O-乙酰化(α1-4)-D-GalANAc组成的高阴离子均聚合物。目前经批准的用于伤寒的疫苗之一是

（Sanofi PasteurSA），其含有作为抗原的非缀合的Vi多糖。在最初的研究中，为了测试是否可将蛋白质基质疫苗成功地用于递送Vi抗原并引起免疫应答，在含4mg/mL Vi作为抗原和4mg/mL CRM197作为基质形成载体蛋白质的反应物中制备PCMV。通过将戊二醛添加为交联剂启动基质形成。在持续振动的情况下，在4℃温育24小时后，在2.6×10cm Sepharose CL2B柱上分离反应物，并收集高分子量级分，用明矾作为佐剂，并用于免疫小鼠。使用反应后转移到更高分子量的Vi的量，据估计，在蛋白质基质中包载了PCMV反应中<5%的Vi。PCMV组合物中抗Vi抗体滴度比仅多糖（对照）高大约3倍，也比通过当前市售的Vi多糖疫苗引起的滴度低。相反，Vi缀合物疫苗，例如Vi-CRM197在文献中显示引起的滴度比仅多糖高40-100倍。参见，例如Rondini等人，2011,Clinical and VaccineImmunology，18：460-468；Cui等人，2010，Clinical and VaccineImmunology，17：73-79；An等人2011Vaccine44：7618-7623Micoli等人，2011，Vaccine，29：712-720。

认为与缀合物疫苗比较，Vi PCMV颗粒的差免疫原性可能是由于Vi在CRM197基质中差的包载、PCMV颗粒从未包载的（游离的）Vi中差的分离或二者。

由于Vi的高价阴离子性质，推测Vi在关键的交联步骤期间排斥CRM197，并干扰进入PCMV颗粒的有效包载。

最初，研究了将盐加入到PCMV中，以降低电荷排斥；然而，交联后形成了不溶的沉淀。

研究了聚阳离子对PCMV方法的作用：使用聚-L-赖氨酸（PLL）制备了用于第一次免疫实验的两种PCMV，每一PCMV反应含4mg/ml Vi、4mg/ml CRM197和0.01%α-聚-L-赖氨酸（150-300kDa）。在加入作为交联剂的0.25%戊二醛和作为载体蛋白质的CRM197之前，在持续振动的情况下室温温育Vi和α-聚-L-赖氨酸（α-PLL）15分钟。将来自肠道沙门氏菌血清型Typhimurium的0.01mg/mL鞭毛蛋白（Flg）作为佐剂添加剂加入到一种反应混合物中。在持续振动的情况下4℃放置24小时之前，在持续振动的情况下室温继续温育另外10分钟。在2.6×30cm SephacrylS-1000上实施PCMV反应物的分离。在柱子上分离反应产物后，分别使用microBCA（Pierce Chemical）和Stains-All（Sigma Chemical）测定试剂盒测定蛋白质和多糖水平。大约20%的Vi转移到高分子量并与蛋白质的峰共洗脱，表明Vi被包载在载体蛋白质/聚阳离子基质内（图2）。收集并合并这些高分子量级分（参见，图2，加框的级分），用明矾佐剂化，并用于免疫。

用10μg PCMV形式的Vi、仅Matrivax Vi或

伤寒Vi多糖疫苗（Sanofi Pasteur SA）两周三次的间隔免疫5只BalBC小鼠组（Jackson Laboratories）。最后一次免疫后3周处死小鼠，并通过ELISA测定法测定Vi特异性抗体的水平。表1中显示了来自上述免疫的终点几何平均滴度（GMT）。

表1.用αPLL制备的Vi-CRM197PCMV的免疫原性

从这些结果中可以看出，通过在反应中使用α-PLL，PCMV引起的抗Vi抗体滴度比用仅Vi多糖观察到的那些抗Vi抗体滴度高40倍（表1）。此外，在含α-PLL的PCMV中掺入少量鞭毛蛋白导致了甚至更高的具有GMT的抗Vi抗体滴度，其比用仅Vi多糖的免疫高300倍，并且比没有鞭毛蛋白的PCMV高7.5倍。鞭毛蛋白的存在不会影响PLL包载的Vi的量（数据未显示）。

有趣地，聚-L-精氨酸（PLA）（其也是聚阳离子并含有与PLL相同程度的正电荷，但其不含重复的伯胺）不会改进Vi包载（数据未显示），表明PLL不仅抵消了Vi的负电荷，还通过与其他PLL分子和CRM197交联，辅助了基质形成。

实施例2：Vi-CRM197-αPLL PCMV的改进的分离

为了从PCMV颗粒中更好地去除低分子量种类（假定为未包载的、未缀合的抗原聚合物），使用更长的（90cm）大小排阻柱。特别地，制备含4mg/ml Vi、4mg/ml CRM197和0.01%α-聚-L-赖氨酸（150-300KDa）的PCMV交联反应混合物。在加入0.25%戊二醛和CRM197之前，在持续振动的情况下室温温育Vi和αPLL15分钟。在持续振动的情况下室温继续温育另外10分钟，然后在持续振动的情况下4℃温育24小时。在SEC柱上分离反应产物后，分别用microBCA和stains-all测定法测定蛋白质和多糖水平。为了测定PCMV颗粒的大小或分子量是否会影响其免疫原性，收集了来自SEC柱的3个不同洗脱点的级分，并用于免疫。图3中图解了库选择。库1和库2在其从柱子洗脱方面没有显著不同，然而，怀疑库3比库1和2具有更低的分子量，并含更多的未包载Vi。

使用10μg来自主题组合物的Vi，通过每两周三次注射，免疫5只小鼠组。在其最后一次免疫后3周处死小鼠，并通过ELISA测定法测定Vi特异性抗体的水平。比较了来自以上免疫的终点GMT（表2）。

PLL和改进的大小分离的组合允许我们制备可以引起抗Vi抗体滴度的Vi-CRM197PCMV，其比仅Vi高485倍至1400倍，并且比

伤寒疫苗高22倍（表2；库1和2）。

表2.Vi-CRM197-αPLL PCMV的不同大小级分的免疫原性

尽管来自库3的PCMV的GMT比仅Vi高44倍，并且比市售的

伤寒疫苗高1.3倍，但其比库1和2引起的那些GMT低。这可能是由于PCMV更低的分子量和/或更大量未包载的或“游离的”Vi的存在。

实施例3：PPS18C-CRM197-αPLL PCMV

在使用α-PLL改进Vi包载的情况下，我们接下来测试了α-PLL是否会改进更少负电荷的肺炎球菌多糖PPS18C的包载。不同于Vi，其中每一糖残基都是带负电荷的，PPS18C的每5个糖残基仅具有一个负电荷。然而，在PCMV反应中纳入0.04%α-PLL（15-30kDa）导致SEC分离时35%的多糖从较低分子量向较高分子量组分转移（图4）。PCMV反应物中存在的大多数CRM197还与高分子量级分共定位。通过使用捕获ELISA测定法显示，高分子量级分中存在的多糖都被捕获在PCMV颗粒中，其中PCMV颗粒通过抗CRM197抗体与ELISA平板结合，并且使用血清型特异的抗血清检测多糖（数据未显示）。

实施例4-增加的PLL增加了PCMV中的Vi包载

使用0.01%和0.02%的αPLL（150-300kDa）和0.04%αPLL（15-30kDa）、4mg/mL Vi和4mg/mL CRM197进行PCMV交联反应。在500mL（90cmx2.6cm）Sepharcryl S-1000柱上分离反应物，并分别使用microBCA和Stains-all测定法分析级分的蛋白质和多糖（图5）。随着PLL（150-300kDa）浓度从0.01%增加到0.02%，包载的Vi的量从15%增加到21%。增加的Vi包载对PCMV的免疫原性没有影响，其中使用两种PLL浓度合成PCMV引起的Vi抗体滴度比仅Vi高14至20倍和比

伤寒疫苗高2至3倍（数据未显示）。当使用0.04%的较小α-PLL（15-30kDa）时，包载的Vi的量增加至64%。用较低分子量PLL增加的包载并没有导致相对于仅Vi改进的PCMV的免疫原性（数据未显示）。我们推断，更高浓度的较低分子量α-PLL（15-30kDa）可能掩盖了Vi表位（数据未显示）。

实施例5：三价PCMV

为了研究聚阳离子对PCMV的有益作用是否可用于多价PCMV，制备了掺入肺炎球菌多糖抗原PPS18C、PPS4和PPS23F的三价肺炎球菌疫苗。PCMV制备如下：PCMV反应混合物含有5mg/ml总多糖（大约1.7mg/ml每一PPS18C、PPS4和PPS23F）、1mg/ml CRM197和0.04%ε-聚-L-赖氨酸（4kDa，Bainafo Bioengineering Co.Ltd.，Zhengzhou，PRC）。在加入作为交联剂的0.25%戊二醛和作为基质蛋白质的CRM197之前，在持续振动的情况下室温温育多糖和ε-聚-L-赖氨酸15分钟。在持续振动的情况下4℃放置24小时之前，在持续振动的情况下室温继续温育另外10分钟。在2.6×90cm Sephacryl S-1000柱上实施PPS18C/PPS4/PPS23-CRM197-εPLL PCMV的分离。分析级分，对于多糖，使用蒽酮测定法，对于蛋白质，使用MicroBCA，并且对于PCMV颗粒中每一多糖的包载，使用捕获ELISA（参见图5）。蒽酮测定法是用于检测己醣的比色测定法，随后在浓硫酸中水解。Trevelyan，等人，1952，“Determination of Yeast Carbohydrates with the Anthrone Reagent”，Nature，170（4328）：626–627。对于PPS4，观察到了强阳性捕获ELISA（数据未显示）；然而，用PPS18C和23F观察到了弱信号。合并含在捕获ELISA中为阳性的高分子量多糖的级分（参见图6，加框的级分）、用明矾作为佐剂，并用于免疫。

使用与如上所述的Vi-PCMV相同的剂量方案免疫10只小鼠组。对于三价分批的PCMV，每一剂量含有2μg每一种PS或6μg总多糖。将缀合物疫苗（除6B外，其含有每一剂量2.2μg的每一种PS，对于总的30.8μg PPS，所述6B为4μg）施用给一组小鼠作为阳性对照，用于与PCMV诱导的抗体应答比较。还用仅抗原免疫一组小鼠，即在13价中发现了13种未缀合的多糖抗原，对于每一剂量总的26μg总多糖，每一种多糖为2μg。还包括了作为阴性对照组的幼稚（未免疫接种）小鼠组。

第三次免疫后约2.5周（第47天），对全部小鼠实施安乐死，并通过心脏穿刺收集血液。通过用于识别PPS4、PPS18C和PPS23的抗原特异性IgG抗体应答的PPS特异性ELISA分析免疫血清。根据来自免疫动物的各个血清的滴度，计算抗PPS IgG几何平均抗体滴度（GMT）。结果显示于下表3中。

表3.三价PPS18C/PPS4/PPS23-CRM197-εPLL PCMV抗体滴度

如表3中所示，含ε-PLL的分批的PCMV引起了比仅多糖高179倍的抗PPS4GMT、比仅多糖高29倍的抗PPS18C GMT，以及比仅多糖高53倍的抗PPS23F GMT。对于PPS4、PPS18C和PPS23F，这些GMT分别比缀合物疫苗低37倍、低8.3倍和低2.8倍。尽管分批的三价PCMV引起的滴度没有

缀合物疫苗引起的那些滴度高，但相对于使用仅抗原以及以前不用PLL并使用DNI作为基质蛋白质制备的肺炎球菌多糖PCMV，它们显示出显著的改进。该研究显示了通过在PCMV形成中加入聚阳离子改进多价疫苗以及单价疫苗的免疫原性的可行性。此外，与常规的缀合物疫苗产生比较，使用PCMV技术的多价疫苗产生的容易性是有明显有利的。

实施例6：分批的13-价肺炎球菌多糖PCMV

制备和测试了目前在

缀合物疫苗中所包括的掺入了肺炎球菌多糖抗原的13价肺炎球菌疫苗，所述多糖即PPS1、PPS3、PPS4、PPS5、PPS6A、PPS6B、PPS7F、PPS9V、PPS14、PPS18C、PPS19A、PPS19F和PPS23F，以进一步研究聚阳离子添加对PCMV基质形成反应混合物的有益作用。

如下制备PCMV：PCMV反应混合物含4mg/ml总多糖（大约0.3mg/ml每一种多糖抗原）、4mg/ml CRM197和0.4mg/mlε-聚-L-赖氨酸（4kDa，Bainafo Bioengineering Co.Ltd.，Zhengzhou，PRC）。在加入0.25%戊二醛作为交联剂和CRM197作为基质蛋白质之前，在持续振动的情况下室温温育多糖和ε-聚-L-赖氨酸15分钟。在持续振动的情况下4℃放置24小时之前，在持续振动的情况下室温继续温育另外10分钟。在2.6×90cm Sephacryl S-1000柱上实施PPS-CRM197-εPLL PCMV的分离。分析级分，对于多糖，使用蒽酮测定法，对于蛋白质，使用MicroBCA，并且对于PCMV颗粒中每一多糖的包载，使用捕获ELISA。合并含捕获ELISA中为阳性的高分子量多糖的级分（参见图7，加框的级分）、用明矾作为佐剂，并用于免疫。

在第0天、第14天和第28天，使用前述剂量方案免疫10只小鼠组。对于13价分批的PCMV，每一剂量含有4μg的总多糖。将

缀合物疫苗（除6B外，其含有每一剂量2.2μg每一多糖，对于总的30.8μgPPS，所述6B为4μg）施用给一组小鼠作为阳性对照，用于与PCMV诱导的抗体应答比较。还用仅抗原免疫一组小鼠，即在13价

中发现了13种未缀合的多糖抗原，对于每一剂量总的26μg总多糖，每一多糖为2μg。还包括了作为阴性对照组的幼稚（未免疫接种）小鼠组。

第三次免疫后约2.5周（第47天），对全部小鼠实施安乐死，并通过心脏穿刺收集血液。通过用于对10种PPS抗原抗原特异性IgG抗体应答的PPS特异性ELISA，分析免疫血清。根据来自免疫动物的各个血清的滴度，计算抗PPS IgG几何平均抗体滴度（GMT）。结果显示于表4中。

图4:13价PPS-CRM197-εPLL PCMV抗体滴度

来自用分批的PCMV制剂免疫的小鼠的血清的终点IgG GMT比用仅PPS免疫的小鼠的GMT显著更高（比仅PPS高8倍至3,000以上）。根据表4中的数据，可以看出，取决于所检查的PPS，使用实际上更少的PPS抗原（PCMV中～0.3μg/PPS对比

中2μg/4μg PPS），含ε-PLL的分批的13价PCMV诱导了与通过用

（2或4μg的每一种PPS）免疫实现的GMT相当的IgG GMT。

根据上表3和表4的免疫学数据，可以明确，含ε-PLL的3价和13价PCMV显示出比不含PLL或其他聚阳离子的先前PCMV更强烈的抗体免疫应答。例如在更长的柱子上，用更高的反应物水平和大小分级分离PCMV再配制，以去除未掺入的多糖抗原和基质蛋白质单体，改进了抗原特异性免疫应答（优于仅抗原）。此外，聚阳离子聚合物α-PLL和/或ε-PLL的加入增加了PS在CRM-197-PCMV基质中的包载效率，并且与不包括α-PLL和ε-PLL的DNI-PCMV制剂比较，引起了3至125倍更强烈的免疫应答（参见实施例7）。从上表中可以看出，通过PLL配制的PCMV诱导的抗原特异性抗体应答有时低于、比得上或者高于通过

缀合物疫苗实现的抗PPS抗原免疫应答的幅度；然而，当提及与

缀合物疫苗中的2μg或4μg的每一种PPS抗原比较，PPS(13)-CRM197-εPLL PCMV含每一剂量0.3μg的每一种多糖抗原时，应当理解，PCMV提供了独特的有效的免疫原性组合物，并且其还可以在一个反应步骤中有效地制备（如与对于生产

疫苗所需的多个分离的缀合反应比较）。

实施例7：混合的和分批分包的13价PPS-DNI PCMV

使用来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原的无毒突变体形式（DNI）作为载体蛋白质制备一系列PCMV。如上所述，用0.25%戊二醛，根据相同的交联反应方法，合成了13种分离的PPS/DNI蛋白质基质疫苗，每一种都含不同的肺炎球菌多糖抗原（PPS）。然后在2.6×15cm的SepharoseCL2B柱上按大小分离PCMV。此外，进行PCMV交联反应，其在相同的PCMV反应物中含4种多糖抗原（分批的抗原）以产生多价PCMV。多价PCMV含有以下抗原“包”：

·包1：PPS3、PPS18C、PPS19F、PPS23F

·包2：PPS4、PPS6A、PPS6B、PPS14

·包3：PPS5、PPS7F、PPS9V、PPS19A

PPS1没有包括在分包的PCMV反应物中，因为其含有重复结构的伯胺，所述重复结构的伯胺在戊二醛存在的情况下可与载体蛋白质共价交联。然后以与单价PCMV相同的方式，通过SEC分离分批的-抗原PCMV。混合13种分离的疫苗组合物，以制备13价混合的PPS-DNI-PCMV。还混合了包含各个PPS1-DNI PCMV的3种分批的抗原PCMV，以制备分批的分包的13价PCMV。然后，使用单价PCMV的混合物或者分批的抗原PCMV的混合物免疫10只小鼠组。对于混合的单价PCMV，给予小鼠2.2μg或6μg的每一种多糖。然而，对于分批的包，除PPS1外（其中递送了2.2μg），在每一剂量中仅递送了0.5μg的每一种多糖。作为对照，用仅13种多糖或缀合物疫苗

免疫小鼠组。除PPS6B外（其为4μg），每一剂量的

含有2μg的每一种多糖。下表5显示了来自用混合物的和分批分包的PCMV免疫的小鼠的抗PPS抗体滴度的总结。

表5.来自混合的13价PCMV的抗PPS抗体滴度

（表5，续）

两种PCMV“混合物”都引起了多糖抗原特异性滴度，其高于通过仅多糖抗原引起的多糖抗原特异性滴度，然而，它们比通过

缀合物疫苗（Pfizer Inc.，美国）引起的滴度低2至200倍。结果显示，与用混合的单价PCMV免疫比较，对于几乎全部抗原，分批抗原PCMV的分包导致了更高的抗体滴度。与比较，PCMV混合物降低的免疫应答可能是由于差的多糖包载和PCMV从游离多糖中的分离，而不是由于每一剂量递送的多糖的量。

实施例8:三价分批的PPS-CRM197-αPLL PCMV和加入的鞭毛蛋白

在用和不用鞭毛蛋白的情况下，制备含PPS4、18C和23F肺炎球菌多糖抗原和CRM197作为基质形成载体蛋白质和聚-L-赖氨酸的三价PCMV。如下制备PCMV：PCMV反应混合物含有4mg/ml总多糖（1.33mg/ml的每一种多糖）、4mg/ml CRM197和0.01%αPLL（150-300kDa）。在加入0.25%戊二醛之前，在持续振动的情况下室温温育多糖和αPLL15分钟。还将0.001mg/mL来自鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的鞭毛蛋白（InvivoGen，San Diego，CA，美国）加入到具有戊二醛的一种PCMV反应混合物中。在持续振动的情况下，室温继续温育另外30分钟。在2.6×90cm Sephacryl S-1000柱上分离PCMV反应产物，并收集和合并高分子量级分（参见图8，加框的级分）。在柱子上分离反应物后，分别使用microBCA和蒽酮测定法测定蛋白质和多糖水平。

如前实施例中所述，使用没有鞭毛蛋白的分批抗原PCMV或具有鞭毛蛋白的分批抗原PCMV免疫10只小鼠组，并用于免疫小鼠。阳性和阴性对照如前实施例中所述。结果显示于表6中。

表6.来自分包的三价PPS-CRM197PCMV的抗PPS抗体滴度

在相当的剂量下，不含鞭毛蛋白的PCMV中，抗PPS4和PPS18抗体滴度分别比仅多糖高59,000倍和3055倍，并且比高11倍和22倍（参见表7）。PPS23F的滴度比仅多糖稍高并且比由

引起的那些滴度低，表明PCMV颗粒中仅包载了低水平的PPS23F。与以前的三价PPS-CRM197-εPLL PCMV数据（参见实施例5）比较的这些数据显示，使用较高分子量αPLL作为聚阳离子导致了PCMV基质中改进的抗原包载以及蛋白质基质中待共包载的抗原的合理选择，通过基质形成反应产物的低分子量组分的例如大小排阻，去除了非免疫原性种类，合适地使用佐剂元素如鞭毛蛋白，以及合理地控制每一剂量包载的和可递送的抗原的量，提供了与目前市场上的缀合物疫苗商业产品相当的和甚至更优的免疫原性的PCMV疫苗组合物。

实施例9：23价PPS-CRM197PCMV

通过在三价PPS-PCMV中使用α-PLL（150-300kDa）观察到多糖包载和免疫原性改进的情况下，使用来自市售疫苗

的23种多糖制备了23价PPS-PCMV。将来自的23种多糖脱盐和浓缩至4mg/mL（每种多糖0.17mg/mL）后，在持续振动的情况下，用0.01%α-PLL（150-300kDa）室温温育15分钟。加入0.25%戊二醛和4mg/mLCRM197，并在4℃持续振动温育24小时之前，在持续振动的情况下室温继续温育10分钟。在2.6cm×90cm Sephacryl S-1000柱上分离PCMV反应物，并分别使用蒽酮测定法和microBCA测定法测定级分中总的多糖和蛋白质的量（图9）。合并图9中通过方框指出的高分子量级分，并用于免疫。

如前面实施例中所述免疫10只小鼠组。阳性和阴性对照如前实施例中所述。结果显示于表7中。

表7.来自23价PPS-CRM197-αPLL（150-300kDa）PCMV的抗PPSGMT

（表7，续）

23价PPS-PCMV引起了对PPS1、PPS14和PPS18C的GMT，其比通过缀合物疫苗

引起的那些GMT高77倍、4.9倍和134倍，而PPS3和PPS19F的GMT与通过引起的GMT相当。在根据本发明的23价PCMV中，每一剂量仅递送了0.26μg的每种多糖，而每一剂量的

含有2.2μg的每种多糖（除PPB6B外，其为4μg），表明对于低7倍剂量的几种多糖，23价PCMV能比

引起更高的滴度。尽管在该免疫原性实验中，测试的其他多糖的GMT比通过

引起的那些GMT低，但通常它们仍比仅多糖高。

在本说明书中引用的或者提及的所有专利、专利申请、专利申请出版物和其他出版物都在此处引用作为参考，就如同每一独立的专利、专利申请、专利申请出版物或出版物被明确和单独地说明被引用作为参考一样。

Claims (19)

1.免疫原性组合物，其包含(1)一种或多种目的抗原，(2)一种或多种载体蛋白质和(3)一种或多种聚阳离子，其中所述载体蛋白质和任选地所述聚阳离子交联以形成蛋白质基质，并且所述目的抗原被所述蛋白质基质包载。

2.权利要求1的组合物，其中所述聚阳离子选自：聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸、分支的聚氮丙啶（PEI）、亚精胺、精胺、脱乙酰壳多糖[2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcN）和2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖（GlcNAc）的β-(1-4)连接的共聚物]、聚胺N7（CAS29320-38-5）和乙二氨基甲基聚苯乙烯（CAS177987-93-8）。

3.权利要求2的组合物，其中所述聚阳离子是聚-L-赖氨酸（PLL）。

4.权利要求3的组合物，其中所述聚-L-赖氨酸是α-聚-L-赖氨酸（α-PLL）或ε-聚-L-赖氨酸（ε-PLL）。

5.权利要求4的组合物，其中所述聚-L-赖氨酸是α-聚-L-赖氨酸（α-PLL）。

6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述组合物包含具有大于50nm直径的平均颗粒大小的蛋白质基质颗粒。

7.权利要求6的组合物，其中所述组合物包含具有大于100nm–2000nm的平均颗粒大小直径的蛋白质基质颗粒。

8.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗原与所述载体蛋白质的摩尔比为1比10至10比1之间。

9.前述权利要求中任一项的组合物，其中聚阳离子与反应混合物的百分比为0.005至0.10%。

10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述目的抗原包含两种或两种以上抗原。

11.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述目的抗原是多糖。

12.权利要求11的组合物，其中所述多糖选自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）多糖、土拉热弗朗西丝氏菌（Francisellatularensis）多糖、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）多糖、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）多糖、伤寒沙门菌（Salmonella Typhi）多糖、弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）多糖、沙门氏菌属（Salmonella）物种的多糖、志贺氏菌属（Shigella）多糖或脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriameningitidis）多糖。

13.权利要求12的组合物，其中所述肺炎链球菌多糖选自荚膜型3型、4型、6B型、7A型、7B型、7C型、7F型、9A型、9L型、9N型、9V型、12A型、12B型、12F型、14型、15A型、15B型、15C型、15F型、17型、18B型、18C型、19F型、23F型、25A型、25F型、33F型、35型、37型、38型、44型或46型。

14.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述一种或多种载体蛋白质选自白喉类毒素、CRM197、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白质、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）Hcp1蛋白质、大肠杆菌热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白质、李斯特菌溶胞素O、来自全细菌细胞的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原的显性失活抑制剂（DNI）突变体或大肠杆菌β半乳糖苷酶。

15.制备免疫原性组合物的方法，包括(i)将目的抗原与载体蛋白质和聚阳离子混合以形成混合物和(ii)交联所述载体蛋白质和聚阳离子以形成包载所述目的抗原的载体蛋白质基质。

16.在哺乳动物中引起针对目的抗原的免疫应答的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用根据权利要求1-14中任一项的免疫原性组合物。

17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物是人。

18.疫苗组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项的两种或两种以上的免疫原性组合物。

19.对受试者接种针对感染物的方法，所述方法包括将根据权利要求1-14中任一项的组合物以足以引起免疫应答的量施用给受试者。

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