CN103732292B - 从鲑科鱼卵孵化液生产美容组合物的方法以及所述组合物改善皮肤美容外观的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从鲑科（Salmonidae）孵化液获得或可以从其获得的美容组合物，生产所述组合物的方法以及它们在各种针对皮肤的美容应用中的用途，尤其是用于减少或防止哺乳动物皮肤中在外观上出现或盛行皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛、皮肤干燥、起皮和/或经皮水分散失。

Description

从鲑科鱼卵孵化液生产美容组合物的方法以及所述组合物改 善皮肤美容外观的用途

本发明涉及包含可源自于鲑科（Salmonidae）孵化液的多肽或多肽部分的组合物在用于皮肤的各种应用中的用途。具体来说，所述组合物可用于改变、优选改善老化皮肤的美容外观。

皮肤是更易受伤的人体器官之一。皮肤总是与外界刺激直接或间接地相互作用，并且常常暴露于环境因素并受其影响。事实上，皮肤可以被看做与外部世界接触的前线。这种持续的暴露能够引起皮肤、特别是皮肤美容外观的令人不快和/或不想要的物理和可见变化。尽管这样的变化可能不危及个体的健康，但这样的变化可能令人身体不适或看起来不舒服。事实上，由于皮肤清晰可见，因此皮肤外观的变化能够引起心理压力。因此，对维持、恢复或改善皮肤状况、特别是恢复皮肤的青春外观的有效处理，存在着持续不断的需求。

皮肤形成人体的最大器官，占个人重量的约12-16%。它作为外部世界和我们体内受控环境之间的屏障和调节势力两者，执行许多至关重要的作用。

皮肤由3层构成，即表皮、真皮和皮下组织。表皮是皮肤最外部的上皮层。它充当物理屏障，防止身体水分流失，并防止物质和有机体进入体内。它的厚度随身体部位而变。

表皮由分层的鳞状上皮构成，即它由扁平细胞的层构成。皮肤、毛发和指甲是角质化的，意味着它们具有由被称为角蛋白的蛋白质构成的死亡的、硬化的疏水表面。由于表皮的与角化细胞相关的细胞外脂类的含量，使表皮不具有渗透性，尤其是在表皮的中间层（透明层）中。粘膜（例如食道、口咽腔、生殖器官等的粘膜）主要是非角质化且潮湿的。表皮具有三种主要细胞类型，即角化细胞（皮肤细胞）、黑素细胞（产色素细胞）和朗氏细胞（免疫细胞）。梅克尔细胞是第四种表皮细胞，其较不普遍。

角化细胞随着向外移动而成熟和分化，并伴有角蛋白的累积。它们最终起皮或擦落。它们形成四个或五个明显不同的组织层，从最浅表到最深处为：（i）角质层，其具有无细胞核的死亡干透的坚硬细胞；（ii）颗粒层，其具有含有嗜碱性颗粒的细胞并在向外方向上通过薄的透明层与角质层隔开；（iii）有棘层（多刺、刺状或棘细胞层），其中细胞随着向上移动变得越来越扁平，以及（iv）基底层，其具有柱状（长的）再生细胞。

紧靠表皮下方的是基膜，其是位于表皮与真皮之间的特化结构。

真皮是皮肤的纤维结缔组织或支持层。主要纤维是交织的胶原蛋白纤维和弹性蛋白。

皮下组织是紧靠真皮和表皮下方的脂肪层。它也被称为皮下的组织、下皮或膜。皮下组织主要由脂肪细胞、神经和血管构成。

在皮肤的下层，颗粒层中产生新的上皮皮肤细胞。细胞随时间向皮肤表面迁移并变得更加酸性。在其30天的迁移期间，它们死亡并被角蛋白饱和。角蛋白和相关的脂类是重要的，因为它们保护皮肤抵御外部因素。

许多因素可能造成皮肤美容外观劣化，这些因素包括疾病、受伤、环境因素、年龄、激素水平、药物、外部施加的或摄入的材料、遗传状况或这些与其他因素的组合。与衰老相关的皮肤美容外观劣化是普遍的因素，特别是光老化即皮肤日射病（Dermatoheliosis）。这种劣化可以在皮肤中的不规则或异常处看到，其可能表现为例如皮肤干燥、皱纹、细纹、松弛加重（松垂）或色素沉着改变。

光老化是用于由长期UVA和UVB暴露引起的特征性变化的术语。生物功能和管控代谢应激的能力的降低，是所述老化过程的主要结果之一。老化是复杂的渐进性过程，其也引起皮肤的功能和美观变化。

光老化是归因于皮肤连续长期暴露于约245-290nm的紫外（UV）辐射的皮肤老化过程，所述紫外辐射可以来自于自然光或合成光。因此，光老化也被称为由UVA和UVB射线引起的皮肤老化，特别是面部、耳、颈部和手的皮肤老化。

皮肤干燥和/或起皮是老化皮肤的最常见征兆之一。尽管某些个体更易于发生皮肤干燥和/或起皮，但皮肤干燥和/或起皮的出现能够影响任何人，而与年龄、性别或皮肤类型无关。

当皮肤外层（具有透明层的角质层）的水通过例如经皮水分散失（TEWL）而耗尽时，发生皮肤干燥。当这一层被良好保湿时，它使通过皮肤的失水最小并有助于抵御刺激物、过敏原和微生物。然而，当角质层干透时，其保护功能下降。这使得失水更多，导致皮肤易于受到环境因素的影响。

理想情况下，角质层具有10%至30%的水含量。这种水使得皮肤柔软、平滑并具有柔性质地，即与皮肤的青春外观相关的特征。所述水来自大气、皮肤的基底层和汗。由皮肤腺产生的油和由皮肤细胞产生的脂肪物质充当天然保湿剂，允许角质层锁住水分。

身体通过蒸发从皮肤表面连续损失水（TEWL）。在正常条件下，损失速率缓慢，且水可充分更替。当失水超过水的更替且角质层的水含量降低至低于10%时，出现皮肤干燥的特征性迹象和症状。

改善或消除皮肤干燥和/或起皮，从而改善皮肤的美容外观的保湿剂，是非常合乎需要的。尽管在本领域内已知许多保湿剂，但对有效且温和的天然产品仍存在需求。

表现出不想要或过量色素沉着、即色素沉着过度的表皮细胞，例如黄褐斑，是老化皮肤的另一种常见征兆。传统上，可以使用去角质处理来除去对皮肤的美容外观不利的表皮细胞。

去角质处理移除表皮的外层以露出下面更新的皮肤细胞。去角质可以通过物理手段（例如磨皮）或通过化学手段来实现。化学去角质剂包括含有水杨酸、乙醇酸、水果酶、柠檬酸或苹果酸的磨砂剂，并且可由皮肤科医生以高浓度使用，或在非处方产品中以较低浓度应用。化学去角质可涉及使用含有α-羟基酸（AHA）或β-羟基酸（BHA）或酶的产品，其起到使在细胞连接处将细胞保持在一起的胶状物质松散而使其渐渐松开的作用。这种类型的去角质被推荐用于人们处理痤疮。

去角质处理的最大缺点是用于实现所述去角质处理的一些产品和方法的高价格。去角质在开始时将导致皮肤有些变红。在化学剥皮接近结束时，皮肤将产生霜层（frost），其颜色在皮肤表面上从亮白色到灰色不等。

因此，与去角质处理相比对皮肤更加温和的减少皮肤色素沉着过度的有效方法，是合乎需要的。

因此，对适合于促进皮肤美观的处理仍存在需求。换句话说，改善皮肤美容外观的方法是合乎需要的。具体来说，对于恢复老化皮肤的青春外观和/或对抗皮肤老化征兆的方法，存在需求。

现在已经令人吃惊地发现，包含在鲑科孵化液中发现的某些分子、即多肽或多肽部分的组合物，对于改善皮肤的美容外观，特别是减少与皮肤老化相关的物理征兆或症状来说，是显著有效的。

鱼胚的孵化通过被称为孵化酶的能够降解蛋白质卵壳的各种酶来实现。所有脊椎动物的卵母细胞具有被称为卵黄被膜、卵壳或蛋壳的细胞外被膜，其由各种多肽的交联构成。具有不同特异性的蛋白酶作用于蛋壳以分解卵壳并促进鱼胚的释放。因此，胚胎在其中孵化的流体包含大量多肽和多肽部分，即降解产物。

已令人吃惊地发现，包含源自于鲑科孵化液的蛋白质和多肽部分的组合物对皮肤的美容外观具有显著效果。尽管不希望受到理论限制，但实施例证实，包含鲑科孵化液多肽和多肽部分的组合物能够恢复皮肤的青春外观。据认为，在本文定义的组合物中多肽和多肽部分的组合（其被认为包含至少50种不同的多肽或多肽部分），可以与皮肤的真皮和表皮中存在的不同类型的蛋白质相互作用。据信，多肽和多肽部分的组合可以协同作用，并且这些相互作用可能至少部分造成了所述组合物对皮肤的美容/美学外观的效果。

因此，在最广泛意义上，本发明可以被视为提供了一种包含可源自于鲑科孵化液的多肽和多肽部分的组合物，所述组合物用于促进皮肤的美观或用于促进皮肤美观的方法中。换句话说，一种如本文所描述的包含可源自于鲑科孵化液的多肽和多肽部分的组合物，所述组合物用于改善皮肤的美容外观或用于改善皮肤美容外观的方法中。在特别优选情况下，本发明可以被视为提供了本文中描述的包含可源自于鲑科孵化液的多肽和多肽部分的组合物，所述组合物用于恢复老化皮肤的青春外观和/或对抗皮肤老化的征兆，或用于获得这种效果的方法中。上面提到的组合物在本文中也被称为“鲑科孵化液提取物”。除了多肽和多肽部分之外，所述提取物还可以包含本源的非蛋白质材料。

从下面的公开内容可以明显看出，本文中描述的包含可源自于鲑科孵化液的多肽和多肽部分的组合物可以被提供为美容组合物，其包含一种或多种药学可接受的赋形剂和/或稀释剂。

因此，一方面，本发明提供了从鲑科孵化液（例如鲑鱼孵化液）制备本文中描述的美容组合物的方法，所述方法至少包括下列步骤：

a）将鲑科鱼卵悬浮在最小体积（例如等于卵的体积或更少）的水中；

b）诱导所述卵的同步快速孵化（优选地使对于超过95%的胚胎来说，孵化在不到2小时内完成）；

c）任选地，对所述孵化的卵进行过滤以获得孵化液；以及

d）对所述孵化液进行过滤以获得所述多肽和/或组合物，其中过滤所述孵化液的步骤至少包括下列步骤：

（i）使用孔径大小为至少5μm、优选地5-15μm、特别优选地孔径大小为7μm的滤器过滤所述孵化液，并收集滤液；

（ii）使用孔径大小为0.30-0.60μm、优选地孔径大小为0.35-0.55μm、特别优选地0.40-0.50μm、最优选地0.45μm的滤器过滤来自于步骤（i）的滤液，并收集滤液；

（iii）用药学可接受的缓冲液交换来自于步骤（ii）的滤液中的水；

（iv）使用孔径大小为0.15-0.30μm、优选地孔径大小为0.22μm的滤器过滤来自于步骤（iii）的溶液，并收集滤液；以及

（v）从来自于步骤（iv）的滤液制备所述美容组合物。

交换所述滤液中的水的步骤可以使用本领域已知的任何适合方法例如渗滤或透析来进行。在特别优选实施方式中，这一步骤使用排除尺寸小于15kDa、优选地10kDa或更小例如9、8、7、6、5、4、3kDa或更小的滤器，通过渗滤来进行。

渗滤使用超滤膜从溶液中移除例如盐类或其他不想要或不需要的微小溶质，或者作为交换溶液的溶剂例如缓冲剂的方式。小分子与溶液分离，同时较大分子保留在渗余物（不通过滤膜的材料）中。微小溶质和溶剂例如水一般容易地洗过膜。约3倍体积的渗滤溶剂通常将排除95%的微小溶质。因此，上面来自于步骤（ii）的滤液首先通过渗滤进行处理，随着一定比例的溶液（其含有孵化液的可溶性杂质/不想要的级分）通过膜，这导致渗余物浓缩。然后将渗余物用药学可接受的缓冲液例如0.5mM磷酸钠和1mM氯化钠、磷酸盐缓冲盐水等稀释。如果需要，可以对稀释的渗余物进行重复的多轮渗滤。通常，在步骤（iv）之前将渗余物稀释，使得来自于步骤（iv）的滤液具有3000-5000mU/L、优选地3000-4000mU/L、更优选地约3400mU/L的酶活性。滤液的酶活性可以通过滤液切开因子Xa发色底物（CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH，Sigma aldrich产品号：F3301-25MG）的能力来测量。在渗滤步骤之前，孵化液可能包含10至150,000mU/L范围内的酶活性。

因子Xa发色底物（Sigma-Aldrich）被孵化液中存在的酶切割，产生可以使用分光光度分析法在405nm处方便地测量的黄色产物。典型的测定方法包括向包含10μl因子Xa发色底物（10mg/ml）、70μl0.2M Tris-HCl pH8.5和520μl dH₂O的600μl底物溶液添加可以从上述方法的步骤（iii）获得的100μl孵化液。方便的是，可以对吸光值的变化进行5-20分钟，通常10分钟的测量。将结果乘以适合的因数例如10（对于10分钟测定来说），以获得每1ml样品的酶活性。可以使用其他适合且等同的底物来测定孵化液的活性。

同步孵化可以通过本领域已知的任何适合方法来获得。例如，可以使用光操控，例如将卵从光照条件（其抑制孵化）转移到无光条件，使卵同步化。也可以使用溶液温度的操控、脱氧合作用（Oppen-Berntsen等，1990,Aquaculture,86,pp.417-430）和使用电刺激来引起同步孵化。正如上面指出的，水的极小体积可以等于卵的体积或更小，例如对于每1ml卵来说可以使用≤1、0.75、0.5、0.25ml的悬浮液体，例如0.5至1ml。

上述制备美容组合物的方法产生富集的制备物，其优选地基本上不含源自于源材料或分离程序中使用的材料的任何污染性组分，例如粗品孵化液中包含的所述多肽或多肽部分之外的组分。在优选实施方式中，组合物可以被富集到纯度超过30、40、50或60%，例如>70、80或90%的程度，所述纯度以与起始孵化液相比多肽和多肽部分的w/w（干重）来评估，即90%的纯度是指通过制备方法的过程失去90%的起始原料（污染性组分）。然而，可以使用具有较低纯度，例如保留超过40、50、60、70、80或90%的起始原料的组合物。

尽管滤液本身可以形成美容组合物，但任选地，可以将从上述方法获得或可以从上述方法获得的产物（步骤（iv）的滤液）稀释（或浓缩）至适合的浓度，然后将其用于本发明的方法和用途中。因此，方法可以包含另一个稀释（或浓缩）所述组合物的步骤。优选地，可以将滤液稀释（或浓缩）至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、100、1000、5000或10000倍。在特别优选的实施方式中，将来自于上述方法步骤（iii）的溶液稀释或浓缩，以获得当通过上述方法测量时酶活性为1000-10000mU/L的溶液。优选地，所述溶液以及因此来自于步骤（iv）的滤液包含2000-10000、3000-9000、3000-7000、3000-6000、3000-5000或3000-4000mU/L的活性。最优选地，所述溶液包含约3400mU/L的活性。

任选地，可以向从或可以从上述方法获得的产物添加一种或多种药学可接受的赋形剂和/或稀释剂。因此，方法可以包括向组合物添加一种或多种药学可接受的赋形剂和/或稀释剂，或者将组合物与一种或多种药学可接受的赋形剂和/或稀释剂合并的另一个步骤。可选的或附加的制备方法步骤包括改变或修改溶剂，例如pH、离子浓度等。

可以向从或可以从上述方法获得的产物添加其他药学可接受的组分或成分。一种或多种其他组分可以是活性组分，即对皮肤有效果，优选地也在例如本文描述的美容适应症中起到促进皮肤的美观或改善皮肤的美容外观的作用的组分。因此，可选替地或另外，方法可以包括向组合物添加一种或多种药学可接受的活性组分或将组合物与一种或多种药学可接受的活性组分合并的另一个步骤。药学可接受的活性组分可以包括矿物质、维生素、酶、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、抗氧化剂、多糖、适合作为防晒过滤物的物质、化学去角质剂、提取物、或其混合物，正如在下面更详细描述的。

从或可以从上述方法获得的美容组合物适合用于本文中别处描述的本发明的方法中。具体来说，美容组合物用于在哺乳动物中改善皮肤的美容外观。

本发明还提供了用于改善哺乳动物皮肤的美容外观的方法，在所述方法中向所述动物施用如上所定义的美容组合物。

本发明的另一方面是如上所定义的美容组合物在制造用于改善哺乳动物皮肤的美容外观的药物中的应用。

当在本文中提到时，“多肽”是具有优选地超过50、100、150、200或250个残基和/或少于500、400、300、200或100个残基或选自其中的范围的分子。当在本文中提到时，“部分”优选地包含它所源自的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240个或更多氨基酸。所述部分可以从所需序列的中央或N-端或C-端部分获得。

本文中所定义的组合物可以从任何鲑科鱼卵获得，所述鲑科鱼卵可以被视为起始材料的天然生物学变化。特别优选的鲑科鱼卵是来自于斑鳟（Salmo）或钩吻鲑（Oncorhynchus）亚科的卵。用于上述方法的特别优选的起始原料是来自于大西洋鲑（Salmosalar）或太平洋鲑（Oncorhynchus masou）的卵。

本文描述的美容组合物用在体内，正如本文中讨论的。

“药学可接受的”或“生理上可接受的”是指成分必须适用于美容应用和组合物。成分还必须与组合物中的其他成分相容，并且对于接受者来说是生理上可接受的。

用于施用的活性成分、即可以通过上述方法获得的组合物，可以被适当地修饰以用于美容组合物中。例如，通过例如使用适合的添加剂例如盐类或非电解质、乙酸盐、SDS、EDTA、柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液、甘露糖醇、甘氨酸、HSA或聚山梨醇酯，可以使根据本发明来使用的组合物稳定以抵抗降解。

通过本文描述的方法获得的组合物，可以作为唯一活性成分存在于美容用途的组合物中，或者可以与其他成分、特别是其他活性成分组合，以例如增强美容效果（如上所述）或使组合物更吸引消费者。

正如上面提到的，本文中描述的组合物表现出可用于改善皮肤、特别是老化皮肤例如光老化的皮肤的美容外观的性质。

本文描述的组合物在例如从上述天然来源之一制备所述组合物后，可能还包含杂质。在本文所述的组合物中，可以源自于鲑科孵化液的各种多肽或多肽部分，可以以0.0001至50%w/w的范围（组合地）存在于按照上述方法制备的美容组合物中。优选地，所述可以源自于鲑科孵化液的多肽或多肽部分，以0.0001至10%w/w的范围（组合地）存在于美容组合物中（或高达10-40%），例如按照上述方法制备的或者如下文中所述在例如稀释后的美容组合物的0.0001至5%、0.0001至3%、0.0001至2%、0.0001至1%、0.0001至0.5%、0.0001至0.1%w/w。因此，可源自于鲑科孵化液的单个多肽或多肽部分可以1x10^-6至10%w/w的范围存在于美容组合物中。在某些实施方式中，所述可源自于鲑科孵化液的单个多肽或多肽部分可以以美容组合物的1x10^-6至5%w/w的范围存在，例如美容组合物的1x10^-6至4%、1x10^-6至3%、1x10^-6至2%、1x10^-6至1%、1x10^-6至0.5%、1x10^-6至0.1%或1x10^-6至0.01%。

美容组合物中可源自于鲑科孵化液的多肽或多肽部分的比例，可以相对于组合物中的其他溶质，即不包括溶剂例如水来定义。因此，所述多肽或多肽部分合起来可以以组合物的干物质的1-100%w/w的范围存在。在某些实施方式中，多肽或多肽部分合起来可以以组合物的干物质的1-90%w/w的范围存在，例如组合物的干物质的5-80%、10-70%、20-60%、30-50%w/w。在其他实施方式中，多肽或多肽部分合起来可以以组合物的干物质的1-40%、2-39%、3-38%、4-37%w/w等的范围存在。因此，单个多肽或多肽部分可以以组合物的干物质的0.0001至50%w/w的范围存在，例如组合物的干物质的0.0001至40%、0.001至30%、0.01至25%w/w。正如在后文中描述的，组合物可以被稀释用于本发明的应用。

尽管本发明涉及用于改善皮肤的美容外观的方法，这可以包括障碍、异常或病症的处理，但在所有情形中所述处理在本质上是美容的。

当在本文中提到时，“美容”是指不治愈、治疗或预防疾病或障碍，而是起到皮肤护理产品的作用或起到修改或改善皮肤的外观，例如皮肤的颜色、质地或水分含量的作用的处理。

本文描述的处理的基础是本文中公开的美容组合物的皮肤抗老化效果。这些效果在本文提供的实施例中示出。

因此，设想了基于美容组合物的抗老化性质的处理。

因此，本发明提供了用于改善哺乳动物皮肤的外观的美容方法，在所述方法中向所述动物施用上文中描述的美容组合物。

在特别优选的实施方式中，皮肤是老化的皮肤。

“老化的皮肤”是指显示出老化的一种或多种征兆或症状，即出现皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛（松垂）、皮肤干燥、起皮或经皮水分散失（TEWL）的皮肤。具体来说，“老化的皮肤”相对于正常的最适皮肤，即健康、水合、正常色素沉着和未老化的皮肤来确定。就此而言，老化的皮肤不一定与对象的年龄相关，并且可能例如由于长期暴露于日光（光损伤）而过早老化。因此，“正常最适皮肤”的相关参数可以被确定为从与所讨论的对象相同或类似年纪的大量对象、如未接受长期日光暴露的对象获得的上述老化征兆的平均测量值。或者，“正常最适皮肤”的相关参数可以取为从比所讨论的对象更年轻的对象获得的测量值。换句话说，本文描述的组合物可用于相对于较早年龄时对象的皮肤，恢复皮肤的青春外观。

因此，本发明提供用于在哺乳动物中处理皮肤日射病的美容方法，在所述方法中向所述动物施用上文中描述的美容组合物，其中所述组合物优选表面施用。

从另一个角度来看，本发明提供了用于在哺乳动物中处理皮肤日射病的上文中描述的美容组合物，其中所述美容组合物优选地施用到所述动物的皮肤。在特定实施方式中，组合物用于表面施用。

在特别优选的实施方式中，改善皮肤的美容外观（例如老化或光损伤的皮肤）包括减少或防止在外观上出现或盛行皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛、皮肤干燥、起皮和/或经皮水份散失。可以改善这些参数中的一种或多种。优选地，减少细纹和/或皱纹。

减少或防止在外观上出现或盛行例如老化的皮肤或皮肤日射病的征兆或症状，可以意味着所述征兆或症状的数量和/或严重性的降低。例如，可以减少细纹和皱纹的数量，和/或可以减小或最小化皱纹或细纹的尺寸例如深度。此外，减少或防止可以包括停止或降低新征兆或症状出现的速率。

当在本文中提到时，“皮肤干燥”是指表皮缺乏水分或皮脂，其通常以细纹图案、起皮和瘙痒和/或灼烧感为特征。皮肤干燥可以作为皮肤状况本身而发生（例如由于老化），或者可以是皮肤障碍或病症例如晒伤的症状。

就此而言，通过上述组合物的保湿效果，可以实现皮肤干燥、起皮、细纹或经皮水分散失的减少。

因此，本发明可以被视为提供了一种对哺乳动物皮肤进行保湿的美容方法，在所述方法中向所述动物施用本文中定义的美容组合物。

换句话说，本发明提供了本文中描述的用于对哺乳动物皮肤进行保湿的美容组合物。（所述组合物也可用于制备用于此目的的美容性药物）。

当在本文中提到时，“保湿”涵盖防止皮肤水分流失（例如TEWL）的保湿剂以及当施用于皮肤时吸引并持留水的保湿剂（润湿剂）和润肤剂（其改善缺陷性脱皮）。

正如上面提到的，这样的保湿形式对于改善皮肤的美容外观是有利的。在特别优选实施方式中，皮肤是面部、耳、颈部、手的皮肤或头皮。

“皱纹”是皮肤中的折叠、隆起或皱褶。皮肤皱纹通常作为老化过程的结果而出现。就此而言，真皮包含皮肤的许多结构元件，其包括为皮肤提供强度的胶原蛋白、使皮肤饱满的糖胺聚糖和为皮肤提供弹力或弹性的弹性蛋白纤维。

当皮肤老化时，真皮层变得越来越薄，并且皮肤也产生更少的胶原蛋白。此外，提供弹性的弹性蛋白纤维耗尽。这些皮肤支架的变化导致皮肤出现皱纹和松垂。真皮-表皮接合处的表皮突变平，使皮肤更加脆弱并且使皮肤更容易发生切变。这一过程还通过减少与真皮接触的表面积并干扰皮肤的正常修复过程，减少可用于表皮的营养物质的量。

在皮下层中，随着衰老脂肪细胞变得更小。这引起更加明显的皱纹和松垂（松弛），因为脂肪细胞不能“填充到”来自于其他层的损伤中。

暴露于UVA和UVB辐射即日光，引起与仅仅时光衰老相比，胶原蛋白更高速率的分解。日光损坏胶原蛋白纤维，并引起异常弹性蛋白的积累。当这种日光诱导的弹性蛋白积累时，基质金属蛋白酶（MMP）大量产生。正常情况下，金属蛋白酶通过制造和重新形成胶原蛋白来重塑日光损伤的皮肤。然而，这一过程不总是良好工作，并且某些金属蛋白酶事实上分解胶原蛋白。这导致被称为日光瘢痕的组织混乱的胶原蛋白纤维的形成。这种不完美的重建/再生过程的重复，引起皱纹发生和皮肤松弛。

在另一种优选情况下，待美容性处理或预防的皮肤状况是色素沉着状况、障碍或异常。

皮肤的色素沉着障碍或异常，即色素沉着过度，可以作为老化的结果发生，或者可以由例如日光损伤造成的过早老化引起。色素沉着改变可能由黑素细胞的局部过量或黑素细胞活性的增加或两者引起。色素沉着障碍包括肝斑、晒斑或老年斑（日光斑）和其他斑点例如雀斑。

当在本文中提到时，“改善”皮肤的美容外观相对于正常的最适皮肤，即健康、水合、正常色素沉着和非老化的皮肤来确定。因此，对于老化的皮肤来说，优选地当改善是减轻老化的一种或多种征兆或症状时，可以按照实施例中所述测量老化的一种或多种征兆或症状，并与时间或生理上更年轻的皮肤的相同征兆进行比较。

在优选情况下，美容用途通过向皮肤表面施用来实现。

当在本文中使用时，“处理”是指相对于在所述个体的皮肤没有罹患所述状况或障碍且没有进行所述处理的不同身体部位上或者在没有进行所述处理的相应的正常个体中所存在的症状或影响，所述状况或障碍的一种或多种美容症状或影响降低、减轻或消除、优选地到正常水平，所述症状或影响如皮肤干燥的存在或程度、色素沉着的程度或面积等。

“预防”或“减少”是指绝对防止、或者降低或减轻所述症状或影响发作的程度或时间（例如延迟）。例如，通过在以干燥、色素沉着异常、有皱纹的皮肤为特征的状况出现之前定期施用本文描述的组合物，可以预防这样的状况。

本发明的美容性处理或预防方法可以有利地与一种或多种活性成分的施用相组合，所述活性成分能够有效处理或预防所述障碍或状况和/或实现例如保湿。因此，本文描述的美容组合物可以另外含有一种或多种这样的活性成分。

根据本发明的另一方面，我们提供了本文中所定义的组合物和任选的一种或多种其他活性成分作为联合制剂，用于在本文所述的人类或哺乳动物疗法中同时、分别或顺序使用。

本文描述的组合物，可以按照本领域公知的技术，使用易于获得的成分，以常规方式，使用一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂来配制。

因此，可以将组合物、任选地与作为联合制剂的其他活性物质一起，与一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂合并，以制备常规的盖伦制剂如粉剂、袋剂、扁囊剂、酏剂、悬液（输注液）、乳液、溶液、糖浆、气溶胶（作为固体或在液体介质中）、软膏、无菌包装粉剂等。可以通过使用冷冻干燥、过冷或派酶（Permazyme），使组合物稳定。

适合的赋形剂、载体或稀释剂是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、碳酸钙、乳酸钙、玉米淀粉、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或者脂肪物质例如固体脂肪，或其合适的混合物。还可以使用用于获得持续释放配方的试剂，如羧基聚亚甲基、羧甲基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。

组合物可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、增粘剂、成粒剂、崩解剂、粘合剂、渗透活性剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、吸附增强剂（例如表面渗透剂如胆盐、卵磷脂、表面活性剂、脂肪酸、螯合剂）、褐变剂、有机溶剂、抗氧化剂、稳定剂、软化剂、硅酮、α-羟基酸、缓和剂、消泡剂、保湿剂、维生素、香精、离子型或非离子型增稠剂、表面活性剂、填充剂、离子型或非离子型增稠剂、多价螯合剂、聚合物、推进剂、碱化剂或酸化剂、遮光剂、着色剂和脂肪化合物等。这些组分中的一些在下面更详细描述。

美容组合物中的其他活性成分或组分可以选自矿物质、维生素、酶、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、多糖、适合作为防晒过滤物的物质、化学去角质剂、提取物、皮肤调理剂、抗氧化剂中的任一种或多种及其混合物。

可以与本发明的组合物合并的蛋白质的实例包括胶原蛋白和/或其衍生物（例如其部分，如上定义）、能够促进细胞生长的蛋白质或肽、糖蛋白1、糖蛋白2和层粘连蛋白。

本发明的组合物可以与酶合并，所述酶包括但不限于水果酶（例如菠萝蛋白酶）、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、透明质酸酶和粘多糖酶中的任一种或多种。

肽可以选自但不限于D,L-肌肽、D-肌肽、L-肌肽,鹅肌肽和基肽(Matrixyl)（五肽衍生物）中的任一种或多种。

氨基酸可以选自但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸及其衍生物中的任一种或多种，所述衍生物包括表1中所定义的非天然存在的氨基酸。作为抗氧化剂的特别优选的氨基酸可以选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸中的任一种或多种。

表1

美容组合物可以包含一种或多种脂质，其包括脂肪、油类、蜡等。适合的极性油类是例如卵磷脂类和脂肪酸甘油三酯类，即饱和和/或不饱和的、支链和/或直链的具有8至24、特别是12至18个碳原子的链长的烷羧酸的三甘油酯。脂肪酸甘油三酯可以有利地选自例如合成、半合成和天然油类，例如橄榄油、葵花油、大豆油、花生油、菜籽油、杏仁油、棕榈油、椰子油、蓖麻油、小麦胚芽油、葡萄籽油、蓟油、月见草油、澳洲坚果油等。

可选替地或另外地，油可以选自挥发性油类、非挥发性油类或其混合物。非挥发性油类包括满足至少一个下列定义的油类：（a）所述油在25℃和一个大气压下表现出不超过0.2mm Hg的蒸气压；（b）所述油在一个大气压下具有至少300℃的沸点。挥发性油包括不是如上所定义的“非挥发性”油类的材料。

非挥发性油可以选自非挥发性硅油、非挥发性烃油及其混合物。适合的非挥发性硅油包括直链聚甲基硅氧烷，并且优选地，非挥发性硅油是高分子量二甲聚硅氧烷。可商购的直链聚甲基硅氧烷的实例包括来自于Dow Corning Corporation的DC200Fluid20Cst、DC200Fluid100Cst、DC200Fluid350Cst。

适合的非挥发性烃油包括双甘油或三甘油的支链酯类或1,2,3,4-丁三醇或赤藓糖醇、二赤藓糖醇或三赤藓糖醇的酯类。优选地，非挥发性烃油包含赤藓糖醇三乙基己酸酯（可以作为Salacos E-38从Nisshin Oilio获得）和聚甘油基-2三异硬脂酸酯（可以作为Cosmol43V从Nisshin Oilio获得）、二乙基己基碳酸酯（可以作为Tegosoft DEC从Degussa获得）、二辛基醚（可以作为Cetiol OE从Cognis AG获得）、二辛基碳酸酯（可以作为CetiolCC从Cognis AG获得）、异壬酸异壬基酯（可以作为Lanol99从Seppic获得）、新戊酸三癸基酯（作为Ceraphyl55由International Speciality Products供应）或其混合物。

挥发性油可以选自官能化和未官能化的挥发性硅油、挥发性烃油及其混合物。可以在本发明中使用的挥发性油可以是饱和或不饱和的，具有直链或支链或环状结构，或具有这些特点中的任一个或多个。

挥发性烃油的实例包括聚癸烷例如异十二烷和异癸烷（例如可以从PresperseInc.获得的Permethyl-99A）和C7-C15异链烷烃（例如可以从Exxon Chemicals获得的Isopar系列）。

挥发性硅油可以选自环戊硅氧烷、环己硅氧烷或其混合物。可商购的挥发性环状硅油的实例包括来自于Dow Corning Corp.的DC244、DC245、DC344和DC345，来自于Momentive Performance Materials的SF-1204和SF-1202硅酮流体，来自于GeneralElectric Co.的GE7207和7158，来自于SWS Silicones Corp.的SWS-03314。

直链挥发性硅油可以是直链聚甲基硅氧烷。可商购直链聚甲基硅氧烷的实例包括来自于Dow Corning Corp.的DC200Fluid,5Cst。

本发明的美容组合物还可以包含一种或多种多糖，其选自但不限于以下多糖中的任一种或多种：阴离子型多糖（例如藻酸、果胶、黄原胶、透明质酸、硫酸软骨素、阿拉伯树胶、刺梧桐胶、黄耆树胶、羧甲基几丁质、纤维素胶、糖胺聚糖）、阳离子型多糖（例如壳聚糖、乙酰化壳聚糖、阳离子型瓜尔胶、阳离子型羟乙基纤维素（HEC））、非离子型多糖（例如淀粉、糊精、瓜尔胶、纤维素醚例如羟乙基纤维素、甲基纤维素和硝酸纤维素）、两性多糖（例如羧甲基壳聚糖、N-羟基-二羧基乙基-壳聚糖、改性的马铃薯淀粉）和疏水性多糖（例如鲸蜡基羟乙基纤维素、聚季铵盐24）。

美容组合物还可以包含适合作为防晒过滤物的物质，例如有机防晒剂例如肉桂酸衍生物。有机防晒活性物质可以选自亲水有机防晒剂、疏水有机防晒剂或其混合物。防晒剂的适合实例可以在《CTFA国际化妆品成分字典和手册》（CTFA International CosmeticIngredient Dictionary and Handbook），第7版第2卷，pp.1672，由Wenning和Mc Ewen主编（The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.,Washington,D.C.1997）中找到。

有机防晒剂可以选自烷基β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物、α-氰基-β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物、邻氨基苯甲酸酯衍生物、二苯甲酮衍生物、樟脑衍生物、二苯甲酰基甲烷衍生物、对氨基苯甲酸衍生物、水杨酸衍生物、三嗪衍生物或其混合物。例如，疏水性有机防晒剂可以选自4-(1,1-二甲基乙基)-4'-甲氧基二苯甲酰基甲烷、4-异丙基二苯甲酰基甲烷、4-(1,1-二甲基乙基)-4'-甲氧基二苯甲酰基甲烷、2-乙基己基-2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸酯或其混合物。

可商购的4-(1,1-二甲基乙基)-4'-甲氧基二苯甲酰基甲烷、也称为丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷或阿伏苯宗的实例，包括来自于Givaudan Roure S.A.的Parsol TM1789和来自于Merck&Co.,Inc.的Eusolex TM9020。可商购的4-异丙基二苯甲酰基甲烷、也称为异丙基二苯甲酰基甲烷的实例，包括来自于Merck&Co.,Inc.的Eusolex TM8020。可商购的2-乙基己基-2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸酯、也称为奥克立林(Octocrylene)的实例，包括来自于BASF的Uvinul N539SG和来自于Rona/Merck的Eusolex OCR。

在某些实施方式中，亲水性有机防晒剂可以是2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。可商购的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸、也称为PBSA的实例，包括来自于Rona/Merck的Eusolex232。

肉桂酸衍生物防晒剂的适合实例可以在《CTFA国际化妆品成分字典和手册》（CTFAInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook），第7版第2卷，pp.1672，由Wenning和Mc Ewen主编（The Cosmetic,Toiletry,and FragranceAssociation,Inc.,Washington,D.C.1997）中找到。肉桂酸衍生物可以选自2-乙基己基-对甲氧基肉桂酸酯、二乙醇胺甲氧基肉桂酸酯、2-乙氧基乙基-对甲氧基肉桂酸酯或其混合物。例如，肉桂酸衍生物可以是2-乙基己基-对甲氧基肉桂酸酯。

美容组合物可以与化学去角质剂组合，所述去角质剂选自但不限于α-羟基酸（AHA）、β-羟基酸（BHA）或多羟基酸例如水杨酸、乙醇酸、柠檬酸和苹果酸中的任一种或多种。

可以掺入到美容组合物中的提取物包括但不限于植物提取物，其可以包含酚类化合物例如类黄酮（例如糖基芦丁、阿魏酸、咖啡酸）、呋喃亚甲基葡萄糖醇、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚、去甲二氢愈创木树脂酸、去甲二氢愈创木酸、三羟基丁酰苯及其衍生物。在本发明的组合物中使用的具体植物提取物包括芦荟提取物、人参提取物和问荆提取物。

人参提取物可以通过用亲水性溶剂（具体来说水、乙醇、乙二醇或其任何混合物）提取人参（Panax ginseng）的根来获得。所述提取物含有皂角苷类、甾醇类、糖类、果胶、维生素、矿物质和脂质。

问荆提取物可以通过用亲水性溶剂（例如水、乙醇、乙二醇或其任何混合物）提取问荆（Equisetum arvense）的整株药草来获得。所述提取物含有硅酸盐、类黄酮、皂草苷（saponoside）、咖啡酸和阿魏酸。

美容组合物还可以包含皮肤调理剂。皮肤调理剂可以选自保湿剂、去角质剂、润肤剂或其混合物。保湿剂包括多元醇类例如甘油、丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、羟丙基山梨糖醇、己二醇、1,3-丁二醇、1,2,6-己三醇、乙氧基化甘油、丙氧基化甘油或其混合物。

可以与本发明的组合物合并的抗氧化剂的实例包括但不限于氨基酸、维生素、矿物质、类胡罗卜素、肽、硫醇、亚砜亚胺化合物、螯合剂、不饱和脂肪酸、酚类化合物、植物提取物、芪类、尿酸、甘露糖、绿原酸、咪唑类（例如尿刊酸）、呋喃亚甲基山梨糖醇、泛醌、泛醇、质体醌、植物甾醇类及其衍生物（例如盐类、酯类、醚类、糖类、核苷酸类、核苷类、肽类和/或脂类衍生物），其中一些在上面已描述。

微生素可以选自但不限于下列任一种或多种：维生素A及其衍生物（例如类视色素或视黄醇或其衍生物例如棕榈酸视黄酯或丙酸视黄酯），生物素，叶酸，泛酸钙，烟酰胺，盐酸吡哆醇，盐酸吡哆醛，核黄素，盐酸硫胺素，胸苷，维生素B12，维生素B3（例如烟酰胺），维生素B5（例如泛酰醇），维生素C及其衍生物（例如抗坏血酸棕榈酸酯，抗坏血酸磷酸镁，抗坏血酸乙酸酯），生育酚类及其衍生物（例如维生素E乙酸酯）。

矿物质可以选自但不限于以下的任一种或多种盐类：钼（例如(NH₄)OMo₇O₂₄）、铝（例如AlCl₃）、钙（例如CaCl₂）、钴（例如CoCl₂）、铬（例如CrK(SO₄)）、铜（例如CuSO₄）、铁（例如Fe(NO₃)₃，FeSO₄）、钾（例如KCl）、镁（例如MgCl₂）、锰（例如MnCl₂，MnSO₄）、磷酸盐（例如Na₂HPO₄，NaH₂PO₄）、碳酸盐（例如NaHCO₃）、硅酸盐（例如Na₂SiO₃）、钠（例如NaCl）、钒（例如NH₄VO₃）、镍（例如NiCl₂）、锡（例如SnCl₂）、锌（例如ZnO、ZnSO₄）、硒（例如硒代甲硫氨酸、依布硒啉、H₂SeO₃、Na₂SeO₃）、硫酸盐和硝酸盐。

类胡罗卜素可以选自但不限于胡萝卜素，例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、ψ-番茄红素、八氢番茄红素等及其衍生物中的任一种或多种。

硫醇类可以选自但不限于下列任一种或多种：硫代葡萄糖金，丙基硫氧嘧啶，硫氧还蛋白，硫辛酸，谷胱甘肽，半胱氨酸，胱氨酸，胱胺以及它们的糖基、N-乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊基、丁基和月桂基、棕榈酰基、油烯基、γ-亚油烯基、胆固醇基和甘油基酯及其盐，硫代二丙酸二月桂基酯，硫代二丙酸二硬脂基酯，硫代二丙酸及其衍生物。

亚砜亚胺化合物可以选自但不限于高半胱氨酸亚砜亚胺、丁硫氨酸砜类、戊、己、庚硫氨酸亚砜亚胺中的任一种或多种，其可以包含在组合物中以使它们以非常低的剂量（例如pmol至μmol/kg）提供。

螯合剂可以选自但不限于下列任一种或多种：脱辅基铁蛋白，desferral，乳铁蛋白，α-羟基脂肪酸，棕榈酸，植酸，α-羟基酸（例如柠檬酸、乳酸、苹果酸），腐殖酸，胆汁酸，胆汁提取物，胆红素，胆绿素，EDTA，EGTA及其衍生物。

不饱和脂肪酸可以选自但不限于γ-亚麻酸、亚油酸、油酸及其衍生物中任一种或多种。

芪及其衍生物包括例如芪氧化物和反式芪氧化物。

可以将各种其他任选活性成分掺入到本发明的美容组合物中。这些其他成分的非限制性实例包括其他皮肤护理活性物质，例如法呢醇、没药醇、植三醇、尿素、胍（例如氨基胍），己脒定(hexaminidine)化合物、其盐或衍生物，糖胺，自晒黑剂（例如脱羟基丙酮），结构化剂，亲水胶凝剂，抗痤疮药物（间苯二酚、水杨酸等），皮肤抚慰和康复剂例如尿囊素等，以及适用于美容目的的试剂例如精油、芳香剂、皮肤增感剂、遮光剂、芳族化合物（如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油和丁子香酚）。通过使用本领域公知的技术，本文描述的组合物可以被配制成在施用到身体后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

组合物可以采取允许递送或用于靶向特定细胞或组织的任何适合的剂型，例如作为乳液或者在脂质体、类脂囊泡、微球、纳米粒子等中，借此活性成分可以被吸附、吸收、掺入或结合。这可以将产物有效地转变成不溶形式。这些颗粒形式可以克服稳定性（例如降解）和递送两种问题。

溶液、悬液、凝胶和乳液的使用是优选的，例如，活性成分可以装载在水、气体、水基液体、油、凝胶、乳液、水包油或油包水乳液、分散系或其混合物中。

乳化剂可以选自非离子型乳化剂、阴离子型乳化剂、阳离子型乳化剂、两性离子乳化剂、两性乳化剂或其混合物。乳化剂在本领域中是已知的。参见例如McCutcheon的《去污剂和乳化剂》（Detergents and Emulsifiers），北美版（1986），Allured PublishingCorporation出版。

当化妆品中可接受的载体是硅酮包水乳液时，乳化剂优选地选自聚氧化烯共聚物、聚甘油基共聚物或其混合物。聚氧化烯共聚物也称为硅酮聚醚，详细描述在US4,268,499中。可商购的聚氧化烯共聚物的实例包括来自于Dow Corning Corp.的DC5225C或DC2-5185C（可以作为与环戊硅氧烷的掺混物获得的PEG/PPG-18/18二甲聚硅氧烷），以及来自于Shin-Etsu Inc.的KF6017或KF6028（PEG-9二甲聚硅氧烷）。可商购的聚甘油基乳化剂的实例包括来自于Shin-Etsu Inc.的KF6100和KF6104。

组合物优选地用于表面施用（即施用到皮肤）。

表面组合物包括凝胶、霜剂、软膏、喷剂、洗剂、油膏、棒剂、肥皂、粉剂、薄膜、气溶胶、滴剂、泡沫剂、溶液、乳液、悬液、分散系例如非离子性囊泡分散系、乳剂和本领域任何其他常规的化妆品形式。

软膏、凝胶和霜剂可以例如用水性或油性基料并添加适合的增稠剂和/或胶凝剂来配制。洗剂可以使用水性或油性基料来配制，并且一般还含有一种或多种乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。粉剂可以在任何适合的粉剂基料协助下形成。滴剂和溶液可以用水性或非水性基料来配制，并且还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。气溶胶喷剂通过使用适合的推进剂从加压包装物中方便地递送。

在某些实施方式中，本文描述的美容组合物可以通过已施加、浸渍或化学键合有多肽或组合物的产品、装置或材料，表面施用到皮肤。为此，可以将绷带、膏药（例如粘附性贴片）、纱布、手术胶带、棉签或其他吸收性材料例如粉扑、绒布或海绵或支撑性基质用本文所描述的组合物涂布、浸渍或化学键合。例如，许多组合物可以使用皮肤贴片施用到皮肤，所述皮肤贴片在本领域中已很好地描述，例如US2008/0038300、US2009/0043236、WO2005/067499和WO2009/085302，其通过参考并入本文。在某些实施方式中，包含本文所描述的组合物的材料可以采取装置的形式，所述装置可以例如由待处理的对象佩戴。例如，本文描述的组合物可以被施用、浸渍或化学键合到形成尿布、手套、袜子等的全部或一部分的材料或支撑性基质上。

美容组合物可以与使用说明书一起包含在容器、包装物或配药器中。

因此，本发明的另一方面包括提供用本文描述的组合物涂布、浸渍或化学键合的产品、材料或装置。本发明还扩展到这样的产品、材料或装置用于本文描述的用途。优选地，所述产品是绷带、膏药（例如粘附性贴片）、纱布、手术胶带或棉签，或者所述装置是尿布、手套或袜子。

本文描述的组合物中活性成分的浓度可以取决于组合物的来源（即用于上述方法的起始原料）、施用方式、处理过程、患者的年龄和体重、美容适应症、待处理的身体或身体区域，并且可以根据选择进行改变或调整。然而，一般来说，本文描述的组合物的浓度范围为按照本发明的方法制备的上述组合物的0.001、0.005、0.01或0.1至50%，例如0.005-40%，例如0.1至25%，例如0.1或0.5至5，例如1-5%（用于施用、特别是用于表面施用的最终制剂的w/w或v/v），例如1%溶液。

当向通过上述方法制造的组合物添加其他组分，例如本文中所描述的其他保湿剂时，所述其他组分可以以0.0001、0.0005、0.001或0.01至50%，例如0.0005-40%，例如0.01至25%，例如0.1或0.5至5，例如1-5%（用于施用、特别是用于表面施用的最终制剂的w/w）的量存在。当作为单一剂量表面施用时，取决于待处理的哺乳动物，用于组合物的有效的单一剂量可以在0.0001-100mg/cm²/天（组合物中的总蛋白），例如0.1-100mg/cm²/天，优选地0.0001-10mg/cm²/天，例如0.1-10mg/cm²/天的范围内。

优选地将液体溶液、霜剂或悬液用于表面施用。

可以施加或施用组合物的动物限于哺乳动物。哺乳动物优选地是灵长动物，驯养动物、牲畜和实验室动物。因此，优选的哺乳动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗、猴、猪、奶牛、山羊、绵羊和马。特别优选地，组合物施加或施用到人类。

提供下面的实施例仅仅是出于说明的目的，其中提到的图如下所述：

图1示出了用本发明的孵化液组合物处理的对象在处理前（基线）、处理2周后和处理12周后的照片。在2周和12周后两种情况下，老化皮肤的各种征兆的减轻是明显的。提供的值指示了35位参加者的平均变化。

图2示出了图1中对象的特写照片，强调了在用本发明的孵化液组合物处理2和12周后看到的细纹和皱纹的减少。

图3示出了用本发明的孵化液组合物处理的对象在处理前（基线）和处理12周后的特写照片。圆圈区域示出了在处理12周后皱纹的明显减少。

图4示出了条形图，其示出了根据面部两侧上的触觉/视觉临床分级，被认为在衰老的各种征兆方面获得改善的对象的百分数。

图5示出了用水、5%乙醇酸、1mU/ml菠罗蛋白酶或1%孵化液组合物处理12小时的重构的人类表皮的扫描电子显微照片（x400、x5000和x15000放大倍数）。

图6示出了用水、5%乙醇酸、1mU/ml菠罗蛋白酶或1%孵化液组合物处理48小时的重构的人类表皮的扫描电子显微照片（x400、x5000和x15000放大倍数）。

图7示出了未处理或用5%乙醇酸、1mU/ml菠罗蛋白酶或1%孵化液组合物处理12或24小时的重构的人类表皮的切片的光学显微照片。箭头（A）示出了细胞增殖和分化，箭头（B）示出了更致密的颗粒层和更高浓度的板层颗粒。

实施例1：组合物的制备

组合物从鲑鱼孵化液制备。为了提高孵化液的蛋白质浓度，在孵化前将鲑鱼卵转移到极小体积水中。可以通过升高的温度（室温）或通过脱氧合作用来诱导高度同步的孵化（Oppen-Berntsen等，1990,Aquaculture,86,pp.417-430），这产生小体积高度浓缩的粗品多肽和多肽部分的制备物。对于超过95%的胚胎来说，孵化应该在2小时内完成。

使用具有7μm孔径大小的标准滤器过滤孵化液，以除去可能在随后的过滤步骤中堵塞滤器的材料。该滤液、即处理过的孵化液，可以被冷冻数年而不显著降解，然后将其融化并用于进一步的蛋白质纯化。这一事实极大简化了用于纯化孵化液组合物的起始原料的生产。

使用孔径大小为0.45μm的滤器对处理过的孵化液进行过滤，并收集滤液。然后使用排除尺寸为8kDa的滤器对滤液进行渗滤，用缓冲液交换孵化液的水。在这种情形中，缓冲液含有0.5mM磷酸盐和1mM NaCl，尽管其他缓冲液同样适合。例如，pH在中性附近或微碱性（pH7.5-8.5），含有5mM NaCl的磷酸盐缓冲盐水或含有毫摩尔Tris（例如10mM）的缓冲液，是适合的。从渗滤步骤收集渗余物，并通过添加缓冲液进行稀释，以使如上所定义的滤液的酶活性等于3400mU/升。

最后，通过孔径大小为0.22μm的滤器对滤液进行过滤，并收集最终滤液。该滤液是在粗品孵化液中存在的多肽和多肽部分的富集制备物。

实施例2：孵化液组合物对老化皮肤的体内效应

如实施例1中所述制备孵化液组合物。将组合物制备成1%和3%润肤液[v/v]（每单位体积润肤液的组合物总体积），在试验中使用这两种活性物质润肤液，并与不含活性组分、即孵化液组合物的对照润肤液进行比较。所述润肤液是水包油（O/W）乳液。油相占总组合物的9%，并用氢化卵磷脂乳化。

进行双盲安慰剂对照的临床试验，在具有轻度至中度光损伤、即老化的面部皮肤的女性中评估表面皮肤处理的有效性和耐受性。该试验的持续时间为12周，在基线、第2周、第6周和第12周时随访。使用目测分级、仪器测量、数字化VISIA CR照片和对象自我评估调查问卷来评估效能。

对象数量

一百零一位（101）女性对象完成本研究（对于三种处理，即一种安慰剂和两种包含不同浓度的孵化液组分的组合物来说，N>30）。

对象群体和识别

对象是年龄为40至65水的健康女性并被指派三位数字的编号，其在与临床研究编号联合使用时，独一无二地识别研究中的每位对象。在整个研究中该编号一致伴随着所述对象，以维持实验的匿名性。

合格判据

入选判据

1.女性，年龄为40至65岁并包括40和65岁，其通过健康和合格性调查问卷确定为健康总体良好。

2.愿意合作并参加，在研究持续时间内遵从研究要求并立即报告任何不良症状。

3.在面部具有临床确定的轻度至中度光损伤（细纹、皱纹、色素沉着过度、松弛和粗糙），对应于改良Griffith分级量表的3-7的分值。

4.没有可能损害试验位点的评估的、或通过参与研究会增加对象健康风险的任何疾病状态或物理性面部皮肤状况（例如特应性皮炎、湿疹、银屑病、脂溢性皮炎）。

5.愿意在研究持续时间内避免长期日光暴露和所有日光浴床的使用。应该特别小心以穿戴防护衣包括太阳镜，并避免10AM至4PM的日光暴露。

6.愿意在研究持续时间内继续使用所有常规品牌的有色化妆品、清洁剂、化妆水（如果适用）和卸妆水。个体必须克制使用指派的试验材料之外的任何抗老化产品或皮肤亮白产品。

7.愿意在每次计划的诊所随访之前至少20分钟卸除所有化妆。在研究随访完成之前不向面部或眼部区域施用其他表面产品。如果对象到达时尚未卸除所有化妆，要求她在诊所卸除残余化妆并在程序之前等待至少20分钟。

8.使用激素替代疗法或服用激素避孕的个体，在研究开始之前必须处于稳定的用药方案已至少一个月，并且愿意在研究持续时间内继续且不改变这种药物处理。在研究开始时未使用HRT或激素的个体，必须愿意在研究持续时间内不开始使用它们。

9.愿意合作并参加，遵从研究要求并立即报告任何不良症状。

排除判据

1.对任何个人护理产品具有不耐受或过敏史的个体。

2.在进入研究之前30天内使用过任何处方或OTC皮肤亮白产品的个体。

3.具有检查研究人员视为不适合参加的皮肤状况和/或疾病的个体。

4.在研究期间正在哺乳、妊娠或计划妊娠的个体。

5.在进入研究之前30天内日常使用任何抗衰老、抗皱纹表面抗氧化剂的个体。

6.在研究开始前的6个月内使用酶法面部皮肤处理的个体。

7.在研究开始前的3个月内使用Retin-A 或或其他表面类视色素，或在过去6个月内服用阿克唐丸（Accutane）或口服类视色素。

8.在研究开始前的30天内在面部上日常使用含有α-、β-、γ-羟基酸（包括水杨酸和Lachydrin）、视黄醇或视黄醇衍生物的产品或其他“抗老化”产品。

9.在处理前的3个月内或研究期间接受面部皮肤磨削术或化学剥皮处理的个体。

10.在处理前的6个月内或研究期间，在被处理区域内接受使用光RF或其他装置的处理的个体。

11.在处理前的9个月内或研究期间，在被处理的区域内接受Botox、胶原蛋白、脂肪注射或使用注入或植入材料进行增大的方法的个体。

12.在本试验开始之前的12个月内经历表面重修手术、面部提升或眼或眼睑手术的个体。

13.在面部上具有预先存在的和/或潜伏皮肤病症（例如白癫风、特应性皮炎、银屑病、红斑痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、严重表皮剥脱等）或据调查人员来看可能干扰研究结果的医学状况/疾病的个体。

14.具有免疫抑制/免疫缺陷障碍（包括HIV感染或AIDS）病史或目前使用免疫抑制药物的个体。

15.正参加任何其他临床使用研究的个体（贴片研究可以接受）。

16.患有不受控制的疾病例如糖尿病、高血压、甲状腺机能亢进或甲状腺机能减退的个体。一些具有多种健康状况的个体被排除在参加之外，即使可以通过饮食、药物等控制所述状况。

17.在入选在本研究中之前28天内参加过任何临床试验的个体。

在调查人员或其指定者根据医疗史和研究前面试和检查的发现做出慎重判断后，允许个体加入本研究。

研究设计

进行双盲安慰剂对照的临床试验，在具有轻度至中度光损伤、即老化的面部皮肤的女性中评估表面皮肤处理的有效性。该试验的持续时间为12周，在基线、第2周、第6周和第12周时按计划随访。使用目测分级、仪器测量、数字化VISIA CR照片和对象自我评估调查问卷来评估效能。

每组N>30的三个组完成本研究。对象在12周内接受向面部施加的活性物质皮肤处理、即上面描述的孵化液组合物，或介质对照（水）。按照预先确定的随机化方案将对象随机分配到3个组中。

效能和耐受性评估

由专业临床分级人员对面部右侧和左侧的下面示出的参数进行评估。使用改良的Griffith量表，其中0=无，1-3=轻度，4-6=中度，7-9=重度。当需要更好地描述皮肤状况时使用半个点。

·细纹

·皱纹

·色素沉着过度

·松弛

·暗淡/无光（透明感）

·触觉粗糙度

由专业临床分级人员对面部右侧和左侧的下面示出的参数进行评估。使用4个点的量表，其中0=无，2=轻度，3=中度，4=重度。当需要更好地描述皮肤状况时使用半个点。

·红斑

·干燥/起皮

·烧灼/叮刺感

·瘙痒

·紧绷/干燥感觉

数字VISIA CR摄影

获取面部右侧和左侧的VISIA-CR成像。对象在成像时将头发向后拉，除去首饰，闭上眼睛，使对象在取景框内居中并采取中性面部表情。

经皮水分散失（TEWL）

在仪器测量之前，使对象平衡到诊所的环境条件至少20分钟。在研究随访期间每小时记录环境条件。在此期间，将对象分级、完成调查问卷和/或进行VISIA CR成像。

在所有随访时使用皮肤水分流失测试仪（Tewameter）获取经皮水分散失（TEWL）测量值。测量值在右侧和左侧面颊上，在从眼角向下延伸的线与水平横过鼻子下部的线的交点处获取。

皮肤水分流失测试仪利用开放仓室系统测量TEWL。置于皮肤表面上的手持式探针对表面上的两个点处的相对湿度进行取样，允许从测量到的湿度梯度计算水分流失速率。

皮肤弹性测量仪MPA580

在所有随访时对所有对象获取皮肤弹性测量仪测量值。使用皮肤弹性测量仪来评估皮肤的粘弹性性质（即可延伸性和弹性）。所述仪器向小面积皮肤施加真空，并通过光学技术测量皮肤的弹性响应（皮肤进出孔隙的运动）。

对于本研究来说，使用2mm探针，施加300mbar的真空，并进行两个吸吮和释放的循环。循环时间是打开5秒和关闭10秒。

测量值在右侧和左侧面颊上，在从眼角向下延伸的线与水平横过鼻子下部的线的交点处，或者在靠近下颌的可选替位置处获取。

皮肤评估和自我评估调查问卷

对象完成皮肤自我评估调查问卷，所述问卷含有描述对象对其面部右侧和左侧上的面部皮肤外观和状况的感觉的问题。

结果

细纹

在第2周时，用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象，与安慰剂（4.58%）相比显示出细纹减少（例如5.59%（1%溶液）和5.65%（3%溶液）的百分率变化）。细纹的减少在第6周（例如14.34%（1%溶液），14.86%（3%溶液）和8.98%（安慰剂））和第12周时（例如23.43%（1%溶液），25.99%（3%溶液）和14.68%（安慰剂））继续。图1和2示出了细纹减少28%的对象。

皱纹

在第2周时，用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象，与安慰剂（0.70%）相比显示出皱纹减少（例如2.15%（1%溶液）和1.75%（3%溶液）的百分率变化）。皱纹的减少在第6周（例如6.13%（1%溶液），7.32%（3%溶液）和3.70%（安慰剂））和第12周时（例如14.72%（1%溶液），15.15%（3%溶液）和9.57%（安慰剂））继续。图1示出了皱纹减少12.5%的对象。图3示出了皱纹减少26.32%的对象。

色素沉着过度

在第2周时，用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象，与安慰剂（0.40%）相比显示出色素沉着过度的减少（例如2.11%（1%溶液）和2.68%（3%溶液）的百分率变化）。色素沉着过度的减少在第6周（例如5.61%（1%溶液），7.91%（3%溶液）和3.16%（安慰剂））和第12周时（例如10.53%（1%溶液），15.35%（3%溶液）和5.73%（安慰剂））继续减少。图1示出了12周后老年斑的色素沉积减少15%的对象。

松弛

在第2周时，用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象，与安慰剂（0.87%）相比显示出松弛的减少（例如2.64%（1%溶液）和1.62%（3%溶液）的百分率变化）。松弛的减少在第6周（例如6.33%（1%溶液）和6.61%（3%溶液），2.51%（安慰剂））和第12周时（例如10.55%（1%溶液）和11.33%（3%溶液），5.18%（安慰剂））继续减少。图1示出了在12周后松弛（松垂）减少7.69%的对象。

暗淡/无光（透明感）

在第2周时，用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象，与安慰剂（10.67%）相比显示出皮肤透明感的改善（例如12.95%（1%溶液）和16.00%（3%溶液）的百分率变化）。这种改善在第6周（例如29.26%（1%溶液），28.50%（3%溶液）和19.07%（安慰剂））和第12周时（例如37.17%（1%溶液），39.18%（3%溶液）和26.72%（安慰剂））继续。图1示出了无光泽性减少33.33%的对象。

触觉粗糙度

在第2周时，用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象，与安慰剂（13.38%）相比显示出皮肤触觉粗糙度的降低（例如16.51%（1%溶液）和20.24%（3%溶液）的百分率变化）。这种改善在第6周时继续（例如24.77%（1%溶液），26.65%（3%溶液）和16.79%（安慰剂）），但是在第12周时没有进一步降低（例如26.61%（1%溶液），29.19%（3%溶液）和15.79%（安慰剂））。图1示出了触觉粗糙度降低12.5%的对象。

干燥/起皮

在第2周时，用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象，与安慰剂（64.71%）相比显示出皮肤干燥/起皮的减少（例如72.09%（1%溶液）和100.00%（3%溶液）的百分率变化）。然而，与安慰剂相比，在第6周（例如86.05%（1%溶液）、84.62%（3%溶液）和100.00%（安慰剂））和第12周时（例如90.70%（1%溶液）、100.00%（3%溶液）和89.47%（安慰剂））没有进一步减少。

TEWL

尽管用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象在第2周时显示出TEWL的减少，但这与安慰剂（17.26%）相比没有明显差别（例如15.35%（1%溶液）和14.53%（3%溶液）的百分率变化）。然而，与安慰剂相比，在第6周（例如29.46%（1%溶液）、26.66%（3%溶液）和22.96%（安慰剂））和第12周时（例如37.46%（1%溶液）、40.04%（3%溶液）和34.21%（安慰剂））存在进一步更大的减少。

可延展性

尽管用包含所述活性物质组合物中的一种的润肤液处理的对象在第2周时显示出皮肤可延展性的改善，但这与安慰剂（10.82%）相比仅略微不同（例如16.18%（1%溶液）和17.21%（3%溶液）的百分率变化）。在第6周时在三种处理之间没有显著差异（例如18.04%（1%溶液）、17.18%（3%溶液）和19.90%（安慰剂）），但是在第12周时使用包含活性组分的组合物进行的皮肤处理与安慰剂相比具有更高的进一步改善（例如31.84%（1%溶液）、33.57%（3%溶液）和16.48%（安慰剂））。

在研究开始时（基线）和处理12周后面部两侧上触觉/视觉临床分级的比较显示，所有对象在用本发明的孵化液组合物处理后在她们皮肤的无光泽性和粗糙性方面显示出改善，并且大部分对象在细纹（97%的对象）、皱纹（91%的对象）、色素沉着过度（87%的对象）和松垂（80%的对象）方面显示出改善（图4）。

调查问卷揭示，从使用6周起，在安慰剂与包含本发明的孵化液组合物的美容组合物之间，对关于总体外观、总体感觉、光滑度、柔软度、透明感和弹性的陈述的平均分值，发现统计学显著的差异。

因此，从上述结果明显看出，孵化液提取物组合物与安慰剂相比显示出对老化皮肤的每一方面的效果。

实施例3：孵化液组合物相对于已知美容性皮肤处理对重构的人类表皮的效果的 比较性体外研究

体外重构的人类表皮由在惰性聚碳酸酯滤器上，在空气-液体界面处，在化学限定培养基中培养的正常人类角化细胞构成。这种体外模型在组织学上与体内人类表皮类似。

将重构的人类表皮（SkinEthic）在角质层一侧上暴露于200μl下列溶液之一12小时、24小时或48小时：

1%孵化液组合物；

5%乙醇酸（AHA）；

1mU/ml菠罗蛋白酶（水果酶）；或

dH₂O（对照）。

在暴露之后，将培养物在PBS中的4%（w/v）聚甲醛中在4℃下固定，并通过扫描电子显微镜或光学显微镜进行分析。

处理12小时后的重构的人类表皮的扫描电子显微照片的评估（图5）显示，用5%乙醇酸溶液的处理导致角质层受损和皮肤腐蚀。用菠罗蛋白酶的处理通过消化细胞被膜引起皮肤脱皮。相反，用本发明的孵化液组合物的处理通过剥落完整的角质细胞引起皮肤脱皮，因为只有细胞结合位点被降解。因此，孵化液溶液提供了温和的皮肤微观剥落。

在暴露48小时后，重构的人类表皮的扫描电子显微照片（图6）显示，乙醇酸产生严重受损的皮肤，其中细胞被膜已经破裂并且细胞的细胞骨架清晰可见。尽管使用菠罗蛋白酶的处理产生相当光滑的皮肤表面，但仍存在明显的粗糙小块。然而，使用本发明的孵化液组合物的处理产生超光滑的皮肤表面，其与对照（即未处理的）皮肤相比更好。因此，孵化液组合物可以被视为提供了皮肤光滑效果。

重构人类表皮的切片的光学显微术（图7）显示，暴露于乙醇酸24小时导致破坏活细胞、包括来自基底层的表皮干细胞。在乙醇酸处理后，所有剩余的是少量固缩核（其中染色质不可逆地凝缩）和无核细胞。暴露于菠罗蛋白酶24小时引起基底层和有棘层的极小变化。相反，在暴露于本发明的孵化液组合物24小时后，重构的皮肤显示出细胞增殖和分化的迹象（参见图7的箭头A）。在暴露于本发明的孵化液组合物48小时后，皮肤显示出更致密的颗粒层和更高浓度的板层颗粒的迹象（参见图7的箭头B）。因此，本发明的孵化液组合物具有恢复皮肤青春的效果并引起皮肤屏障功能的改善。

Claims (20)

1.一种用于非治疗目的的在哺乳动物皮肤中减少或防止皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛、皮肤干燥、起皮和/或经皮水分散失的美容外观或普遍程度的方法，所述方法包括向所述动物施用美容组合物，其中所述组合物通过至少包括下列步骤的方法获得：

a)将鲑科(Salmonidae)鱼卵悬浮在最小体积的水中；

b)诱导所述卵的同步快速孵化；

c)对孵化的卵进行过滤以获得孵化液；以及

d)对所述孵化液进行过滤以获得组合物，其中过滤所述孵化液的步骤至少包括下列步骤：

(i)使用孔径大小为至少5μm的滤器过滤所述孵化液，并收集滤液；

(ii)使用孔径大小为0.30-0.60μm的滤器过滤来自于步骤(i)的滤液，并收集滤液；

(iii)通过使用排除尺寸小于15kDa的渗滤，用药学可接受的缓冲液交换来自于步骤(ii)的滤液中的水；

(iv)使用孔径大小为0.15-0.30μm的滤器过滤来自于步骤(iii)的溶液，并收集滤液；以及

(v)从来自于步骤(iv)的滤液制备所述美容组合物。

2.权利要求1的方法，其中鲑科鱼卵是鲑鱼卵。

3.权利要求1或2的方法，其中对于超过95％的胚胎来说，孵化在不到2小时内完成。

4.权利要求1或2的方法，其中：

a)步骤(i)中的滤器的孔径大小为5-15μm；

b)步骤(ii)中的滤器的孔径大小为0.35-0.55μm；和/或

c)步骤(iv)中的滤器的孔径大小为0.22μm。

5.权利要求4的方法，其中a)步骤(i)中的滤器的孔径大小为7μm；和/或

b)步骤(ii)中的滤器的孔径大小为0.45μm。

6.权利要求1或2的方法，其中所述鲑科鱼卵来自于大西洋鲑或太平洋鲑。

7.权利要求1或2的方法，其中所述皮肤是老化的皮肤。

8.权利要求1或2的方法，其中所述动物的皮肤被保湿。

9.权利要求1或2的方法，其中所述美容组合物用于表面施用到所述皮肤。

10.权利要求1或2的方法，其中所述美容组合物被涂布、浸渍或化学键合在产品、材料或装置上。

11.权利要求1或2的方法，其中所述方法用于减少或防止皱纹和/或松弛的美容外观或普遍程度。

12.一种美容组合物，其如权利要求1至4任一项中所定义，并用于减少或防止哺乳动物的皮肤的皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛、皮肤干燥、起皮和/或经皮水分散失的美容外观或普遍程度。

13.权利要求12的组合物，其中所述皮肤由权利要求7定义，所述皮肤的美容外观由权利要求8定义，和/或所述施用由权利要求9定义。

14.权利要求12或13的组合物，其中所述组合物用于减少或防止皱纹和/或松弛的美容外观或普遍程度。

15.权利要求1至4任一项中定义的美容组合物在制造药物中的应用，所述药物用于减少或防止哺乳动物的皮肤的皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛、皮肤干燥、起皮和/或经皮水分散失的美容外观或普遍程度。

16.权利要求15的应用，其中所述皮肤由权利要求7中所定义，所述皮肤的美容外观由权利要求8中所定义，和/或所述施用由权利要求9中所定义。

17.权利要求15或16的应用，其中所述组合物用于减少或防止皱纹和/或松弛的美容外观或普遍程度。

18.一种制备美容组合物的方法，所述方法至少包括下列步骤：

a)将鲑科鱼卵悬浮在最小体积的水中；

b)诱导所述卵的同步快速孵化；

c)对孵化的卵进行过滤以获得孵化液；以及

d)对所述孵化液进行过滤以获得组合物，其中过滤所述孵化液的步骤至少包括下列步骤：

(i)使用孔径大小为至少5μm的滤器过滤所述孵化液，并收集滤液；

(ii)使用孔径大小为0.30-0.60μm的滤器过滤来自于步骤(i)的滤液，并收集滤液；

(iii)通过使用排除尺寸小于15kDa的渗滤，用药学可接受的缓冲液交换来自于步骤(ii)滤液中的水；

(iv)使用孔径大小为0.15-0.30μm的滤器过滤来自于步骤(iii)的溶液，并收集滤液；以及

(v)从来自于步骤(iv)的滤液制备所述美容组合物。

19.权利要求18的方法，其中鲑科鱼卵为鲑鱼卵。

20.权利要求18或19的方法，其中对于超过95％的胚胎来说，孵化在不到2小时内完成。