CN103717743A

CN103717743A - pAVEC

Info

Publication number: CN103717743A
Application number: CN201280017429.0A
Authority: CN
Inventors: D.P.萨哈
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2014-04-09
Also published as: JP2014511696A; JP2017184752A; US20140030760A1; EP2694655A1; WO2012138591A1; JP6200414B2; EP2694655A4; US9080177B2

Abstract

本申请部分提供用于产生多肽诸如免疫球蛋白以及生成所述含有编码所述多肽的多核苷酸的质粒的重组版本的pAVEC质粒和所述质粒的使用方法。

Description

pAVEC

本申请要求2011年4月8日提交的美国临时专利申请号61/473,431的权益，该申请通过全文引用并入本文。

发明领域

本发明的领域涉及质粒，其可用于，例如，表达目标多肽。

发明背景

培养用于治疗性蛋白商业生产的细胞是一个昂贵的过程。所需设备费用昂贵并且研发及生产成本高昂。开发使每升细胞培养物生产的治疗性蛋白的量最大化的细胞培养方法将会使生产给定量蛋白所需的资源最少化。因此，期望使用商业上可行的生产大量蛋白的试剂。

在标准的培养条件下，许多天然存在的细胞并不产生大量的期望蛋白。相反地，必须进行广泛的会诱使培养中的细胞产生大量治疗性蛋白的细胞培养方法的研发。通常，在高水平鉴定可用于表达蛋白的质粒载体需要大量的创造性投入。

发明概述

本发明部分提供分离的pAVEC质粒载体，所述分离的pAVEC质粒载体是包含多克隆位点的线性或环状质粒载体，所述多克隆位点包含限制性位点：

例如，所述分离的pAVEC质粒载体包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；例如，该质粒载体的特征在于图1的质粒图谱；其中该质粒包含SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列。pAVEC质粒载体可以是环状的，因此，能够在宿主细胞中自主异位复制；或者是线性的且能够，例如，用于整合到宿主细胞的染色体DNA中。

本发明进一步包括用于制备重组质粒的方法，其包括切割pAVEC质粒，且将经切割质粒的末端连接至引入的多核苷酸(例如编码免疫球蛋白诸如阿昔单抗(Abciximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、达妥珠单抗(Dalotuzumab)(MK0646)、赛尼哌(Daclizumab)、狄诺塞麦(Denosumab)、依库丽单抗(Eculizumab)、依法珠单抗(Efalizumab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、英夫利昔单抗(Infliximab)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)、那他珠单抗(Natalizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、兰尼单抗(Ranibizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、ALD518和曲妥珠单抗(Trastuzumab)；或者，是与选自以下的抗原特异性结合的抗体的重链或轻链或其抗原结合片段的免疫球蛋白链：VEGF、VEGFR、EGF、EGFR、TNFα、TGFβ、TRAIL-R1、Nav1.7、Nav1.8、ERK、MEK、TRAIL-R2、IL-6、IL-6R、IGF1R、IL-23p19、IL-23R、PCSK9、CD20、RANKL、RANK、CD33、CD11a、ErbB2、IgE、G蛋白偶联受体(GPCR)、HIV抗原、HCV抗原、和呼吸道合胞病毒(RSV)抗原)的相容末端，从而使得产生闭环质粒，例如，其中所述引入的多核苷酸可操作连接至质粒中的启动子，诸如hCMV启动子。通过这种方法产生的任何重组质粒形成本发明的部分。

本发明进一步包括分离的宿主细胞(例如，细菌或哺乳动物细胞，诸如CHO细胞)，所述分离的宿主细胞包含含有本发明的任何pAVEC质粒的分离的宿主细胞。

本发明还提供了用于在分离的宿主细胞中产生重组多肽的方法，其包括将包含编码多肽(例如)的多核苷酸的本发明的任何重组pAVEC质粒载体引入宿主细胞中，其中所述编码多肽的多核苷酸可操作连接到质粒中的启动子，诸如hCMV启动子；其条件允许表达该多肽；和任选地，纯化多肽。

此外，本发明包括包含本发明的pAVEC质粒载体和一种或多种额外组分的试剂盒。

附图简述

图1：pAVEC质粒图谱。

图2：pAIL17L质粒图谱。

发明详述

本发明提供用于在任何细胞中，例如在哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞中进行重组蛋白表达的表达载体。该载体可以用于瞬时或稳定表达大范围的重组蛋白。该载体的多克隆位点提供许多共用稀有限制性位点，以容纳各种表达盒。

pAVEC质粒是特征在于图1中所述的质粒图谱和/或包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由其组成的质粒；该术语也涵盖由以下方法产生的重组质粒，所述方法包括切割pAVEC质粒和将经切割的质粒的末端连接至引入的多核苷酸的相容末端，从而使得产生包含引入的多核苷酸的闭环质粒。

分子生物学

根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中解释。参见，例如，

。

“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”包括DNA或RNA。例如，在本发明的实施方案中，多核苷酸是环状质粒pAVEC。

“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是核酸诸如DNA或RNA中的一系列核苷酸，并且表示任何两个或更多个核苷酸的链。

“编码序列”或“编码”表达产物(诸如RNA或肽(例如，免疫球蛋白链))的序列是在表达时导致产生产物的核苷酸序列。

如本文使用的，术语“寡核苷酸”是指通常具有不超过约300个核苷酸(例如30、40、50、60、70、80、90、150、175、200、250或300个)的核酸，其可以与编码基因的基因组DNA分子、cDNA分子或mRNA分子、mRNA、cDNA或其他目标核酸杂交。寡核苷酸一般为单链，但也可为双链。例如，可以通过掺入³²P-核苷酸、³H-核苷酸、¹⁴C-核苷酸、³⁵S-核苷酸或已经共价缀合于标记诸如生物素的核苷酸而对寡核苷酸进行标记。在一个实施方案中，标记的寡核苷酸可以用作探针来检测核酸的存在。在另一个实施方案中，寡核苷酸(其中之一或两者可以被标记)可以用作PCR引物，用于克隆基因的全长或片段，或用于检测核酸的存在。通常，合成制备寡核苷酸，例如在核酸合成仪上制备。

“蛋白序列”、“肽序列”或“多肽序列”或“氨基酸序列”是指蛋白、肽或多肽中一系列两个或更多个氨基酸。

“蛋白”、“肽”或“多肽”包括两个或更多个氨基酸的连续序列段(contiguous string)。

术语“分离的多核苷酸”或“分离的多肽”分别包括与细胞或重组DNA表达系统中正常存在的其他组分或任何其他污染物部分或完全分离的多核苷酸(例如RNA分子或DNA分子、或混合多聚体)或多肽。这些组分包括但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清组分和外来基因组序列。

优选分离的多核苷酸(例如，pAVEC)或多肽为分子的基本均质组合物，但也可包含某些异质成分。

术语“宿主细胞”包括任何以下生物体的任何细胞：所述生物体以任何方式选择、修饰、转染、转化、生长或使用或操作，用于由细胞生产物质，例如由细胞表达或复制基因、多核苷酸诸如环状质粒 (例如，pAVEC)或RNA或蛋白。例如，宿主细胞可以是哺乳动物细胞或细菌细胞(例如，大肠杆菌)或任何以下分离的细胞，所述分离的细胞能够保持pAVEC质粒，并且在本发明的一个实施方案中，促进质粒中的多核苷酸编码的多肽(例如免疫球蛋白链)的表达。哺乳动物宿主细胞的实例通过非限制性实例的方式包括，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、CHO-DXB-11细胞、CHO-DG44细胞、牛乳腺上皮细胞、小鼠Sertoli细胞、犬肾细胞、布法罗大鼠肝细胞、人肺细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、大鼠成纤维细胞、牛肾(MDBK)细胞、NSO细胞、SP2细胞、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾(COS)细胞、人肝癌(例如，Hep G2)细胞、A549细胞等。在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是人宿主细胞。可根据本领域中已知的方法培养哺乳动物宿主细胞(参见，例如，J. Immunol. Methods 56:221 (1983), Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed ., Rickwood, D.和Hames, B. D., 编 Oxford University Press, New York (1992))。合适的大肠杆菌的实例包括DH1、DH5、DH5α、XL1-Blue、SURE、SCS110、OneShot Top 10、和HB101。在本发明的一个实施方案中，本发明的pAVEC质粒异位保持在宿主细胞中和/或整合到宿主细胞的染色体DNA中。这种宿主细胞和其使用方法(例如，如本文讨论的)形成本发明的部分。

本发明的载体(诸如pAVEC)可以根据本领域中已知的任何许多技术被引入宿主细胞，所述技术例如，葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质体转染、将载体直接显微注射进入细胞核、或适合于给定宿主细胞类型的任何其他方式。

“盒”或“表达盒”是指编码表达产物(例如肽或RNA)的DNA编码序列或DNA区段，例如，其可在确定的限制性位点插入到载体中。表达盒可以包含可操作连接到DNA编码序列的启动子和/或终止子和/或聚腺苷酸信号。

通常，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(例如直接或通过其他启动子结合的蛋白或物质)并起始编码序列的转录的DNA调节区。通常，启动子序列在其3’末端以转录起始位点为边界，并且向上游延伸(5’方向)，以包括起始任何水平的转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内可以存在转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图而方便地确定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域(共有序列)。启动子可以与其他表达控制序列包括增强子和阻抑物序列或与待表达的核酸可操作结合或可操作连接。表达控制序列与启动子可操作结合或可操作连接到启动子，如果其调节从所述启动子的表达。

可用于控制基因表达的启动子包括但不限于SRα启动子(Takebe等人, Molec. and Cell. Bio. 8:466-472 (1988))、人CMV即时早期启动子(Boshart等人, Cell 41:521-530 (1985); Foecking等人，Gene 45:101-105 (1986))、小鼠CMV即时早期启动子、SV40早期启动子区(Benoist等人, Nature 290:304-310 (1981))、黄杉合毒蛾(Orgyia pseudotsugata)即时早期启动子、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、金属硫蛋白基因的调节序列 (Brinster等人, Nature 296:39-42 (1982))；原核表达载体诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 (1978))，或tac启动子(DeBoer等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))；以及来自酵母或其他真菌的启动子元件，诸如GAL1、GAL4或GAL10启动子、ADH (醇脱氢酶)启动子、PGK (磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。

本发明的载体中可包括病毒长末端重复启动子，诸如小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR) (Fasel 等人, EMBO J. 1(1):3-7 (1982))、莫洛尼鼠肉瘤病毒(moloney murine sarcoma virus)长末端重复序列(Reddy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(9): 5234-5238 (1980))、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复序列(Van Beveren 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(6): 3307-3311 (1980))、HIV LTR (Genbank登记号AB100245)、牛泡沫病毒LTR (Genbank登记号NC_001831)、RSV 5’-LTR (Genbank登记号K00087)、HIV-2 LTR (Genbank登记号NC_001722)、禽反转录病毒LTR(Ju 等人, Cell 22: 379-386 (1980))和人疱疹病毒LTR (Genbank 登记号NC_001806)。

其他可接受的启动子包括人CMV5启动子、鼠CMV启动子、EF1α启动子、SV40启动子、用于肝特异性表达的杂合CMV启动子(例如通过使CMV即时早期启动子与人α1-抗胰蛋白酶(HAT)或者白蛋白(HAL)启动子的转录启动子元件缀合而形成)，或用于肝细胞瘤特异性表达的启动子(例如其中人白蛋白(HAL；约1000 bp)或人α1-抗胰蛋白酶(HAT；约2000 bp)的转录启动子元件与人α1-微球蛋白和尿抑胰酶素前体基因(AMBP)的145 bp长的增强子元件结合；HAL-AMBP和HAT-AMBP)。

另外，细菌启动子，诸如T7 RNA聚合酶启动子或tac 启动子，也可用于控制表达。

在一个实施方案中，启动子是人CMV (hCMV)启动子。hCMV启动子在各种哺乳动物细胞类型中提供高水平的表达。

在细胞中，当转录和翻译控制序列指导或调节编码序列的表达时，编码序列就处于转录和翻译控制序列的“控制”之下，或者与转录和翻译控制序列“功能性结合”、“可操作连接”或“可操作结合”。例如，与基因可操作连接的启动子将指导编码序列进行RNA聚合酶介导的转录形成RNA，优选mRNA，然后其可进行剪接(如果其含有内含子的话)，任选翻译成编码序列所编码的蛋白。与基因可操作连接的终止子/聚腺苷酸(polyA)信号使基因转录RNA终止，并指导在RNA上添加polyA信号。

术语“表达”表示允许或引起基因、RNA或DNA序列中的信息展现出来；例如，通过激活参与相应基因的转录和翻译的细胞功能而产生蛋白。“表达”包括DNA转录成RNA，RNA再翻译成蛋白。DNA序列在细胞中表达，或由细胞表达，以形成“表达产物”，诸如RNA(例如mRNA)或蛋白。表达产物自身也可以描述为由细胞“表达”。

术语“转化”表示将核酸导入细胞。导入的基因或序列可以称作“克隆”。接受了导入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”，并且是“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或来自不同属或种的细胞。本领域众所周知的转化方法的实例包括脂质体递送、电穿孔、CaPO₄转化、DEAE-葡聚糖转化、显微注射和病毒感染。

本发明包括包含本发明多核苷酸的载体。术语“载体”可指能够将DNA序列或RNA序列导入宿主细胞，以转化宿主、且任选地促使导入序列进行表达和/或复制的媒介物(例如质粒)。

本发明的多核苷酸可在表达系统中表达。术语“表达系统”是指宿主细胞和相容性载体，其在合适条件下能够表达蛋白或由载体所携带并导入宿主细胞中的核酸。通用表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体以及哺乳动物宿主细胞和载体诸如质粒、黏粒、BAC、YAC和病毒(诸如腺病毒和腺病毒相关病毒(AAV))。

载体

本发明提供了包含以下多克隆位点的质粒：

EcoRI、XhoI、PaeR7I、Bsp120I、ApaI、BstZ17I、Bst1107I、PstI、BamH1，例如，其包含如图1中所示的这些限制性位点之间的相对间隔，例如，其中具有多克隆位点的重叠限制性位点表征如下：

在本发明的一个实施方案中，多克隆位点包含核苷酸序列：

。

在本发明的一个实施方案中，本发明的pAVEC质粒通过图1中所示的质粒图谱表征。

在本发明的一个实施方案中，质粒是pAVEC，其包含以下核苷酸序列：

。

基因

任何几种基因(例如，免疫球蛋白)可插入本发明的质粒中。编码任何以下目标免疫球蛋白氨基酸序列的本发明的质粒形成本发明的部分。本发明涵盖任何方法的产物，其中将多核苷酸或基因(例如，编码免疫球蛋白)插入pAVEC，并且在该过程中，其导致一些pAVEC多核苷酸序列的损失，例如，由于切除部分多克隆位点，以便产生容许引入的基因连接至载体中的限制性酶切位点。这种方法的产物在本文中被称为包含特定基因或多核苷酸的pAVEC载体。

本发明的范围包括用于将多核苷酸引入pAVEC质粒的方法，其包括例如用一种或多种限制性核酸内切酶，例如在该质粒的多克隆位点切割质粒，并且将经切割质粒的末端例如用DNA连接酶连接至引入的多核苷酸的相容末端，以产生闭合的重组质粒。作为这种方法的产物的任何重组质粒形成本发明的部分。多核苷酸的相容末端是可以用DNA连接酶连接在一起的末端。在本发明的一个实施方案中，末端是平末端或粘性末端，例如，是限制性核酸内切酶诸如EcoR1或BamH1切割的结果。

在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白是任何以下多肽的成熟的或未经处理的版本，例如，仅可变区或可变结构域和恒定结构域：

19D12/15H12轻链(SEQ ID NO:3)

19D12/15H12重链(SEQ ID NO:4)

19D12/15H12轻链-C (LCC) (SEQ ID NO:5)

19D12/15H12轻链-D (LCD) (SEQ ID NO:6)

19D12/15H12轻链-E (LCE) (SEQ ID NO:7)

19D12/15H12轻链-F (LCF) (SEQ ID NO:8)

19D12/15H12重链-A (HCA) (SEQ ID NO:9)

19D12/15H12重链-B (HCB) (SEQ ID NO:10)

参见国际申请公开号WO2003/100008，其通过全文引用并入本文。

本发明的实施方案包括以下那些：其中包括超过一个免疫球蛋白的质粒，例如以任何本文所列的那些的组合(例如重链Ig. # 1.0和轻链Ig. #1.0；或LCC和HCA；或LCF和HCA；或LCC和HCB)。

在本发明的一个实施方案中，pAVEC质粒含有包含以下氨基酸序列的轻链免疫球蛋白：

; 和/或，包含以下氨基酸序列的重链免疫球蛋白：

或者其可变结构域或包含一个或多个(例如，3个)轻链和/或重链的CDRs的轻链和/或重链免疫球蛋白，例如，在上面序列中加下划线的那些。

在本发明的一个实施方案中，pAVEC载体包含编码抗体的轻和/或重免疫球蛋白链的多核苷酸，所述抗体诸如阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达妥珠单抗、赛尼哌、狄诺塞麦、依库丽单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、托西莫单抗、ALD518或曲妥珠单抗。所述抗体的序列是本领域已知的。在本发明的一个实施方案中，pAVEC载体包含与抗原特异性结合的抗体的重链和/或轻链免疫球蛋白或其抗原结合片段(例如，来自任何哺乳动物，诸如人或犬或猴或大鼠或兔或小鼠)；例如，抗原诸如VEGF、VEGFR、EGF、EGFR、PD-1、TNFα、TGFβ、TRAIL-R1、TSLP、Nav1.7、Nav1.8、ERK、MEK、TRAIL-R2、IL-10、IL-6、IL-6R、IGF1R、IL-23p19、IL23R、PCSK9、CD20、RANKL、RANK、CD33、CD11a、ErbB2、IgE、G蛋白偶联受体(GPCR)、HIV抗原、HCV抗原、或呼吸道合胞病毒(RSV)抗原；或其抗原结合片段，或者任何所述抗体或抗原结合片段的可变结构域或包含一个或多个(例如，3个)任何所述抗体或抗原结合片段的轻链和/或重链的CDRs的轻链和/或重链免疫球蛋白。在本发明的一个实施方案中，抗原由其衍生的物种与轻链和/或重链恒定结构域；和/或免疫球蛋白构架的物种是相同的或不同的。

在本发明的一个实施方案中，pAVEC载体包含轻和/或重链免疫球蛋白，所述轻和/或重链免疫球蛋白包含选自以下的成员：

(a) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链：

(b) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链：

(c) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链：

(d) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链：

(e) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链：

(f) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链：

(g) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链：

(h) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链：

(i) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链：

(j) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链：

(k) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链：

(l) 包含以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链：

(SEQ ID NO:24)；或包含上述一个或多个(例如，3个)轻和/或重链的CDRs的免疫球蛋白。

蛋白的表达和纯化

本发明的进一步方面涉及用于使用质粒pAVEC质粒产生重组蛋白和/或增殖特定多核苷酸的方法。例如，在本发明的一个实施方案中，用于表达蛋白的方法包括在适当条件下培养包含具有编码多肽的多核苷酸(例如，可操作连接至pAVEC的启动子诸如hCMV启动子)的pAVEC质粒的宿主细胞(例如，CHO细胞)，所述条件适于能够实现所述包含质粒的宿主细胞的生长和重组蛋白的表达，例如，所述方法包括以下步骤：

a) 将编码目标多肽(例如，免疫球蛋白链)的多核苷酸引入pAVEC质粒(例如，SEQ ID NO:1)，例如，所述多核苷酸可操作连接至pAVEC的启动子，诸如hCMV启动子；

如上讨论，将多核苷酸引入pAVEC质粒可以导致一些pAVEC多核苷酸序列的损失，例如，由于切除部分多克隆位点，以便产生容许引入的多核苷酸的末端连接至质粒中的限制性酶切位点。

b) 用包含编码目标蛋白的多核苷酸的pAVEC质粒转染宿主细胞；

该质粒可以作为自主复制元件(例如，其中该质粒具有高拷贝数，例如，约2、3、4、5、10、20或50)在宿主细胞中异位增殖或整合到宿主细胞染色体中。

c) 在适当条件下培养细胞，以实现包含质粒的宿主细胞的生长和重组蛋白的表达；和，任选地

d) 收获产生的多肽。

用于从(例如)细胞或细胞培养物或细胞已经在其中培养的培养基中收获(分离和/或纯化)给定蛋白的方法在本领域中是众所周知的。通过非限制性实例的方式，蛋白可通过以下方法从生物材料分离和/或纯化，以去除污染物诸如IgG：盐或醇沉淀(例如，硫酸铵沉淀或乙醇沉淀)、亲和层析(例如，连同纯化标签使用)；在免疫亲和或离子交换柱上分级；高压液相层析(HPLC)；反相HPLC；在二氧化硅上或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；等电聚焦；逆流分配；SDS-PAGE；凝胶过滤(使用，例如，Sephadex G-75)；和蛋白A琼脂糖柱。这些纯化方法在本领域中是众所周知的，且公开于例如“Guide to Protein Purification”, Methods in Enzymology, Vol. 182, M. Deutscher, Ed., 1990, Academic Press, New York, NY。

在液体水性培养物中生长哺乳动物细胞在本领域中是众所周知的。本领域中已知的哺乳动物细胞培养生长培养基的实例包括EX-CELL ACF、CHO培养基(Sigma-Aldrich(St.Louis, MO)；以下进一步讨论)、DMEM、DMEM/F-12、F-10营养物混合物(Nutrient Mixture)、RPMI 培养基1640、F-12营养物混合物、培养基199、Eagle’s MEM、RPMI、293培养基和Iscove培养基。

可在几种系统中的任一种进行细胞生长。例如，可在简单烧瓶例如玻璃摇瓶中进行细胞生长。其他系统包括罐式生物反应器、袋式生物反应器和一次性生物反应器。罐式生物反应器通常包括金属容器(例如有不锈钢套的容器)，其中，细胞在液体培养基中生长。罐式生物反应器可用于多种培养体积(例如100 l、150 l、10000 l、15000 l)。罐式生物反应器通常具有用于控制细胞生长条件的附加特征，包括用于温度控制、培养基搅拌、控制鼓气(sparge gas)浓度、控制pH、控制O₂浓度、从培养基中取出样品、反应器重量指示和控制、清洗硬件、消毒硬件、布管或铺管以递送所有服务、添加培养基、控制pH、控制溶液、和控制气体、将无菌液体泵入生长容器中、以及监控和数据采集的装置。罐式生物反应器的分类包括搅拌罐式反应器，其中机械搅拌器(例如叶轮)用于混合反应器以散布热和物质(诸如氧和底物)。泡罩塔反应器是高大的反应器，其仅使用空气来混合内容物。气升式反应器类似于泡罩塔反应器，但不同之处在于它们包含通风管。通风管通常是一种改善循环和氧转运且均衡反应器中剪切力的内管。在流化床反应器中，细胞被“固定”在随流体而移动的小颗粒上。该小颗粒形成用于细胞粘附的大表面积并使得能够进行高速的氧和营养物转运至细胞。在填充床反应器中，细胞被固定在大颗粒上。这些颗粒并不随液体而移动。填充床反应器容易构建且易于操作，但可能会遭遇堵塞和不良氧转运。一次性生物反应器是一种用后可丢弃的、一次使用的生物反应器。通常，一次性生物反应器具有类似于非一次性生物反应器的特征(例如搅拌系统、鼓泡装置、探头、端口等)。

特别是当多肽从细胞或组织来源中分离出来时，试验系统中优选包括一种或多种蛋白水解酶抑制剂，诸如苯甲磺酰氟(PMSF)、Pefabloc SC、胃酶抑制剂、亮抑酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制剂和EDTA。

在一些实施方案中，目标蛋白伴随被称为“标签(tag)”或“标记(marker)”的第二种多肽或多核苷酸部分。例如，在表达后，可使用标签便于多肽的纯化或检测。可构建融合多肽，例如，通过在编码待表达多肽的多核苷酸5'端或3'端，插入符合读框的编码标签的多核苷酸。融合多核苷酸随后可在本发明的表达系统中进行表达。此类标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、六组氨酸(hexahistidine, His6)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、血细胞凝集素(HA)标签、纤维素结合蛋白(CBP)标签和myc标签。检测标签诸如³²P、³⁵S、³H、^99mTc、¹²³I、¹¹¹In、⁶⁸Ga、¹⁸F、¹²⁵I、¹³¹I、^113mIn、⁷⁶Br、⁶⁷Ga、^99mTc、¹²³I、¹¹¹In和⁶⁸Ga，也可用于标记本发明的多肽和多核苷酸。这类融合物的构建和使用方法是本领域十分常规的和众所周知的。

本领域技术人员理解，适合于目标多肽的纯化方法可能需要改变以负责多肽在重组细胞培养中表达后的特征改变。

本发明还涉及用于将多核苷酸引入pAVEC质粒的方法，其包括用质粒转化宿主细胞，例如，包括以下步骤：

a) 在需要多核苷酸插入其中的位点切割pAVEC质粒(例如，使用限制性酶，例如，生成容许与待插入的多核苷酸的末端杂交且随后连接末端的末端的限制性酶)。待插入的多核苷酸的末端也可以通过以下方法生成，所述方法包括用生成与经切割质粒的末端相容的末端的限制性酶切割。

b) (例如，使用DNA连接酶)将经切割的pAVEC的末端与多核苷酸的末端连接，以生成最终环状的重组质粒；

b) 然后可以将该重组质粒转化至宿主细胞中，质粒和添加的多核苷酸在所述宿主细胞中增殖。该质粒可以作为自主复制元件(例如，其中该质粒具有高拷贝数，例如，约2、3、4、5、10、20或50)在宿主细胞中异位增殖或整合到宿主细胞染色体中。

试剂盒

本发明的pAVEC质粒载体可以在试剂盒中提供。本发明的试剂盒除包括质粒载体外，还可包括使用质粒载体时可能需要使用的任何试剂。在一个实施方案中，试剂盒包括载体转化到细菌和/或哺乳动物宿主细胞中所必需的试剂。例如，试剂盒可包括用于磷酸钙转化程序的试剂：氯化钙、缓冲液(例如2X HEPES缓冲盐水)和无菌蒸馏水。在另一个实施方案中，试剂盒包括用于DEAE-葡聚糖转化法的试剂：氯喹的PBS溶液、DEAE-葡聚糖的PBS溶液和磷酸缓冲盐水。在又另一个实施方案中，试剂盒中包括用于脂质体转化法的试剂：从DOTAP/胆固醇挤出的脂质体的挤出脂质体(Liposomes extruded from DOTAP/cholesterol extruded liposomes)。例如试剂盒可包括基于阳离子脂质的转染试剂Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies; Carlsbad, CA)。

试剂盒可包括用于本发明载体的细菌转化所需的试剂。例如，试剂盒可包括转化感受态细菌(例如DH1、DH5、DH5α、XL1-Blue、SURE、SCS110、OneShot Top 10或HB101)。

试剂盒可包括生长培养基或用于制备生长培养基所需的试剂。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包括用于哺乳动物细胞生长的胎牛血清或DMEM (Dulbecco/Vogt改良的 Eagle (Harry Eagle)极限必需培养基(Dulbecco/Vogt modified Eagle's (Harry Eagle) minimal essential medium)。在另一个实施方案中，试剂盒可包含用于细菌生长的含有合适的抗生素(例如氨苄青霉素或卡那霉素)的粉末LB培养基(powdered Luria broth media)或LB板(Luria broth plates)。

试剂盒所供给的组分可以在合适的小瓶或容器(例如塑料小瓶或玻璃小瓶)中提供。试剂盒可包括合适用于贮存的标签指示或合适的使用说明书。

实施例

所提供的下述实施例用以进一步描述本发明，但不得解释为对本发明的限制。本发明的范围包括下述实施例中下面所述的任何和所有方法。

实施例1：pAVEC质粒的构建

多克隆位点(MCS)的序列：

；其通过聚合酶链式反应(PCR)进行合成。PCR产物随后通过限制性酶EcoRI和BamHI消化。载体pAIL17L(图2)也通过限制性酶EcoRI和BamHI消化。最后，将经消化的PCR产物连接到消化的载体中，且针对载体pAVEC对转化体进行筛选。pAVEC中的多克隆位点随后通过测序分析位点的完整性。

本发明不限于本文所描述的特定实施方案的范围内。实际上，根据前述描述和附图，对于本领域技术人员而言，除那些在本文中所描述的那些之外，本发明的各种修改将变得显而易见。这样的修改旨在落入附加的权利要求的范围中。

专利、专利申请、出版物、产品说明书以及实验方案在本申请通篇中引用，其公开内容为了所有目的通过全文引用并入本文。

Claims

1.分离的质粒，其是线性或环状的，包含含有以下限制性位点的多克隆位点：

。

2.权利要求1的载体，其特征在于图1的质粒图谱。

3.权利要求1的载体，其中所述多克隆位点包含SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列。

4.权利要求1的载体，其包含SEQ ID NO:2中所述的多核苷酸序列。

5.用于制备重组质粒载体的方法，其包括切割权利要求1的质粒，且将经切割质粒的末端连接至引入的多核苷酸的相容末端，从而使得产生闭环质粒。

6.权利要求5的方法，其中所述引入的多核苷酸编码免疫球蛋白链。

7.权利要求6的方法，其中所述免疫球蛋白链是选自以下的成员的重链或轻链：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达妥珠单抗、赛尼哌、狄诺塞麦、依库丽单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、托西莫单抗、ALD518和曲妥珠单抗；

或者，其中所述免疫球蛋白链是与选自以下的抗原特异性结合的抗体的重链或轻链或其抗原结合片段：VEGF、VEGFR、EGF、EGFR、PD-1、TNFα、TGFβ、TRAIL-R1、TSLP、Nav1.7、Nav1.8、ERK、MEK、TRAIL-R2、IL-10、IL-6、IL-6R、IGF1R、IL-23p19、IL23R、PCSK9、CD20、RANKL、RANK、CD33、CD11a、ErbB2、IgE、G蛋白偶联受体(GPCR)、HIV抗原、HCV抗原、和呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。

8.重组质粒载体，其是权利要求5的方法的产物。

9.包含权利要求1的载体的分离的宿主细胞。

10.权利要求9的宿主细胞，其是细菌或哺乳动物细胞。

11.用于在分离的宿主细胞中产生重组多肽的方法，其包括在允许所述多肽表达的条件下将权利要求5的重组载体引入所述宿主细胞中。

12.权利要求11的方法，进一步包括纯化所述多肽。

13.试剂盒，其包含权利要求1的质粒载体和一种或多种额外组分。