CN103694366B - 一种高含量香菇多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高含量香菇多糖的制备方法，该高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：将香菇子实体于50℃烘干至恒重后，切片，按料液比1:20加入蒸馏水充分浸泡20min～30min，加入胰蛋白酶反应4小时，胰蛋白酶酶添加量为0.5%～2%，沸水灭酶活15min～20min，过滤、10000rpm，离心10min～15min得上清；提取液浓缩，将提取液按照浓缩比1:3进行浓缩；乙醇沉淀，向浓缩液中添加无水乙醇，至乙醇终浓度的质量百分比达到60%～70%，4℃静置过夜；4000rpm离心15min，沉淀用等浓度60%～70%乙醇搅拌悬浮洗涤，10000rpm，离心10min～15min，得沉淀；真空冷冻干燥，将沉淀溶于重量比1:5的蒸馏水中，70度～80度水浴挥去残余乙醇，经过真空冷冻干燥得到香菇多糖粗品。本发明提高了多糖含量，同时降低了冻干品粘度，更易于干燥。
Description
技术领域
本发明属于食用菌深加工技术领域，尤其涉及一种高含量香菇多糖的制备方法。
背景技术
香菇（lentinus），又称香蕈、冬菇，是一种药食两用的高脂肪、低蛋白的营养保健食品。香菇多糖是香菇子实体中一种具有免疫活性、抗肿瘤等功能的物质。近年来香菇多糖的提取方法主要有热水浸提法、稀酸稀碱浸提法、复合酶法、微波超声辅助提取法等。这些常用提取制备方法存在着工艺复杂、材料设备费高、能耗大、多糖含量低、粗品得率低的不利因素，制约了香菇多糖的规模化制备。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种高含量香菇多糖的制备方法，旨在解决目前的提取方法存在工艺复杂，制作成本高，多糖的含量较低，得率低的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种高含量香菇多糖的制备方法，该高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将香菇子实体于50℃烘干至恒重后，切片，按料液比1:20加入蒸馏水充分浸泡20min～30min，然后加入胰蛋白酶反应4小时，胰蛋白酶酶添加量为0.5%～2%，沸水灭酶活15min～20min，过滤、10000rpm，离心10min～15min得上清；
步骤二，提取液浓缩，采用旋转蒸发仪60℃浓缩，将提取液按照浓缩比1:3进行浓缩；
步骤三，乙醇沉淀，乙醇为醇沉浓度相同的酒精浓度洗涤，向浓缩液中添加无水乙醇，至乙醇终浓度的质量百分比达到60%～70%，4℃静置过夜；
步骤四，醇洗，4000rpm离心15min，沉淀用60%～70%乙醇搅拌悬浮洗涤，10000rpm，离心10min～15min，得沉淀；
步骤五，-55℃真空冷冻干燥，将沉淀溶于重量比1:5的蒸馏水中，70℃～80℃水浴挥去残余乙醇，经过真空冷冻干燥得到香菇多糖粗品。
进一步，该高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：
将香菇子实体干品烘干、粉碎到60目，每次取2克，通过筛选采用胰蛋白酶，按照料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，酶添加量为1%，自然PH，50℃反应6小时，沸水灭酶活20min，10000rpm离心10min，收集滤液，冷却，定容，加入无水乙醇到终浓度为70%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用70%酒精洗涤一次，10000rpm，10min离心去除上清，沉淀用水溶解，挥干酒精，真空冷冻干燥，测多糖含量。
进一步，该高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：
将香菇子实体干品烘干、粉碎到60目，每次取2克，按照料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，胰蛋白酶酶添加量为0.5%～2%，自然PH，50℃反应6小时，沸水灭酶活20min，离心过滤，收集滤液，冷却，定容，加入无水乙醇到终浓度为70%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用70%酒精洗涤一次，10000rpm，10min离心去除上清，沉淀用水溶解，挥干酒精，真空冷冻干燥，测多糖含量。
进一步，该高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：
将香菇子实体干品烘干、切片，称取600克，按料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，胰蛋白酶添加量为1.5%，自然PH，50℃反应4小时，沸水灭酶活20min，离心过滤，浓缩，冷却，四等分，分别加入无水乙醇至终浓度为50%、60%、70%、80%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用等浓度酒精洗涤一次，4000rpm，10min～15min离心去除上清，沉淀用水溶解，水浴挥干酒精，真空冷冻干燥，称重，测多糖含量。
进一步，该高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：
将香菇子实体干品烘干、切片，每次取50克，按照料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，胰蛋白酶添加量为1.5%，自然PH，50℃反应4小时，沸水灭酶活20min，离心过滤，浓缩至150ml，冷却，定容，加入无水乙醇到终浓度为70%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用70%酒精洗涤一次，10000rpm，10min离心去除上清，沉淀用水溶解，挥干酒精，真空冷冻干燥，测多糖含量。
本发明提供的高含量香菇多糖的制备方法，优化了醇沉浓度，从10%～80%乙醇浓度都进行了多糖的纯化，10%～40%均无沉淀析出，60%～70%醇沉浓度得到的多糖纯度高、得率高；本发明通过醇沉洗涤去除了小分子的低聚糖类，显著提高了多糖含量，同时降低了冻干品粘度、更易于干燥。本发明的提取过程容易实现，利于工业化生产与传统沸水提取法相比，耗能更少，得率更高，得到的香菇粗多糖含量大于50%，具有显著刺激巨噬细胞产生NO活性。本发明多糖提取物粗品得率为1.9%，比传统沸水提取法1.2%得率提高了53.1%；多糖含量大于50%，纯度大大提高，具有显著地刺激巨噬细胞产生NO活性。本发明的反应温度为50℃大大降低了能耗，节约了能源，易于工业化，是提取香菇多糖的有效方法。本发明制备的香菇多糖得率高、含量高，同时活性成分没有损失，是大规模制备香菇多糖有效方法。
附图说明
图1是本发明实施例提供的高含量香菇多糖的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例的高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：
S101：将香菇子实体于50℃烘干至恒重后，切片，按料液比1:20加入蒸馏水充分浸泡20min～30min，然后加入胰蛋白酶反应4小时，胰蛋白酶酶添加量为0.5%～2%，沸水灭酶活15min～20min，过滤、10000rpm，离心10min～15min得上清；
S102：提取液浓缩，采用旋转蒸发仪浓缩，将提取液按照浓缩比1:3进行浓缩；
S103：乙醇沉淀，为醇沉浓度相同的酒精浓度洗涤，向浓缩液中添加无水乙醇，至乙醇终浓度的质量百分比达到60%～70%，4℃静置过夜；
S104：醇洗，4000rpm离心15min，沉淀用等浓度60%～70%乙醇搅拌悬浮洗涤，10000rpm，离心10-15min，得沉淀；
S105：真空冷冻干燥，将沉淀溶于一定量的蒸馏水中，70度～80度水浴挥去残余乙醇，经过真空冷冻干燥得到香菇多糖粗品。
本发明的高含量香菇多糖的制备方法具体包括以下步骤：
步骤一，将香菇子实体于50℃烘干至恒重后，切片，按料液比1:20加入蒸馏水充分浸泡20min～30min，然后加入胰蛋白酶反应4小时，胰蛋白酶酶添加量为0.5%～2%，沸水灭酶活15min～20min，过滤、10000rpm，离心10min～15min得上清；
步骤二，提取液浓缩，采用旋转蒸发仪60℃浓缩，将提取液按照浓缩比1:3进行浓缩；
步骤三，乙醇沉淀，乙醇为醇沉浓度相同的酒精浓度洗涤，向浓缩液中添加无水乙醇，至乙醇终浓度的质量百分比达到60%～70%，4℃静置过夜；
步骤四，醇洗，4000rpm离心15min，沉淀用60%～70%乙醇搅拌悬浮洗涤，10000rpm，离心10min～15min，得沉淀；
步骤五，-55℃真空冷冻干燥，将沉淀溶于重量比1:5的蒸馏水中，70℃～80℃水浴挥去残余乙醇，经过真空冷冻干燥得到香菇多糖粗品。
结合以下具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
酶种类选择
将香菇子实体干品烘干、粉碎到60目，每次取2克；
选取纤维素酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、甲壳素酶分别进行单独和复合酶实验，以可溶性固形物（判断固体含量）和总糖为指标，筛选后续用酶；
按照料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，酶添加量为1%，自然PH，50℃反应6小时，沸水灭酶活20min，10000rpm离心10min，收集滤液，冷却，定容，加入无水乙醇到终浓度为70%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用70%酒精洗涤一次，10000rpm，10min离心去除上清，沉淀用水溶解，挥干酒精，真空冷冻干燥，测多糖含量。用苯酚-硫酸法测总糖含量，用手持式折光仪测定可溶性固形物的量，从表1结果可以看出胰蛋白酶效果最佳；
表1不同酶处理下，总糖含量与可溶性固形物对比
实施例2
酶浓度的确定，将香菇子实体干品烘干、粉碎到60目，每次取2克，按照料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，胰蛋白酶酶添加量为0.5%～2%，自然PH，50℃反应6小时，沸水灭酶活20min，离心过滤，收集滤液，冷却，定容，加入无水乙醇到终浓度为70%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用70%酒精洗涤一次，10000rpm，10min离心去除上清，沉淀用水溶解，挥干酒精，真空冷冻干燥，测多糖含量。用苯酚-硫酸法测总糖含量，用手持式折光仪测定可溶性固形物的量。低酶浓度下，总糖含量随蛋白酶浓度升高而升高，在1.5%～2.0%的添加量下提高较少，因此选择1.5%为酶的最佳添加量。
表2不同蛋白酶浓度下总糖含量和可溶性固形物对比
实施例3
醇沉浓度的优化，将香菇子实体干品烘干、切片，称取600克，按料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，胰蛋白酶添加量为1.5%，自然PH，50℃反应4小时，沸水灭酶活20min，离心过滤，浓缩至一定体积，冷却，四等分。分别加入无水乙醇至终浓度为50%、60%、70%、80%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用等浓度酒精洗涤一次，4000rpm，10min～15min离心去除上清，沉淀用水溶解，水浴挥干酒精，真空冷冻干燥，称重，测多糖含量。60%醇沉多糖含量高、70%醇沉多糖得率高。
表3不同醇沉浓度下多糖粗品得率与含量
实施例4
醇洗对多糖粗品得率和含量的影响，将香菇子实体干品烘干、切片，每次取50克，按照料液比1:20加入蒸馏水，充分浸泡30min，胰蛋白酶添加量为1.5%，自然PH，50℃反应4小时，沸水灭酶活20min，离心过滤，浓缩至150ml，冷却，定容。加入无水乙醇到终浓度为70%，静置过夜，离心去除上清，沉淀用70%酒精洗涤一次，10000rpm，10min离心去除上清，沉淀用水溶解，挥干酒精，真空冷冻干燥，测多糖含量。表4结果说明，经过乙醇洗涤后，香菇多糖含量大大提高，是提高多糖纯度简单易行的方式。
表4醇洗处理对多糖含量得率的影响
实施例5
体外刺激巨噬细胞生成NO实验，供试样品的配制，精确称取实例4制备的香菇子实体粗多糖样品于灭菌的eppendorf管中，用无菌PBS缓冲液配置成浓度5mg/mL，充分溶解后以12000rpm/min离心30min，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成50μg/mL、250μg/mL、500μg/mL待用，阴性对照为PBS缓冲液，阳性对照为10μg/mLLPS溶液；
小鼠RAW264.7巨噬细胞的制备，用DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下传代培养后，用0.25%胰蛋白酶消化，混悬液1000rpm/min离心3min后收集细胞，用无色RPMI1640培养基将细胞稀释到5×105备用；
巨噬细胞释放NO活性的测定，由于NO极不稳定，在体内很快生成亚硝酸基（NO2-）和硝酸基（NO3-），故采用Griess法测定样品中的NO2-/NO3-作为衡量NO水平的指标；
（1）用亚硝酸钠制标准曲线：
配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM共9个浓度梯度；取100μL于96孔板，加入50μLGriess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，绘制标准曲线；
（2）NO产量测定
稀释后的细胞按照每孔180μL加入96孔板，然后再加入20μL各浓度待测样品和阴性（PBS）、阳性（LPS，10μg/mL）对照，于37℃、含5%的CO2条件下培养48h后，取100μL培养上清于96孔板，加入50μLGriess试剂，显色10min后，于波长543nm处测定吸光度，根据标准曲线计算相应的NO量；
实施结果：
4种提取条件制备的香菇子实体粗多糖在浓度50μg/mL时，刺激巨噬细胞产生NO的量（单位：μmoL/5.0×105cells）分别为：39.61、35.75、37.25、33.40；在浓度250μg/mL时，产生NO量分别为44.69、47.42、42.12、45.16μmoL/5.0×105cells；在浓度500μg/mL时，产生NO量分别为50.37、57.72、49.84、53.34μmoL/5.0×105cells，阴性对照5.60μmoL/5.0×105cells，阳性对照（浓度1μg/mL）56.89μmoL/5.0×105cells，各样品组均显著高于阴性对照活性（p<0.05），本发明获得的粗多糖在三种浓度下测定的活性稳定上升，在500μg/mL优于阳性对照效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种高含量香菇多糖的制备方法，其特征在于，该高含量香菇多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将香菇子实体于50℃烘干至恒重后，切片，按料液比1:20加入蒸馏水充分浸泡20min～30min，然后加入胰蛋白酶反应4小时，胰蛋白酶酶添加量为0.5％～2％，自然pH,沸水灭酶活15min～20min，过滤,10000rpm，离心10min～15min得上清；
步骤二，提取液浓缩，采用旋转蒸发仪60℃浓缩，将提取液按照浓缩比1:3进行浓缩；
步骤三，乙醇沉淀，向浓缩液中添加无水乙醇，至乙醇终浓度的质量百分比达到60％～70％，4℃静置过夜；
步骤四，醇洗，4000rpm离心15min，沉淀采用与步骤三醇沉时乙醇终浓度相同的60％～70％乙醇搅拌悬浮洗涤，10000rpm，离心10min～15min，得沉淀；
步骤五，-55℃真空冷冻干燥，将沉淀溶于重量比1:5的蒸馏水中，70℃～80℃水浴挥去残余乙醇，经过真空冷冻干燥得到香菇多糖。
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