CN103649302A - 细胞培养装置、细胞培养长期观察装置、细胞长期培养方法以及细胞培养长期观察方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供细胞培养装置、细胞培养长期观察装置、细胞长期培养方法、细胞培养长期观察方法，不会产生随着培养细胞的老化而产生的生理状态的变化，而能够在均匀的环境条件下连续地培养、观察细胞，还能够追踪特定细胞的历史(谱系)。细胞培养装置具有细胞培养基板、半透膜、培养液的供给机构，细胞培养基板在表面具有用于保持培养细胞的细的培养用槽和用于将在该培养用槽内保持培养的细胞排出的粗的排出用槽，并且，所述培养用槽的两端与排出用槽连接，排出用槽比培养用槽粗且比培养用槽深，半透膜用于覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽，培养液的供给机构能够对由半透膜覆盖的细胞培养基板连续地供给培养液。

Description

细胞培养装置、细胞培养长期观察装置、细胞长期培养方法以及细胞培养长期观察方法

技术领域

本发明涉及细胞培养装置、细胞培养长期观察装置、细胞长期培养方法以及细胞培养长期观察方法。

背景技术

一直以来，在将细胞放入碟皿等中并在显微镜下观察细胞时，随着时间的经过，细胞消耗营养而积蓄废物，造成细胞周围的环境发生变化，因此难以进行历经几个世代的细胞的连续的培养、观察。而且，该情况下，由于细胞呈几何级数地增殖，因此存在难以追踪观察特定的细胞这样的问题。

因此，作为用于长期培养细胞的方法，例如，本发明人提出了将细胞放入微米尺寸的容器中并使用光镊等细胞处理技术将一部分的细胞向测量系统外除去的方法(非专利文献1)。但是，对于该方法而言，一次移动的细胞的数量少，而且实验者需要一个个地挑选并除去细胞，因此工作的负担大，事实上最长也只能达到10世代左右的连续培养。

另一方面，最近，作为用于长期培养、观察细胞的方法，关注一种被称为“Mother machine”的方法(非专利文献2)。在该方法中，在基板上形成宽度大的槽(100μm宽)、须状的宽度小的槽(1μm宽、25μm长)。而且，将细胞放入该宽度小的槽中，并使宽度大的槽中流动培养液，利用培养液冲走随着细胞增殖而被从宽度小的槽挤出到宽度大的槽中的细胞，从而连续地除去不需要的细胞，而能够历经200世代以上地培养宽度小的槽内的细胞。

【在先技术文献】

【非专利文献】

非专利文献1：Wakamoto，Y.et al.(2001)Fres′J Anal Chem；Wakamoto，Y.et al.(2005)Analyst

非专利文献2：Current Biology，22June2010，Pages1099-1103“RobustGrowth of Escheruchia coli.”Ping Wang et al.

发明内容

【发明要解决的课题】

但是，“Mother machine”被设计为，须状的宽度小的槽的一方的端部被封锁，即使除去了连续培养不需要的细胞，在该宽度小的槽中残留的细胞也必然是老细胞(母细胞)。即，在“Mother machine”中，不存在抑制随着培养细胞的老化而产生的生理状态的变化的构思，从而存在不可避免地伴随有随着所观察的细胞的老化而产生的生理状态的变化的问题。

此外，在“Mother Machine”中，细胞周围的培养环境通过由来自宽度大的槽的扩散引起的宽度小的槽内的培养液的更换而进行。在该方法中，在将宽度小的槽的长度形成得较长的情况下，存在这样的问题：在宽度小的槽内，靠近宽度大的槽的区域和远离宽度大的槽的区域的环境条件发生较大变化。因此，例如，在观察细胞对药物等的响应时，由于环境条件的差异而引起培养细胞的响应的结果发生波动，从而导致难以实现准确的检验。

本发明是鉴于如上的情况而完成的，其目的在于提供如下的细胞培养装置、细胞培养长期观察装置、细胞长期培养方法以及细胞培养长期观察方法，即，没有伴随培养细胞的老化而产生的生理状态的变化，能够在均匀的环境条件下连续长期培养、观察细胞，从而能够追踪特定的细胞的历史(谱系)。

【用于解决课题的手段】

为了解决上述的课题，本发明的细胞培养装置具有细胞培养基板、半透膜、培养液的供给机构，所述细胞培养装置的特征在于，细胞培养基板在表面具有用于保持培养细胞的细的培养用槽和用于将在该培养用槽内保持培养的细胞排出的粗的排出用槽，并且，所述培养用槽的两端与排出用槽连接，排出用槽比培养用槽粗且比培养用槽深，半透膜用于覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽，培养液的供给机构能够对由半透膜覆盖的细胞培养基板连续地供给培养液。

在该细胞培养装置中，优选为，半透膜能够通过生物素-抗生物素蛋白结合覆盖细胞培养基板。

在该细胞培养装置中，更优选为，所述培养液的供给机构具有送液衬垫。

本发明的细胞培养长期观察装置的特征在于，该细胞培养长期观察装置具备所述的细胞培养装置和能够观察细胞培养基板上的细胞的显微观察机构。

在该细胞培养长期观察装置中，优选为，显微观察机构为倒立型显微镜。

本发明的细胞长期培养方法为利用所述细胞培养装置长期培养细胞的方法。此外，所述细胞长期培养方法的特征在于，该细胞长期培养方法包括：将期望的细胞保持在细胞培养基板的培养用槽内的工序；利用半透膜覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽的工序；利用供给机构向细胞培养基板连续地输送培养液，经由半透膜向被保持在细胞培养基板的培养用槽内的细胞供给培养液，并且，利用在与培养用槽的两端连接的排出用槽中流动的培养液向培养用槽内的细胞的一部分向排出用槽排出的工序。

本发明的细胞培养长期观察方法为利用所述细胞培养长期观察装置长期培养、观察细胞的方法。此外，所述细胞培养长期观察方法的特征在于，所述细胞培养长期观察方法包括：将期望的细胞保持在细胞培养基板的培养用槽内的工序；利用半透膜覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽的工序；利用供给机构向细胞培养基板连续地输送培养液，经由半透膜向被保持在细胞培养基板的培养用槽内的细胞供给培养液，并且，利用在与培养用槽的两端连接的排出用槽中流动的培养液将培养用槽内的细胞的一部分向排出用槽排出的工序；利用显微观察机构观察细胞培养基板上的细胞的工序。

【发明效果】

根据本发明，能够进行长期连续培养，从而不会产生随着培养细胞的老化而产生的生理状态的变化，能够在均匀的环境条件下或者受到控制的环境变化条件下连续培养细胞，且能长期观察生长状态，能够以长期追踪特定细胞的生长的方式进行观察，因此能够进行细胞尺寸频度分布、生长率的频度分布、世代时间的频度分布、蛋白质表达水平的自相关函数的测定、细胞谱系的测定。

附图说明

图1(A)为例示了构成本发明的细胞培养装置的细胞培养基板的一实施方式的部分放大图。图1(B)为图1(A)的A-A’剖视图，图1(C)为图1(A)的B-B’剖视图。

图2为例示了构成本发明的细胞培养装置的细胞培养基板的另一实施方式的部分放大图。

图3(A)为例示了本发明的细胞培养装置的一实施方式的整体图，并将一部分用剖面表示。图3(B)为例示了半透膜的使用方法的概略图。

图4为例示了向由半透膜覆盖的细胞培养基板供给培养液时的细胞的状态的示意图，(A)为俯视图，(B)为剖视图。

图5为例示了本发明的细胞培养装置的另一实施方式的整体图，并将一部分用剖面表示。

图6为例示了本发明的细胞培养长期观察装置的一实施方式的整体图，并将一部分用剖面表示。

图7为记录有存在于细胞培养基板上的培养用槽内的细胞的状况的连续图像的一部分。

图8为绘制有通过图像解析得到的、一个细胞系的55世代的细胞尺寸的变化以及细胞内部的GFP表达水平(细胞内浓度)的变化的图。

图9为表示进行表达GFP的大肠杆菌的延时观察、测定观察到的所有时刻的所有细胞的细胞内GFP平均荧光辉度、并测定出据此推定出的GFP表达水平的频度分布的结果的图形(实施例4)。

图10为表示进行表达GFP的大肠杆菌的延时观察而测定出细胞尺寸的频度分布的结果的图形(实施例5)。

图11为表示进行表达GFP的大肠杆菌的延时观察而测定出生长率的频度分布的结果的图形(实施例6)。

图12为表示进行表达GFP的大肠杆菌的延时观察而测定出世代时间的频度分布的结果的图形(实施例7)。

图13为表示进行表达GFP的大肠杆菌的延时观察而测定出蛋白质表达水平的自相关函数的结果的图形(实施例8)。

图14为表示进行表达GFP的大肠杆菌的延时观察而测定出细胞分裂龄的频度分布的结果的图形(实施例9)。

图15为表示进行表达GFP的大肠杆菌的延时观察而测定出在一个观察用槽内观察到的细胞谱系的结果的图形(实施例10)。

图16(A)为表示在玻璃基板的表面形成有槽深度小于细胞尺寸的培养用槽的情况下的细胞的状态的从玻璃基板上方拍摄的照片。图16(B)为表示在玻璃基板的表面形成有槽深度具有细胞尺寸的2倍以上的大小的培养用槽的情况下的细胞的状态的从玻璃基板上方拍摄的照片。

具体实施方式

本发明的细胞培养装置具有细胞培养基板、半透膜、培养液的供给机构。

图1(A)为例示了构成本发明的细胞培养装置的细胞培养基板的一实施方式的部分放大图。图1(B)为图1(A)的A-A’剖视图，图1(C)为图1(A)的B-B’剖视图。

细胞培养基板在表面上形成有细的培养用槽L的两端与粗的排出用槽M连接的格子状的槽图案。培养用槽L和排出用槽M以大致直角交叉。

培养用槽L作为将细胞保持在槽内而能够进行连续的培养的区域发挥功能，排出用槽M作为通过将保持于培养用槽L内被培养的细胞适度冲走并排出来调节培养用槽L内的环境的区域发挥功能。

在本发明中，连续的培养指历经多个世代的细胞培养，在本发明中，通过控制细胞周围的环境能够实现历经200世代以上的长期细胞培养。

作为本发明对象的细胞可以为所期望的细胞，细胞的种类不受限定。具体而言，例如，包含从人或非人动物的组织分离的干细胞、皮肤细胞、粘膜细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、骨细胞、肌细胞等、植物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等细菌细胞等细胞，能够培养其中的1种或2种以上的细胞。

培养用槽L由于是用于将细胞保持于槽内的槽，因此，前提是槽深度L1以及槽宽度L2大于所培养的细胞的尺寸。具体而言，培养用槽L的槽深度L1能够设计成比细胞的尺寸大1倍～2倍，优选为1倍～1.5倍。而且，培养用槽L的槽宽度L2能够设计成比细胞的尺寸大1倍～3倍，优选为1倍～2倍。

在此所说的“细胞的尺寸”，在为大致球形的细胞的情况下，以细胞的直径(最大长度)为基准。而且，例如，在为细长的棒状等球形以外的细胞的情况下，能够根据将细胞载置于基板上的状态下的细胞的厚度(宽度)决定细胞的尺寸，在该情况下，培养用槽L的槽深度L1能够设计成比细胞的厚度(宽度)大1倍～2倍，槽宽度L2能够设计成比细胞的厚度(宽度)大1倍～3倍。

而且，细胞的尺寸也能够参照文献等中记载的公知的尺寸，也能够根据实际通过显微镜等测定细胞的尺寸的结果决定。

当培养用槽L的槽深度L1以及槽宽度L2在所述的范围内时，能够将细胞稳定地保持在培养用槽L内，从而能够进行细胞的连续的培养、观察。另外，当培养用槽L的槽深度L1具有比细胞的尺寸大2倍的大小时，细胞可能不会停留在培养用槽L内而向排出用槽M流出，难以将细胞保持于培养用槽L内而连续地进行培养。而且，当培养用槽L的槽宽度L2具有比细胞的尺寸大3倍的大小时，半透膜也粘接于培养用槽内，可能导致压坏细胞或细胞不向排出用槽流出，难以连续地进行培养。

另外，培养用槽L的长度能够根据细胞的尺寸、应当在培养用槽L内保持培养的细胞的数量等适当设计。具体而言，例如，能够例示10μm～100μm左右的范围，优选30μm～100μm左右的范围。

另一方面，排出用槽M形成得比培养用槽L粗、深。即，排出用槽M的槽深度M1以及槽宽度M2形成得大于培养用槽L的槽深度L1以及槽宽度L2。在此，如图1所示，“排出用槽M的槽深度M1”是指从培养用槽L的槽底的高度位置到排出用槽M的槽底的距离。

排出用槽M的槽深度M1以及槽宽度M2能够根据在培养用槽L保持培养的细胞的尺寸、数量、在细胞培养基板上流动的细胞培养液的速度，在能够冲走培养用槽L内的细胞的范围内适当设计。作为大致的基准，排出用槽M的槽深度M1优选为细胞的尺寸的3倍～50倍的大小。而且，就排出用槽M与培养用槽L的关系而言，能够例示排出用槽M的槽深度M1为培养用槽L的槽深度L1的1.5倍～50倍的深度。具体而言，排出用槽M的槽深度M1能够优选例示出5μm～50μm左右的范围。

另外，排出用槽M的槽宽度M2具有与槽深度M1同等程度或其以上的大小。就排出用槽M与培养用槽L的关系而言，能够例示排出用槽M的槽宽度M2为培养用槽L的槽宽度L2的10倍～100倍的长度，具体而言，能够例示10μm以上，优选30μm以上的范围。

像这样，培养用槽L以及排出用槽M的槽深度(L1、M1)以及槽宽度(L2、M2)能够根据所培养的期望的细胞的尺寸适当设计。列举具体例，例如，公知大肠杆菌的尺寸大致为0.5μm～1.0μm(宽度)×1.5μm～7.0μm(长度)。在利用本发明的细胞培养装置连续培养大肠杆菌时，例如，对于细胞培养基板的培养用槽L而言，能够优选例示出槽深度L1：1.0μm～1.5μm、槽宽度L2：1.0μm～3.0μm的范围，对于排出用槽M而言，能够优选例示出槽深度M1：5μm～20μm、槽宽度M2：20μm～100μm的范围。

细胞培养基板的材料例如能够例示出硼硅酸盐玻璃、石英玻璃等玻璃、聚苯乙烯等树脂、塑料或者硅基板等。其中，玻璃基板的加工性、处理性优异，因而优选。

在利用玻璃制作细胞培养基板的情况下，相对于玻璃板的一个面，例如通过光刻法将培养用槽L和排出用槽M的形状形成为光致抗蚀剂的图案，再利用公知的方法进行蚀刻而形成培养用槽L和排出用槽M，从而制作成细胞培养基板。另外，也能够适当地对玻璃板实施激光加工等。另外，作为图案形成，除光刻法以外，也能够利用电子束直接描画法等。细胞培养基板可以利用表面处理剂对其表面进行处理，也可以进行物理性的表面加工处理。例如，能够进行对细胞培养基板表面或者表面的一部分赋予亲水性、亲油性、防水性等功能的处理。例如，能够在表面赋予硅涂层、官能基涂层，例如氨基、异氰酸酯基、环氧基、羧基、羟基、巯基、硅烷醇基等官能基。而且，优选利用生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素等中的任一种修饰表面。或者，也能够利用胶原、纤连蛋白、明胶等细胞粘接基质涂敷细胞培养基板的表面。

培养用槽L和排出用槽M的槽图案并不限定于图1中例示的形状。在细胞培养基板中，培养用槽L和排出用槽M只要以大致直角的角度连接即可，例如也可以为图2所例示那样的具有在两条排出用槽M之间形成有一条培养用槽L的槽图案的形态。另外，只要能够适当冲走培养用槽L内的细胞，排出用槽M相对于培养用槽L也可以不是严格地以直角连接，具体而言，排出用槽M相对于培养用槽L的角度能够容许在90°±15°的范围左右。此外，培养用槽L以及排出用槽M优选呈直线状，但也可以具有一部分弯曲的区域。另外，图1中，培养用槽L和排出用槽M的截面形状形成为方形，然而并不限定于该形状，例如，也可以为槽的底部弯曲的形状。

本发明的细胞培养装置所具有的半透膜用于覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽。作为半透膜，例如，能够采用纤维素膜等公知的半透膜。半透膜优选利用生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素中的任一种来修饰，该情况下，细胞培养基板也优选利用生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素中的任一种来修饰基板的表面。在细胞培养基板利用生物素修饰的情况下，使用利用抗生物素蛋白或链霉亲和素修饰了的半透膜，在细胞培养基板利用抗生物素蛋白、链霉亲和素修饰的情况下，使用利用生物素修饰了的半透膜，从而通过生物素抗生物素蛋白结合，能够从上方密封细胞培养基板的培养用槽L以及排出用槽M。利用该半透膜，能够始终从上表面向细胞供给新鲜的培养液。

在利用半透膜覆盖细胞培养基板的上表面的情况下，例如，能够例示以下的方法。首先，在细胞培养基板的上表面蒸镀或者溅射与硅、或氧化硅、或铬、或铝、或铁、或钛等的硅烷醇基进行硅烷偶联的材料的薄膜。然后，在该薄膜的表面，例如通过在一端具有硅烷醇基而在另一端具有氨基或者羧基或者巯基的双功能试剂等导入氨基或者羧基或者巯基，从而使生物素形成共价键。然后，利用抗生物素蛋白或链霉亲和素来修饰纤维素等膜等半透膜，使该半透膜和薄膜接触，通过进行生物素-抗生物素蛋白结合而能够密封细胞培养基板的上表面。需要说明的是，也能够使细胞培养基板的薄膜的表面的抗生物素蛋白或链霉亲和素与半透膜的生物素结合。需要说明的是，半透膜只要能够从上方以良好的密接性被覆细胞培养基板的排出用槽以及培养用槽即可，未必限定于利用生物素-抗生物素蛋白结合的形态。

接下来，对本发明的细胞培养装置的一实施方式进行说明。图3(A)为例示了本发明的细胞培养装置的一实施方式的整体图，并将一部分用剖面表示。图3(B)为例示了半透膜的使用方法的概略图。此外，图4为例示了向由半透膜覆盖的细胞培养基板供给培养液时的细胞的状态的示意图，(A)为俯视图，(B)为剖视图。

细胞培养装置1具有细胞培养基板2、半透膜3、培养液的供给机构4。

如上所述，在细胞培养基板2上形成有培养用槽L以及排出用槽M，其上表面被半透膜3覆盖。如图3(B)所例示，半透膜3至少覆盖培养用槽L的上方区域即可。通过使排出用槽M的两端部侧处于不被半透膜3覆盖而开放的状态，能够从排出用槽M的一端供给培养液、并从另一端排出培养液。而且，能在由半透膜3覆盖的培养用槽L内保持细胞。

在培养用槽L以及排出用槽M的周围，在细胞培养基板2的表面配设有框架密封件S。框架密封件具有适度的厚度，能够优选例示出在表背面具有粘接性的构件，然而并不特别限定。

培养液的供给机构4具有送液泵41(注射器)、送液衬垫42、废液罐43。

送液泵41通过送液管与送液衬垫42的一端的贯通孔连接，能送出细胞所需的培养液而向细胞培养基板2供给培养液。

送液衬垫42配置在细胞培养基板2之上，配置为覆盖培养用槽L、排出用槽M以及半透膜3，且在包含培养用槽L、排出用槽M以及半透膜3的范围的周围借助框架密封件S进行密接密封。另外，送液衬垫42以贯通垫面的方式在其一方端部的至少一个部位设置供培养液流入的贯通孔，且在另一方端部的至少一个部位设置将废培养液向外部排出的贯通孔。这些各贯通孔配置为：使得在形成于送液衬垫42和细胞培养基板2之间、充满了培养液的空间内，从培养液流入用贯通孔向排出用贯通孔流动有营养液即可。

即，送液衬垫42具有在细胞培养基板2上始终保持新鲜的培养液的功能。

送液衬垫42能够使用玻璃、丙烯酸等硬质材料或者橡胶、合成橡胶等柔性材料，没有特别限制。另外，关于送液衬垫42的透明性，在显微镜观察需要来自细胞培养装置1的上表面的透过光时适合使用透明的材料，而在荧光观察等不需要透过光时，未必需要透明。

在该实施方式中，如图3(A)所示，送液衬垫42隔着框架密封件S粘接于细胞培养基板2的上方。在细胞培养基板2和送液衬垫42之间形成有空间，在培养时，该空间被从送液泵供给来的培养液充满。而且，通过了细胞培养基板2上的培养液通过送液衬垫42的所述的贯通孔而向与该送液衬垫42连接的废液罐43送出。送液衬垫42能够优选例示出例如由PDMS(聚二甲基硅氧烷)形成的透明的垫。由PDMS形成的送液衬垫42例如通过如下能够制作成为箱盖形状：在硅晶片上涂布光致抗蚀剂，利用光刻法制作将槽翻转而成的凸型的铸型，向该铸型中注入PDMS树脂并进行加热成型。另外，在送液衬垫42上，例如也能够在箱盖内面底上设置除去培养液中的泡的除泡槽等。

而且，在图3(A)中，培养液的供给机构4配置为：从送液泵41向细胞培养基板2供给的培养液的供给方向与细胞培养基板2的排出用槽M的长度方向一致。

此外，如图6所示，本发明的细胞培养装置1能够与能观察细胞培养基板2上的细胞的显微观察机构5一起构成细胞培养长期观察装置。作为显微观察机构5，例如能够举出具备将观察对象的细胞的像放大的透镜等光学系统的装置，具体而言，能够例示出倒立型显微镜、光学显微镜、荧光显微镜、视频录像装置、相机等。而且，也能够将这些显微观察机构与个人电脑等连接而进行图像处理。而且，也可以与用于容易进行细胞观察的光照射装置一起使用。

接下来，对利用了本发明的细胞培养装置的细胞长期培养方法、细胞培养长期观察方法的一实施方式进行说明。

使图3、图5的供给机构4的送液泵41驱动，而向细胞培养基板2上输送培养液。由于从送液泵41向细胞培养基板2的培养液的送液方向与细胞培养基板2的排出用槽M的方向一致，因此，从送液泵41供给来的培养液从排出用槽M的一端顺畅地流入，充满送液衬垫42和细胞培养基板2之间的内部空间且通过细胞培养基板2上。例如，培养液的送液能够以送液速度在0.5ml／hr～200ml／hr左右的范围内进行。

此时，通过利用半透膜3覆盖细胞培养基板2的上表面，从而能够抑制在细胞培养基板2上流动营养液时在培养用槽L内保持培养的细胞流出且能够供给培养液。细胞培养基板2由于在细的培养用槽L的两侧连接有粗的排出用槽M，因此存在例如在对置的两条排出用槽M流动的培养液的流速略有不同的情况等。因此，在不使用半透膜3的情况下，可能导致培养液以较快的流速流入培养用槽L内从而造成细胞从培养用槽L内向排出用槽M流出。通过利用半透膜3覆盖细胞培养基板2的培养用槽L，能够抑制培养液从排出用槽M向培养用槽L的流入，从而能够稳定地保持培养用槽L内的细胞。

此外，在半透膜3的上侧流动的培养液通过经由半透膜3透过、扩散相对于保持在培养用槽L内的细胞供给。因此，例如，在将培养用槽L形成得长至30μm以上的情况下，也能将培养用槽L内维持稳定且均匀的环境条件。而且，通过使培养环境均匀，能够更准确地检验细胞对药物等的响应。

图4为例示了向由半透膜覆盖的细胞培养基板供给培养液时的细胞的状态的示意图。需要说明的是，图4中省略了培养用槽L和排出用槽M的连接部的边界线的图示。图4(A)为俯视图，图4(B)为剖视图。

通过经由半透膜3而进行的培养液的供给，能够稳定地培养培养用槽L内的细胞，使其呈几何级数地增殖。而且，当成为细胞充满培养用槽L内的状态时，利用在培养用槽L的两侧以大致直角的角度连接的排出用槽M中流动的培养液，将位于培养用槽L的两端(排出用槽M和培养用槽L的连接部)附近的细胞的一部分向排出用槽M内冲走，并与培养液一起排出而向废液罐43回收。因此，能够将培养用槽L内的细胞的数量维持在规定的数量，从而能够解决以往随着时间的经过而产生的细胞的营养消耗、废物的积蓄、细胞周围的环境变化等问题，利用使用了显微观察机构5的细胞培养长期观察装置，能够进行历经200世代以上的细胞的连续的培养、观察。由此，能够基于以往没有的长期间的时序数据测量一个细胞系的生长速度、基因表达水平的波动的大小、自相关函数的信息。而且，由于历经100世代以上的时间相当于发生随着基因型的变化的进化状态的时间标尺，因此本发明的细胞培养装置、细胞培养长期观察装置能够应用于至今为止难以进行实验性的证实、检验的进化研究。

而且，构成本发明的细胞培养装置的细胞培养基板由于在培养用槽L的两端连接有排出用槽M，因此培养用槽L内的细胞具有流动性，从而能避免像以往的“Mother machine”那样母细胞残留于培养用槽L的现象。因此，能抑制伴随培养用槽L内的细胞老化而产生的生理状态的变化。

而且，由于在培养用槽L内残留的细胞为从存在于培养用槽L内的细胞(母细胞)分裂出来的细胞，因此通过进行由显微观察机构5、计算机进行的图像解析等，能够细胞培养长期观察装置追踪特定的细胞的历史(谱系)地进行观察、解析。

此外，本发明的细胞培养装置、细胞培养长期观察装置也可以用于基因突变的检测。具体而言，通过使用设计为在某个特定的部位发生了移码突变、点突变等基因突变时、配置于该部位的荧光蛋白质以正确的排列表达的细胞株，能够在存在于培养用槽内的细胞发生了该突变时以通过荧光蛋白质的表达而细胞开始发出荧光的方式检测到细胞未被杀死而发生了突变的情况。通过在细胞培养装置内长期间连续观察该细胞，能够获取该基因突变的发生频度、在分裂周期中的发生时间等信息。

图5为例示了本发明的细胞培养装置的另一实施方式的整体图，将一部分用剖面表示。省略对与图3、图4所示的方式共通的部分的说明。

在图5所例示的细胞培养装置1中，在送液衬垫42连接有多个送液泵41，能从各个送液泵向由半透膜3覆盖的细胞培养基板2供给培养液。在该实施方式中，例如，在各个送液泵41中放入不同成分的培养液，在连续培养的适当时间切换使用的送液泵，从而能够对保持在细胞培养基板2的培养用槽L中的细胞施加各种环境条件的变化，能够长期检验对施加有环境条件的变化的细胞的影响。

图6为例示了本发明的细胞培养长期观察装置的一实施方式的整体图，将一部分用剖面表示。省略对与图3、图5所示的实施方式共通的部分的说明。

图6所例示的细胞培养长期观察装置1a具备细胞培养装置1和显微观察机构5。

在该实施方式中，作为适于如上所述的细胞的生长速度、荧光蛋白质的表达等的经时观察的显微观察机构5，使用具备荧光显微镜功能的倒立型电动显微镜。

倒立型电动显微镜(显微观察机构5)具备：明视场观察光源51a、荧光观察用光源51b、自动快门52a、自动快门52b、聚光透镜53、二向色镜54、物镜55以及XY台56。XY台56具有开口部A，细胞培养装置1的细胞培养基板2以保持有细胞的培养用槽L位于开口部A的方式被载置在XY台56上。

保持于培养用槽L的细胞利用由电动机驱动的XY台56能够自动移动至欲观察的位置。在XY台56的开口部A的下方相邻地配置有物镜55。通过使XY台56分别沿横切光轴的X、Y轴方向移动且使物镜55沿Z轴方向向上下方向移动，能够调整XY台56和物镜55的相对位置。而且，通过使XY台56不仅在X、Y轴方向移动还在Z轴方向上独立移动，也能够调节XY台56与物镜55的相对距离。

倒立型电动显微镜在未图示的主体外壳的内部具备明视场透过照明系统、反射照明系统、拍摄系统。明视场透过照明系统配置于比XY台56的高度位置靠上方的位置，反射照明系统以及拍摄系统配置在比XY台56的高度位置靠下方的位置。

明视场透过照明系统用于进行利用透过光的观察。明视场透过照明系统包含明视场观察光源51a、自动快门52a、聚光透镜53。明视场观察光源51a能够使用卤素灯等。从该明视场观察光源51a射出的光在自动快门52a打开的状态下，通过聚光透镜53，朝向垂直方向下方而对被保持于在XY台56上载置的细胞培养基板2的培养用槽L中的细胞进行照射。

反射照明系统用于进行利用荧光的观察。反射照明系统包含荧光观察用光源51b、自动快门52b、二向色镜54。荧光观察用光源51b能够使用汞灯等。反射照明系统除此以外还可以具备吸热过滤片、聚光透镜、用于使来自荧光观察用光源51b的光成为特定的短波段的激发光的激发滤光片等光学系统。从该荧光观察用光源51b射出的光在自动快门52b打开的状态下，通过二向色镜54以及物镜55，朝向垂直方向上方而从开口部A对被保持于在XY台56上载置的细胞培养基板2的培养用槽L中的细胞进行照射。

拍摄系统包含面向二向色镜54安装的相机57。相机57能够使用例如CCD相机。

此外，倒立型电动显微镜搭载有电源单元、电动机驱动电路板等。电源单元包含明视场观察光源51a的电源、用于控制装入倒立型电动显微镜的电动机等系统的电源、荧光观察用光源51b的电源等。电动机驱动电路板例如对用于在X、Y轴方向上驱动XY台56的电动机、用于驱动拍摄系统的电动变焦机构的电动机、用于驱动汞灯等荧光观察用光源51b的光圈的电动机等进行控制。

使用者能够通过个人电脑等计算机58并利用键盘、鼠标对倒立型电动显微镜进行各种操作、设定。

可以选择性地使用透过照明系统和反射照明系统。当选择透过照明系统时，通过来自明视场观察光源51a的透过照明光得到的被保持在培养用槽L中的细胞的像，从开口部A通过物镜55而由二向色镜54反射，被朝向水平方向配置的相机57摄入。

另一方面，当选择反射照明系统时，通过来自荧光观察用光源51b的激发光的照射得到的被保持在培养用槽L中的细胞的基于荧光的像，从开口部A通过物镜55而由二向色镜54反射，被导入朝向水平方向配置的相机57摄入。

此外，虽然未图示，但倒立型电动显微镜具备用于以肉眼观察细胞的目镜和将目镜与物镜55光学结合的光学系统。该光学系统包含反射镜、中继透镜、光路切换棱镜。例如，在利用相机57进行观察时，光路切换棱镜被插入观察光轴上，物镜原像被光路切换棱镜反射，能够利用相机57进行观察。另一方面，当通过肉眼进行观察时，光路切换棱镜从观察光轴退出，物镜原像被反射镜朝向目镜反射。此外，物镜原像被中继透镜转换，从而能够通过目镜以肉眼进行观察。

利用如上结构的细胞培养装置1，能够进行如下的细胞观察。

与图3、图5的实施方式同样，利用培养液的供给机构4，向隔着框架密封件S粘接于细胞培养基板2的上方的送液衬垫42与细胞培养基板2之间供给培养液。需要说明的是，在该实施方式中，在送液衬垫42设置有上述的作为除去培养液中的泡的槽的除泡用槽44。

在该实施方式中，使用倒立型电动显微镜作为显微观察机构5，因此使显微观察机构5的观察位置位于细胞培养装置1之下是很重要的。

由此，供给至送液衬垫42与细胞培养基板2之间的培养液中的泡被细胞培养基板2上方的除泡用槽44向上方除去，从与其相反侧的细胞培养基板2的下方，利用物镜55通过XY台56的开口部A能够得到被保持在培养用槽L内的细胞的放大像。

因此，能防止在细胞培养装置1内产生的泡阻碍利用显微观察机构5进行的观察的情况，从而也能够进行长期连续细胞观察，例如200世代的长期连续细胞观察。

通过经由半透膜3进行的培养液的供给，可以稳定地培养培养用槽L内的细胞，使其呈几何级数地增殖。而且，当成为细胞充满培养用槽L内的状态时，利用在培养用槽L的两侧以大致直角的角度连接的排出用槽M中流动的培养液将位于培养用槽L的两端附近的细胞的一部分向排出用槽M内冲走，而与培养液一起排出。

这样，通过对在培养用槽L内培养的细胞照射透过照明系统和反射照明系统中的任一个，能够通过相机57或目镜观察到使用物镜55放大了的像。

在利用透过照明系统进行的观察中，具体而言，能够观察如上所述的细胞的尺寸，特别是一个细胞系中的细胞尺寸的变化、生长速度等。

在利用反射照明系统进行的荧光观察中，具体而言，能够观察如上所述的在细胞内部的荧光蛋白质的表达水平及其变化、染色了的细胞的荧光图像及其变化等。

即，由于在培养用槽L内残留的细胞为从存在于培养用槽L内的细胞(母细胞)分裂出来的细胞，因此通过进行利用显微观察机构5、计算机58的解析等，能够追踪特定的细胞的历史地进行观察、解析。

例如，通过利用相机57经时地取得荧光蛋白质的荧光图像等，并将其记录在计算机58中，能够进行延时测量。通过利用专用的图像解析软件在计算机58中对该延时图像进行解析，能够取得与取得图像中含有的细胞的尺寸、内部的荧光辉度的平均等相关的时序信息。由此，能够基于以往没有的长期间的时序数据测量一个细胞系的生长速度、基因表达水平的波动的大小、自相关函数等的信息。

本发明并不限定于以上的实施方式。能对其细节部分可以采取各种形态是不言而喻的。

【实施例】

以下，通过实施例更详细地说明本发明，然而本发明并不限定于这些实施例。

<实施例1>细胞培养基板的作成

作为用于连续培养大肠杆菌的细胞培养基板，在玻璃基板(60mm(长度)×24mm(宽度)×0.17mm(厚度))上以格子状设置培养用槽L(槽深度L1：1.0μm、槽宽度L2：3.0μm、长度30μm，50条)、排出用槽M(M1：槽深度17μm、M2：槽宽度60μm、长度5000μm，20条)(参照图1)。

<实施例2>由半透膜进行的覆盖

利用生物素修饰在实施例1中作成的细胞培养基板的表面。另一方面，作为半透膜使用宽度1mm×长度1mm的纤维素制半透膜，并利用链霉亲和素修饰表面。而且，在从细胞培养基板的表面的培养用槽L、排出用槽M的上方滴下包含大肠杆菌的1μl的培养液后，利用半透膜密封细胞培养基板的培养用槽L以及排出用槽M的上方的中央部分的一部分区域。

<实施例3>细胞的培养、观察

利用本发明的细胞培养装置，对细胞连续地进行培养、观察。具体而言，将作为两面带的呈四边框形状的框架密封件(バイオラツド社(Bio-Rad)制：SLF-0201)以包围培养用槽以及排出用槽的方式密封在细胞培养基板上，再在框架密封件上表面粘贴PDMS制的送液衬垫。将安装于PDMS制的送液衬垫的两根硅制管中的一根与注射器(送液泵)连结，将另一根导入废液罐内(参照图3)。通过注射器，以2ml／h的流速连续地持续流动作为营养源含有0.2％重量比的葡萄糖的大肠杆菌培养用M9最小培养基。通过将该细胞培养装置配置在倒立型电动显微镜的台上而构成图6所示的细胞培养长期观察装置，并利用倍率100倍相位差物镜以2分钟间隔延时观察培养用槽内的细胞。

观察中使用的大肠杆菌具体而言为W3110菌株，并具有以被rpsL基因的启动子控制的方式表达荧光蛋白质(GFP)的质粒。

在延时测量中，取得细胞的GFP的荧光图像，并将其记录在PC上。通过利用图像解析软件ImageJ(http：／／rsbweb.nih.gov／ij／)对该延时图像进行解析，而取得与取得图像中含有的细胞的尺寸、内部的荧光辉度的平均(相当于GFP的细胞内浓度)相关的时序信息。

图7为记录有存在于细胞培养基板上的培养用槽内的细胞的状况的连续图像的一部分。

如图7所示，可以确认，当对细胞培养基板供给培养液而进行连续培养时，存在于培养用槽内的细胞中的、存在于培养用槽的两端的细胞的一部分被适度地向排出用槽冲走而从画面消失。而且，还可以确认，利用细胞培养基板的槽形状以及半透膜能将细胞稳定地保持在培养用槽L内进行培养。此外，通过经由半透膜进行的向细胞的培养液的供给，能将培养用槽L内维持在稳定且均匀的环境下。

可以确认，通过将存在于培养用槽的两端的细胞适度地向排出用槽冲走，能够将培养用槽L内的细胞的数量维持在规定的数量，从而能够解决以往随着时间的经过而产生的细胞的营养消耗、废物的积蓄、细胞周围的环境的变化等问题，能够进行细胞的连续的培养、观察。而且，还可以确认，能避免母细胞残留于培养用槽L，从而能够不发生随着老化而产生的生理状态的变化，而长期培养培养用槽L内的细胞。

图8为绘制有通过图像解析得到的一个细胞系的55世代的细胞尺寸的变化以及在细胞内部的GFP表达水平(细胞内浓度)的变化的图。

如图8所示，可以确认，利用本发明的细胞培养装置，能够进行长期的细胞的连续培养。由此，可以确认，能够基于以往没有的长期间的时序数据测量一个细胞系的生长速度(细胞尺寸的变化)、基因表达水平的波动的大小等信息。

<实施例4>蛋白质表达水平的频度分布

将与实施例3同样的具有细胞培养基板、PDMS制的送液衬垫、注射器(送液泵)以及废液罐的细胞培养装置配置在倒立型电动显微镜的台上，对培养用槽内的表达荧光蛋白质GFP的大肠杆菌进行延时观察。通过注射器，以2ml／h的流速连续地持续流动作为营养源含有0.2％重量比的葡萄糖的大肠杆菌培养用M9最小培养基。将观察时的培养温度维持在37℃，并以1分钟间隔对培养用槽内的细胞进行5000分钟的延时观察。

测定观察到的所有时刻的所有细胞的细胞内GFP平均荧光辉度，从而测定出据此推定出的GFP表达水平的频度分布。图9表示其结果。

<实施例5>细胞尺寸的频度分布

在实施例4的延时观察中，测定了细胞尺寸的频度分布。其结果如图10所示。

<实施例6>生长率的频度分布

在实施例4的延时观察中，测定了生长率的频度分布。对于一个细胞的生长率而言，用指数函数C×2^kt表示从分裂到分裂结束的细胞尺寸的变化，将其指数k作为各细胞的生长率。其中，C表示常数，t表示时间。其结果如图11所示。

<实施例7>世代时间分布

在实施例4的延时观察中，测定了世代时间的频度分布。世代时间为各细胞从分裂到下次分裂为止所需要的时间。其结果如图12所示。

<实施例8>蛋白质表达水平的自相关函数

在实施例4的延时观察中，测定了蛋白质表达水平的自相关函数。将在某个时刻t的蛋白质表达水平设为x(t)时，通过计算下式求出了与经过了时间t的时刻的自相关函数A(t)。

【化1】

$A\left(\mathrm{\&tau;}\right)=\frac{E\left[(x\left(t\right)-E[x\left(t\right)\left]\right)(x(t+\mathrm{\&tau;})-E[x\left(t\right)\left]\right)\right]}{V\left[x\left(t\right)\right]}$

其中，E[]、V[]分别表示平均值和离散。其结果如图13所示。该图为相对于τ绘制了A(τ)的图。

<实施例9>细胞分裂龄的分布

在实施例4的延时观察中，测定了细胞分裂龄的频度分布。细胞分裂龄表示从即将分裂到当前的时间。其结果如图14所示。

<实施例10>在一个观察用槽内观察到的细胞谱系

在实施例4的延时观察中，测定了在一个观察用槽内观察到的细胞谱系。其结果如图15所示。系列的分支表示细胞分裂，系列的断裂处表示细胞被冲走。

<实施例11>

将与实施例3同样的具有细胞培养基板、PDMS制的送液衬垫、注射器(送液泵)以及废液罐的细胞培养装置配置在倒立型电动显微镜的台上，对培养用槽内的细胞进行延时观察。以老鼠的胚胎干细胞取代实施例3的大肠杆菌，通过注射器泵，以2ml／h的流速，取代大肠杆菌培养用M9最小培养基而连续地持续流动未分化维持用无血清培养基ESF7。为了促进与老鼠的胚胎干细胞粘接，对所述玻璃基板表面涂敷胶原或者E钙粘着蛋白。通过倒立型电动显微镜并利用倍率20倍相位差物镜，以15分钟间隔培养用槽内的老鼠的胚胎干细胞进行延时观察。

其结果为，可以确认，当对细胞培养基板供给培养液而进行连续培养时，存在于培养用槽内的老鼠的胚胎干细胞中的、存在于培养用槽的两端的老鼠的胚胎干细胞的一部分被适度向排出用槽冲走。

而且，还可以确认，利用细胞培养基板的槽形状以及半透膜，能将老鼠的胚胎干细胞稳定地保持在培养用槽L内进行培养。

可以确认，通过经由半透膜进行的向老鼠的胚胎干细胞的培养液的供给，能将培养用槽L内维持在稳定且均匀的环境下，通过将存在于培养用槽的两端的老鼠的胚胎干细胞适度地向排出用槽冲走，能够将培养用槽L内的老鼠的胚胎干细胞的数量维持在规定的数量，进而能够进行细胞的连续的培养、观察。而且，还可以确认，能避免母细胞残留于培养用槽L，从而能够不发生随着老化产生的生理状态的变化而长期培养培养用槽L内的老鼠的胚胎干细胞。

<比较例1>

对在玻璃基板的表面形成槽深度L1小于细胞的尺寸的培养用槽L能否进行大肠杆菌的培养进行了研究。具体而言，以格子状设置培养用槽L(L1：槽深度0.5μm、L2：槽宽度2.0μm、长度30μm，50条)、排出用槽M(M1：槽深度17μm、M2：槽宽度60μm、长度5000μm，20条)。

而且，与实施例2同样地利用半透膜覆盖细胞培养用基板，用与实施例3同样的装置结构对细胞培养基板供给培养液，对细胞进行了观察。

结果如图16(A)所示，培养用槽L内的细胞C被半透膜压破而变形，不能进行正常状态下的观察。

<比较例2>

对在玻璃基板的表面形成槽深度L1超过细胞尺寸(厚度)的2倍的大小的培养用槽L能否进行大肠杆菌的培养进行了研究。具体而言，以格子状设置培养用槽L(L1：槽深度2.0μm、L2：槽宽度2.0μm、长度30μm，50条)、排出用槽M(M1：槽深度17μm、M2：槽宽度60μm、长度5000μm，20条)。

而且，与实施例2同样地利用半透膜覆盖细胞培养用基板，用与实施例3同样的装置结构对细胞培养基板供给培养液，对细胞进行了观察。

结果如图16(B)所示，可以确认，培养用槽L内的细胞C未被稳定地保持而从培养用槽L向排出用槽M流程，导致难以进行连续培养。

【符号说明】

1   细胞培养装置

1a  细胞培养长期观察装置

2   细胞培养基板

3   半透膜

4   供给机构

5   显微观察机构

41  送液泵

42  送液衬垫

43  废液罐

44  除泡用槽

51a 明视场观察光源

51b 荧光观察用光源

52a 自动快门

52b 自动快门

53  聚光透镜

54  二向色镜

55  物镜

56  XY台

57  相机

58  计算机

L   培养用槽

M   排出用槽

A   开口部

S   框架密封件

Claims (9)

1.一种细胞培养装置，其具有细胞培养基板、半透膜、培养液的供给机构，所述细胞培养装置的特征在于，

细胞培养基板在表面具有用于保持培养细胞的细的培养用槽和用于将在该培养用槽内保持培养的细胞排出的粗的排出用槽，并且，所述培养用槽的两端与排出用槽连接，排出用槽比培养用槽粗且比培养用槽深，

半透膜用于覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽，

培养液的供给机构能够对由半透膜覆盖的细胞培养基板连续地供给培养液。

2.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，

所述半透膜能够通过生物素抗生物素蛋白结合覆盖细胞培养基板。

3.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，

所述培养液的供给机构具有送液衬垫。

4.一种细胞培养长期观察装置，其特征在于，

该细胞培养长期观察装置具备权利要求1至3中任一项所述的细胞培养装置和能够观察细胞培养基板上的细胞的显微观察机构。

5.如权利要求4所述的细胞培养长期观察装置，其特征在于，

显微观察机构为倒立型显微镜。

6.一种细胞长期培养方法，其特征在于，

利用权利要求1所述的细胞培养装置。

7.如权利要求6所述的细胞长期培养方法，其中，该细胞长期培养方法包括：

将期望的细胞保持在细胞培养基板的培养用槽内的工序；

利用半透膜覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽的工序；

利用供给机构向细胞培养基板连续地输送培养液，经由半透膜向被保持在细胞培养基板的培养用槽内的细胞供给培养液，并且，利用在与培养用槽的两端连接的排出用槽中流动的培养液将培养用槽内的细胞的一部分向排出用槽排出的工序。

8.一种细胞培养长期观察方法，其特征在于，

该细胞培养长期观察方法利用权利要求4所述的细胞培养长期观察装置。

9.如权利要求8所述的细胞培养长期观察方法，其中，该细胞培养长期观察方法包括：

将期望的细胞保持在细胞培养基板的培养用槽内的工序；

利用半透膜覆盖细胞培养基板的培养用槽以及排出用槽的工序；

利用供给机构向细胞培养基板连续地输送培养液，经由半透膜向被保持在细胞培养基板的培养用槽内的细胞供给培养液，并且，利用在与培养用槽的两端连接的排出用槽中流动的培养液将培养用槽内的细胞的一部分向排出用槽排出的工序；

利用显微观察机构观察细胞培养基板上的细胞的工序。

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