CN103583832B - 纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法 - Google Patents
纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法 Download PDFInfo
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，所述的制备技术为：水热合成法制备得到金属杂原子负载的有序多级纳米沸石组装体材料，通过筛选与植酸酶溶液间的固液比和固载时间，在乙酸-乙酸钠溶液介质中高选择性亲和吸附固载植酸酶分子，以制备得到纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂。相应复合饲料添加剂具有抗饲料制粒高温、耐畜禽消化道内蛋白酶水解能力，可有效提高饲料中植酸磷利用率，减少相关环境“磷”污染负荷。
Description
技术领域
本发明属于纳米功能材料技术领域，具体涉及一种有效提高饲料中植酸磷利用率的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法。
背景技术
植酸盐（1,2,3,4,5,6-肌醇六磷酸盐）是畜禽植物性饲料中磷元素贮存的主要化学形式，但相应化学形态存在的有机磷难以被非反刍畜禽消化吸收，因而饲料中需要人为添加大量无机磷酸盐以满足其生长过程的营养需求，大量未被消化的有机植酸磷与过量添加的无机磷化合物通过畜禽排泄物释放,形成基于畜禽养殖业的环境“磷”污染负荷。同时，饲料中的植酸盐可与蛋白质和微量元素（铁、钙等）形成不溶性复合体，阻碍畜禽对饲料营养的吸收。
植酸酶是一种磷酸单酯水解酶，能够催化植酸盐分解为肌醇和无机磷酸盐，使畜禽有效吸收饲料中大量存在的植酸磷，显著降低畜禽排泄物中“磷”含量，符合现代“绿色低碳”可持续理念发展。上世纪90年代后，随着基因工程和生物技术的发展，微生物源的植酸酶逐渐发展并被应用于饲料添加剂。
值得关注的是，直接向饲料中添加微生物植酸酶存在着下列三个瓶颈性问题：其一，饲料制粒过程的瞬时高温会导致一部分植酸酶分子构象改变进而失去催化活性。其二，植酸酶本身作为一种蛋白质，进入畜禽消化系统中后，易被胃蛋白酶和胰蛋白酶等催化水解为多肽，失去活性。其三，微生物源植酸酶的适应pH范围窄，进入畜禽肠道后一般失去活性。因此，通过固定化酶技术，有利于植酸酶在相应固载基质中保留其三维活性分子构象，可以改善植酸酶的酶活稳定性、抗蛋白酶水解能力。根据国内外文献报道，最近有研究者采用改性的水铝英石和蒙脱石多孔粉体材料固载植酸酶。智利Universidad de La Frontera大学和意大利Universitàdi Napoli大学DanielMenezes-Blackburn等人题为“Activity stabilization of Aspergillusniger and Escherichiacoliphytases immobilized on allophanic synthetic compounds and montmorillonitenanoclays”（黑曲霉和大肠杆菌植酸酶在合成水铝英石化合物和蒙脱石纳米粘土上的固载及活性稳定化）的研究论文发表在“Bioresource Technology”（生物资源技术，2011年，102期，页码9360-9367）。需要指出的是，该工作中选择粘土粉体材料作为固载基质，易于团聚，同时该固载基质材料对于植酸酶分子的特异性亲和识别方面，尚有待拓展，以期提供高效的固载植酸酶饲料添加剂。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，可有效提高植酸酶的热稳定性和抗蛋白酶水解能力。
为实现上述目的，本发明所述的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步，先采用模板导向剂水热合成法合成含金属杂原子的纳米沸石组装体；
优选地，所述的金属杂原子是指铁、铜、锌原子。
第二步，配置固载缓冲溶液和植酸酶溶液：所述固载缓冲溶液为乙酸-乙酸钠溶液；所述植酸酶溶液浓度为10-20g/L；
第三步，金属杂原子负载纳米沸石组装体亲和固载植酸酶：将第一步中的纳米沸石组装体投入第二步的植酸酶溶液中，充分混合搅拌，通过吸附固载，其中固液比为20-40g/L，得到纳米沸石组装体固载植酸酶悬浊液，经抽滤、风干得到纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂。
优选地，所述的充分混合搅拌，搅拌时间可以为6～48h。
优选地，所述第一步中含金属杂原子的纳米沸石组装体的制备具体为：
(1)分别称取白炭黑、金属杂原子化合物、四丙基氢氧化铵，加入去离子水，放入磁力搅拌子，搅拌，转移入反应釜中，将反应釜放置于130-170°C预热的鼓风干燥箱中，水热合成反应48-72h；
(2)反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然降温至室温，打开反应釜，将产物抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性为止，置于马弗炉中在氮气气氛下焙烧去除模板剂，即得金属杂原子负载纳米沸石组装体材料。
所述制备原料摩尔比为四丙基氢氧化铵:白炭黑:去离子水:金属杂原子=150:390:8000:(15-30)，其中金属杂原子可在水热合成过程中添加，也可在材料水热合成完成后通过离子交换反应置换进入纳米沸石组装体阳离子交换位点。
优选地，所述第二步中配置植酸酶溶液，其中固载缓冲溶液具体为：称取分析纯乙酸钠固体于玻璃烧杯中，取去离子水并倒入烧杯，以玻璃棒搅拌至固体完全溶解、溶液澄清透明，后加入分析纯冰乙酸液体，充分搅拌混匀后移入玻璃容量瓶中，用去离子水定容，倒出储存于玻璃试剂瓶中。
优选地，所述第二步中配置植酸酶溶液，具体为：将10-20g植酸酶倒入1L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=4.5，溶液浓度0.05mol/L）中，采用磁力搅拌棒以50-400rpm的搅拌速度搅拌10-60min，后置于超声波溶解器中在冰水浴下以50%-100%功率超声溶解10-60min，过滤两次待用。
所述植酸酶为大肠杆菌植酸酶、黑曲霉植酸酶或无花果曲霉植酸酶，均为成熟技术，可以通过市售途径获得，比如可以购自武汉驰飞化工有限公司，其特征酶活为500-10000U/g。
优选地，所述第三步中，固载固液比为20-40g/L，固载过程为以2-4cm长的磁力搅拌棒，50-400rpm的搅拌速度搅拌6-24h，也可采用静态吸附固载。
通过实验具体验证本发明所提供的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的优越性能，主要包括：
（1）纳米沸石组装体亲和固载植酸酶复合饲料添加剂的热稳定性实验：取纳米沸石组装体固载植酸酶于聚丙烯离心管中，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，涡旋振荡均匀，与此同时，取相同体积、植酸酶含量与纳米沸石组装体固载植酸酶所含相同的自由植酸酶溶液作对照样。将上述样品置于预热的恒温水浴锅中分别暴露不同时间，后测定剩余植酸酶酶活，得出纳米沸石组装体固载植酸酶对植酸酶热稳定性改善效果。
（2）纳米沸石组装体亲和固载植酸酶复合饲料添加剂的抗蛋白酶水解能力实验：取纳米沸石组装体固载植酸酶于聚丙烯离心管中，加入模拟猪胃液，涡旋振荡均匀，与此同时，取相同体积、植酸酶含量与纳米沸石组装体固载植酸酶所含相同的自由植酸酶溶液作对照样。将上述样品置于预热的恒温水浴锅中分别暴露不同时间，后测定相应植酸酶酶活，以指征纳米沸石组装体清河固载植酸酶复合饲料添加剂对植酸酶抗蛋白酶水解能力的改善效果。
（3）纳米沸石组装体亲和固载植酸酶复合饲料添加剂重复利用效果实验：取固载植酸酶复合饲料添加剂，测定相应植酸酶酶活，测定完成后离心取出复合饲料添加剂，自然风干，重复测定酶活5次，得到纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂重复利用性能。
所述模拟猪胃液是指：在pH=3.2的柠檬酸氢钠缓冲溶液，添加猪胃蛋白酶1.0mg/mL，氯化钙2.0mmol/L，氯化铜、氯化锰、氯化锌和氯化亚铁各0.01mmol/L，使用前新鲜配制。
所述植酸酶酶活测定方法是指：GB/T18634-2002《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》。
大肠杆菌植酸酶分子是一个磷酸化后修饰的蛋白质分子，因此，本发明设计依据磷酸化蛋白质分子结构中磷酸根基团与铁等金属原子间所存在的特异性亲和结合作用，通过水热合成过程将金属杂原子均匀引入相应沸石晶体骨架结构中，利用金属负载的纳米沸石分子筛组装体作为基质材料，亲和固载植酸酶分子。同时，相应纳米沸石组装体基质具有有序的微孔、介孔、大孔多层级孔道结构，既能够有效克服纳米尺度粉体材料团聚问题，也有利于植酸酶生物大分子的空间结构稳定性。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明所提供的纳米沸石组装体亲和性固载基质材料，对于相应植酸酶分子具有特异性亲和识别能力，固载过程快速简便，适宜规模化生产实施。所得植酸酶复合材料饲料添加剂性能结构稳定，热稳定性和抗蛋白酶水解能力有效改善，具有抗饲料制粒高温、耐畜禽消化道内蛋白酶水解能力，可有效提高饲料中植酸磷利用率，减少相关环境“磷”污染负荷。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实例1
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、六水合氯化高铁（FeCl3·6H2O）8.11g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.80mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O:Fe2O3=150:390:8000:15）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于130℃预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应48h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组装体材料约30g。
（2）配制固载缓冲溶液体系：
用分析天平称取1.46g分析纯无水乙酸钠固体于500mL玻璃烧杯中，用玻璃量筒量取500mL去离子水并倒入烧杯中，以玻璃棒搅拌至固体完全溶解、溶液澄清透明，后用玻璃量筒量取并加入1.93g分析纯冰乙酸液体，充分搅拌混匀后移入1L的容量瓶中，用去离子水定容，配置完成的乙酸-乙酸钠缓冲溶液倒出储存于1L透明玻璃试剂瓶中。
（3）配制植酸酶溶液：
用分析天平称取20g植酸酶（大肠杆菌植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，于200rpm下磁力搅拌30min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下以100%功率超声溶解30min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
（4）纳米沸石组装体固载植酸酶：
用分析天平称取10g经（1）步骤制备得到的纳米沸石组装体材料置于1L锥形瓶中，加入500mL（3）步骤配制所得植酸酶溶液中，加塞，后将该溶液置于水平摇床上，室温条件下（25℃）以200rpm转速振荡混合12h。混合完成后混合液分批以4000rpm转速离心分离固液相，固相经去离子水淋洗两次后，在室温条件下风干过夜，即为纳米沸石组装体亲和固载植酸酶复合饲料添加剂；
（5）纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：
测得酶活为15800U/g。
实例2
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、六水合氯化高铁（FeCl3·6H2O）8.11g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.8mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O:Fe2O3=150:390:8000:15）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于150℃预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应60h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组装体材料约30g。
（2）配制固载缓冲溶液体系：同实施例1；
（3）配制植酸酶溶液：
用分析天平称取20g植酸酶（黑曲霉植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，于200rpm下磁力搅拌30min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下以100%功率超声溶解30min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
（4）纳米沸石组装体固载植酸酶：同实施例1；
（5）纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：同实施例1。
实例3
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、六水合氯化高铁（FeCl3·6H2O）8.11g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.8mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O:Fe2O3=150:390:8000:15）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于170°C预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应72h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组装体材料约30g。
（2）配制固载缓冲溶液体系：同实施例1；
（3）配制植酸酶溶液：
用分析天平称取20g植酸酶（无花果曲霉植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，于200rpm下磁力搅拌30min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下以100%功率超声溶解30min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
（4）纳米沸石组装体固载植酸酶：同实施例1；
（5）纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：同实施例1。
实例4
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.80mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O=150:390:8000）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于150℃预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应48h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组材料。
用分析天平称取8.11g六水合氯化高铁（FeCl3·6H2O）于500mL玻璃烧杯中，用玻璃量筒量取并加入500mL去离子水，缓慢倒入制得的纳米沸石材料，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，以200rpm的速度搅拌24h，将生成物于布氏漏斗上抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液加碱后无红色沉淀为止，滤纸上的材料置于真空干燥箱内80°C干燥24h，即得纳米沸石组装体材料约30g。
（2）配制固载缓冲溶液体系：同实施例1；
（3）配制植酸酶溶液：
用分析天平称取20g植酸酶（无花果曲霉植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，于200rpm下磁力搅拌30min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下以100%功率超声溶解30min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
（4）纳米沸石组装体固载植酸酶：同实施例1；
（5）纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：同实施例1。
实例5
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）5.12g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.80mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O:CuO=150:390:8000:30）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于130℃预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应60h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组装体材料约30g。
（2）配制固载缓冲溶液体系：同实施例4；
（3）配制植酸酶溶液：
用分析天平称取20g植酸酶（大肠杆菌植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，于200rpm下磁力搅拌30min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下以100%功率超声溶解30min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
（4）纳米沸石组装体固载植酸酶：同实施例4；
（5）纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：同实施例4。
实例6
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、氯化锌（ZnCl2）4.09g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.80mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O:ZnCl2=150:390:8000:30）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于150℃预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应72h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组装体材料约30g。
（2）配制固载缓冲溶液体系：同实施例4；
用分析天平称取1.46g分析纯无水乙酸钠固体于500mL玻璃烧杯中，用玻璃量筒量取500mL去离子水并倒入烧杯中，以玻璃棒搅拌至固体完全溶解、溶液澄清透明，后用玻璃量筒量取并加入1.93g分析纯冰乙酸液体，充分搅拌混匀后移入1L的容量瓶中，用去离子水定容，配置完成的乙酸-乙酸钠缓冲溶液倒出储存于1L透明玻璃试剂瓶中；
（3）配制植酸酶溶液：
用分析天平称取20g植酸酶（黑曲霉植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，于200rpm下磁力搅拌30min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下以100%功率超声溶解30min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
（4）纳米沸石组装体固载植酸酶：同实施例4；
（5）纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：
测得酶活为15800U/g。
实例7
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.80mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O=150:390:8000）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于150℃预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应48h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组材料。
用分析天平称取5.12g二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）于500mL玻璃烧杯中，用玻璃量筒量取并加入500mL去离子水，缓慢倒入制得的纳米沸石材料，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，以200rpm的速度搅拌24h，将生成物于布氏漏斗上抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液加碱后无红色沉淀为止，滤纸上的材料置于真空干燥箱内80°C干燥24h，即得纳米沸石组装体材料约30g。
其他步骤同实施例4。
实例8
（1）纳米沸石组装体的制备：
分别用分析天平称取白炭黑23.43g、四丙基氢氧化铵（TPAOH）30.50g于500mL聚丙烯烧杯中，用量筒量取并加入去离子水140.80mL（其组分摩尔比为TPAOH:SiO2:H2O=150:390:8000）。放入一根4cm长的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上以200rpm搅拌24h，搅拌完成后将烧杯内乳浊液转移入内胆为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜盖后，将反应釜放置于150℃预热4h的电热鼓风干燥箱中，水热合成反应48h。
反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然冷却至室温。旋开反应釜盖，取出聚四氟乙烯内胆，将生产物倒于布氏漏斗上，接循环水真空泵抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性（pH=7）为止。将滤纸上的产物转移到石英舟（长5cm，宽2cm，高1cm）中，置于马弗炉中在氮气气氛下500℃焙烧4h以去除模板剂。自然冷却后，置于玛瑙研钵中研磨，过200目筛，即得纳米沸石组材料。
用分析天平称取4.09g氯化锌（ZnCl2）于500mL玻璃烧杯中，用玻璃量筒量取并加入500mL去离子水，缓慢倒入制得的纳米沸石材料，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，以200rpm的速度搅拌24h，将生成物于布氏漏斗上抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液加碱后无红色沉淀为止，滤纸上的材料置于真空干燥箱内80℃干燥24h，即得纳米沸石组装体材料约30g。
其他步骤同实施例5。
实例9
（1）纳米沸石组装体的制备：同实施例1；
（2）配制固载缓冲溶液体系：同实施例1；
（3）配制植酸酶溶液：
用分析天平称取10g植酸酶（大肠杆菌植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，于200rpm下磁力搅拌30min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下以100%功率超声溶解30min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
（4）纳米沸石组装体固载植酸酶：同实施例1；
（5）纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为7900U/g。
实例10
本实例与实例9不同之处在于，配制植酸酶溶液，称取15g植酸酶（黑曲霉植酸酶，酶活为5000U/g）；其他操作与实例9相同。
本实例纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为11850U/g。
实例11
本实例与实例9不同之处在于，配制植酸酶溶液：称取20g植酸酶（无花果曲霉植酸酶，酶活为5000U/g）固体于1L玻璃烧杯中，加入1L（2）步骤配置所得的固载缓冲溶液，放入一根长4cm的磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，分别于50rpm、200rpm、400rpm下磁力搅拌30min、60min、10min，用镊子取出磁力搅拌棒，置于超声波溶解器中在冰水浴下，分别以50%、75%、100%功率超声溶解10min、30min、60min，后用滤纸过滤两次，储存于1L棕色玻璃试剂瓶中；
其他操作与实例9相同。
本实例纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为15800U/g。
实例12
本实例与实例11不同之处在于，纳米沸石组装体固载植酸酶：用分析天平称取15g经（1）步骤制备得到的纳米沸石组装体材料置于1L锥形瓶中，加入500mL（3）步骤配制所得植酸酶溶液中，加塞，后将该溶液置于水平摇床上，室温条件下（25℃）以200rpm转速振荡混合12h。混合完成后混合液分批以400rpm转速离心分离固液相，固相经去离子水淋洗两次后，在室温条件下风干过夜，即为纳米沸石组装体亲和固载植酸酶复合饲料添加剂；
本实例纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为11850U/g。
实例13
本实例与实例12不同之处在于，纳米沸石组装体固载植酸酶：用分析天平称取20g经（1）步骤制备得到的纳米沸石组装体材料置于1L锥形瓶中，加入500mL（3）步骤配制所得植酸酶溶液中，加塞，后将该溶液置于水平摇床上，室温条件下（25℃）以50rpm、200rpm转速振荡混合12h、6h。混合完成后混合液分批以4000rpm转速离心分离固液相，固相经去离子水淋洗两次后，在室温条件下风干过夜，即为纳米沸石组装体亲和固载植酸酶复合饲料添加剂；
本实例纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为7900U/g。
实例14
本实例与实例9不同之处在于，配制植酸酶溶液：称取20g植酸酶（酶活为500U/g）；其他操作相同。
纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为1580U/g。
实例15
本实例与实例9不同之处在于，配制植酸酶溶液：用分析天平称取20g植酸酶（酶活为10000U/g）固体于1L玻璃烧杯中；其他操作相同。
本实例纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为31600U/g。
实例16
本实例与实例9不同之处在于，纳米沸石组装体固载植酸酶：用分析天平称取10g经（1）步骤制备得到的纳米沸石组装体材料置于1L锥形瓶中，加入500mL（3）步骤配制所得植酸酶溶液中，加塞，后将该溶液在室温条件下（25℃）放置12h。混合完成后混合液分批以4000rpm转速离心分离固液相，固相经去离子水淋洗两次后，在室温条件下风干过夜，即为纳米沸石组装体亲和固载植酸酶复合饲料添加剂；
本实例纳米沸石组装体固载植酸酶酶活：测得酶活为15800U/g。
实例17
对上述各实例所制备得到的纳米沸石组装体固载的植酸酶进行热稳定性研究：取20mg纳米沸石组装体固载植酸酶于1.5mL聚丙烯离心管中，加入一定体积的0.05mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中（pH=4.5），涡旋振荡均匀，与此同时，取相同体积、植酸酶含量与纳米沸石组装体固载植酸酶所含相同的自由植酸酶溶液作对照样。将上述样品置于预热30min的60℃恒温水浴锅中分别暴露30min和120min。实例1-实例8中制备得到的固载植酸酶在暴露30min后酶活保留率为75.2±7.2%，暴露60min后酶活保留率为51.8±5.1%；而自由植酸酶的30min酶活保留率为8.1%，暴露60min后酶活已低于国标方法检出限。
实例18
对上述各实例所制备得到的纳米沸石组装体固载的植酸酶进行抗蛋白酶水解能力研究：取20mg纳米沸石组装体固载植酸酶于1.5mL聚丙烯离心管中，加入1mL的模拟猪胃液，涡旋振荡均匀，与此同时，取相同体积、植酸酶含量与纳米沸石组装体固载植酸酶所含相同的自由植酸酶溶液作对照样。将上述样品置于预热30min的37℃恒温水浴锅中分别暴露2h和24h。实例1-实例8中制备得到的固载植酸酶在暴露于模拟猪胃液2h后酶活保留率为96.7±3.1%，暴露24h后酶活保留率为58.0±9.2%；而自由植酸酶暴露2h后酶活已低于国标方法检出限。
实例19
对上述各实例所制备得到的纳米沸石组装体固载的植酸酶进行重复利用研究：取20mg固载植酸酶复合饲料添加剂，以国标方法测定其酶活，测定完成后离心取出复合饲料添加剂，自然风干，重复以国标方法测定酶活5次。以第一次测定的酶活归一化，第二、三、四、五次测定的酶活保留率分别为83.0±3.9%、81.0±2.8%、75.0±5.1%、72.0±7.2%。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (7)
1.一种纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
第一步，先采用模板导向剂水热合成法合成含金属杂原子的纳米沸石组装体；
第二步，配置固载缓冲溶液和植酸酶溶液：所述固载缓冲溶液为乙酸-乙酸钠溶液；所述植酸酶溶液浓度为10-20g/L；
第三步，金属杂原子负载纳米沸石组装体亲和固载植酸酶：将第一步中的纳米沸石组装体投入第二步的植酸酶溶液中，充分混合搅拌，通过吸附固载，其中固液比为20-40g/L，得到纳米沸石组装体固载植酸酶悬浊液，经抽滤、风干得到纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂；
所述第一步中含金属杂原子的纳米沸石组装体的制备具体为：
(1)分别称取白炭黑、金属杂原子化合物、四丙基氢氧化铵，加入去离子水，放入磁力搅拌子，搅拌，转移入反应釜中，将反应釜放置于130-170℃预热的鼓风干燥箱中，水热合成反应48-72h；所述的金属杂原子是指铁、铜、锌原子；
(2)反应完成后，关闭电热鼓风干燥箱电源，打开箱门，使反应釜自然降温至室温，打开反应釜，将产物抽滤，用去离子水充分洗涤直至滤出液中性为止，置于马弗炉中在氮气气氛下焙烧去除模板剂，即得金属杂原子负载纳米沸石组装体材料；
所述制备原料摩尔比为四丙基氢氧化铵:白炭黑:去离子水:金属杂原子＝150:390:8000:(15-30)，其中金属杂原子在水热合成过程中添加，或者在材料水热合成完成后通过离子交换反应置换进入纳米沸石组装体阳离子交换位点；
所述第二步中，所述固载缓冲溶液为pH 4.5、浓度为0.05mol/L的乙酸-乙酸钠溶液。
2.根据权利要求1所述的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述焙烧去除模板剂是指500℃焙烧2h去除模板剂。
3.根据权利要求1所述的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，该固载缓冲溶液具体制备为：称取分析纯乙酸钠固体于玻璃烧杯中，取去离子水并倒入烧杯，以玻璃棒搅拌至固体完全溶解、溶液澄清透明，后加入分析纯冰乙酸液体，充分搅拌混匀后移入玻璃容量瓶中，用去离子水定容，倒出储存于玻璃试剂瓶中。
4.根据权利要求1-3任一项所述的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述第二步中配置植酸酶溶液，具体为：将10-20g植酸酶倒入1L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，采用磁力搅拌棒以50-400rpm的搅拌速度搅拌10-60min，后置于超声波溶解器中在冰水浴下以50％-100％功率超声溶解10-60min，过滤两次待用。
5.根据权利要求4所述的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述植酸酶为大肠杆菌植酸酶、黑曲霉植酸酶或无花果曲霉植酸酶，其特征酶活为500-10000U/g。
6.根据权利要求4所述的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，第三步中，所述固载固液比为20-40g/L，固载过程为以磁力搅拌棒在50-400rpm的搅拌速度搅拌6-24h。
7.根据权利要求4所述的纳米沸石组装体固载植酸酶复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，第三步中，所述固载采用静态吸附固载。
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