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CN103562389B - 用于有效表面展示抗原蛋白的新颖表达盒 - Google Patents

用于有效表面展示抗原蛋白的新颖表达盒 Download PDF

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CN103562389B CN201280016937.7A CN201280016937A CN103562389B CN 103562389 B CN103562389 B CN 103562389B CN 201280016937 A CN201280016937 A CN 201280016937A CN 103562389 B CN103562389 B CN 103562389B
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Abstract

表达盒，其中所述表达盒包含：(a)来自白斑综合征病毒的iel启动子或其变体；(b)编码N‑端gp64信号肽的核酸序列或其变体、编码抗原肽的核酸序列、编码跨膜区的核酸以及编码gp64胞质域的核酸或其变体；其中所述启动子可操作地连接至所述核酸序列。

Description

用于有效表面展示抗原蛋白的新颖表达盒
发明领域
本发明通常涉及生物分子表面展示系统，连同展示抗原肽的特定应用，所述抗原肽例如病毒蛋白，诸如用作疫苗的病毒衣壳蛋白。特别地，本发明涉及用于治疗和/或预防病毒感染的方法、疫苗、免疫组合物和试剂盒，并且涉及用于调节免疫反应的关联方法。
背景技术
数百种不同的已知病毒感染人类和动物。感染人类和动物的病毒常常通过呼吸排泄和肠排泄而传播。例如，肠病毒71(EV71)为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)家族中肠病毒属(genus Enterovirus)的单股、RNA病毒。其在遗传上分类成3组(A、B和C)以及11个基因型(A、B1-B5、C1-C5)。EV71包括4个主衣壳蛋白，例如VP1、VP2、VP3以及VP4。其中，VP1被认为是主要负责病毒向靶细胞的附着以及因此包容病毒中和的主要表位。实际上，不同肠病毒菌株的免疫学研究已经指出多个中和性mAbs的显性表位位于VP1上。EV71为导致手足口病的一种病毒。
手足口病已变成为主要的新兴感染性疾病并且是重要的威胁，尤其在亚洲。1998年在台湾发生了由于EV71感染而导致的HFMD大爆发，包括129,106例个案报告，405名儿童患有严重的并发症，并且多于80例死亡。自1997以来，EV71感染已经呈示出新的重要性，并且个案数量越来越多。由各种EV71菌株造成的事件已经持续地在其他国家再现，例如，泰国、中国以及越南。随着最近在新加坡爆发，EV71感染的扩张的地理分布表明更多的人群处于危险中。常用的EV71疫苗基于失活病毒，其在细胞株内生产，并且通过化学手段而失活。然而，病毒的恶性本质要求病毒在生物安全水平条件下处理，从而使用常规技术的疫苗候选者的生产会要求现有制造程序的显著改变，如果发生爆发，这可能会延迟疫苗的生产。
控制流行性脊髓灰质炎和根除脊髓灰质炎病毒的福尔马林失活的和减活的疫苗凸显了通过群体接种来控制EV71流行病的可能性。据此，发展福尔马林失活EV71疫苗是对1975年保加利亚流行病的反应而非用于控制流行病，并且从那时起一直未使用。此外，没有可得的保加利亚疫苗效能的数据。
因此，高度期望有效预防病毒感染如EV71的良好的疫苗。
发明概述
在第一方面，提供了表达盒，其中所述表达盒包含：
(a)来自白斑综合征病毒的ie1启动子或其截序列；
(b)编码N-端gp64信号肽的核酸序列或其变体、编码抗原肽的核酸序列、编码跨膜区的核酸以及编码gp64胞质域的核酸或其变体；
其中所述启动子可操作地连接至所述核酸序列。
在第二方面，提供了表达载体，其包括本文所述的表达盒。
在第三方面，提供了试剂盒，其包括本文所述的表达盒或本文所述的表达载体以及为此的包装材料。
在第四方面，提供了宿主细胞，其包含本文中所述的表达盒或本文所述的表达载体。
在第五方面，提供了免疫原性组合物，其包含本文所述的表达盒、本文所述的表达载体或本文所述的宿主细胞，连同药物可接受的载剂、佐剂、稀释剂或赋形剂。
在第六方面，提供了疫苗，其包含本文所述的表达盒、本文中所述的表达载体或本文所述的宿主细胞，连同药物可接受的载剂、佐剂、稀释剂或赋形剂。
在第七方面，提供了抗体，其由用本发明的疫苗接种的生物体所生产。
第八方面，提供了抗血清，其包含本发明的抗体。
在第九方面，提供了用于治疗或预防个体疾病的本文所述的表达盒、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、本文中所述的免疫原性组合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗体或本文所述的抗血清供，其中所述抗原肽由所述个体中的所述表达载体来表达。
在第十方面，提供了用于调节免疫反应的方法，其中所述方法包括向个体给予有效量的本文所述的表达盒、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、本文所述的免疫原性组合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗体或本文所述的抗血清。
在第十一方面，提供了本文所述的表达盒、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、本文中所述的免疫原性组合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗体或本文所述的抗血清在制造用于调节个体的免疫反应的药物中的用途。
在第十方面，提供了一种用于呈递、生产或展示抗原肽的方法，其中所述方法包括：
(a)使编码多肽的核酸插入本文所述的表达载中；
(b)用表达载体来转染至少一个宿主细胞；以及
(c)由所述表达载体来表达所述多肽，
其中将所述多肽呈递或展示在杆状病毒的表面膜上。
在第十方面，提供通过本文所述的方法获得的抗原肽。
在第十一方面，提供了诊断方法，其包括使用本文所述的抗原肽。
附图简述
参考下列附图，仅以实例形式来描述本发明。
图1.如实施例1所详细说明的使用PCR的融合基因的结构。执行3个连续的PCR反应来产生最终PCR产物，其包含gp64信号序列、H3N2-HA跨膜域以及gp64的胞质域(CTD)。
图2.根据实施例1而制造的重组型杆状病毒载体的图示。使用EV71基因组作为模板，表1所列的引物用于扩增VP1基因，其然后能被插入pBac-HTA载体中。所生成的质体被称为pBac-VP1。
图3.rVP1蛋白在SF-9II细胞质膜上的表面展示谱。第3示出该蛋白的GP64C-端部分位于在SF-9II细胞内部，而H3N2跨膜域及抗原肽位于细胞外的培养基内。
图4.EV71的rVP1的锚定(放大率×60)。为了确定rVP1蛋白是否恰当地移位至细胞表面，细胞在无菌盖玻片上培养，以为10的感染复数(MOI)来感染，以及感染后2天进行使用共焦显微镜的免疫荧光染色。DAPI染色用于检测细胞核，而绿荧光标记的抗-VP1多株抗体用于检测由Bac-VP1重组型杆状病毒所展示的rVP1。第4图明确地示出rVP1位于质膜，从而展现出rVP1锚定于Sf-9细胞的表面上。关于更多的细节，请参见实施例1。
图5.EV71的rVP1在Bac-VP1包膜上表达的确认。细胞以为10的MOI被感染并且感染后3天收集。采集上清液并进行使用抗-VP1(天竺鼠)多克隆抗体、然后使用抗天竺鼠HRP标记的二级抗体的免疫印迹分析。
rBac-VP11-编码新颖的“表达盒”的重组型杆状病毒。
rBac-VP12-编码带有全长gp64作为融合伙伴的表达盒的重组型杆状病毒。
如由图5可见，在杆状病毒-WT(野生型)中没有检测到蛋白。比较时，由从用rBac-Vp11和rBac-Vp12感染的细胞获得的上清液看见清晰带，表明rVP1成功地在Bac-VP1病毒包膜上表达。
图6.纯化的杆状病毒的免疫金电子显微图，其由抗-EV71和抗-VP1抗体作为初级抗体以及与5-nm金颗粒结合的抗小鼠IgG作为二级抗体而检测(放大率200,000×，刻度尺=100nm)。金颗粒(示为黑点)表明EV71和VP1蛋白表达的位置。没有金颗粒展现在杆状病毒-WT(对照)的表面上，然而，EV71和VP1在本发明的重组型杆状病毒的表面上被检测到。
图7.在重组型杆状病毒的包膜上展示的EV71的rVP1的定量。在杆状病毒包膜上所展示的rVP1蛋白使用抗-VP1单克隆抗体来探测。在rBac-VP1(107/ml)、rBac-VP12(107/ml)、EV71WT(B5菌株)(107/ml)、WT杆状病毒上的VP1的量被校正成经纯化的重组型VP1蛋白的量。免疫印迹上的带强度使用ODYSSEY LICOR荧光扫描仪和软件进行扫描和分析。数据为3个独立实验的平均值。
rBac-VP11-编码新颖的“表达盒”的重组型杆状病毒
rBac-VP12-编码带有全长gp64作为融合伙伴的表达盒的重组型杆状病毒。
图7示出rBac-VP11(新颖表达盒)与B5-EV71和rBac-VP12(全长gp64)相比具有最高的VP1蛋白表达，由此说明新颖的表达盒用于生产大量VP1抗原肽的效能。
图8.测试血清中和病毒感染性的能力。*含有100TCID50EV71病毒的50μl病毒悬浮液在添加至96孔板中的RD细胞之前与50μl连续2倍稀释的抗体一起预孵育30min。在37℃下3天之后，提供完整的保护免受CPE的中和性抗体滴定度被读取为最高的稀释。
如由图8可见，rBac-VP1与失活EV71(B5)病毒相比产生更高的中和滴定度。负对照PBS与杆状病毒-WT(结果为重迭的，杆状病毒-WT结果迭加在PBS结果上方)示出如预期那样的可忽略的中和滴定度。
图9.带有PCV2衣壳的表面展示衣壳区域(rBac-PCV2)的蔗糖梯度纯化的杆状病毒的免疫印迹，其使用8C2(抗ORF2)单克隆抗体(初级)，然后使用抗小鼠HRP标记的二级抗体。
如由图9可见，在经纯化的杆状病毒内出现大量表达水平的各个衣壳蛋白区域。
图10.感染有PCV2的PK-15细胞的免疫荧光分析，其使用来自用纯化的rBac-PCV2免疫的天竺鼠的抗体和Alexa Fluor546标记的抗天竺鼠二级抗体(放大率×40)。图10的淡灰色部份示出Alexa Fluor546染色。因而，图10示出感染有PCV2的细胞内PCV2蛋白的良好表达。
图11.PRRSV的蔗糖梯度纯化的rBac-ORF7蛋白的免疫印迹，其使用5H2(ORF7)单克隆抗体(初级)，然后使用抗小鼠HRP标记的二级抗体。
图11清楚地示出存在PRRSV的ORF7蛋白的大量表达。
图12.感染有PRRSV的MARC-145细胞的免疫荧光分析，其使用来自用纯化的rBac-ORF7蛋白免疫的天竺鼠的抗体，然后使用Alexa fluor546标记的抗天竺鼠二级抗体(放大率×40)。图11的淡灰色部份示出Alexa Fluor546染色。因而，图11示出感染有PRRSV的细胞内ORF蛋白的良好表达。
图13.在白斑综合征病毒(WSSV)内的ie1启动子的顺式元件的示意图。
图14.杆状病毒锚定的核衣壳α蛋白的免疫印迹分析。Bac-noda、β野田村病毒(Betanodavirus)和野生型杆状病毒进行使用抗野田村衣壳多克隆抗体(天竺鼠)和各自二级HRP结合抗体的免疫印迹。(1)Bac-Noda，(2)β野田村病毒，(3)野生型杆状病毒。
如由图14可见，在杆状病毒-WT(野生型)内没有检测到蛋白。比较时，由感染有rBac-VP11和rBac-VP12的细胞获得的上清液观察到清晰带，表明rVP1成功地在Bac-VP1病毒包膜之上表达。
图15.noda衣壳α蛋白的表达和锚定(放大率×60)。(a)在感染Bac-noda的Sf9-II的质膜上的α蛋白的锚定的确认。(b)在感染野生型杆状病毒的Sf9-II细胞的质膜上观察到没有α蛋白的锚定。细胞在无菌的盖玻片上培养并以为0.1的MOI而感染。细胞用4%PFA固定并用2%牛血清白蛋白在37℃阻断30min。α蛋白用多克隆抗天竺鼠抗体(1：300)、然后用二级FITC-结合兔抗天竺鼠Mab(1：100稀释，Dako)染色。
图15(a)示出rVP1位于质膜，从而表明VP1锚定在Sf-9细胞的表面上。
图16.VP1在非洲绿猴肾脏细胞内的转导和表达(放大率×40)。非洲绿猴肾脏细胞与为200的感染复数(MOI)一起孵育并且在感染后48h用抗-VP1单克隆抗体、然后用FITC-结合二级抗体染色，(A)活Bac-VP1-转导的非洲绿猴肾脏细胞，(B)与失活Bac-VP1一起孵育的非洲绿猴肾脏细胞。
图16的淡灰色部份示出表达VP1之处。因而，图16示出与失活Bac-VP1相比，VP1在用活Bac-VP1转导的非洲绿猴肾脏细胞内良好表达。
图17.体内小鼠肌肉组织的杆状病毒转导(放大率×40)。在第一次免疫六天之后，肌肉组织样品包埋在石蜡内并且进行切片。免疫组织化学染色使用抗-VP1单克隆抗体和HRP-结合兔抗小鼠抗体来进行。示出(A)Bac-VP1，(B)WT-Bac，(C)PBS注射的小鼠。箭头指出表达VP1之处。因而，图17示出VP1在来自Bac-VP1转导的小鼠的小鼠肌肉组织中表达，然而，负对照内没有VP1的表达。
图18.来自致命性EV71病毒攻击的小鼠的保护。小鼠组(n=6)以14天的间隔疫苗接种2次。野生型杆状病毒和PBS免疫的小鼠用作负对照。监测小鼠的存活，持续21天的观察期。结果基于存活百分率来表达。如由结果可见，EV71-B5和Bac-VP1(结果重迭于第18图上)免疫的小鼠在7天后显示出100%的存活，相比之下，对照小鼠则无一者。
图19.EV71拷贝数的实时RT-PCR定量。RNA由脑组织萃取并且对照的样品以7dpi采集，并且预防性治疗的小鼠样品以20dpi采集。EV715`UTR区域的112-bp片段用作qRT-PCR引物的靶标。编码EV71的全长基因组的质体用于获得定量病毒拷贝数的标准曲线。数据为3个独立分析的平均值±SD。
如由图19可见，与接种抗-EV71血清和Bac-VP1抗血清的小鼠相比，来自接种野生型杆状病毒抗血清和PBS抗血清的小鼠的脑组织有显著量的病毒RNA。因而，这表明来自Bac-VP1接种的生物体的抗血清用于提供被动式保护对抗VP1的效能。
图20.各种表达盒的示意图。(A)带有ie1启动子和gp64信号肽的表达盒；(B)带有ie1启动子、gp64启动子和跨膜区的表达盒；(C)带有ie1启动子、gp64启动子、跨膜区以及gp64胞质域的表达盒。
图表
表1.用于构建重组型BAC-VP1融合基因的引物序列。
表2.用于构建PCV2的ORF2的重组型BAC-PCV2衣壳融合基因的引物序列。
表3.用于构建重组型BAC-PRRSV核衣壳蛋白(ORF7)融合基因的引物序列。
表4.抗原肽的实例。
序列
SEQ ID NO：1：用于扩增带有gp64信号序列的额外重迭区域的整个全长VP1基因的正向引物。
SEQ ID NO：2：用于扩增带有H3N2-HA跨膜序列的额外重迭区域的整个全长VP1基因的反向引物。
SEQ ID NO：3：用于扩增带有H3N2-HA跨膜序列的整个序列的C-端VP1的反向引物。
SEQ ID NO：4：用于扩增N-端处的gp64信号序列的整个重迭区域的正向引物。
SEQ ID NO：5：用于扩增C-端处的gp64胞质域(CTD)的整个重迭区域的反向引物。
SEQ ID NO：6：用于扩增ie1启动子的正向引物。
SEQ ID NO：7：用于扩增ie1启动子的反向引物。
SEQ ID NO：8：用于扩增PCV2的衣壳76F区域的正向引物。
SEQ ID NO：9：用于扩增PCV2的衣壳135R区域的反向引物。
SEQ ID NO：10：用于扩增PCV2的衣壳121F区域的正向引物。
SEQ ID NO：11：用于扩增PCV2的衣壳180R区域的反向引物。
SEQ ID NO：12：用于扩增PRRSV的衣壳ORF7F区域的正向引物。
SEQ ID NO：13：用于扩增PRRSV的衣壳ORF7R区域的反向引物。
SEQ ID NO：14：N-端gp64信号肽的序列(20个氨基酸)。
SEQ ID NO：15：含有7个氨基酸的gp64细胞质域(CTD)的全长序列。
SEQ ID NO：16：含有6个氨基酸的gp64细胞质域的截序列(CTD)
SEQ ID NO：17：H3N2-HA跨膜域的序列。
SEQ ID NO：18：白斑综合征病毒ie1启动子的序列。
SEQ ID NO：19：EV71病毒的VP1的序列。
SEQ ID NO：20：PCV2PRF2衣壳蛋白的序列。
SEQ ID NO：21：PRRSV衣壳蛋白的ORF7的序列。
SEQ ID NO：22：鱼野田村病毒衣壳蛋白α的序列。
SEQ ID NO：23EV71-VP1-第167个-第178个氨基酸
SEQ ID NO：24EV71-VP1-第209个-第222个氨基酸
SEQ ID NO：25EV71-VP1-第240个-第260个氨基酸
SEQ ID NO：26PCV2-ORF2-第100个至第150个氨基酸
SEQ ID NO：27PCV2-ORF2-第151个至第200个氨基酸
SEQ ID NO：28PRRSV-ORF7-第18个至第57个氨基酸
SEQ ID NO：29PRRSV-ORF7-第58个至第123个氨基酸
SEQ ID NO：30PRRSV-ORF5-第28个至第65个氨基酸
SEQ ID NO：31PRRSV-ORF5-第132个至第200个氨基酸
SEQ ID NO：32PRRSV-ORF5-第28个至第65个以及132至第200个氨基酸的组合
SEQ ID NO：33对应于核酸序列SEQ ID NO：19EV71-VP1的EV71病毒的VP1的氨基酸序列
SEQ ID NO：34对应于核酸序列SEQ ID NO：20PCV2衣壳蛋白-PCV2PRF2的序列的PCV2衣壳蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：35对应于核酸序列SEQ ID NO：21PRRSV衣壳蛋白的ORF7-PRRSV ORF7的序列的PRRSV衣壳蛋白的ORF7的氨基酸序列
SEQ ID NO：36对应于核酸序列SEQ ID NO：22：鱼类野田村病毒衣壳蛋白-衣壳蛋白α的序列的鱼类野田村病毒衣壳蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：37用于扩增野田村病毒衣壳区域的正向引物
SEQ ID NO：38用于扩增野田村病毒衣壳区域的反向引物
SEQ ID NO：39用于扩增野田村病毒衣壳区域的可替代的反向引物
SEQ ID NO：40用于检测VP1mRNA的正向引物
SEQ ID NO：41用于检测VP1mRNA的反向引物
定义
如本文所用，术语“包含(comprising)”意指“主要包括，但是不必然唯一地包括”。此外，措词“包含(comprising)”的变化，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有相应变化的意义。
如本文所用，术语“治疗(treating)”及“治疗(treatment)”是指任何的和所有的应用，其医治疾病状态或征状，预防疾病状态或疾病的建立，或是无论以何方式预防、阻碍、延迟、改善或逆转疾病状态或疾病或是其他不期望的征状的进展。
如本文所用，术语“有效量”在其意义之内包括无毒的但是足够量的制剂或化合物来提供所需作用。所需要的确切的量会根据下列因素而随个体变化，例如，待治疗的物种、个体的年龄和一般疾病状态、待治疗的疾病状态的严重性、被给药的特定制剂和给药方式等等。因而，不可能具体指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可以仅由本领域技术人员使用惯常实验而确定。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可交换地使用来提及氨基酸残基的聚合物以及提及其片段、变体、类似物、同系物(orthologues)或同源物(homologues)。因而，这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及应用于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”可交换地使用并且表示包含一个或多个核苷酸、或寡核苷酸、或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或其组合。
如本文所用，在术语“蛋白”、“多肽”、“肽”、“多核苷酸”以及“核酸”的范畴内为片段及其变体，包括但不限于多核苷酸和核酸的反向互补形式和反义形式。
术语“片段”是指多核苷酸或多肽序列，其编码全长蛋白或基因的组成或为其的组成。对于多肽，片段可拥有与全长蛋白一样的定性生物活性，例如，片段可以含有或编码一个或多个表位，例如免疫显性表位，其允许对该片段或由该片段编码的序列产生相似的免疫反应，如同全长序列或由该片段编码的序列。
如本文所用，术语“变体”是指基本相似的序列。一般而言，核酸序列变体可以编码具有共同的定性生物活性的多肽。一般而言，多肽序列变体亦可以拥有共同的定性的生物活性。此外，这些多肽序列变体可以共有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
如本文所用，术语“表达载体”意指具有在细胞或无细胞系统中赋予其所可操作地连接的核酸片段表达的能力的核酸。在本发明的上下文中，要了解的是，包含如本文所定义的启动子的表达载体可以为质体、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组片段或基因组片段，或能够维持和/或复制其被引入细胞的可表达形式的异源DNA的其他核酸。
如本文所用，术语“表达系统”是指表达载体和该载体的宿主的组合，所述表达系统提供了环境以允许在宿主细胞中的外来基因表达，即，使以可检测水平生产蛋白。表达系统的实例包括但不限于：病毒表达系统，基于细菌的系统如大肠杆菌(Escherichia coli)，酵母菌系统如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)，基于昆虫细胞的系统如杆状病毒系统，哺乳动物系统如非洲绿猴肾脏系统，其他真核系统如利什曼(Leishamani)表达系统。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指用于生产本发明表达盒之内所编码的蛋白的细胞。这样的宿主细胞的实例包括真核细胞或更多的特定哺乳动物细胞；昆虫细胞；鱼细胞；酵母细胞；或植物细胞。这样的细胞的实例包括但不限于：人类TK-143b细胞、猴Marc145细胞、非洲绿猴肾脏细胞和猪PK15细胞、草地夜蛾Sf9和Sf-21细胞、Hink's粉纹夜蛾Tn-368和BTI-TN-5B1-4细胞、鲤鱼上皮瘤乳头状细胞(EPC)、CHSE-214、黑头呆鱼(FHM)、石纹棕真鮰(brown bullhead)(BB)、蓝鳃太阳鱼(bluegill fry)(BF2)或白鲟鱼皮肤(WSSK-1)。如本文所用，术语“盒”是指表达载体的一部份，其编码由载体表达的目标序列。例如，盒可以指表达载体的一部份，其编码N-端gp64信号肽和抗原肽。盒可以进一步包含编码其他组份的序列，例如C-端血球凝集素(例如H3N2-HA跨膜域)跨膜域和gp64胞质域。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指转录的和转译的调节性多核苷酸，其以使多核苷酸被转录和多肽被转译的方式而相对于编码多肽的多核苷酸来定位。
如本文所用，术语“启动子”包括基因组基因的转录调节序列，包括TATA盒或起始子元件，其可能是准确转录启动所需要的，伴随有或没有额外的调节元件，其对发展和/或外部刺激的反应而改变基因表达，或以组织特异性方式改变基因表达。在上下文中，术语“启动子”亦用于描述重组型、合成或融合分子，或衍生物或片段，例如启动子的截序列，其赋予、活化或提高其所可操作地连接的核酸分子的表达，以及编码肽。
ie1启动子内的顺式元件在图13中示出。如图13所示，可以使用荧光素酶基因报导分析进行截断分析来识别最小的启动子区域。ie1启动子的最小区域通过渐进地由5’端删除启动子而确定。在一实施方案中，对于白斑综合征病毒(WSSV)的ie1启动子，观察到最小的启动子活性在基因的位置-189和+1之间。
如本文所用，措辞“与病毒相关的疾病”意指由病毒造成的或是与病毒相关的任何疾病、疾病状态或病症。
如本文所用，术语“抗原”是指能够由生物体的免疫系统识别的物质。免疫原为当向生物体给予时能刺激免疫反应的抗原。二个术语都可交换地在本文中使用。如本文所用，“抗原肽”为能够在本文表达系统中表达的肽或多肽序列。
如本文所用，术语“调节”当涉及免疫反应而使用时意指直接地或间接地增加或减少对抗抗原的免疫反应。
如本文所用，术语“信号肽”是指氨基酸序列，其能够引发其所可操作地连接的多肽的进入宿主细胞的内质网(ER)中。信号肽通常由肽链内切酶(例如特定的位于ER的信号肽酶)切开以释放(成熟的)多肽，虽然存在信号肽可以不切割的情况。信号肽的长度典型地为约10个至约40个氨基酸。在本文所用的一实施方案中，术语“编码信号肽的核酸序列”在其范围内不包括编码同源多肽的全长序列的核酸序列，因为信号肽天然引发进入内质网。可能的信号肽的实例包括荧光素酶信号肽以及蜜蜂蜂毒肽信号肽。例如，在一实施方案中，可以使用gp64的信号肽。在特定实施方案中，gp64的信号肽为由SEQ ID NO：14所编码的蛋白或其变体。
本文所述的核酸序列可以视需要包括额外的核苷酸，例如以促进表达。例如，连接子序列(若存在)可以视需要在信号肽与抗原肽之间和/或在抗原肽与跨膜域之间提供。核酸序列可以视需要进一步或是可替代地在表达盒内所含有的任何其他序列之间包含连接子序列。这样的连接子序列可以为异源的或是同源的。连接子序列可以为1个至40个氨基酸，10个至25个氨基酸，6个至10个氨基酸或为例如2、3、4或5个氨基酸。
如本文所用，术语“疫苗”是指成为非病原性或较少病原性的整个的(活的或失活的)或分次的细菌/病毒的悬浮液。疫苗可以概括地分类成3个一般组：减毒病毒、失活(杀灭)的病毒体，以及纯化的病毒组份(亚单位疫苗)。基于本发明表达盒而获得的疫苗属于次单位疫苗组。
如本文所用，术语“佐剂”是指可以刺激免疫系统并增加对抗原或免疫原的反应的制剂。
如本文所用，术语“接种载体”是指当被引入合适的宿主细胞中时会导致抗原肽的表达的表达载体，抗原肽的表达可以被调整以刺激一系列免疫反应，包括抗体、T辅助细胞(CD4+T细胞)以及胞毒型T淋巴球(CTL，CD8+T细胞)介导的免疫。
如本文所用，术语“免疫原性组合物”是指当向人类或是动物给予时导致免疫反应的组合物，所述免疫反应包括抗体、T辅助细胞(CD4+T细胞)以及胞毒型T淋巴球(CTL，CD8+T细胞)介导的免疫。
如本文所用，术语“胞质域”(或“CTD”)是指提供了锚定域的氨基酸序列，该锚定域允许融合蛋白在重组型病毒如杆状病毒的包膜表面上表达。胞质域可以为5个至40个氨基酸，10个至25个氨基酸，6个至10个氨基酸或为例如，2、3、4或5个氨基酸。
如本文所用，术语“gp64胞质域”为如SEQ ID NO：15所示的7个氨基酸的区域。在一实施方案中，gp64胞质域为如SEQ ID NO：16所示的gp64CTD的变体。gp64胞质域的变体的其他实例可以包含gp64胞质域，其对SEQ ID NO：15具有80%或85%或90%或92%或95%或96%或98%或99%的序列同一性。
如本文所用，术语“跨膜域”是指横跨细胞膜之内的氨基酸序列。跨膜域可以为约5个至约60个氨基酸，约5个至约40个氨基酸，约10个至约25个氨基酸，约6个至约10个氨基酸，或例如，序列可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸或是由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸所组成。跨膜域可以为gp64跨膜域，或可以为适合用于该系统内的任何其他跨膜域，例如，跨膜域可以为糖蛋白跨膜域，例如血球凝集素跨膜域，其为流感表面上的糖蛋白并允许病毒结合至细胞唾液酸并与宿主膜融合。血球凝集素跨膜域的实例包括但不限于：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16。
在一实施方案中，血球凝集素跨膜域为H3N2跨膜域或H5N1跨膜域。H3N2跨膜域例如含有半胱氨酸残基，其可以经受软脂酰化(pamitoylation)并由此与SF9-II质膜连接并使VP1蛋白能在表面上定位。如本文所用，术语“gp64跨膜域”为如SEQ ID NO：17所示的27个氨基酸的区域。在一实施方案中，gp64胞质域为gp64跨膜域的截序列并且包含以下或是由以下组成：约10个至约25个氨基酸，约6个至约10个氨基酸或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸，所述氨基酸如SEQ ID NO：17所示。
如本文所用，术语“功能性片段”是指能够执行蛋白域的全部功能的蛋白领域的片段。
在本发明中，可以使用不同的表达系统来表达本文所述的表达盒。这样的表达系统的实例包括但不限于：病毒表达系统如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和杆状病毒表达系统，基于细菌的系统如大肠杆菌，酵母系统如啤酒酵母、毕赤酵母，基于昆虫细胞的系统如InsectSelect Stable表达系统，哺乳动物系统如非洲绿猴肾脏系统，以及其他真核系统如利什曼表达系统。在一实例中，使用杆状病毒表达系统。
杆状病毒起初被认为仅感染昆虫和无脊椎动物，并已经广泛地用于昆虫细胞内许多重组型蛋白的生产。然而，在20世纪80年代早期，苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)发展成真核蛋白表达系统标志着这种病毒开始广泛用于使异源蛋白在昆虫细胞内表达。从那时以来，已经做出许多尝试来发展杆状病毒载体，其可以携带哺乳动物表达盒以用于体外和体内基因疗法研究、药物筛选以及重组型蛋白表达。杆状病毒表达系统的主要优点包括其大的插入容量、其相对容易的构建，以及存在强大的启动子和转译后加工能力。
使用gp64全长蛋白，在20世纪90年代中期首次发展出外来蛋白在杆状病毒膜之上的表达(表面展示)。典型地，包含编码目标异源蛋白或肽的基因的“表达载体”在多角体蛋白或p10启动子的控制下框内融合在全长gp64基因的N-端。这样的构造然后使用各种适合的方法而整合入杆状病毒基因组，例如Bac-To-Bac系统(Invitrogen)。融合蛋白在表达为额外的拷贝之后移位至质膜并且并入病毒包膜中，导致异源蛋白在杆状病毒膜表面上表达。
在一实施方案中，本发明涉及表达盒，其包含ie1启动子或其截序列、N-端gp64信号肽和抗原肽，其中启动子可操作地连接至核酸序列(见图20A)。在一实施方案中，前面提及的gp64信号肽由SEQ ID NO：14或其变体编码。
在另一实施方案中，本发明涉及新颖的“表达盒”，其包含ie1启动子或其变体、N-端信号肽(例如N-端gp64信号肽)、抗原肽以及跨膜区，其中启动子可操作地连接至核酸序列(见图20B)。在一实施方案中，前面提及的跨膜区为H3N2或H5N1或H3N2-HA(SEQ ID NO：17或其变体)跨膜区。
在另一实施方案中，本发明涉及表达盒，其包含ie1启动子或其截序列、N-端信号肽(例如N-端gp64信号肽)、抗原肽、跨膜区以及gp64胞质域，其中启动子可操作地连接至核酸序列(见图20C)。在一实施方案中，前面提及的胞质域由SEQ ID NO：15或16或是其变体编码。
在一实施方案中，本发明涉及表达盒，其至少编码N-端gp64信号肽(20个氨基酸[aa])、抗原衣壳蛋白、C-端H3N2-HA-跨膜域(27aa)和gp64-胞质域(6aa)，并且其由WSSV立即早期ie1启动子(SEQ ID NO：18)或其片段或截断版本转录地控制。
在一些实施方案中，启动子序列为WSSV ie1启动子的区域。在一实施方案中，启动子序列为WSSV ie1启动子的区域，其包含由基因的位置-189至+1的核苷酸的序列或是由其组成。“表达盒”可以并入适于用于病毒表达系统如杆状病毒的“表达载体”中，并随后使用本领域技术人员公知的各种手段而并入杆状病毒基因组中。
特别地，发明人已经阐明通过抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣壳蛋白)的协同表面展示和基因转导来将病毒表达系统如杆状病毒表达系统用作抗病毒的免疫试剂。在重组型病毒如杆状病毒的表面上有效率地展示显性免疫蛋白赋予了接种策略方面的主要优点。如本文所述，除了将这种病毒表达系统用作EV71、PCV2、PRRSV、野田村病毒的接种载体之外，病毒膜展示系统还可以用于表征广泛种类的抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣壳蛋白)的结构和功能。
例如，在来自白斑综合征病毒的ie1启动子的控制之下，VP1病毒衣壳基因使用病毒载体如杆状病毒载体而有效率地在昆虫细胞和哺乳动物细胞二者之中表达。小鼠体内通过使用杆状病毒表面展示的VP1作为免疫原而产生的抗体有效率地中和体外EV71感染性。因此，重组型杆状病毒是用于治疗例如EV71感染的良好的疫苗。
在示例性实施方案中，本发明的表达盒使用本领域已知的标准分子技术而克隆入适合用于所选蛋白表达系统的表达载体中，例如Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)。
然后，多拷贝的表达载体通过使表达载体转染入细胞株如大肠杆菌中而获得。然后，表达载体系被转染入宿主细胞株如昆虫Sf9中，并且被释放入宿主细胞株所生长的培养基中的出芽病毒颗粒在转染后4天进行收集。然后，病毒颗粒用作小鼠接种的亚单元疫苗。
使用“表达盒”设计的相同策略也用于产生遗传工程病毒以表达猪环状病毒(PCV2)和猪呼吸与生殖症候群病毒(PRRSV)的免疫原性肽或蛋白。使表达盒插入病毒基因组如杆状病毒基因组中，并且发现得到大量地表达且在各个病毒表面上展示。在本文所述的一实例中，基因重组型杆状病毒展示来自PCV2或PRRSV的免疫原性肽，并且用于免疫天竺鼠，生产有效率地中和各病毒的感染性(中和性)抗体。
本文所提及的表达来自PCV2或PRRSV的免疫原性肽的重组型杆状病毒的产生以及其作为抗各病毒的感染的免疫原的效能，表现出本文“表达盒”的设计的广泛效能并说明其作为工具的可能性，所述工具用于产生对抗抗原肽如病毒蛋白(例如任何病毒的衣壳蛋白)的疫苗以及还用于生产供诊断试剂盒内使用的抗原。
用于呈递或展示生物分子的方法、试剂盒以及系统
本发明公开了生物分子表面展示系统，连同这样的系统用于展示作为疫苗的肽的特定应用。如本领域技术人员会显而易见的，这些生物分子表面展示系统不限于本文所公开的特定应用，而是在其中期望呈递生物分子、特别是抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣壳蛋白)的任何情况中得到广泛应用。
因此，在一实施方案中，本发明公开了用于涉及肽的表面展示的疫苗生产的方法、试剂盒以及系统。这些方法、试剂盒以及系统可以例如使用本文所例示的与生产抗病毒的疫苗相关的基于杆状病毒的表面展示系统。然而，本领域技术人员会认识且理解到，用于涉及肽的表面显示的疫苗生产的方法、试剂盒以及系统不限于本文所公开的疫苗生产。
因此，本发明提供了用于呈递或展示多肽的方法，其中所述方法包括：
(a)使编码所述多肽的核酸插入本文所公开的表达载体中；
(b)用所述表达载体来转染至少一个宿主细胞；以及
(c)由所述表达载体来表达所述多肽，
其中所述多肽呈递或展示在杆状病毒的表面膜上。
本发明进一步提供了用于呈递或展示多肽的系统，其中所述系统包括：
(a)插入表达载体中的编码所述多肽的核酸，其中所述表达载体包含来自白斑综合征病毒的ie1启动子；
(b)用于使用所述表达载体转染至少一个宿主细胞的构件；以及
(c)用于由所述表达载体表达所述多肽的构件，
其中所述多肽呈递或展示在病毒如杆状病毒的表面膜上。
抗原肽
本发明所用的抗原肽包括能够在本表达系统中表达的多肽或肽。本文所用的抗原肽可以为细菌、病毒或原虫抗原，其包括但不限于：病毒包膜、病毒衣壳、病毒显性免疫区或病毒表面抗原。在一实施方案中，抗原为病毒衣壳肽抗原。使用本文所述的系统，可以表达病毒包膜和非包膜蛋白二者。本文所用的抗原肽在其范围内可以包括或可以不包括编码全长序列的多肽的核酸序列。本文所用的抗原肽可以为能含有或编码一个或多个表位如显性免疫表位的片段，相对于全长序列或由该片段编码的序列，所述表位允许对该片段或由该片段编码的序列产生相似的免疫反应。抗原片段可以为1-500个氨基酸，20-400个氨基酸，30-300个氨基酸，例如，片段可以为约100、200、250、300或350个氨基酸。
抗原肽可以为病毒、细菌或原生动物肽，例如病毒衣壳肽，其选自以下细菌：疏螺旋体属、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、巨细胞病毒、登革热、艾-巴病毒、EV71、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、疱疹、HIV、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、流感病毒如H5N1、H1N1、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、麻疹病毒、野田村病毒、β野田村病毒、PCV2、PRRSV、风疹病毒、SARS冠状病毒、弓形虫、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、西尼罗病毒或水痘病毒。肽可以由病毒、细菌或原生动物来表达或衍生自病毒、细菌或原生动物。肽可以为重组型或经纯化的。
本文所用的抗原肽可以为病毒或逆转录病毒或其免疫原性片段的衣壳蛋白。
本文所用的抗原肽可以得自EV71病毒，例如抗原肽选自VP0、VP1以及VP3或其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所组成：VP1的氨基酸167-178(SEQ ID NO：23)；VP1的氨基酸209-222(SEQ ID NO：24)；和/或VP1的氨基酸240-260(SEQ ID NO：25)或其免疫原性片段。抗原肽的示例性实施方案在第3图中示出。
本文所用的抗原肽可以得自PCV2病毒，例如抗原肽为由ORF2编码的PCV2衣壳蛋白，或是其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所组成：ORF2的氨基酸100-150(SEQ ID NO：26)和/或ORF2的氨基酸151-200(SEQ ID NO：27)或其免疫原性片段。
本文所用的抗原肽可以得自PRRSV病毒，例如抗原肽由选自以下的ORF所编码：ORF-4、ORF-5(主要包膜蛋白)以及ORF-7(核衣壳蛋白)或其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所组成：ORF7的氨基酸18-57(SEQ ID NO：28)；ORF7的氨基酸58-123(SEQID NO：29)；ORF5的氨基酸28-65(SEQ ID NO：30)和/或ORF7的氨基酸132-200(SEQ ID NO：31)或其免疫原性片段。
本文所用的抗原肽可以得自来自螺旋体属的细菌，例如抗原肽选自p41和C6或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自克氏锥虫，例如抗原肽为TcF或是其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自衣原体细菌，例如抗原肽为主要外膜蛋白或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自登革热病毒，例如抗原肽为非结构性蛋白1或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自艾-巴病毒，例如抗原肽为非结构性蛋白1或是其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎，并且抗原肽例如为HBsAg或E1肽，或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自疱疹病毒，例如抗原肽为H1或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自于HIV病毒，例如抗原肽为gp120或是其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)，例如抗原肽为gp46或是其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自流感病毒，例如H5N1或是H1N1，并且抗原肽例如为血球凝集素或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫，并且抗原肽为例如为裂殖子表面蛋白2(MSP2)或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自麻疹病毒，例如抗原肽为麻疹或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自风疹病毒，例如抗原肽为E1或是其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自于SARS冠状病毒，并且抗原肽例如为S蛋白或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自弓形虫，并且抗原肽例如为SAG-1或P30或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自梅毒螺旋体，并且抗原肽例如为主要外鞘蛋白(Msp)或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自西尼罗病毒，并且抗原肽例如为E蛋白或其表位或片段。
本文所用的抗原肽可以得自野田村病毒，例如抗原肽为野田村病毒的衣壳蛋白或其表位或片段。
可以用于本发明的抗原肽的实例在以下表4中示出：
表4
Figure BDA0000391128760000201
Figure BDA0000391128760000211
本发明还包括抗体，其对于在宿主细胞中表达的抗原肽为特异性的。
免疫原性组合物或疫苗
本发明还提供了用于治疗或预防个体的疾病的如本文所述的免疫原性组合物或疫苗供，其中所述疾病与感染相关，例如病毒感染，例如EV71、PCV2、PRRSV或野田村病毒，以及其中所述疫苗包含表达载体，其包含编码抗原肽如病毒衣壳蛋白的核酸，以使在使用中该抗原肽由该表达载体来在个体中表达。
个体可以为哺乳动物、鸟类动物、甲壳类动物、无颚鱼类、多骨鱼类、爬虫类动物或两栖动物。个体可以为人类、非人类灵长类动物、鸟、鱼、虾、蟹、龙虾或猪。
表达载体可以包含启动子。在一实施方案中，启动子包含本文所述的来自白斑综合征病毒的ie1启动子或由其组成。启动子可以可操作地连接至编码抗原肽的核酸序列。
本发明还提供了用于治疗或预防个体的疾病的本文所述的免疫原性组合物或疫苗，其包含本文所述的表达载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病与病原体相关，例如细菌、病毒或原虫，例如肠病毒71(EV71)、猪环状病毒2(PCV2)、猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRSV)、鱼类野田村病毒或A型流感病毒(HA，H3N2)。
本发明还提供了用于治疗或预防个体的疾病的免疫原性组合物或疫苗，其包含本文所述的表达载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病选自：手足口病、断奶后多系统衰竭综合征、猪生殖与呼吸综合征、疱疹、流感、癌症、肝炎、弓形虫病、梅毒、疟疾或病毒性神经坏死病、疏螺旋体病、查加斯氏病、衣原体、登革热、脑炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、疱疹、HIV、HTLV、流感(例如H5N1、H1N1)、疟疾、麻疹、野田村病毒相关疾病、PCV2-相关疾病、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、风疹、SARS、弓形虫病、梅毒、西尼罗热或水痘(水痘(chicken pox))。
表达载体和宿主细胞
本发明还提供了表达载体，其包含编码抗原肽的核酸，例如其中所述抗原肽包含病毒衣壳肽。
本发明进一步提供了用于治疗或预防个体的疾病的表达载体，其包含编码抗原肽的核酸，其中所述疾病系与病毒感染相关，以使在使用中所述抗原肽的由所述表达载体在所述个体中表达。适于杆状病毒的表达载体的实例包括但不限于：Bac-to-BacTM(Invitrogen)、BaculoDirectTM(Invitrogen)、BacPAK6/BaculoGoldTM(BD Biosciences/Clonetech)、FlashBACTM(Genway)和ProEasyTM(AB Vector technologies)。
本发明还提供了宿主细胞，其包含本文所述的表达载体。在一实施方案中，宿主细胞为昆虫细胞，例如宿主细胞可以为SF9细胞，例如SF9-II、SF9-III。在另一实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞，例如人类、猴或猪细胞，例如人类TK-143b细胞、猴Marc145细胞或非洲绿猴肾脏细胞，或猪PK15细胞。在另一实施方案中，宿主细胞为鱼细胞，例如鲤鱼上皮瘤乳头状细胞(EPC)。
组合物和免疫增效剂
本发明进一步预期组合物，其包含免疫增效剂、稀释剂、佐剂或赋形剂。
免疫增效剂可以配制为中性或盐形式的组合物。药物可接受的盐包括酸加成盐类(由肽的游离氨基形成的)，并且其由无机酸或有机酸形成的，所述无机酸例如盐酸或磷酸，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、顺丁烯二酸等。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱或有机碱，无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
一般而言，适合的组合物可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，并且可以包含药物可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。稀释剂、佐剂和赋形剂在与组合物的其他成分相容方面必须为“可接受的”，以及对其接受者不是有害的。
药物可接受的稀释剂的实例为去矿质水或蒸馏水；盐溶液；基于植物的油，例如，花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液态石蜡、软石蜡或鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；鹿角菜胶；黄蓍胶或阿拉伯胶，以及凡士林。典型地，一种载剂或多种载剂会形成1%至99.9%重量比的组合物。最优选地，稀释剂为盐水。
为了可注射溶液或悬浮液形式给药，无毒肠胃外可接受的稀释剂或载剂可以包括林格溶液、中链甘油三酯(MCT)、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇以及1,2丙二醇。
用于口腔使用的适合的载剂、稀释剂、赋形剂以及佐剂的一些实例包括花生油、液态石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠、阿拉伯胶、黄蓍胶、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、明胶以及卵磷脂。此外，这些口服配制剂可以包括适合的调味剂和着色剂。当使用胶囊形式时，胶囊可以涂覆有延迟崩解的化合物，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
佐剂可以划分成数个主要的组，包括含有佐剂组合物的矿物、油-乳剂佐剂、皂素佐剂配制剂、病毒体和类病毒颗粒(VLP)、细菌或微生物衍生物以及免疫刺激性寡核苷酸。佐剂的常见实例包括但不限于：Adjuvant65(含有花生油、二缩甘露醇一油酸酯和单硬脂酸铝)；Montanide佐剂，例如Montanide Incomplete Seppic Adjuvant(ISA)，例如MontanideISA50、51或是720，弗氏完全佐剂或不完全佐剂；矿物凝胶，例如氢氧化铝、磷酸铝和明矾；表面活性剂，例如十六基胺、十八基胺、脱脂酸卵磷脂、双十八烷基二甲基溴化铵、N,N-双十八烷基-N’,N’-双(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六基甘油和复合多元醇(pluronicpolyol)；聚阴离子，例如吡喃、硫酸葡聚糖、poly IC、聚丙烯酸和卡波姆；肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和特夫素；QS-21、Detox-PC、MPL如3D-MPL、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-1、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax CpG ODN、倍他非丁、明矾、MF59以及油乳剂，例如油包水乳剂或水包油乳剂。
用于口服给药的固体形式可以包含人类和兽医的药学实践方面可以接受的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包被剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。适合的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适合的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或甜精。适合的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯氢吡咯酮、瓜尔胶、三仙胶、膨土、藻酸或琼脂。适合的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露糖醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢钙。适合的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙或树莓调味剂。适合的包被剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或面筋。适合的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。
用于口服给药的液体形式除以上制剂之外还可以包含液体载剂。适合的液体载剂包括水、油，例如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花子油、落花生油、椰子油、液态石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
用于口服给药的悬浮液可以进一步包含分散剂和/或悬浮剂。适合的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯氢吡咯酮、藻酸钠或乙酰醇。适合的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸的聚氧乙烯酯，例如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。
用于口服给药的乳剂可以进一步包含一个或多个乳化剂。适合的乳化剂包括如上所例示的分散剂或天然胶，例如瓜尔胶、阿拉伯胶或黄蓍胶。
用于制备可肠胃外给药的组合物的方法对于本领域技术人员是显而易见的，并且更详细地在例如Remington's Pharmaceutical Science,第15版,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.中描述，其并入本文作为参考。
组合物可以包括任何适合的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，例如去水山梨醇酯或其聚氧乙烯的衍生物。也可以包括悬浮剂，例如天然胶，纤维素衍生物或无机材料，例如硅酸盐质二氧化硅(silicaceous silicas)，以及其他成分，例如羊毛脂。
在本发明的组合物的配制剂中可以包括本文或上述所公开的一个或多个制剂。这样的配制剂使用了本领域技术人员已知的惯常方法。典型地，这样的组合物被制备为可注射的液体溶液或悬浮液；在注射之前还可以制备适于液体溶液或液体悬浮液的固体形式。配制剂也可以被乳化。活性免疫原性成分常与药物可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。
给药途径
根据本发明的方法，可以通过任何适合的途径而全身地、区域地或局部地给予疫苗和组合物。在任何给定情况下使用的特定给药途径会取决于一些因素，包括要治疗的疾病的本质、疾病的严重性和程度、要递送的特定化合物所需的剂量以及所需疫苗或组合物的潜在副作用。
例如，在需要将适当浓度的所需疫苗或组合物直接递送到待治疗的位点的情况下，给药可以为区域性的而非全身性的。区域给药提供了将非常高的局部浓度的所需疫苗或组合物递送至所需位点的能力，并因此适于达到所需治疗作用或预防作用，同时避免身体的其他器官暴露于疫苗或组合物，由此潜在地减少副作用。
举例来说，本发明的实施方案的给药可以通过任何标准的途径来实现，包括腔内、膀胱内、肌肉内、动脉内、静脉内、皮下、局部或口服。腔内给药可以为腹膜内或胸膜内的。
若需要，适于持续释放或间歇释放的包含本文所述表达盒的装置或组合物可以有效地植入身体内或向该处局部施用，以用于将这样的材料相对缓慢地释放到身体内。
表达载体或宿主细胞的给药可以包括经由直接口服摄取、全身性注射的递送，或向所选组织或细胞的递送，或经由向与个体或可相容的供体分离的细胞的递送而间接递送。
对于基于核酸的组合物，这样的组合物的所有递送方式由本发明所预期。这些组合物向动物的细胞或组织的递送可以例如由微粒轰击、脂质体介导的转染(例如，lipofectin或lipofectamine)、电穿孔、磷酸钙或DEAE-葡聚糖-介导的转染而促进。在可替代的实施方案中，合成的构建物可以以本领域已知的“裸DNA”组合物的形式而用作治疗或预防性组合物。适合的递送方法的讨论可在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的第9章(Eds.Ausubel等人；John Wiley&Sons Inc.,1997版)中或在网址DNAvaccine.com上找到。组合物可以由皮内的(例如，使用panjetTM递送)或肌肉内的途径来给药。
引导合成的多核苷酸进入靶细胞的步骤会根据意图用途和物种而不同，并且可以包括非病毒和病毒载体、阳离子脂质体、逆转录病毒和杆状病毒的一种或多种，例如在Mulligan,R.C.(1993Science260926-932)中所描述的，其并入作为参考。这样的方法可以包括例如：
A.通过注射(Wolff等人，1990，Science2471465-1468，其并入作为参考)、外科植入、滴注或任何其他手段的合成的多核苷酸的局部施用。这种方法也可以与由注射、外科植入、滴注或任何其他手段而局部施用对由合成多核苷酸编码的蛋白有反应的细胞组合地使用，从而增加该治疗的有效性。这种方法也可以与由注射、外科植入、滴注或任何其他手段而局部施用该蛋白的活性所需要的另一因子或多个因子组合地使用。
B.由单独注射DNA、(Calabretta等人，1993，Cancer Treat.Rev.19169-179，其并入作为参考)或RNA，或者与脂质体(Zhu等人，1993,Science261209-212，其并入作为参考)、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等人，1991，Biotech.Appl.Biochem.13390-405，其并入作为参考)或是递送的任何其他介质组合地注射DNA或RNA的一般全身性递送。可以通过将合成的多核苷酸与靶分子连接(使用例如抗体的所谓的“魔弹”方法)，或通过由编码合成的多核苷酸的蛋白的活性所需的另一个因子或多个因子(factors)的，或对该蛋白反应的细胞的注射、外科植入或任何其他手段的局部应用来实现改善的靶向。
C.已经由间接体内转染(例如，在磷酸钙的存在下：Chen等人，1987,Mole.CellBiochem.72745-2752，或是在阳离子脂质和多胺的存在下：Rose等人，1991,BioTech.10520-525，这些文章并入本文作为参考)、感染、注射、电穿孔(Shigekawa等人，1988,BioTech.6742-751，其并入本文作为参考)或是任何其他方式而修饰的细胞的注射或植入或通过任何手段的递送，从而增加那些细胞内合成的多核苷酸的表达。可以通过质体、噬菌体、粘接质体、病毒(例如腺病毒或逆转录病毒；Mulligan,1993,Science260926-932；Miller,1992,Nature357455-460；Salmons等人，1993,Hum.Gen.Ther.4129-141，这些文章并入本文作为参考)或其他载体，或其他修饰制剂，例如脂质体(Zhu等人，1993,Science261209-212，其并入本文作为参考)、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等人，1991,Biotech.Appl.Biochem.13390-405，其并入本文作为参考)，或任何其他的修饰介质来介导修饰。使用细胞作为基因或基因产物的递送载体已经由Barr等人，1991,Science2541507-1512和Dhawan等人，1991,Science2541509-1512说明，这些文章并入本文作为参考。处理的细胞可以与会促进其在治疗的个体中的存活的任何营养素、生长因子、基质或其他制剂组合地递送。
组合物也可以以脂质体形式给药。脂质体通常衍生自磷脂质或其他脂质物质，并且由分散在水性培养基的单层状或多层状水合液晶所形成。可以使用任何无毒的、生理可以接受的且可代谢的能够形成脂质体的脂质。脂质体形式的组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质为天然的和合成的磷脂质和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法为本领域已知的，并且涉及特定参考：Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.Y.(1976),p.33以及下列等，其内容并入本文作为参考。
剂量
用于任何特定个体的给予的化合物的有效剂量水平会取决于各种因素，包括：待治疗的疾病类型和疾病的阶段；使用的化合物的活性；使用的组合物；个体的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药时间；给药途径；化合物的螯合率；治疗的持续时间；与治疗组合或共同使用的药物，连同本领域公知的其他相关因素。
本领域技术人员通过惯常实验能够确定治疗可适用的病况所需要的有效的、无毒的剂量。这些最常给予具体情况而确定。
在重量方面，用于向病人给药的组合物的治疗有效剂量预期为每24小时每公斤体重约0.01mg至约150mg；典型地，每24小时每公斤体重约0.1mg至约150mg；每24小时每公斤体重约0.1mg至约100mg；每24小时每公斤体重约0.5mg至约100mg；或每24小时每公斤体重约1.0mg至约100mg。更典型地，有效的剂量范围预期为每24小时每公斤体重约5mg至约50mg。
或者，有效剂量可以高至约5000mg/m2。一般而言，有效剂量预期为约10至约5000mg/m2，典型地为约10至约2500mg/m2，约25至约2000mg/m2，约50至约1500mg/m2，约50至约1000mg/m2，或约75至约600mg/m2。
此外，本领域技术人员显而易见的是，通过待治疗的疾病状态的本质和程度、给药的形式、途径和位点，以及待治疗的特定个体的本质来决定最佳量和单次给药的间隔。此外，这些最佳条件可以由常用技术来确定。
对本领域普通技术人员还显而易见的是，治疗的最佳过程，例如每单位时间给予的组合物的剂量数，可以由本领域技术人员使用治疗确定试验的常用过程来确定。
免疫效能的评估
根据本发明的方法进行的免疫的效能可以使用任何适合的技术来评估。例如，可以使用CTL溶解分析，其利用51Cr标记的靶细胞，在肽涂覆的或重组型病毒感染的细胞上使用经刺激的脾细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)。这样的分析可以使用例如灵长类动物、猪、天竺鼠、小鼠或人类细胞(Allen等人，2000,J.Immunol.164(9)：4968-4978，以及Woodberry等人，下文)而进行。或者，免疫的效能可以使用一个或多个技术来监测，包括但不限于：新鲜的和经刺激的PBMC二者的第I类HLA四聚体染色(参见例如Allen等人，上文)、增殖分析(Allen等人，上文)、ElispotTM分析；直接或间接的免疫荧光分析和细胞内IFN-γ染色(Allen等人，上文)、线性B细胞反应的ELISA分析，以及表达本文所述的抗原肽的细胞样品的免疫印迹。可以可替代地或额外地使用免疫金电子显微镜技术。
试剂盒
本发明提供了用于治疗或预防个体的疾病的试剂盒，其中所述疾病与病毒相关，以及其中所述试剂盒包含本文所述的疫苗、表达载体、宿主细胞或组合物。
在本发明的上下文中，间隔化的试剂盒包括其中在各容器内含有试剂的任何试剂盒，并且可以包括小玻璃容器、塑料容器或者塑料或纸的带状物。这样的容器可以允许由一个隔间向另一个隔间有效率地转移试剂并避免样品和试剂的交叉污染，以及以定量方式由一个隔间向另一个隔间添加各容器的制剂或溶液。
典型地，本发明的试剂盒也会包括用于使用试剂盒组份来实施适当方法的用法说明。
现参考下列实施例来说明本发明，所述实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1-重组型Bac-VP1的构建
EV71病毒(C4菌株)的VP1基因的全长开放读框(ORF)被扩增并克隆入pFASTBacHTA质体(Invitrogen,SanDiego,CA)。为了在杆状病毒包膜上有效率地展示VP1，使gp64的额外信号序列在基因地融合至VP1的N端，而H3N2-HA跨膜域和gp64的CTD位于C端侧面以识别核衣壳以及随后的向出芽病毒体中的蛋白并入。设计了总计5个引物(表1中列出)来构建融合基因。
图1示出用于产生融合基因的整个方法。引物A(SEQ ID NO：1)和B(SEQ ID NO：2)用于扩增整个全长VP1基因，连同分别在VP1的N端和C端的gp64信号序列的额外重迭区域、H3N2-HA跨膜区。使用上面纯化的反应混合物作为模板，引物A(SEQ ID NO：1)和C(SEQ IDNO：3)用于使VP1的C端与H3N2-HA跨膜域的完全序列重迭。最后，使用上面纯化的反应混合物作为模板，引物D(SEQ ID NO：4)和E(SEQ ID NO：5)用于使分别在N端和C端的gp64信号序列的整个区域、gp64CTD区域重迭。所生成的PCR产物被纯化并克隆入带有适当限制位点的质体pFASTBacHT。引物D(SEQ ID NO：4)和引物E(SEQ ID NO：5)设计为在两端添加限制酶位点RsrII和Hind III。ie1启动子使用引物F(SEQ ID NO：6)和引物G(SEQ ID NO：7)而由WSSVDNA来扩增，并随后使用AccI和Rsr II限制位点而插入pFASTBac HT A中。图2示出完全构建的重组型杆状病毒载体。
表1
Figure BDA0000391128760000311
在表1中，注意到下列SEQ ID NO：鉴定子适用：
引物A：SEQ ID NO：1
引物B：SEQ ID NO：2
引物C：SEQ ID NO：3
引物D：SEQ ID NO：4
引物E：SEQ ID NO：5
引物F：SEQ ID NO：6
引物G：SEQ ID NO：7
重组型杆状病毒的产生
对于重组型杆状病毒的产生，构建物通过使用Bac-To-Bac系统(Invitrogen)的位点特异性转位作用而并入DH10Bac(Invitrogen)内的杆状病毒基因组中。然后，重组型杆状病毒质粒(bacmids)转染至Sf9细胞中，并且在转染后4天收集释放入培养基中的出芽病毒颗粒。随后的病毒扩增和菌斑纯化在补充有Sf9-II无血清培养基的昆虫Sf9-II细胞株内进行。TCID50通过终点稀释法来测定。理想地，在病毒复制期间，gp64信号序列指导嵌合蛋白移位入昆虫细胞质膜内并在蛋白锚定之后被切割，从而向外表面暴露VP1N-端。H3N2-HA跨膜域使蛋白能够锚定在质膜上，而gp64CTD介导(1)带有膜结合蛋白的出芽杆状病毒核衣壳的识别以及(2)锚定的蛋白向病毒包膜内的并入。
Sf9-II细胞中重组型蛋白(rVP1)的确认
为了确认rVP1在昆虫的Sf9-II细胞内的表达，将细胞感染，用作对照，并且如以上所提及的那样进行感染。在SF9-II细胞表面上的rVP1展示的谱在图3中示出。为了确认rVP1是否恰当地移位到质膜上的表面上，细胞在无菌盖玻片上培养，由rBac-VP11、即野生型杆状病毒(WT-Bac)感染并且以2dpi进行免疫荧光标记/共焦显微镜可视化(图4)。在感染后2天，移去上清液，并细胞由4%PFA在4℃固定1h，用1ml PBS冲洗，然后用2%BSA的PBS(1ml)在37℃阻断30min。然后，细胞与初级抗体(抗-VP1，多克隆抗天竺鼠，1：500)在37℃一起孵育1h，然后PBS清洗3次。然后，细胞与二级抗体(FITC-结合山羊抗天竺鼠抗体，1：100)在37℃一起孵育1h，然后3次PBS清洗。蛋白定位通过共焦显微镜(Leica)来可视化。合并的照片表明rVP1与质膜共定位。rBac-VP11表达蛋白，所述蛋白由多克隆抗-VP1天竺鼠(1：500)抗体检测到。根据rVP1与质膜的共定位，确认了rVP1移位且锚定在质膜上。
rVPI在杆状病毒包膜上的展示
为了检查在质膜上锚定的rVP1是否成功地展示在杆状病毒包膜上，rBac-VP11、rBac-VP12和WTBac通过蔗糖梯度离心而纯化，并进行免疫印迹，其使用多克隆抗-VP1(天竺鼠)抗体作为初级抗体、然后使用抗天竺鼠HRP标记抗体的作为二级抗体(图5)。所获得的rVP1如图5所示，重组型病毒通过以MOI0.1来感染细胞而产生，并在感染后4天收集。病毒上清液分别通过蔗糖梯度超速离心(O`Reilly,1992)而纯化。总计200ml的病毒通过以90,000×g(Beckman coulter)超速离心2hr而制成小球，并且将小球合并并再悬浮于2ml PBS中。为了进一步的病毒纯化，将浓缩的病毒(1ml)装载到20%、35%、50%和60%(wt/wt)蔗糖溶液组成的蔗糖梯度(10ml)上。在以90,000×g离心2.5hrs之后，沉积在50%蔗糖附近的杆状病毒通过注射器而采集，稀释在8PBS中并以90,000×g超速离心2h。纯化的病毒小球再悬浮于0.5ml PBS中，随后经历如下的免疫金电子显微镜。将涂碳的铜网漂浮在微量(drop)的阻断溶液(PBS含有1%BSA和25mM甘胺酸，pH6.2)的顶部上30min，并用PBS3×5min清洗。在清洗以后，将网转移到微量的(各25μl)抗小鼠VP1pAb溶液(1：500)的上并在室温下孵育30min。在用PBS清洗3次之后，随后，在室温下将网漂浮在结合有5-nm金颗粒的山羊抗小鼠Ab上(1：25)30min。在用PBS清洗之后，将网用2%磷钨酸(PTA，Sigma)负染色2min，并在室温下风干。然后，网在透射电子显微镜下检查。图6显示在WT-Bac表面上没有金颗粒，然而，在rBac-VP11表面上观察到金颗粒，表明rVP1在病毒包膜上的并入和展示。
rVP1向纯化的杆状病毒(rBac-VP11，rBACVP12)的并入由SDS-PAGE/免疫印迹而可视化，并且由红外线扫描密度测定法来定量(图7)，其中并入病毒中的rVP1的量根据纯化的蛋白与并入的rVP1的强度之间的比较来定量。当进行比较时，在杆状病毒包膜rBac-VP11上的rVP1的表达水平比野生型EV71病毒(B5菌株)高约2倍，并且比rBac-VP12高约14倍。如图5所示，纯化的病毒进行SDS-PAGE和使用抗-VP1mAb作为初级抗体和二级驴抗小鼠IRdye800(1：5000)的免疫印迹。蛋白定量使用Odyssey v1.1IR成像系统(LI-COR)来完成。
VP1-重组型杆状病毒(Bac-VP1)的免疫原引发特性
为了检查在杆状病毒上展示的VP1是否可以用作体内引发抗-VP1抗体的免疫原，各包含8只雌性BALB/c小鼠(6周龄，购自NUS Animal care)的2组小鼠各别用1.2×107PFU纯化的Bac-VP1皮下免疫。作为负对照，5只小鼠用纯化的野生型杆状病毒WT或PBS注射。作为正对照，注射化学失活的EV71(B5)病毒(107)。各小鼠用纯化的病毒(200μl)连同200μl完全弗氏佐剂注射。在初级注射后2周，小鼠接受使用等量的纯化病毒连同不完全弗氏佐剂的一次加强注射9。血液样品在第6周从尾部静脉取得并热失活。
EV71菌株在RD细胞内生长。单独的病毒(100TCID50单位)在连续稀释的测试或对照血清(在56℃热失活30min)内在37℃孵育1h。在3天之后，EV71感染的单层用95%乙醇和5%丙酮在-20℃固定20min，并且抗-EV71(天竺鼠)抗体作为第一个抗体且FITC-结合山羊抗天竺鼠IgG作为第二个抗体。使用荧光显微镜来观察细胞，并测定测试血清中和病毒感染性的能力。荧光为50%或比病毒感染的对照孔更小的测试血清的最高稀释的倒数用作病毒中和滴定度。如图8所示，负对照野生型杆状病毒和PBS诱导没有中和作用，而rBac-VP11诱导高至27.2的中和滴定度，然而失活EV71诱导高至24.9的中和滴定度。
这些数据表明并入的rVP1成功地诱导功能性抗体。虽然已经提出展示免疫原的杆状病毒作为疫苗候选者，但是这是表明重组型杆状病毒在其表面具有大量免疫原表达(衣壳蛋白VP1)的首次报道。编码包含gp64(全长)作为融合伙伴的表达盒的杆状病毒不会在其表面上有效率地展示免疫，这由VP1定量分析和病毒中和分析而确认。然而，对抗暴露的融合gp64配对物的免疫反应的可能性会阻碍疫苗的效率。
在本实施例中，信号肽序列仅含有来自gp64基因的信号序列(SEQ ID NO：14)，然而，全长gp64基因含有gp64信号序列、胞外域、跨膜域(TMD)以及胞质域(CTD)。当在具有gp64信号序列、H3N2-HA跨膜域和gp64CTD的本文新颖的表达盒内表达VP1时，最终表达的蛋白会或多或少地与天然VP1分子量类似，而对于正常表达盒，VP1被插入gp64信号序列和成熟gp64域(包括gp64胞外域、跨膜域、胞质域)之间，所以最终的总体表达的蛋白会比VP1蛋白的正常大小更高(参见图5)。
因而，在本发明中，产生的重组型杆状病毒(rBac-VP11)编码包含gp64信号肽(20aa)、H3N2-HA跨膜域(27aa)和gp64胞质域(6aa)作为融合伙伴的新颖的“表达盒”，该重组型杆状病毒(rBac-VP11)展示杆状病毒包膜上的更多rVP1，并且当与rBac-VP12和失活EV71(B5)病毒比较时赋予更高的抗VP1免疫反应。当EV71感染变成感染世界各地、尤其是亚洲国家的婴儿和儿童的主要感染性疾病之一时，EV71疫苗的发展已变成紧迫的。这种新颖疫苗的认可能开启EV71疫苗发展的新途径并还为现有疫苗技术提供了可替代的方法。
因此，该实施例清楚地表明本发明的表达盒在不需要全长gp64序列的情况下用于在杆状病毒的表面上表达靶抗原(在该实施例中为VP1)的用途，以及杆状病毒成功地引发免疫反应、由此作用对抗靶病原体的疫苗的后续用途。
实施例2-表达盒用于在杆状病毒的表面上展示其他免疫原蛋性白/肽的用途
根据本发明，“表达盒”用于在杆状病毒的表面上展示其他免疫原性蛋白/肽的应用及其作为免疫原的效用通过表达来自猪环状病毒2(PCV2)、猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRSV)及β野田村病毒的免疫原性肽/蛋白来确定。PCV2和PRRSV为感染猪的主要病原体，并且它们使猪生产工业遭受沉重的经济损失。PCV2为具单个结构性蛋白的无包膜病毒，并且PRRSV为具多结构性组份的包膜病毒。β野田村病毒属于野田村病毒家族的成员，其为鱼的病毒性神经坏死的病原体，并且由其导致的感染造成亚洲、欧洲、澳洲、马提尼克岛和塔希提岛(Tahit)中广泛的海水鱼物种的幼体和稚体的高死亡率。由ie1启动子所驱动的由“表达盒”来表达PCV2、PRRSV和β野田村病毒免疫原性肽/蛋白的重组型杆状病毒在杆状病毒包膜上表现出大量的表达和表面展示。在其表面上表达PCV2、PRRSV和β野田村病毒免疫原性区域的重组型杆状病毒可以用作对抗这些猪病原体的疫苗。
PCV2和PRRSV免疫原性区域向表达盒中的构建
PCV2衣壳蛋白：
PCV2的衣壳蛋白ORF-2为主要的免疫原性蛋白。使用前面提及的表达盒而在杆状病毒表面上展示的衣壳区域由PCV2菌株BJW(GenBank：AY847748.1)来获得。氨基酸76至135、121至180以及76至180在N-端gp64信号序列和C端H3N2-HA跨膜域gp64胞质域之间与“表达盒”的组份框内融合。下列的引物用于扩增PCV2的衣壳区域(表2)。
表2
编号 引物 方向 序列
1 衣壳76F 正向 ATTAATGATTTTCTTCCCCCAGGAG
2 衣壳135R 反向 GGCTGTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATC
3 衣壳121F 正向 AGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAAC
4 衣壳180R 反向 TCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTGG
在表2内，注意到下列的SEQ ID NO：鉴定子适用：
引物核衣壳76F：SEQ ID NO：8
引物核衣壳135R：SEQ ID NO：9
引物核衣壳121F：SEQ ID NO：10
引物核衣壳180R：SEQ ID NO：11
在“表达盒”中包容以上所提及的PCV2衣壳蛋白的区域的杆状病毒基因组如先前所述那样构建并再生病毒。在杆状病毒表面上的PCV2衣壳蛋白区域的表达和并入如先前rBac-VP1构建所述的那样由免疫印迹和电子显微镜来检查。观察表明衣壳蛋白区域确实在杆状病毒表面上展示并且表达水平是大量的，如使用构形特异性单克隆抗体8C2的免疫印迹分析(图9)和免疫荧光法分析内所观察到的。此外，由用以上重组型杆状病毒接种的天竺鼠所获得的抗体能够通过免疫荧光分析而在PCV2感染的PK-15细胞单层中检测到PCV2抗原(图10)。
PRRSV核衣壳蛋白(ORF7)：
PRRSV的ORF5和ORF7编码PRRSV的主要免疫原性蛋白。主要包膜蛋白(由ORF5编码)和核衣壳蛋白(由ORF7编码)使用前面提及的表达盒而在杆状病毒表面上展示。对于PRRSV主要包膜蛋白(ORF5)，其3个跨膜横跨氨基酸的删失促进了杆状病毒的有效率表面展示。主要包膜蛋白不需要核衣壳蛋白的共表达，因为其要以此方式在杆状病毒上被表面展示。ORF7和ORF5为不同的ORF，并且分别地转录。免疫原性区域由PRRSV菌株JK100(GenBank：AF332732.1)扩增。目标蛋白在N-端gp64和C端H3N2-HA跨膜域之间与“表达盒”的组份框内融合。下列的引物用于扩增PRRSV的衣壳区域(表3)。
表3
编号 引物 方向 序列
1 ORF7F 正向 ATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGC
2 ORF7R 反向 TGCTGAGGGTGATGCTGTGACGCG
在表1内，注意到下列SEQ ID NO：鉴定子适用：
引物ORF7F：SEQ ID NO：12
引物ORF7R：SEQ ID NO：13
在“表达盒”内包容以上所提及的PRRSV的蛋白的杆状病毒基因组如先前所述的那样构建并再生病毒。在杆状病毒表面上的PRRSV蛋白的表达和并入如先前rBac-VP11构建所述的那样由免疫印迹和电子显微镜来检查。观察表明蛋白趋势在杆状病毒表面上有效率地展示并且表达水平是大量的，如使用构形特异性单克隆抗体特异性ORF7(5H2)的免疫印迹(图11)和免疫荧光法分析所观察到的。此外，由用以上重组型杆状病毒接种的天竺鼠所获得的抗体能够通过免疫荧光法分析在PRRSV感染的MARC-145细胞单层中检测到PRRSV抗原(图12)。
β野田村病毒衣壳蛋白到表达盒中的构建
β野田村病毒的核衣壳α蛋白为主要的免疫原性蛋白。全长野田村衣壳α蛋白在N-端gp64信号序列和C端H3N2跨膜域gp64胞质域之间与“表达盒”的组份框内融合。下列引物用于扩增野田村病毒的衣壳区域。NodaR1用于添加H3N2域，而NodaR2用于添加gp64胞质域。
NodaF-5’-(SEQ ID NO：37)
AATCGGTCCGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGTACGCAAAGGTGAGAAGAAATTGG
NodaR1-5’-(SEQ ID NO：38)
TGGCAAAGGAAATCCATAGGATCCAGTTTCCCGAGTCAACCCTGGTGCAG
NodaR2-(SEQ ID NO：39)
AAGCTTATTTTAATATTGTCTATTACGGTTTTGGCAGGCCCACATGATGAACCCCAACAAAGCAACACAAAGCAAAAAACATGATATGGCAAAGGAAATCCATAGGA
在“表达盒”内包容以上所提及的β野田村病毒的衣壳α蛋白的杆状病毒基因组如先前所述那样构建并再生病毒。在杆状病毒表面上的衣壳蛋白的表达和并入如先前rBac-VP1构建所述的那样通过免疫印迹和共焦显微镜分析来检查。观察表明蛋白确实在杆状病毒表面上有效展示并且表达水平是大量的，如使用抗β野田村病毒的特异性抗天竺鼠多克隆抗体的免疫印迹(图14)和共焦分析(图15)所观察到的。衣壳区域的有效的杆状病毒表面展示表明“表达盒”用于表面展示来自除EV71之外的包膜和无包膜病毒二者的蛋白/肽的广泛效用。此外，这些表面展示的区域/蛋白的免疫原性的保留以及对抗天竺鼠体内表面展示区域/蛋白而产生的抗体识别经感染的细胞内的天然抗原的能力表现出其作为疫苗的效能。
从而，此实施例清楚地表明表达盒用于在杆状病毒表面上表达各种不同靶抗原的可使用性。
实施例3-表达盒用于在非洲绿猴肾脏细胞中表达VP1的用途(体外转导分析)
非洲绿猴肾脏细胞以2×105细胞的浓度接种到六孔板中。在细胞达到70-80%融合之后，移去培养基并将细胞用PBS(pH7.4)清洗3次。然后，细胞在含有重组型杆状病毒(Bac-VP1)的培养基内于27℃孵育6h。作为负对照，非洲绿猴肾脏细胞与BEI失活Bac-VP1在27℃一起孵育6h。在移去病毒之后，添加新鲜的培养基并且培养物在37℃孵育。在转导后48h，通过间接免疫荧光分析(IFA)来分析细胞的VP1衣壳蛋白的表达。简言之，细胞用4%多聚甲醛固定并加工用于IFA，其使用抗-VP1单克隆抗体，然后用PBS-Tween-20(0.1%)3次清洗，然后与FITC结合二级抗小鼠抗体一起孵育。未结合的抗体用PBS-Tween-20(0.1%)清洗3次并在荧光显微镜之下可视化。所获得的影像在图16中示出。
该实施例清楚地表明其除Sf9-II昆虫细胞外的他可替代的宿主细胞(例如哺乳动物非洲绿猴肾脏细胞)可以用于本发明的表达盒。
实施例4-表达盒用于在全生物体中表达VP1的用途(体内转导分析)
对于体内转导分析，将来自Bac-VP1(野生型杆状病毒)和PBS免疫组的3只小鼠于第6天实施安乐死，并且在10%(wt/vol)缓冲福尔马林中采集肌肉组织，包埋于石蜡内，并切片。然后，使用Histo-choice(Amersco)对切片脱蜡并在连续分级的乙醇浴中再水化。载玻片在0.3%脱脂奶的PBS中阻断30min，然后与抗-VP1单克隆抗体在37℃一起孵育1h。然后，将载玻片在PBS中清洗3次并以1：50的稀释与HRP-结合兔抗小鼠(Dako Cytomation,Denmark)一起孵育30min。在清洗之后，载玻片与苏木精一起孵育2-5min且载玻片用无菌水清洗3次并且使用封固剂封固切片。在显微镜(Olympus,UK)下观察载玻片并且影由数字成像系统(Nikon,USA)来捕获(图17)。
如由图16可见，抗-VP1的阳性染色只有在用Bac-VP1接种的小鼠肌肉组织内观察到。因此，该实施例清楚地表明接种含有本发明表达盒的杆状病毒的全生物体可以随后表达本发明表达盒的靶抗原。
实施例5-从用含表达盒的杆状病毒接种的全生物体获得的抗血清可以赋予另一全生物体被动保护(组织病理学分析)
对于本实验，将所获得的BALB/c小鼠在无特定病原体的条件下、在单独通风的笼中容纳并饲养。为了测试来自Bac-VP1免疫小鼠的抗血清效能，1周龄BALB/c小鼠(n=6)在用5MLD50的EV71B4菌株HFM41(5865/SIN/00009)经由ip.途径的致命挑战的前一天用抗血清腹膜内(ip.)给药。来自正对照组的小鼠(n=6)在致命病毒挑战的前一天被给予等量的来自福尔马林活化EV71病毒的抗血清。对来自野生型杆状病毒和PBS对照小鼠组(n=6)的抗血清遵循相同的程序。每天监测小鼠的存活率和临床评分。总肢体瘫痪用作早期安乐死的标准(图18)。
如由图18可见，用从Bac-VP1免疫小鼠获得的抗血清给药的BALB/c小鼠与用来自野生型杆状病毒和PBS对照小鼠组的抗血清给药的对照小鼠相比，表现出存活率的显著差异。
因此，本实验清楚地表明从用含有表达盒的杆状病毒接种的全生物体获得的抗血清(其因此含有对抗靶抗原的抗体)可以赋予另一全生物体被动保护。
定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析
作为先前实验的追踪，来自对照组(用来自野生型杆状病毒和PBS免疫小鼠的抗血清来治疗的小鼠)和预防性保护的小鼠的脑组织由Trizol试剂(Invitrogen)均质化以用于总RNA提取。提取的RNA(1μg)利用Quantifast SYBR Green RT-PCR试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)根据制造商的方案而用于qRT-PCR。
5’UTR特异性引物，即UTR-F-5’-TCCTCCGGCCCCTGAATG-3’(SEQ ID NO：40)和UTR-R-5’-GGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’(SEQ ID NO：41)用于扩增。qRT-PCR热循环条件为起始孵育在50℃下12min(逆转录)，95℃下6min(起始PCR活化步骤)，然后是各自为95℃下12s(变性)、60℃下30s(组合的退火和延伸)以及77℃下15s的40个周期。以1℃/5s的升温从50-95℃采集熔化曲线数据，并且在40℃进行最后的冷却。使用Rotor-Gene-Q实时PCR循环器(Qiagen)进行反应。相对表达值被标准化为β-微管蛋白管家基因的表达值。包括含有全长EV71基因组的重组型质体DNA的连续10倍稀释以产生用于定量分析的标准曲线。
图19示出对照小鼠的脑组织内与预防性保护的小鼠相比有高表达的EV71mRNA，由此表明预防性保护的小鼠的脑组织内没有EV71病毒的证据并且本发明的表达盒可以用于成功地赋予对抗病原生物体的被动保护。
EV71肽、PCV2衣壳区域以及PRRSV核衣壳蛋白(ORF7)的有效病毒表面展示表明“表达盒”的广泛效用，该“表达盒”包含ie1启动子和gp64信号肽以用于表面展示来自除EV71之外的包膜和无包膜病毒二者的衣壳蛋白/肽。此外，这些表面展示的区域/蛋白的免疫原性的保留以及对抗天竺鼠内的表面展示区域/蛋白而产生抗体用于识别经感染的细胞内的天然抗原的能力表明其作为疫苗的效能。此外，与包含全长gp64的表达盒相比，包含ie1启动子和gp64信号肽的肽型式表达盒的表达水平的增加表明本公开的其它效用。
Figure IDA0000428599800000011
Figure IDA0000428599800000021
Figure IDA0000428599800000031
Figure IDA0000428599800000041
Figure IDA0000428599800000051
Figure IDA0000428599800000061
Figure IDA0000428599800000071
Figure IDA0000428599800000081
Figure IDA0000428599800000091
Figure IDA0000428599800000101
Figure IDA0000428599800000111
Figure IDA0000428599800000121
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Figure IDA0000428599800000141
Figure IDA0000428599800000151
Figure IDA0000428599800000161
Figure IDA0000428599800000171

Claims (35)

1.表达盒，其中所述表达盒包含：
(a)来自白斑综合征病毒的ie1启动子；
(b)编码N端gp64信号肽的核酸序列、编码病毒衣壳肽的核酸序列、编码跨膜区的核酸以及编码gp64胞质域的核酸；
其中所述启动子可操作地连接至所述编码N端gp64信号肽的核酸序列，
并且其中所述gp64胞质域由SEQ ID NO：16组成。
2.如权利要求1所述的表达盒，其中所述病毒衣壳肽来自病毒或逆转录病毒。
3.如权利要求1所述的表达盒，其中所述病毒衣壳肽是来自以下的肽：巨细胞病毒，或登革热病毒，或EV71，或PCV2，或PRRSV，或HSV-1，或HSV-2，或艾-巴病毒，或脊髓灰质炎病毒，或A型肝炎病毒，或B型肝炎病毒，或C型肝炎病毒，或D型肝炎病毒，或E型肝炎病毒(HEV)，或疱疹，或HIV，或HTLV，或流感病毒，或麻疹病毒，或野田村病毒，或风疹病毒，或SARS病毒，或西尼罗病毒，或水痘病毒。
4.如权利要求3所述的表达盒，其中所述野田村病毒为β野田村病毒。
5.如权利要求3所述的表达盒，其中所述流感病毒为H5N1或H1N1。
6.如权利要求3所述的表达盒，其中所述病毒为EV71，并且所述病毒衣壳肽选自：VP0、VP1、VP3及其片段。
7.如权利要求3所述的表达盒，其中所述病毒为PCV2，并且所述病毒衣壳肽为由ORF-2编码的PCV2衣壳肽或其片段。
8.如权利要求3所述的表达盒，其中所述病毒为PRRSV，并且所述病毒衣壳肽为由ORF-7或其片段所编码。
9.如权利要求8所述的表达盒，其中所述由ORF-7编码的毒衣壳肽为核衣壳蛋白。
10.如权利要求3所述的表达盒，其中所述病毒为野田村病毒，并且所述病毒衣壳肽为野田村病毒的衣壳肽或其片段。
11.如权利要求3所述的表达盒，其中所述病毒为β野田村病毒，并且所述病毒衣壳肽为β野田村病毒的衣壳肽或其片段。
12.如权利要求1所述的表达盒，其中所述跨膜区为糖蛋白跨膜区。
13.如权利要求12所述的表达盒，其中所述糖蛋白跨膜区为血球凝集素跨膜区。
14.如权利要求13所述的表达盒，其中所述血球凝集素跨膜区选自：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16。
15.如权利要求13所述的表达盒，其中所述血球凝集素跨膜区选自H3N2、H5N1以及H3N2-HA。
16.如权利要求15所述的表达盒，其中所述H3N2跨膜区由SEQ ID NO：17所编码。
17.如权利要求1所述的表达盒，其中所述N端gp64信号肽由SEQ ID NO：14所编码。
18.如权利要求1所述的表达盒，其中所述ie1启动子为SEQ ID NO：18。
19.表达载体，其包含权利要求1-18中任一项所述的表达盒。
20.如权利要求19所述的表达载体，其中所述载体与蛋白表达系统相容，所述蛋白表达系统包含选自以下的宿主细胞：细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、鱼细胞、酵母菌细胞以及植物细胞。
21.如权利要求20所述的表达载体，其中所述宿主细胞为Sf9-II。
22.如权利要求19所述的表达载体，其中所述表达载体适用于病毒表达系统内。
23.如权利要求22所述的表达载体，其中所述病毒表达系统选自：腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒以及杆状病毒。
24.如权利要求23所述的表达载体，其中所述病毒表达系统为杆状病毒表达系统。
25.试剂盒，其包含权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体以及为此的包装材料。
26.分离的宿主细胞，其包含权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体。
27.免疫原性组合物，其包含权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒，或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体，连同药物可接受的载剂、佐剂、稀释剂或赋形剂中的一种或多种。
28.疫苗，其包含权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒、或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体，连同药物可接受的载剂、佐剂、稀释剂或赋形剂中的一种或多种。
29.用于治疗或预防个体的疾病的权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒，或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体，或权利要求27所述的免疫原性组合物，或权利要求28所述的疫苗，其中所述病毒衣壳肽由所述表达盒在所述个体中表达。
30.权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒，或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体，或权利要求27所述的免疫原性组合物，或权利要求28所述的疫苗在制造用于调节个体免疫反应的药物中的用途。
31.如权利要求30所述的用途；其中所述个体为哺乳动物，或鸟类，或甲壳类动物，或无颚鱼，或多骨鱼，或爬虫类动物或两栖动物。
32.用于治疗或预防个体的疾病的权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒，或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体，或权利要求27所述的免疫原性组合物，或权利要求28所述的疫苗，其中所述病毒衣壳肽由所述表达盒在所述个体中表达；其中所述个体为哺乳动物，或鸟类，或甲壳类动物，或无颚鱼，或多骨鱼，或爬虫类动物或两栖动物。
33.权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体或权利要求27所述的免疫原性组合物或权利要求28所述的疫苗，其适用于口服给药。
34.用于治疗或预防个体的疾病的权利要求1至18中任一权利要求所述的表达盒，或权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体，或权利要求27所述的免疫原性组合物，或权利要求28所述的疫苗，其中所述病毒衣壳肽由所述表达盒在所述个体中表达；其中所述疾病选自：手足口病、断奶后多系统消耗性症候群、猪生殖与呼吸症候群、疱疹、流感、癌症、肝炎、弓形虫症、梅毒、疟疾以及病毒性神经坏死病。
35.用于呈递、生产或展示病毒衣壳肽的方法，其中所述方法包括：
(a)将编码所述病毒衣壳肽的核酸插入权利要求19至24中任一权利要求所述的表达载体内；
(b)用所述表达载体转染至少一个宿主细胞；以及
(c)由所述表达载体表达所述病毒衣壳肽；
其中所述病毒衣壳肽被呈递或展示在杆状病毒的表面膜上。
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