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CN108055827B - 高成长肠病毒71型病毒株及其疫苗 - Google Patents

高成长肠病毒71型病毒株及其疫苗 Download PDF

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CN108055827B CN201680014996.9A CN201680014996A CN108055827B CN 108055827 B CN108055827 B CN 108055827B CN 201680014996 A CN201680014996 A CN 201680014996A CN 108055827 B CN108055827 B CN 108055827B
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Abstract

本发明是关于一种用于提高哺乳动物疫苗产量的驯化肠病毒71型(EV71)疫苗株。该EV71疫苗株包含至少一个经修饰的肠病毒蛋白，可自哺乳动物宿主细胞(如Vero细胞)快速增殖EV71病毒。本发明亦关于一种从驯化的EV71病毒疫苗株产生的疫苗以及该疫苗的制造方法。

Description

高成长肠病毒71型病毒株及其疫苗
技术领域
本发明是关于一种分离出的肠病毒71型(EV71)疫苗株，尤其关于一种肠病毒71型(EV71)B5基因型疫苗病毒株，该病毒株可在哺乳动物宿主细胞(如Vero细胞)快速成长，以及诱导交叉反应中和抗其他基因型的EV71病毒的抗体效价。
背景技术
肠病毒71型(EV71)与其他重要的人类病原体，如脊髓灰质炎病毒和鼻病毒，同属于小核糖核酸病毒科肠病毒属的正股RNA病毒。EV71最早在l969年分离自一患有神经系统疾病的美国病童，但依据近来的文献回顾研究显示，早在1963年EV71就已在荷兰出现(VanDer Saden等人，2009年)。该EV71基因组转译为一有单一开放读序框且接续有一多腺嘌呤序列段(poly A tract)的长聚蛋白，该单一多蛋白的5’及3’两端均有未转译区，且可被分成三个不同的基因组区块(P1、P2和P3)，其中P1基因可再分成VP1～VP4。
根据针对最易变VP1基因的亲源分析，EV71可分为3个主要基因型组(A、B和C)，其中包括11个基因型(A、
Figure GDA0003267456050000011
和
Figure GDA0003267456050000012
)(Solomon等，2010年)。自1997年以来，不同基因型的EV71已经在马来西亚、中国台湾、新加坡、文莱、越南、柬埔寨和中国等亚洲国家、地区引发威胁生命的疾病，并造成严重的神经系统并发症。
根据过去使用脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV，即小儿麻痹疫苗)的经验，依IPV的法规管制策略，开发EV71全病毒灭活疫苗被认为是可行的。在1975年保加利亚的疫情后，吾人在莫斯科依照IPV的类似制造方式制作了EV71全病毒候选灭活疫苗，并在1976年于保加利亚进行了评估，该EV71候选疫苗耐受性良好，且在1～4岁儿童身上产生免疫性。由于EV71没有进一步爆发，并未针对该保加利亚候选疫苗更进一步评估其临床疗效，亦未开发效力分析法(potency assay)以量化疫苗抗原(黄氏等人，2011年)。
在此背景下，EV71灭活疫苗的前景可期，事实上已有5个候选疫苗在进行临床试验评估。目前，共计有5个候选疫苗分别在中国(3个候选疫苗在第三阶段)、新加坡(1个候选疫苗在第一阶段)、中国台湾(1个候选疫苗在第一阶段)进行临床试验评估，如表1所列。
表1.临床试验评估中的EV71候选疫苗
Figure GDA0003267456050000021
5个候选疫苗中有4个使用Vero细胞(生产人类疫苗常用的一种细胞株)，但病毒效价的峰值只能达到107TCID50/ml左右(Chou et al.2012；Liang et al.2012)。整体来说，这5个候选疫苗在可用于疫苗生产的细胞中的生长情况并不佳(～107PFU/ml)。此外，这5个候选疫苗的基因型包括B2(新加坡)、B4(中国台湾)，和三个C4(中国)的病毒株，并非目前在中国台湾和东南亚流行的B5基因型。
发明内容
本发明是将B5基因型EV71疫苗病毒分离出来，并驯化成在使用无血清培养基的Vero细胞中可迅速生长。
因此，本发明一方面是关于一可在哺乳动物宿主细胞内快速成长且适合于增加哺乳动物宿主细胞的EV71疫苗产量的分离的B5基因型EV71疫苗病毒。
在某些实施例中，该分离的B5基因型EV71疫苗病毒包含一个以上的EV71基因，且该EV71基因可转译至少一经修饰的肠病毒蛋白以促进哺乳动物宿主细胞内的EV71病毒快速生长。较佳地，该肠病毒71型基因是分离及/或鉴定自一B5基因型的EV71病毒，如EV71B5-141。
在某些实施例中，该分离出的B5基因型的EV71疫苗病毒包含至少一个位于选自P1-VP4、P1-VP1、P3-3A及P3-3D蛋白的EV71蛋白编码序列变异。
另一个方面，本发明是关于一种EV71疫苗。该疫苗包含本发明的分离自B5基因型的EV71疫苗病毒株及药学上可接受的载体。
更进一步而言，本发明是关于一制备EV71疫苗的方法，亦提供可编码一修饰EV71B5蛋白的分离的核酸分子，及分离的修饰EV71 B5蛋白。本发明的其它面向、特征和优点在下面的说明、关于本发明的详细描述和权利要求中，是显而易见的。
附图说明
图1是使用无血清培养基(VP-SFM)在Vero细胞驯化高成长肠病毒71型的流程图；
图2是EV71 B5-141以及二Vero细胞驯化的病毒的蚀斑形态。图2A显示EV71 B5-141、4-2及6-5病毒在6孔培养盘的无血清培养基(VP-SFM)中Vero细胞上的蚀斑分析结果。图2B显示EV71 B5-141病毒、4-2及6-5在12孔培养盘的无血清培养基(VP-SFM)中Vero细胞上的免疫蚀斑分析结果。
具体实施方式
下列实施例将进一步说明本发明的其它特征和优点，但该等实施例仅为示例而用，并非对本发明的限制。
本文中的“修饰病毒株”是指病毒株在哺乳动物宿主细胞通过连续继代及/或亲本病毒的选择及其后代所获得的病毒株。在本发明的一个实施例中，修饰病毒株在哺乳动物宿主细胞的病毒产量较亲本病毒为高。
本文中的“肠病毒蛋白”是指由EV71病毒基因编码的任何多肽或蛋白质。
本文中的“EV71病毒基因”可以是任何自EV71病毒分离及/或其相同的基因，该EV71病毒基因可以是由一B5基因型EV71病毒分离及/或其相同的基因。EV71 B5-141病毒基因组的核苷酸序列全长列于SEQ ID NO.2。
本文中的“修饰肠病毒蛋白”是指将一未修饰或一参考肠病毒蛋白的一个以上的胺基酸序列进行修饰。举例而言，所述修饰包括插入、取代或删除一未修饰或一参考肠病毒蛋白的胺基酸残基。因此，该修饰肠病毒蛋白可以有一个以上的修饰胺基酸残基及/或在一未修饰或参考蛋白上有特定位置的密码子。
实验例
高成长的疫苗病毒在Vero细胞中的驯化
方法
细胞、培养基及病毒:依照标准程序(Wu等人，2001年、Huang等人，2010年)在人横纹肌肉瘤(RD)细胞和非洲绿猴肾(Vero)细胞中培养肠病毒71型。
病毒学测定：病毒感染性效价测试是以50％的组织培养感染剂量(TCID50)观测细胞病变效应(CPE)，并测定蚀斑形成单位(PFU)进行蚀斑分析(Huang等人，2010年)。亦包含一预先设定容许范围的正对照组以进行TCID50及蚀斑分析。
病毒在细胞培养中的生长曲线测定：在6孔培养盘中培养EV71病毒，并在感染后的第1至6日取其上清液以测定病毒感染效价。在含有血清的培养基中进行微载体细胞培养系统，以评估使用Vero细胞驯化的EV71病毒株作为疫苗种子病毒的效果。依据制造商的使用指南，将Cytodex 1微载体(GE Healthcare,美国)进行水合、高压灭菌等预处理。Vero细胞在不同的培养条件下的生长曲线是以100毫升旋转瓶(使用体积为50毫升)测试，并对微载体进行取样以计算每日的细胞密度。当细胞在微载体上长满时，加入EV71病毒以感染细胞。
病毒颗粒的纯化：疫苗抗原是以超速离心来纯化，并使用SDS-PAGE，Western Blot和电子显微镜(Chia等人,2014年)来评估疫苗抗原的纯度。
家兔的免疫原性研究：近来我们已开发了家兔模式，该模式可引发类似于EV71型感染幼儿的交叉反应中和抗体的情境(Chia等人，2014年)。家兔模式被用来评估Vero细胞驯化的疫苗病毒的免疫原性。
血清分析：使用实验室方法，按照标准程序(Huang等人，2010年)测定EV71血清中和抗体效价。二倍稀释的血清(1：8～1：512)，以及含有100TCID50EV71病毒株的病毒标准溶液，在一96微孔培养盘中以横纹肌肉瘤细胞培养。在
Figure GDA0003267456050000041
天的培养后，在与倒置显微镜相连的监视器中可观察到会导致细胞病变效应。中和效价在最高稀释度时显示可导致细胞病变效应减少50％。每个测试样品的细胞对照、血清对照和病毒反滴定均同时进行。起始稀释倍数为1：8，而血清阳性的截断值设定为8。
实验结果
如图1所示，B5-141病毒是在2008年从20个月大的疱疹性咽峡炎患者的喉咙拭子分离而得，该亲本B5-141病毒不会在Vero细胞导致明显细胞病变效应(CPE)，也不会在Vero细胞中形成明确的蚀斑。在Vero细胞23次继代培养后，驯化的B5-141可以形成清晰的蚀斑，其后择定其中两个蚀斑(B5-141-4和B5-141-6)，分别为在Vero细胞中的第24继代(B5-141-4)和第25继代(B5-141-6)。
再经过一次蚀斑选择及3次继代培养后，进一步选择二病毒株(B5-141-4-2和B5-141-6-5)，以产生病毒原液(图1)。与亲本B5-141病毒相较，B5-141-4-2和B5-141-6-5病毒可以形成非常明确的蚀斑，病毒效价达到高于108PFU/ml(图2)(表2)。
表2.亲本与Vero细胞驯化的B5-141病毒原液在Vero细胞中扩增并测得的病毒效价
Figure GDA0003267456050000051
该二病毒原液的增殖效率是使用不同感染复数(MOI)对在24孔培养盘中的Vero细胞进行评估。如表3所示，B5-141-6-5病毒的峰病毒效价在MOI 0.001和0.0001下皆超过108TCID50/ml。
表3.在不同感染复数(MOI)下，24孔培养盘中Vero细胞驯化的病毒B5-141在Vero细胞增殖的每日病毒效价
Figure GDA0003267456050000052
B5-141-6-5病毒的增殖效率是进一步使用搭配旋转瓶的微载体-无血清Vero细胞培养系统进行评估。如表4所示，病毒效价可能在进行三次后平均值达到108TCID50/ml，印证了B5-141-6-5病毒的商业化潜力。
表4.以搭配旋转瓶的微载体-无血清Vero细胞培养系统生产Vero细胞驯化的病毒B5-141-6-5的情形
Figure GDA0003267456050000053
Figure GDA0003267456050000061
EV71 B5-141-6-5疫苗抗原在家兔的免疫原性
通过离心纯化EV71 B5-141-6-5病毒颗粒，再以超速离心分离完整的与空的两种病毒颗粒后，对完整病毒颗粒进行B5-141-6-5疫苗抗原在家兔的免疫原性评估。两组家兔(每组两只)在第0天及第14天使用两种剂量肌内注射免疫疫苗(总蛋白含量0.05和0.25微克)并使用明矾作为佐剂，收集第一次接种(第0天)、第一次接种后14日(第14日)及第二次接种后14日(第28日)的血清以评估中和抗体效价。
如表5所示，在第二次接种后14日(第28日)，两组均可测得中和抗体效价，表示该疫苗抗原具免疫原性。
表5.以明矾作为佐剂免疫注射EV71 B5-141-6-5疫苗抗原的家兔的中和抗体效价
Figure GDA0003267456050000062
Vero细胞驯化的病毒的序列变异
为了确认Vero细胞适应过程中发生的基因突变，针对B5-141、B5-141-4-2和B5-141-6-5进行完整的基因组测序和分析。以商业试剂盒(中国台湾桃园Geneaid)萃取病毒RNA，所萃取的病毒RNA以RT-PCR法(Promega，Madison,WI)进行扩增。倘有需要，可提供本研究使用的寡核苷酸引物序列供参。扩增的DNA则使用ABI 3730XL DNA分析仪(AppliedBiosystem Inc.,Foster City,CA)进行定序。
与亲本B5-141病毒比较(EV71 B5-141的胺基酸长链及NT序列的编码分别在SEQID No.1和2中列出)，在B5-141-4-2和B5-141-6-5病毒检测出5个和4个的核苷酸变化(表6)。因此，本发明分离的B5基因型EV71疫苗病毒包含至少一个位于选自P1-VP4(SEQ IDNo.4)、P1-VP1(SEQ ID No.6)、P3-3A(SEQ ID No.8)及P3-3D(SEQ ID No.10)基因的基因变异。
表6.亲本B5-141及Vero细胞驯化的病毒的基因变异
Figure GDA0003267456050000071
*依5511-SIN-00编号(存取号DQ341364).
表7.序列表的序列摘要
SEQ ID No. 来源 识别位置
1 亲本EV71 B5-141病毒 CDS 1..2193全链
2 亲本EV71 B5-141病毒 1..7412完整基因组
3 P1-VP4蛋白 CDS 1..69
4 P1-VP4基因片段 EV71 B5-141的748..954基因组
5 P1-VP1蛋白 CDS 566..862
6 P1-VP1基因 EV71 B5-141的2443..3333基因组
7 P3-3A蛋白 CDS 1441..1526
8 P3-3A基因 EV71 B5-141的5068..5325基因组
9 P3-3D蛋白 CDS 1732..2193
10 P3-3D基因 EV71 B5-141的5941..7326基因组
本发明是关于一种用于提高哺乳动物疫苗产量的驯化肠病毒71型(EV71)疫苗株。该EV71疫苗株包含至少一个经修饰的肠病毒蛋白，可自哺乳动物宿主细胞(如Vero细胞)快速增殖EV71病毒。本发明亦关于一种从驯化的EV71病毒疫苗株产生的疫苗以及该疫苗的制造方法。
综上所述，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此而限制本发明的专利保护范围，故举凡本发明说明书及附图所作等效变化等，皆应包括于本发明的保护范围内。
Figure IDA0001508324920000011
Figure IDA0001508324920000021
Figure IDA0001508324920000031
Figure IDA0001508324920000041
Figure IDA0001508324920000051
Figure IDA0001508324920000061
Figure IDA0001508324920000071
Figure IDA0001508324920000081
Figure IDA0001508324920000091
Figure IDA0001508324920000101
Figure IDA0001508324920000111
Figure IDA0001508324920000121
Figure IDA0001508324920000131
Figure IDA0001508324920000141
Figure IDA0001508324920000151
Figure IDA0001508324920000161
Figure IDA0001508324920000171
Figure IDA0001508324920000181

Claims (4)

1.一种分离的B5基因型EV71疫苗病毒，包含至少一个编码一个以上的修饰肠病毒蛋白的EV71基因，其特征在于，其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒可在哺乳动物宿主细胞快速生长，并适用于增加EV71疫苗在哺乳动物宿主细胞的产量；其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒包含：
(a)在由SEQ ID No.1所示的序列中Thr7被取代为Ala的修饰肠病毒P1-VP4蛋白；
(b)在由SEQ ID No.1所示的序列中Thr802被取代为Asn的修饰肠病毒P1-VP1蛋白；以及
(c)在由SEQ ID No.1所示的序列中Pro811被取代为Ala的修饰肠病毒P1-VP1蛋白。
2.一种分离的B5基因型EV71疫苗病毒，包含至少一个编码一个以上的修饰肠病毒蛋白的EV71基因，其特征在于，其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒可在哺乳动物宿主细胞快速生长，并适用于增加EV71疫苗在哺乳动物宿主细胞的产量，其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒包含：
(a)在由SEQ ID No.2所示的序列中核苷酸第766bp处的A被取代为G的修饰肠病毒P1-VP4基因；
(b)在由SEQ ID No.2所示的序列中核苷酸第3152bp处的C被取代为A的修饰肠病毒P1-VP1基因；
(c)在由SEQ ID No.2所示的序列中核苷酸第3178bp处的C被取代为G的修饰肠病毒P1-VP1基因；
(d)在由SEQ ID No.2所示的序列中核苷酸第5097bp处的C被取代为T的修饰肠病毒P3-3A基因；以及
(e)在由SEQ ID No.2所示的序列中核苷酸第7092bp处的A被取代为G的修饰肠病毒P3-3D基因。
3.如权利要求1所述的分离的B5基因型EV71疫苗病毒，其特征在于，其被驯化为可在无血清培养基上的Vero细胞中快速生长。
4.如权利要求2所述的分离的B5基因型EV71疫苗病毒，其特征在于，其被驯化为可在无血清培养基上的Vero细胞中快速生长。
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