CN103555682A - 葡萄糖氧化酶的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶的分离纯化方法。本发明要解决的技术问题是提供一种高效分离纯化葡萄糖氧化酶的方法。本发明的技术方案是葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，包括如下步骤：a、粗酶液的制备；b、DEAE-Sepharose离子交换层析；c、Superdex-200凝胶过滤层析。本发明方法可高效率的分离纯化葡萄糖氧化酶。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶的分离纯化方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶（GOD）在分离纯化中，回收率不高，影响产品产量；比活力不高影响产品的质量。
葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、无副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，已广泛应用于食品、饲料、医药等行业中。
葡萄糖氧化酶的纯度一直是影响其质量的重要因素，杂质的含量和种类严重制约了葡萄糖氧化酶的应用领域和应用效果。同时高纯度的葡萄糖氧化酶也为酶学性质的研究及机理提供了物质基础。王志新等人通过：黑曲霉A9发酵培养—菌丝体破碎—粗酶液制备—超滤—硫酸铵盐析—Sephadex G-25脱盐—DEAE-纤维素离子交换层析-Sephadex G-100分子筛层析的纯化方案使葡萄糖氧化酶的比活力由初始发酵液的88U/mg提高到1779U/mg，其比活值提高了将近20倍，达到了电泳纯[1]。中国科学院的周亚凤等人通过离心分离、透析除盐、SepharoseTMFast Flow离子交换层析盐梯度洗脱的方法纯化了重组酵母的葡萄糖氧化酶，使其比活值达到426.63U/mg，是商品黑曲霉的1.6倍[2]。但是该酶的纯化效率不高，回收率较低，这使得纯化葡萄糖氧化酶的成本增加，因此该酶的价格较高，使其使用受到限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效分离纯化葡萄糖氧化酶的方法。
本发明的技术方案是葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，包括如下步骤：
a、粗酶液的制备：将菌丝研磨，抽提，盐析，得粗酶液；所述的菌丝为收集的产葡萄糖氧化酶的丝状真菌的菌丝；
b、DEAE-Sepharose离子交换层析：用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱，将步骤a得到的粗酶液上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥；
c、Superdex-200凝胶过滤层析：用1个床体积的0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex-200凝胶过滤层析柱，将步骤b得到的样品溶解后上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD纯品。
其中，步骤a中研磨是指将菌丝体置于研钵中，加入液氮，对菌体进行研磨。
其中，步骤a中抽提是指研磨后加入预冷的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液，按菌丝质量︰缓冲液体积为1︰3，4℃静置30min；抽提完成后4℃12000r/min离心30min，取上清液；所述1︰3的比值单位为g︰mL。
其中，步骤a中饱和包含以下操作：向抽提后的上清液中加入NH4SO4至40%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，收集上清液；再加入NH4SO4至60%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀，用上清液体积1/10的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，透析后得粗酶液。
其中，步骤b中上样量为10mL，洗脱流速为1.0mL/min，洗脱后每管收集10mL。
其中，步骤c中洗脱流速0.3～0.5mL/min，每管收集3～5mL。
本发明步骤b中冷冻干燥是为了浓缩酶液，使其活力更高，利于增加凝胶层析上样量，增加分离效率。
本发明的有益效果：本发明分离得到葡萄糖氧化酶纯品，该酶的比活力为28930.6U/mg，回收率为39.5%，纯化倍数为393.6倍。本实验流程简单，便于操作，且生产成本较低，可用于大规模生产，具有较好的经济发展前景。这为该酶的高效分离纯化提供了技术支持。
附图说明
图1黑曲霉H1-9b所产GOD的DEAE-Sepharose离子交换层析曲线
——所示为蛋白含量 
所示为酶活力 －－－－－所示为NaCl浓度
图2黑曲霉H1-9b所产GOD的Superdex-200凝胶过滤层析曲线
——所示为蛋白含量
所示为酶活力
图3黑曲霉H1-9b所产GOD的SDS-PAGE电泳图谱
M.分子质量标准品；1.猪肌球蛋白200.0kD；2.大肠杆菌β-半乳糖苷酶116.0kD；3.兔磷酸酶B97.2kD；4.牛血清蛋白66.4kD；5.鸡卵清蛋白44.2kD；6.牛碳酸酐酶29.0kD；7.大豆胰蛋白酶抑制剂20.0kD；S1.黑曲霉H1-9b所产GOD。
具体实施方式
本发明的技术方案是葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，包括如下步骤：
a、粗酶液的制备：将菌丝研磨，抽提，盐析，得粗酶液；所述的菌丝为收集的产葡萄糖氧化酶的丝状真菌的菌丝；
b、DEAE-Sepharose离子交换层析：用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱，将步骤a得到的粗酶液上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥；
c、Superdex-200凝胶过滤层析：用1个床体积的0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex-200凝胶过滤层析柱，将步骤b得到的样品溶解后上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD纯品。
其中，步骤a中研磨是指将菌丝体置于研钵中，加入液氮，对菌体进行研磨。
其中，步骤a中抽提是指研磨后加入预冷的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液，按菌丝质量︰缓冲液体积为1︰3，4℃静置30min；抽提完成后4℃12000r/min离心30min，取上清液；所述1︰3的比值单位为g︰mL。
其中，步骤a中饱和包含以下操作：向抽提后的上清液中加入NH4SO4至40%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，收集上清液；再加入NH4SO4至60%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀，用上清液体积1/10的0.05mol/LpH7.1Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，透析后得粗酶液。
其中，步骤b中上样量为10mL，洗脱流速为1.0mL/min，洗脱后每管收集10mL。
其中，步骤c中洗脱流速0.3～0.5mL/min，每管收集3～5mL。
本发明中，由于用液氮处理菌株，破碎程度增加，材料中葡萄糖氧化酶提取效率更高，减少了酶的损失。在巧妙优化和使用离子交换层析后，酶比活力呈大幅度上升，活力回收率大幅度增加。
DEAE-Sepharose离子交换层析上样量与样品中蛋白质含量、溶液pH值、溶液离子强度、交换剂的性能等多种因素密切相关，这是影响酶分离纯化的主要因素之一。上样量太多，回收率不高，上样量太少，分离效率不高。收集量与分辨率、纯化效果密切相关，收集量过大会影响比活力。流速与分离效果密切相关，速度太快交换不好，峰变宽，不能与杂质分开，速度太慢，样品扩散，影响分离结果。因此上样量、流速、收集量是离子交换层析分离纯化中最关键的因素之一。
通常凝胶层析流速比离子交换速度更慢，否则分离效果不好，分辨率不高，影响回收率。
实施例1采用本发明方法分离纯化GOD
1、粗酶液的制备
将菌丝体（黑曲霉H1-9b，Aspergillus niger H1-9b）置于研钵中，加入适量液氮，对菌体进行研磨；充分研磨后按1︰3(菌丝质量︰缓冲液体积m/V；比值单位为g/mL)加入预冷的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液，4℃抽提30min。抽提完成后4℃、12000r/min离心30min，取上清液。再按1︰1的比例加入0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液，4℃抽提30min。重复离心，取上清液。再重复二一次抽提。合并三次上清液。向其中加入NH4SO4至40%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，收集上清液，再加入NH4SO4至60%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，沉淀用上清液1/10体积的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液溶解溶解，透析后得粗酶液。
2、DEAE-Sepharose离子交换层析
用300mL0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱（26mm×150mm），取10mL粗酶液上样，用0～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速1.0mL/min，每管收集10mL，层析完成后收集GOD活性管并测定蛋白含量，透析脱盐，冷冻干燥后备用。黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶经过DEAE-Sepharose离子交换层析后，分别测定蛋白质含量和酶活力，结果见图1。其中酶活力主要集中在28～30管，但蛋白峰主要集中在15管左右。可以看出，离子交换层析已经分离出大部分的杂蛋白，效果较好。收集活性峰透析过夜，冷冻干燥后进行Superdex-200凝胶过滤层析
3、Superdex-200凝胶过滤层析
用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex-200凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的样品加水稀释至4mL上样，用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0.3mL/min，每管收集3mL，层析完成后收集GOD活性管并测定蛋白含量，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD纯品。洗脱图谱见图2。GOD活性峰集中在23～24管之间，分别收集后透析除盐，冷冻干燥，得到GOD纯品。
计算各个步骤中的总蛋白含量、总酶活力，比活力、回收率及纯化倍数，整个纯化过程见表1。经过两次柱层析，该酶纯化倍数达到393.6倍，回收率39.5%。
纯化倍数是各步骤所得样品比活力与粗酶液比活力的比值，粗酶液的纯化倍数为1。回收率各步骤所得酶的总活力与第一步总活力之比，粗酶液回收率为100%。
总蛋白量指单位单位体积的蛋白质量（mg/mL）乘以体积(mL)；总活力为单位体积的酶活力(U/mL)乘以总体积（mL）。比活力指总酶活力除以总蛋白量（U/mg蛋白质）。
先测定每毫升的蛋白质含量和每毫升的酶活力，再乘以总体就得到了总蛋白质量和总活力，总活力除以总蛋白质量就得到了比活力。
由Superdex-200凝胶过滤层析纯化的黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶经SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝R-250染色，呈现出单一条带，说明该酶已经达到电泳纯，结果见图3。
表1 黑曲霉H1-9b所产GOD纯化结果
参考文献
[1]王志新，李宁，韩军，等。黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的提取纯化[J]。中国食品学报，2007，7(1)：64-68。
[2]周亚凤，张先恩，刘虹，等。黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达[J]。生物工程学报，2001，17(4)：400-405。
[3]苏茉，高压鹏，梁建荣，等。黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分离纯化及部分性质研究[J]。食品科学，2011，32（3）：181-185。
Claims (6)
1.葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、粗酶液的制备：将菌丝研磨，抽提，盐析，得粗酶液；所述的菌丝为收集的产葡萄糖氧化酶的丝状真菌的菌丝；
b、DEAE-Sepharose离子交换层析：用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱，将步骤a得到的粗酶液上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥；
c、Superdex-200凝胶过滤层析：用1个床体积的0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex-200凝胶过滤层析柱，将步骤b得到的样品溶解后上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD纯品。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中研磨是指将菌丝体置于研钵中，加入液氮，对菌体进行研磨。
3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中抽提是指研磨后加入预冷的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液，按菌丝质量︰缓冲液体积为1︰3，4℃静置30min；抽提完成后4℃12000r/min离心30min，取上清液；所述1︰3的比值单位为g︰mL。
4.根据权利要求1～3任一项所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中盐析包含以下操作：向抽提后的上清液中加入NH4SO4至40%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，收集上清液；再加入NH4SO4至60%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀，用上清液体积1/10的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，透析后得粗酶液。
5.根据权利要求1～4任一项所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中上样量为10mL，洗脱流速为1.0mL/min，洗脱后每管收集10mL。
6.根据权利要求1～5任一项所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中洗脱流速0.3～0.5mL/min，每管收集3～5mL。凝胶层析分离效果与流速关系最为密切。
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