CN103554256A

CN103554256A - 一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN103554256A
Application number: CN201310561370.8A
Authority: CN
Inventors: 赖增祖; 叶欣; 徐健; 杨奎东
Original assignee: Ai Ke Bio Tech Ltd Ningbo
Current assignee: Hunan Jiefei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-11-12
Filing date: 2013-11-12
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-11-12
Also published as: CN103554256B

Abstract

本发明公开了一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。上述抗人糖化白蛋白单克隆抗体为IgG1亚型。本发明还公开了编码上述抗人糖化白蛋白单克隆抗体的基因，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3。上述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体可用于人糖化白蛋白的测定。

Description

一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体、单克隆抗体可变区基因及其用途。

背景技术

糖尿病作为一种慢性疾病，世界卫生组织2011年九月的报告指出全世界有3.46亿人患有糖尿病，而死于高血糖引起的后果人数在2004年估计就有340万。最新流行病学调查显示我国目前全国有糖尿病患者9240多万人。全国糖尿病患病率9.7%，我国已经成为全球糖尿病患病率增长最快的国家之一，到2020印度成为世界上糖尿病人数最多的国家。糖尿病作为一种慢性疾病，血液血糖过高，可以引起许多并发症。血糖监测是糖尿病日常诊治工作中非常重要的一个环节，血糖的有效检测可以有效的血糖控制从而延缓糖尿病急、慢性并发症的发生和发展。血糖的有效检测对控制血糖的浓度有着重要意义。糖化血清白蛋白（glycated albumin,GA）是血液中的葡萄糖与白蛋白分子发生非酶促糖化反应的产物，其约占血浆中糖化蛋白总量的80%，GA蛋白的量和血糖水平有正相关。因白蛋白在体内比较稳定，其半衰期短，约17-19天，故糖化血清白蛋白测定可有效反映体内过去2～3周内平均血糖水平。对于评价糖尿病患者近期血糖控制情况及反映短期内血糖水平的变化具有较高的临床价值。目前GA蛋白的测定方法主要有（1）高压液相离子交换法（HPLC法）。HPLC法测定GA可准确检测患者短期内血糖控制的总体水平，但由于其代价高昂，处理样本量小，不适宜临床常规开展而未得到广泛应用。（2）亲和色谱法和（3）比色法以及（4）免疫化学法由于存在精确性差，检测时间长等缺点，也没有能够推广。（5）近年由日本开发研制的应用液态试剂的酶法检测GA（GA-L），是在固体酶法（2002年由美国研制的一种特异性较高的糖化血清白蛋白测定方法）测定糖化血清蛋白的基础上开发出液态试剂。其减少了溶解处理，提高了操作性。同时加用糖化氨基酸以去除内源性糖化氨基酸对检测结果的影响，并利用对氧化性白蛋白特异性更高的溴甲酚紫替代原来的溴甲酚绿，减少了球蛋白对测定结果的影响，因此结果的精确性有一定提高。GA-L检测具有相对良好的稀释线性、日内重复性和日间稳定性，并与HPLC检测法有一定的一致性（r=0.879）。（6）免疫浊度法，可以快速准确特异测定血浆中糖化白蛋白的量。人糖化白蛋白和抗人糖化白蛋白抗体结合而出现凝集。从而阻碍光线透过，使透射光减少，其减少程度与人糖化白蛋白量成正相关。免疫浊度的的特异性、灵敏度及准确性取决于高度特异性和高亲和力的抗人糖化白蛋白单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种高度特异性的抗人糖化白蛋白单克隆抗体及其在糖化白蛋白检测中的应用。本发明所提供的抗人糖化白蛋白单克隆抗体是利用单克隆抗体杂交瘤技术获得。将人糖化白蛋白免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备单细胞悬液，将其与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。该抗体敏度高、稳定性好，可大量制备，以及广泛用于检测人糖化白蛋白各种检测试剂盒。

本发明技术方案具体如下：

一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

上述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体为IgG1亚型。

本发明还提供了编码权利要求1所述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体的基因，其特征在于编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了上述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）将完全福氏佐剂与人糖化白蛋白溶液制成乳剂免疫Balb/c小鼠，分离脾脏细胞，将分离的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞以50%PEG介导融合，用酶联免疫法筛选阳性克隆，选取阳性最强的杂交瘤细胞；

（2）将阳性杂交瘤细胞腹腔注射乳成年Balb/e小鼠制备抗人糖化白蛋白单克隆抗体，2-4周后，吸取小鼠腹水，离心后吸取上请，用硫酸胺沉淀后，选择蛋白A或蛋白G亲和层析柱进行纯化，得到纯化的抗人糖化白蛋白单克隆抗体。所得的抗人糖化白蛋白单克隆抗体的亲和力很高。抗体的效价大约为1x10⁵，抗体的亲和力大约为1x10^-8M。

抗体的纯化用蛋白G亲和层析柱进行，具体步骤如下：将蛋白G亲和层析柱用PBSpH7.2缓冲液洗柱，然后将经硫酸胺沉淀分离的到的抗体上样，当这些抗体溶液都进入柱体后，用PBS缓冲液洗柱,将不能和蛋白G结合的其它物质洗脱掉，和蛋白G结合的单克隆抗体用甘氨酸溶液pH2.0洗脱下来，然后用Tris-Hcl pH9.0缓冲液中和，将洗脱下来的抗体用PBS pH7.2缓冲液透析。

本发明还提供了上述抗人糖化白蛋白单克隆抗体在糖化白蛋白测定中的应用。

本发明还提供了一种糖化白蛋白的ELISA检测方法，选用本发明所述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体作为检测抗体进行测定。

本发明所用的术语“抗体”是有相同结构特征的约150000Da的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区（VL），另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对，抗体的恒定区是本领域技术人员熟知的。根据脊椎动物抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以分为5类IgA,IgD,IgE,IgG,IgM，其中一些还可以进一步分为亚类，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。

编码本发明抗人糖化白蛋白单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规技术手段得知，例如可以用PCR扩增法得到编码该抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。

杂交瘤细胞制备和培养以及抗人糖化白蛋白单克隆抗体的分离纯化为本领域技术人员熟知的技术手段。

上述抗人糖化白蛋白单克隆抗体可以用常规手段来鉴定，例如使用酶联免疫吸附测定抗体的结合特异性等等。

附图说明

图1为酶联免疫法考察本发明所述抗人糖化白蛋白单克隆抗体的特异性。

图2为抑制酶联免疫法考察本发明所述抗人糖化白蛋白单克隆抗体的特异性。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1抗人糖化白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的制备

将完全福氏佐剂与人糖化白蛋白溶液按1:1的比例混合制成乳剂。腹腔注射免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠（每只小鼠100微升，含10微克人糖化血清白蛋白）。两周后以不完全福氏佐剂腹腔注射10微克糖化血清白蛋白加强免疫小鼠。两周后取血测定抗体的效价。经尾静脉注射10微克糖化血清白蛋白加强免疫小鼠，四天后，将小鼠处死，分离脾脏细胞，将分离的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞以50%PEG介导融合。

实施例2抗人糖化白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选

将100微升溶于PBS缓冲液浓度为2微克每毫升的人糖化血清白蛋白加到96孔酶标板的小孔中，4度放置一个晚上。第二天将人糖化血清白蛋白包被的96孔酶标板用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗两次。然后用封闭液（1%BSA/洗液）室温封闭酶标板两个小时。将封闭液倒掉，然后将实施例1得到的杂交瘤培养液分别取100微升细胞培养上清液加到96孔板，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗板两次，然后加入100微升碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育1小时，用洗液洗两次，加入100微升显色反应底物（4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物），室温显色30分钟，在波长为410纳米读光吸收值。挑取光吸收值最高的克隆做进一步的亚克隆试验。

实施例3杂交瘤细胞的克隆化培养

单克隆杂交瘤细胞可由有限稀释法培养获得。具体方法如下，将实施例2得到的最强阳性的杂交瘤细胞计数，经过系列的稀释制备浓度为1个细胞/200微升的单细胞悬液。将200微升的单细胞悬液加到96孔细胞培养板的小孔中（1细胞/0.2ml/孔）。在37度，5%二氧化碳的细胞培养箱培养。约10天左右选择单克隆孔，检测抗体，如阳性者，再克隆，一般克隆3次。选择抗体阳性强、细胞生长好的克隆，进行扩大培养，建系，保存。

实施例4抗糖化白蛋白单克隆抗体的制备和纯化

腹腔注射成年Balb/e小鼠0.5ml液体石蜡，2周后腹腔注射实施例3得到的生长状态良好的抗糖化血清白蛋白单克隆杂交瘤细胞株（10⁶个细胞/小鼠），2-4周左右小鼠腹部可见明显膨大，用注射器吸取腹水。离心后吸取上请，用硫酸接沉淀后，再用蛋白A或蛋白G亲合层析柱继续纯化。

实施例5抗人糖化白蛋白单克隆抗体的特异性测定

（1）酶联免疫法测定抗人糖化白蛋白单克隆抗体的特异性

分别将100微升溶于PBS缓冲液浓度为2微克每毫升的人糖化白蛋白、非糖化白蛋白和糖化血红蛋白加到96孔酶标板的小孔中，4度放置一个晚上。第二天将包被的96孔酶标板用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗两次。然后用封闭液（1%BSA/洗液）室温封闭酶标板两个小时。将封闭液倒掉，然后分别加入0.1ml，浓度为1微克每毫升的抗人糖化白蛋白单克隆抗体，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗板两次，然后加入100微升碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育1小时，用洗液洗两次，加入100微升显色反应底物（4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物），室温显色30分钟，在波长为410纳米读光吸收值。实验结果见图1，结果表明抗人糖化白蛋白单克隆抗体能够特异性结合糖化白蛋白，而对非糖化白蛋白和糖化血红蛋白均不识别。

（2）抑制酶联免疫法测定抗人糖化白蛋白单克隆抗体特异性

将100微升溶于PBS缓冲液浓度为2微克每毫升糖化血清白蛋白加到96孔酶标板的小孔中，4度放置一个晚上。第二天将糖化血清白蛋白包被的96孔酶标板用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗两次。然后用封闭液（1%BSA/洗液）室温封闭酶标板两个小时。将封闭液倒掉，然后将50微升抗人糖化白蛋白单克隆抗体（1微克每毫升）和50微升不同浓度的糖化血清白蛋白或者非糖化血清白蛋白加到96孔板，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗板两次，然后加入100微升碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育1小时，用洗液洗两次，加入100微升显色反应底物，室温显色30分钟，在波长为410纳米读光吸收值。实验结果见图2，结果显示只有糖人化白蛋白可以抑制抗人糖化白蛋白单克隆抗体对酶标板上人糖化白蛋白的结合，而非糖化白蛋白和糖化血红蛋白均无抑制作用。再次证明本发明所述抗人糖化白蛋白单克隆抗体能够特异结合糖化白蛋白。

实施例6抗体的鉴定

1.抗亚型的鉴定：

将100微升溶于PBS缓冲液浓度为2微克每毫升的人糖化血清白蛋白加到96孔酶标板的小孔中，4度放置一个晚上。第二天将人糖化血清白蛋白包被的96孔酶标板用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗两次。然后用封闭液（1%BSA/洗液）室温封闭酶标板两个小时。将封闭液倒掉，然后将浓度为1微克每毫升的抗人糖化白蛋白单克隆抗体100微升96孔板，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗板两次，然后加入100微升碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，和IgG4抗体分别加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育1小时，用洗液洗两次，加入100微升显色反应底物（4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物），室温显色30分钟，在波长为410纳米读光吸收值，结果发现只有碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG1抗体显示阳性，说明该抗体属于IgG1亚型。

2.抗体效价的测定：

将100微升溶于PBS缓冲液浓度为2微克每毫升的人糖化血清白蛋白加到96孔酶标板的小孔中，4度放置一个晚上。第二天将人糖化血清白蛋白包被的96孔酶标板用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗两次。然后用封闭液（1%BSA/洗液）室温封闭酶标板两个小时。将封闭液倒掉。将抗体进行1:10的系列稀释，将100微升各个稀释度的抗体加到96孔板，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗板两次，然后加入100微升碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育1小时，用洗液洗两次，加入100微升显色反应底物（4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物），室温显色30分钟，在波长为410纳米读光吸收值。最高的稀释倍数即为抗体的效价。实验结果表明本发明所述抗人糖化白蛋白单克隆抗体的效价为1x10⁵。

3.亲和力的测定：

用2微克每毫升糖化血清白蛋白包被96孔酶标板。然后用封闭液（1%BSA/洗液）室温封闭酶标板两个小时。先将抗人糖化血清白蛋白抗体与不同浓度的糖化血清白蛋白孵育，然后将该孵育液加到糖化血清白蛋白包被96孔酶标板中，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液（含有0.05%Tween的PBS缓冲液）洗板两次，然后加入100微升碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育1小时，用洗液洗两次，加入100微升显色反应底物，室温显色30分钟，在波长为410纳米读光吸收值。抗体的亲和力用公式A₀/(A₀-A)=1+K/a₀计算，A₀为没有糖化血清白蛋白为0时的OD值，A为糖化血清白蛋白a₀时的OD值，K为亲和常数的倒数。试验结果表明本发明所述抗人糖化白蛋白单克隆抗体的亲和力大约为1x10^-8M。

实施例7抗人糖化白蛋白单克隆抗体的序列分析

本发明所述抗人糖化白蛋白单克隆抗体的可变区基因通过RT-PCR技术克隆获得。简单的说，先用Trizol试剂从杂交瘤细胞提取细胞总RNA。然后按照Lifetechnologies公司cDNA合成试剂盒Invitrogen

II说明书进行cDNA合成。再用PCR进行重链可变区和轻链可变区基因的克隆。PCR反应体系的组分为cDNA1μl,10×PCR缓冲液5μl,5′端引物及3′端引物各1μl，dNTP(25pM)1μl,25mM氯化镁1μl,水39μl。反应条件为94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸2min,共25个循环。PCR产物用电泳进行鉴定。经鉴定的PCR产物纯化后，进行DNA测序。

重链可变区5′端引物

引物1:GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT SEQ ID NO:5

引物2:GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT SEQ ID NO:6

引物3:GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT SEQ ID NO:7

重链可变区3′端引物：

GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGMRGAGACDGTGA SEQ ID NO:8

轻链可变区5′端引物

引物1:GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT SEQ ID NO:9

引物2:GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG SEQ ID NO:10

引物3:GGGGATATCCACCATGGAGHCACAKHCTCAGGTCTTTRTA SEQ ID NO:11

引物4:GGGGATATCCACCATGKCCCCHRCTCAGYTYCTKGT SEQ ID NO:12

引物5:GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG SEQ ID NO:13

轻链可变区3′端引物

GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTGCGTTTKATTTCCARCTT SEQ ID NO:14

结果显示,本发明所述抗糖化白蛋白单克隆抗体的基因，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。根据上述核苷酸序列推导出重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

Claims

1.一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的抗糖化白蛋白单克隆抗体，所述的抗糖化白蛋白单克隆抗体为IgG1亚型。

3.编码权利要求1所述的抗糖化白蛋白单克隆抗体的基因，其特征在于编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.权利要求1或2所述的抗糖化白蛋白单克隆抗体在人糖化白蛋白测定中的应用。

5.一种糖化白蛋白的测定方法，采用ELISA检测方法，其特征在于选用权利要求1或2所述的抗糖化白蛋白单克隆抗体作为检测抗体进行测定。