CN103533932A - 用于治疗的(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(化合物A) - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗目的的(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，药物组合物以及它们在治疗中的用途，特别是用于肿瘤病症的预防和治疗。

Description

用于治疗的(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(化合物A)

本发明涉及用于治疗目的的(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(=化合物A)，包含化合物A的药物组合物以及它们在治疗中的用途，特别是用于肿瘤病症的预防和/或治疗。

乙酰基-CoA羧化酶(ACC)在细胞脂肪酸稳态中起关键作用。ACC是包含生物素的酶，其以ATP依赖性方式催化乙酰基-CoA羧化为丙二酰基-CoA(Kim,1997;Harwood,2005;Tong,2005)。作为两个半反应(生物素羧化酶(BC)反应和羧基转移酶(CT)反应)进行的这个反应是脂肪酸生物合成中的第一个起始步骤和该途径的速率决定步骤。

已知两种人ACC同工型ACC1和ACC2，其由不同基因编码(LuTFIABU-ELHEIGA等人,1995,Jane WIDMER等人1996)。ACC1在脂肪生成组织(肝、脂肪组织)中表达，位于胞质中，并且填补丙二酰基-CoA池，丙二酰基-CoA池通过FASN和随后的链延长用作长链脂肪酸的从头合成的C2单元供体。ACC2特别在氧化组织(肝、心脏、骨骼肌)中表达(Bianchi等人,1990;Kim,1997)，与线粒体相关，并且调节另一丙二酰基-CoA池。这通过抑制肉碱棕榈酰转移酶I来调节脂肪酸氧化，肉碱棕榈酰转移酶I是促进长链脂肪酸输入线粒体用于β-氧化的酶(Milgraum LZ等人,1997,Widmer J.等人,1996)。两种酶具有非常高的序列同源性，并且以相似的方式受转录、翻译和翻译后机制的组合调节。在人以及动物中，ACC活性在许多饮食、激素和其他生理机制的严格控制之下，例如通过柠檬酸盐正向变构激活，通过长链脂肪酸反馈抑制，可逆磷酸化和/或失活或者通过改造的基因表达调节酶产生。

ACC1敲除小鼠是胚胎致死的(Swinnen等人,2006,Abu-Elheiga等人2005)。ACC2敲除小鼠表现出骨骼肌和心肌中减少的丙二酰基-CoA浓度、肌肉中增加的脂肪酸氧化、降低的肝脂肪水平、减少的总身体脂肪量、骨骼肌中升高的UCP3水平(作为增加的能量输出的标志)、减少的体重、较低的游离脂肪酸血浆浓度、降低的血浆葡萄糖水平、减少的组织糖原量，并且它们受到保护免受饮食诱导的糖尿病和肥胖(Abu-Elheiga等人,2001,2003;Oh等人,2005)。

除了参与脂肪生成组织中的脂肪酸合成和氧化组织中的脂肪酸氧化，在许多肿瘤细胞中观察到ACC的上调和增加的脂肪生成(Swinnen等人,2004,Heemers等人,2000,Swinnen等人,2002,Rossi等人,2003,Milgraum等人,1997,Yahagi等人,2005)。这种表型很可能有助于肿瘤的发生和发展；但是，相关调控机制还有待阐明。

EP0454782和US5759837保护脂肪酸合成抑制剂抑制肿瘤细胞生长的用途。未公开环状酮烯醇。

已发现许多能够抑制植物和/或昆虫ACC的物质。

公开为WO99/48869的PCT专利申请PCT/EPP99/01787(其对应于欧洲专利EP1066258B1)涉及新的芳基苯基取代的环状酮烯醇、制备它们的许多方法以及它们作为杀虫剂和除草剂的用途。

现有技术已描述了3-酰基吡咯烷-2,4-二酮的药学特性(S.Suzuki等人Chem.Pharm.Bull.151120(1967))。此外，R.Schmierer和H.Mildenberger已合成N-苯基吡咯烷-2,4-二酮(Liebigs Ann.Chem.1985,1095)。尚未描述这些化合物的生物学活性。

EP-A-0262399和GB-A-2266888公开了相似结构的化合物(3-芳基吡咯烷-2,4-二酮)；但是，尚未知道这些化合物具有任何除草、杀虫或杀螨活性。已知具有除草、杀虫或杀螨活性的是未取代的双环3-芳基吡咯烷-2,4-二酮衍生物(EP-A-355599、EP-A-415211和JP-A-12-053670)，还有取代的单环3-芳基吡咯烷-2,4-二酮衍生物(EP-A-377893和EP-A-442077)。

还已知多环3-芳基吡咯烷-2,4-二酮衍生物(EP-A-442073)和1H-芳基吡咯烷二酮衍生物(EP-A-456063、EP-A-521334、EP-A-596298、EP-A-613884、EP-A-613885、WO95/01971、WO95/26954、WO95/20572、EP-A-0668267、WO96/25395、WO96/35664、WO97/01535、WO97/02243、WO97/36868、WO97/43275、WO98/05638、WO98/06721、WO98/25928、WO99/24437、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/17972、WO01/23354、WO01/74770、WO03/013249、WO03/062244、WO2004/007448、WO2004/024688、WO04/065366、WO04/080962、WO04/111042、WO05/044791、WO05/044796、WO05/048710、WO05/049569、WO05/066125、WO05/092897、WO06/000355、WO06/029799、WO06/056281、WO06/056282、WO06/089633、WO07/048545、DEA102005059892、WO07/073856、WO07/096058、WO07/121868、WO07/140881、WO08/067873、WO08/067910、WO08/067911、WO08/138551、WO09/015801、WO09/039975、WO09/049851、WO09/115262、WO10/052161、WO10/063378、WO10/063670、WO10/063380、WO10/066780以及WO10/102758。

此外，从WO99/16748知道缩酮取代的1-H-芳基吡咯烷-2,4-二酮，并且从JP-A-14205984和Ito M.等人Bioscience,Biotechnology andBiochemistry67,1230-1238,(2003)知道(螺)-缩酮-取代的N-烷氧基烷氧基-取代的芳基吡咯烷二酮。此外，WO06/024411公开了包含酮烯醇的除草组合物。

已知某些取代的Δ³-二氢呋喃-2-酮衍生物具有除草特性(参见DE-A-4014420)。用作起始原料的特窗酸衍生物的合成(例如，3-(2-甲基苯基)-4-羟基-5-(4-氟苯基)-Δ³-二氢呋喃酮-(2))同样地描述于DE-A-4014420中。从出版物Campbell等人,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,1985,(8)1567-76知道相似结构的化合物，但未陈述任何杀虫和/或杀螨活性。此外，从EP-A-528156、EP-A-647637、WO95/26954、WO96/20196、WO96/25395、WO96/35664、WO97/01535、WO97/02243、WO97/36868、WO98/05638、WO98/06721、WO99/16748、WO98/25928、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/23354、WO、01/74770、WO01/17972、WO04/024688、WO04/080962、WO04/111042、WO05/092897、WO06/000355、WO06/029799、WO07/048545、WO07/073856、WO07/096058、WO07/121868、WO07/140881、WO08/067911、WO08/083950、WO09/015801、WO09/039975以及PCT/EP2010/003020知道具有除草、杀螨和杀虫特性的3-芳基-Δ³-二氢呋喃酮衍生物。

从WO95/26345、96/25395、WO97/01535、WO97/02243、WO97/36868、WO98/05638、WO98/25928、WO99/16748、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/17972、WO01/23354、WO01/74770、WO03/013249、WO04/080962、WO04/111042、WO05/092897、WO06/029799以及WO07/096058知道3-芳基-Δ³-二氢噻吩酮衍生物。

已知某些在苯环中未被取代的苯基吡喃酮衍生物(参见A.M.Chirazi,T.Kappe和E.Ziegler,Arch.Pharm.309,558(1976)以及K.-H.Boltze和K.Heidenbluth,Chem.Ber.91,2849)。在苯环中被取代且具有除草、杀螨和杀虫特性的苯基吡喃酮衍生物描述于EP-A-588137、WO96/25395、WO96/35664、WO97/01535、WO97/02243、WO97/16436、WO97/19941、WO97/36868、WO98/05638、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/17972、WO01/74770、WO03/013249、WO04/080962、WO04/111042、WO05/092897、WO06/029799以及WO07/096058。

已知某些在苯环中未被取代的5-苯基-1,3-噻嗪衍生物(参见E.Ziegler和E.Steiner,Monatsh.95,147(1964),R.Ketcham,T.Kappe和E.Ziegler,J.Heterocycl.Chem.10,223(1973))。在苯环中被取代且具有除草、杀螨和杀虫特性的5-苯基-1,3-噻嗪衍生物描述于WO94/14785、WO96/25395、WO96/35664、WO97/01535、WO97/02243、WO97/02243、WO97/36868、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/17972、WO01/74770、WO03/013249、WO04/080962、WO04/111042、WO05/092897、WO06/029799以及WO07/096058。

已知某些取代的2-芳基环戊烷二酮具有除草、杀虫和杀螨特性(参见例如US-4283348；4338122；4436666；4526723；4551547；4632698；WO96/01798；WO96/03366、WO97/14667还有WO98/39281、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/17972、WO01/74770、WO03/062244、WO04/080962、WO04/111042、WO05/092897、WO06/029799、WO07/080066、WO07/096058、WO09/019005、WO09/019015、WO09/049851、WO10/069834、WO10/000773、WO10/057880、WO10/081894、WO10/089210、WO10/102848以及WO10/133232)。还已知具有相似取代的化合物；来自出版物Micklefield等人,Tetrahedron,(1992),7519-26的3-羟基-5,5-二甲基-2-苯基环戊-2-烯-1-酮，还有来自出版物Edwards等人,J.Chem.Soc.S,(1967),405-9的天然化合物involutin(-)-顺式-5-(3,4-二羟基苯基)-3,4-二羟基-2-(4-羟基苯基)环戊-2-烯酮。未描述杀虫或杀螨作用。此外，从出版物J.Economic Entomology,66,(1973),584和公开的申请DE-A2361084知道2-(2,4,6-三甲基苯基)-1,3-茚满二酮，同时陈述了除草和杀螨活性。

已知某些取代的2-芳基环己烷二酮具有除草、杀虫和杀螨特性(US-4175135、4256657、4256658、4256659、4257858、4283348、4303669、4351666、4409153、4436666、4526723、4613617、4659372、DE-A2813341、还有Wheeler,T.N.,J.Org.Chem.44,4906(1979))、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/17972、WO01/74770、WO03/013249、WO04/080962、WO04/111042、WO05/092897、WO06/029799、WO07/096058、WO08/071405、WO08/110307、WO08/110308、WO09/074314、WO08/145336、WO09/015887、WO09/074314、WO10/046194、WO10/081755以及WO10/089211)。

已知某些取代的4-芳基吡唑烷-3,5-二酮具有杀螨、杀虫和除草特性(参见例如WO92/16510、EP-A-508126、WO96/11574、WO96/21652、WO99/47525、WO01/17351、WO01/17352、WO01/17353、WO01/17972、WO01/17973、WO03/028466、WO03/062244、WO04/080962、WO04/111042、WO05/005428、WO05/016873、WO05/092897、WO06/029799以及WO07/096058)。

已知某些四氢吡啶酮具有除草特性(JP0832530)。还已知具有杀螨、杀虫和除草特性的特定4-羟基四氢吡啶酮(JP11152273)。此外，4-羟基四氢吡啶酮已在WO01/79204和WO07/096058中公开为杀虫剂和除草剂。在WO03/01045中公开了4-羟基喹喏酮。

已知某些作为蛋白酶抑制剂的5,6-二氢吡喃酮衍生物具有抗病毒特性(WO95/14012)。此外，已知4-苯基-6-(2-苯乙基)-5,6-二氢吡喃酮来自kawalactone衍生物的合成(Kappe等人,Arch.Pharm.309,558-564(1976))。而且，已知5,6-二氢吡喃酮衍生物为中间体(White,J.D.,Brenner,J.B.,Deinsdale,M.J.,J.Amer.Chem.Soc.93,281-282(1971))。在WO01/98288和WO07/09658中描述了应用于作物保护的3-苯基-5,6-二氢吡喃酮衍生物。

在WO2008/022725中公开了用于病毒性病症治疗的4’-联苯基取代的特窗酸衍生物。

WO2005/089118和WO2007/039286以一般性的方式公开了用于治疗的含氮双环结构，未具体提到5′-联苯基取代的环酮烯醇。

作为除草剂的4-苯基取代的[1.2]-噁嗪-3,5-二酮最初描述于WO01/17972中。此外，作为杀虫剂，但是特别作为除草剂和生长调节剂的4-酰基取代的[1.2]-噁嗪-3,5-二酮描述于例如EP-A-394889；WO92/07837，US5,728,831，以及（作为除草剂和杀虫剂）WO03/048138中。

化合物A具体地公开于WO2008/067910(表1，第26页，第4行)中。WO2008/067910未公开化合物A适合用于治疗目的。

本申请建立了化合物A的治疗用途的优先权。在建立优先权的本申请(其主题仅为化合物A的治疗用途)的同时，特别提交了PCT申请，其主题为许多环酮烯醇的治疗用途，并且其要求申请号为DE102010008644.4的德国申请的优先权。化合物A是该PCT申请中的实施例1-118，但不是DE102010008644.4的部分。

结构上最接近的现有技术可以是WO99/48869的实施例I-1-a-16，其与化合物A的不同之处仅在于联苯基的外苯环上缺少氟原子。WO99/48869的实施例I-1-a-16的治疗用途还形成DE102010008644.4和要求DE102010008644.4的优先权的PCT申请的主题的部分(实施例1-2)。

但是，结构上最接近的现有技术还可以是WO03/059065的实施例I-1-a-31，其与化合物A的不同之处在于联苯基的外苯环上的氟原子被氯原子代替。WO03/059065的实施例I-1-a-31的治疗用途还形成DE102010008644.4和要求DE102010008644.4的优先权的PCT申请的主题的部分(实施例1-81)。

基于该现有技术，本发明的目的是提供用于病症治疗的特别有效的结构。

本发明的结构应当特别适合肿瘤病症的预防和治疗，并且与现有技术已知的结构相比具有优势。

令人惊讶地，现在已发现化合物A特别适合用于病症治疗

在这点上，已知为杀虫剂或除草剂的结构是否会最有效地实现本发明的目的以及已知为杀虫剂或除草剂的结构中的哪些会最有效地实现本发明的目的，即提供可以最有效地用于人类病症的治疗中的结构，是不可预见。

化合物A具有与WO99/48869的实施例I-1-a-16(可以认为是结构上最接近的现有技术)相当的酶抑制数据。但令人惊讶的是，化合物A的特点在于在MCF7异种移植模型中比该现有技术更宽的治疗窗口，所述现有技术在这种模型中于耐受剂量下无效。

化合物A具有比WO03/059065的实施例I-1-a-31(同样地可以认为是结构上最接近的现有技术)更好的酶抑制数据。

化合物A令人惊讶地以更好的酶抑制和/或在耐受剂量下更好的体内效力而区别于已知作为杀虫剂、杀真菌剂或除草剂的大量环酮烯醇。

本发明同样地包括化合物A的生理上可接受的盐的用途。

化合物A的生理上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如且优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及衍生自氨或具有1-16个C原子的有机胺的铵盐，例如且优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、乙二胺和N-甲基哌啶。

本发明还提供包含化合物A以及至少一种或多种活性化合物的药物，特别用于肿瘤病症的预防和/或治疗。

化合物A可以全身和/或局部发挥作用。为了这个目的，它们可以以合适的方式给药，例如，口服、肠胃外、肺部、鼻腔、舌下、舌（lingually）、含服、直肠、皮肤（dermally）、透皮、结膜、耳、作为植入物或支架给药。

对于这些给药途径，化合物A可以以合适的给药形式给药。

适合口服给药的是根据现有技术起作用的给药形式，其快速和/或以改进的形式释放化合物A，并且包含结晶形式和/或无定形化形式和/或溶解形式的化合物A，例如，片剂(非包衣或包衣片剂，例如用控制本发明的化合物的释放的肠溶包衣、缓慢溶解的包衣或不溶性包衣来包衣)、在口腔中快速分解的片剂或者膜剂/薄膜、膜剂/冻干物、胶囊剂(例如硬明胶胶囊或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、乳剂、混悬剂、气雾剂或溶液剂。

进行肠胃外给药可以规避吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心内、脊髓内或腰髓内)或者包括吸收(例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹腔内)。对于肠胃外给药，合适的给药形式尤其为溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干物或无菌粉末形式的注射和输液制剂。

适合其他给药途径的是例如用于吸入的药物形式(尤其是干粉吸入器、雾化吸入器)，滴鼻剂，鼻溶液剂，鼻喷雾剂；片剂，舌、舌下或口腔施用的膜剂/薄薄或胶囊剂，栓剂，耳或眼制剂，阴道胶囊剂，水性混悬剂(洗剂、摇荡剂)，亲脂性混悬剂，软膏剂，乳膏剂，透皮治疗系统(例如贴剂)，乳，糊剂，泡沫，扑粉，植入物或支架。

可以将化合物A转化为提到的给药形式。这可以以本领域已知的方式，通过与惰性的无毒的药学可接受的辅剂混合来进行。这些辅剂尤其包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露醇)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂和分散剂或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧失水山梨糖醇油酸酯(polyoxysorbitan oleate))、粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成聚合物和天然聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂，如抗坏血酸)、着色剂(例如无机色素，如氧化铁)以及味道和/或气味矫味剂。

本发明还提供包含化合物A(通常连同一种或多种惰性的无毒的药学可接受的辅剂)的药物，以及它们用于上文提到的目的的用途。

以本领域已知的方式，通过将活性成分与药学技术中惯用的赋形剂转化为期望的给药形式，来进行化合物A的配制以提供药物产品。

在这方面可以采用的赋形剂是例如载体物质、填充剂、崩解剂、粘合剂、保湿剂、润滑剂、吸收剂和吸附剂、稀释剂、溶剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、掩味剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、改变渗透压的盐或者缓冲剂。

在这方面应当参考Remington's Pharmaceutical Science,15th ed.MackPublishing Company,East Pennsylvania(1980)。

所述药物制剂可以为：

固体形式，例如片剂、包衣片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、透皮系统，或者

半固体形式，例如软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂、乳剂，或者

液体形式，例如溶液剂、酊剂、混悬剂或乳剂。

本发明的上下文中的赋形剂可以是例如盐、糖(单糖、二糖、三糖、寡糖和/或多糖)、蛋白、氨基酸、肽、脂肪、蜡、油、烃类以及它们的衍生物，其中所述赋形剂可以是天然来源的，或者可以通过合成或部分合成来获得。

适合口服或经口给药的具体是片剂、包衣片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、混悬剂、乳剂或溶液剂。适合肠胃外给药的具体是混悬剂、乳剂，特别是溶液剂。

本发明涉及化合物A在人类病症，特别是肿瘤病症的预防和治疗中的用途。

化合物A具体地可以用于抑制或减少细胞增殖和/或细胞分裂和/或诱导凋亡。

化合物A特别适合用于预防和/或治疗过度增殖性病症，例如，

-银屑病，

-瘢痕瘤和其他皮肤增生，

-良性前列腺增生(BPH)，

-实体瘤以及

-血液肿瘤。

可以按照本发明治疗的实体瘤是例如乳房、呼吸道、脑、生殖器官、胃肠道、泌尿生殖道、眼、肝、皮肤、头和颈、甲状腺、甲状旁腺、骨和结缔组织的肿瘤以及这些肿瘤的转移。

可以治疗的血液肿瘤是例如，

-多发性骨髓瘤，

-淋巴瘤或者

-白血病。

可以治疗的乳房肿瘤是例如：

-具有阳性激素受体状态的乳腺癌

-具有阴性激素受体状态的乳腺癌

-Her-2阳性乳腺癌

-激素受体和Her-2阴性乳腺癌

-BRCA相关的乳腺癌

-炎症性乳腺癌。

可以治疗的呼吸道肿瘤是例如，

-非小细胞支气管癌以及

-小细胞支气管癌。

可以治疗的脑肿瘤是例如，

-神经胶质瘤，

-胶质母细胞瘤，

-星形细胞瘤，

-脑膜瘤以及

-髓母细胞瘤。

可以治疗的男性生殖器官肿瘤是例如：

-前列腺癌，

-恶性睾丸肿瘤以及

-阴茎癌。

可以治疗的女性生殖器官肿瘤是例如：

-子宫内膜癌

-子宫颈癌

-卵巢癌

-阴道癌

-外阴癌。

可以治疗的胃肠道肿瘤是例如：

-结肠直肠癌

-肛门癌

-胃癌

-胰腺癌

-食道癌

-胆囊癌

-小肠癌

-唾液腺癌

-神经内分泌肿瘤

-胃肠道间质肿瘤。

可以治疗的泌尿生殖道肿瘤是例如：

-膀胱癌

-肾细胞癌

-肾盂和下泌尿道癌。

可以治疗的眼肿瘤是例如：

-视网膜母细胞瘤

-眼内黑素瘤。

可以治疗的肝肿瘤是例如：

-肝细胞癌

-胆管细胞癌。

可以治疗的皮肤肿瘤是例如：

-恶性黑素瘤

-基底细胞癌

-spinalioma

-卡波西肉瘤

-梅克尔细胞癌。

可以治疗的头和颈的肿瘤是例如：

-喉癌

-咽癌和口腔癌。

可以治疗的肉瘤是例如：

-软组织肉瘤

-骨肉瘤。

可以治疗的淋巴瘤是例如：

-非霍奇金淋巴瘤

-霍奇金淋巴瘤

-皮肤淋巴瘤

-中枢神经系统淋巴瘤

-AIDS相关的淋巴瘤。

可以治疗的白血病是例如：

-急性髓性白血病

-慢性髓性白血病

-急性淋巴性白血病

-慢性淋巴性白血病

-多毛细胞白血病。

有利地，化合物A可以用于预防和/或治疗：

乳腺癌，特别是激素受体阴性、激素受体阳性或BRCA相关的乳腺癌，还有

胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑素瘤和其他皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、

结肠直肠癌、胃癌和前列腺癌。

特别有利地，化合物A可以用于预防和/或治疗：

乳腺癌，特别是激素受体阴性和激素受体阳性的乳腺癌，还有胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌和胰腺癌。

这些病症在人类中已被良好表征，但是也存在与其他哺乳动物中。

本申请还提供化合物A，其用作药物，特别是用于肿瘤病症的预防和/或治疗。

本申请还提供化合物A，其用于乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑素瘤和其他皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌或前列腺癌的预防和/或治疗。

本申请有利地提供化合物A，其用于乳腺癌，特别是激素受体阴性和激素受体阳性的乳腺癌，还有胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌和胰腺癌的预防和/或治疗。

本发明还提供化合物A在制备药物中的用途。

本申请还提供化合物A的用途，其用于制备用于肿瘤病症的预防和/或治疗的药物。

本申请还提供化合物A的用途，其用于制备用于乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑素瘤和其他皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌或前列腺癌的预防和/或治疗的药物。

本申请有利地提供化合物A的用途，其用于制备用于乳腺癌，特别是激素受体阴性和激素受体阳性的乳腺癌，还有胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌和胰腺癌的预防和/或治疗的药物。

本申请还提供所述化合物的用途，其用于肿瘤病症的预防和/或治疗。

本申请还提供化合物A的用途，其用于乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑素瘤和其他皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌或前列腺癌的预防和/或治疗。

本申请有利地提供化合物A的用途，其用于乳腺癌，特别是激素受体阴性和激素受体阳性的乳腺癌，还有胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌和胰腺癌的预防和/或治疗。

本申请还提供片剂形式的药物制剂，其包含化合物A，其用于乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑素瘤和其他皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌或前列腺癌的预防和/或治疗。

本申请有利地提供片剂形式的药物制剂，其包含化合物A，其用于乳腺癌，特别是激素受体阴性和激素受体阳性的乳腺癌，还有胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、直肠结肠癌、胃癌和胰腺癌的预防和/或治疗。

本发明还提供化合物A在治疗与增殖过程相关的病症中的用途。

化合物A可以单独使用，或者如果需要，与一种或多种其他药理活性物质组合，只要这种组合不导致不需要和不可接受的副作用。因此，本发明还提供包含化合物A以及一种或多种其他活性化合物的药物，特别用于上述疾病的预防和/或治疗。

例如，化合物A可以与用于治疗癌症的已知抗过度增殖物质、细胞抑制物质或细胞毒性物质组合。特别指出化合物A与癌症治疗惯用的其他物质或者与放疗的组合。

可以例举的用于组合的合适的活性化合物是：

依维莫司(afinitor)、阿地白介素、阿仑膦酸、α-干扰素、阿利维A酸、别嘌醇、别嘌呤醇(aloprim)、盐酸帕洛诺司琼注射剂(Aloxi)、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨磷汀、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、多拉司琼片（Anzmet）、阿法达贝泊汀(aranesp)、Arglabin、三氧化二砷、阿诺新、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、BCG或tice-BCG、贝他汀、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、贝沙罗汀、硫酸博来霉素、溴尿苷、硼替佐米、白消安、降钙素、阿仑单抗(Campath)、卡培他滨、卡铂、康士德、Cefesone、西莫白介素、正定霉素(cerubidin)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素脂质体、地卡特隆(decadron)、磷酸地卡特隆(decadron phosphate)、Delestrogen、地尼白介素-毒素连接物、Depomedrol、地洛瑞林、右雷佐生、己烯雌酚、大扶康、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、屈大麻酚、DW-166HC、醋酸亮丙瑞林(Eligard)、拉布立酶注射剂(Elitek)、盐酸表柔比星注射剂(Ellence)、阿瑞吡坦胶囊(Emend)、表柔比星、阿法依伯汀、红细胞生成素制剂、依他铂、Ergamisol、微粉化雌二醇制剂、雌二醇、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、Ethyol、依替膦酸、凡毕复、依托泊苷、法倔唑、Farstone、非格司亭、非那雄胺、Fligrastim、氟尿苷、氟康唑、氟达拉滨、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟甲睾酮、氟他胺、福美坦、Fosteabine、福莫司汀、氟维司群、γ-球蛋白（Gammagard）、吉西他滨、吉妥珠单抗、格列卫、卡氮芥糯米纸胶囊剂、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林、和美新、Hydrocortone、红羟基壬基腺嘌呤(eyrthro-hydroxynonyladenine)、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素-α、干扰素-α-2、干扰素-α-2α、干扰素-α-2β、干扰素-α-n1、干扰素-α-n3、干扰素-β、干扰素-γ-1α、白介素-2、内含子A、易瑞沙、伊立替康、凯特瑞、拉帕替尼、硫酸香菇多糖、来曲唑、亚叶酸、亮丙立德、醋酸亮丙立德、左旋咪唑、左亚叶酸(levofolic acid)钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠制剂、洛莫司汀、氯尼达明、Marinol、氮芥、甲钴胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、酯化雌激素片剂、6-巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、美特维克、米替福新、米诺环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、Modrenal、Myocet、奈达铂、非格司亭(Neulasta)、纽曼格、优保津、尼鲁米特、诺瓦得士、NSC-631570、OCT-43、奥曲肽、盐酸昂丹司琼、Orapred、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松磷酸钠制剂、培门冬酶、派罗欣、喷司他丁、溶血性链球菌制剂、盐酸毛果芸香碱、吡柔比星、普卡霉素、卟吩姆钠、泼尼莫司汀、泼尼松龙、泼尼松、普罗马林、丙卡巴肼、Procrit、雷替曲塞、RDEA119、利比、依替膦酸铼-186、利妥昔单抗、罗荛愫、罗莫肽、舒乐津、善宁、沙格司亭、司莫司汀、西佐喃、索布佐生、甲强龙注射剂、链佐星、氯化锶-89、左甲状腺素钠(synthroid)、他莫昔芬、坦洛新、他索纳明、睾内酯(tastolactone)、泰索帝、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮胶囊剂、硫鸟嘌呤、塞替派、促甲状腺素、替鲁膦酸、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗(tastuzumab)、曲奥舒凡、维甲酸、甲氨蝶呤(Trexall)、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、醋酸曲普瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、UFT、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、Virulizin、右雷佐生粉针剂、净司他丁斯酯、枢复宁；ABI-007、阿考比芬、干扰素-γ-1b、Affinitak、氨基蝶呤、阿佐昔芬、阿索立尼、阿他美坦、阿曲生坦、BAY43-9006(索拉非尼)、Avastin、CCI-779、CDC-501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、醋酸环丙孕酮、地西他滨、DN-101、多柔比星-MTC、dSLIM、度他雄胺、艾特咔林、依氟鸟氨酸、依沙替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林水凝胶植入物、钬-166DOTMP、伊班膦酸、干扰素-γ、内含子-PEG、伊沙匹隆、匙孔血蓝蛋白、L-651582、兰瑞肽、拉索昔芬、Libra、氯那法尼(lonafarnib)、米泼昔芬、米诺磷酸(minodronate)、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、新伐司他、诺拉曲塞、奥利美生、onko-TCS、Osidem、聚谷氨酸紫杉醇、帕米膦酸二钠、PN-401、QS-21、夸西泮、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶、13-顺式-视黄酸、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、它赛瓦、二十二碳六烯酸和紫杉醇轭合物、胸腺肽-α-1、噻唑呋林、替匹法尼、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬、transMID-107R、伐司朴达(valspodar)、伐普肽、伐他拉尼、维替泊芬、长春氟宁、Z-100、唑来膦酸以及这些的组合。

在一优选实施方案中，可以将化合物A与抗过度增殖剂组合，所述抗过度增殖剂可以是例如(这个列表不是结论性的)：

氨鲁米特、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、5-氮杂胞苷、博来霉素、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、左旋门冬酰胺酶(colaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、2',2'-二氟脱氧胞苷、多西他赛、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、埃坡霉素及其衍生物、红羟基壬基腺嘌呤、炔雌醇、依托泊苷、磷酸氟达拉滨、5-氟脱氧尿苷、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5-氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、六甲蜜胺、羟基脲、己酸羟孕酮、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素、伊立替康、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、6-巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、紫杉醇、喷司他丁、N-磷酸乙酰L-天冬氨酸(PALA)、普卡霉素、泼尼松龙、泼尼松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、托泊替康、三甲基三聚氰胺、尿苷、长春碱、长春新碱、长春地辛以及长春瑞滨。

还可以将化合物A以非常有希望的方式与生物治疗剂如抗体(例如Avastin、Rituxan、Erbitux、Herceptin)和重组蛋白组合。

化合物A还可以与针对血管发生的其他治疗如Avastin、Axitinib、Regorafenib、Recentin、索拉非尼或舒尼替尼组合来获得积极的效果。与蛋白酶体抑制剂和mTOR抑制剂以及抗激素和甾体代谢酶抑制剂的组合特别适合，这是因为它们良好的副作用谱。

一般来说，用化合物A与具有细胞抑制或细胞毒性作用的其他药剂的组合可以追求以下目标：

·与用单独活性化合物治疗相比，在减缓肿瘤生长、减小其大小或甚至其完全消除方面活性提高；

·以比单一治疗更低的剂量采用化疗剂的可能性；

·与单独给药相比治疗更耐受并具有很少副作用的可能性；

·治疗更广谱的肿瘤疾病的可能性；

·实现更高的对治疗的应答率；

·与现在的标准治疗相比更长的患者存活时间。

而且，化合物A还可以与放疗和/或手术干预组合使用。

实验部分

1.比较例

表V示出WO99/488691的实施例I-1-a-16和WO03/059065的实施例I-1-a-31，申请人认为它们是最接近的现有技术。

表V

LC-MS和HPLC方法

方法1(UPLC-MS)

仪器：Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001；柱：Acquity UPLC BEH C181.750x2.1mm；流动相A：水+0.1%甲酸，流动相B：乙腈；梯度：0-1.6min1-99%B，1.6-2.0min99%B；流速0.8ml/min；温度：60℃；进样：2μl；DAD扫描：210-400nM。

方法2(UPLC-MS)

仪器：Waters Acquity UPLC-MS ZQ4000；柱：Acquity UPLC BEH C181.750x2.1mm；流动相A：水+0.05%甲酸，流动相B：乙腈+0.05%甲酸；梯度：0-1.6min1-99%B，1.6-2.0min99%B；流速0.8ml/min；温度：60℃；进样：2μl；DAD扫描：210-400nM。

方法3(UPLC-MS)：

仪器：Waters Acquity UPLC-MS SQD3001；柱：Acquity UPLC BEH C181.750x2.1mm；流动相A：水+0.1%甲酸，流动相B：乙腈；梯度：0-1.6min1-99%B，1.6-2.0min99%B；流速0.8ml/min；温度：60℃；进样：2μl；DAD扫描：210-400nm。

比较例C.1的制备

a)中间体

中间体C.1.1

(4’-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰氯

将5.00g(19.18mmol)的(4’-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酸(EP2029531A1和US2009/298828A1)溶于36.51g(306.84mmol)亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃下搅拌4小时，然后在减压下浓缩。在高真空下干燥得到5.4g(理论值的100%)标题化合物，为褐色油。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ[ppm]=2.36(s,3H),4.22(s,2H),7.29(d,1H),7.35–7.55(m,6H)。

中间体C.1.2

顺式-1-{[(4’-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基环己烷羧酸甲酯

在室温下，将5.41g(24.2mmol)的顺式-1-氨基-4-甲氧基环己烷羧酸甲酯盐酸盐(EP1791816A1和WO2006/29799A1)、14.8mg(1.21mmol)的DMAP和8.4ml(60.5mmol)的三乙胺在氮气下溶于118ml二氯甲烷中。然后逐滴加入6.75g(24.2mmol)中间体C.1.1在60ml二氯甲烷中的溶液。将所得的反应混合物在室温下搅拌过夜。对于后处理，将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用饱和的碳酸氢钠水溶液和5%浓度的柠檬酸水溶液洗涤。将有机相在硫酸钠上干燥，然后过滤并浓缩。这得到10.9g标题化合物，通过硅胶色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)来将其进一步纯化。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ[ppm]=1.31-1.47(m,2H),1.60-1.73(m,2H),1.75-1.86(m,2H),2.00-2.11(m,2H),2.27(s,3H),3.09-3.20(m,1H),3.21(s,3H),3.51(s,3H),3.58(s,2H),7.23(d,1H),7.43(dd,1H),7.46-7.54(m,3H),7.61-7.68(m,2H),8.31(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.38min;MS(ESIpos):m/z=430[M+H]⁺。

b)最终产物C.1

(5s,8s)-3-(4’-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在室温和氮气下，将4.63g(41.3mmol)叔丁醇钾加入在103ml N,N-二甲基甲酰胺中的8.87g(20.6mmol)中间体C.1.2中。将反应混合物在80℃下搅拌60分钟。对于后处理，将冷却的反应混合物倒入1l冰水中，利用1N氯化氢水溶液调整至pH3并搅拌3小时，将沉淀抽滤，用水洗涤并干燥。通过与乙醚搅拌过夜、过滤并干燥来进一步纯化粗产物。这得到7.75g(理论值的95%)标题化合物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ[ppm]=1.39-1.62(m,4H),1.84-2.05(m,4H),2.18(s,3H),3.07-3.20(m,1H),3.26(s,3H),7.30(d,1H),7.34(d,1H),7.45-7.53(m,3H),7.62-7.68(m,2H),8.18(br.s,1H),10.82(br.s,1H)。

LC-MS(方法3):R_t=1.19min;MS(ESIpos):m/z=398[M+H]⁺。

比较例C.2

比较例C.2是WO03/059065的实施例I-1-a-31。

WO03/059065的实施例I-1-a-31的治疗用途还形成DE102010008644.4和要求DE102010008644.4的优先权的PCT申请的主题的部分(实施例1-81)。

2.化合物A

化合物A的制备

a)中间体

中间体A.1

(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酸

在氩气下，将33.5g(192mmol)(4-氯-3-氟苯基)硼酸加入40.0g(175mmol)的(5-溴-2-甲基苯基)乙酸(EP1791816和WO2006/29799)在437ml(437mmol)脱气的1N氢氧化钠水溶液、160ml脱气的水和160ml脱气的四氢呋喃的混合物中的溶液中。将混合物搅拌10分钟，加入507mg(1.75mmol)三叔丁基鏻四氟硼酸盐和532mg(1.75mmol)乙酰丙酮钯(II)，并且将混合物在室温下搅拌20h。然后加入甲苯和水，利用浓氯化氢水溶液将pH调整至1-2，将混合物搅拌10分钟，分离各相，将水相用甲苯萃取2次，将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。将残余物在300ml正己烷/叔丁基甲基醚的6/1混合物中搅拌30分钟，抽滤，用正己烷洗涤并在减压下干燥。这得到38.0g(理论值的78%)标题化合物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ[ppm]=2.27(s,3H),3.67(s,2H),7.27(d,1H),7.49-7.59(m,3H),7.61-7.75(m,2H),12.4(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.31min;MS(ESIneg):m/z=277[M+H]⁺。

中间体A.2顺式-1-{[(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基环己烷羧酸甲酯

将10.0g(35.9mmol)中间体A.1溶于14.9ml(205mmol)亚硫酰氯中。将反应混合物在90℃下搅拌1h，然后浓缩。这得到10.8g(理论值的100%)的(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰氯。将10.6g(35.7mmol)的(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰氯溶于120ml乙腈中。将12.0g(53.7mmol)顺式-1-氨基-4-甲氧基环己烷羧酸甲酯盐酸盐(描述于EP1791816和WO2006/2979中)加入乙酸乙酯中，然后加入饱和的碳酸氢钠水溶液。分离各相，并且将水相用乙酸乙酯萃取2次。将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这得到8.50g顺式-1-氨基-4-甲氧基环己烷羧酸甲酯。将17.3g(125mmol)碳酸钾加入在120ml乙腈中的8.02g(42.8mmol)顺式-1-氨基-4-甲氧基环己烷羧酸甲酯中。用冰冷却的同时，逐滴加入酰基氯溶液，并且将混合物在室温下搅拌过夜。然后将混合物浓缩，将水加入残余物中，将混合物用二氯甲烷萃取，将合并的有机相用1N氯化氢水溶液和饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这得到15.7g(理论值的98%)标题化合物，无需进一步纯化直接反应。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ[ppm]=1.30-1.47(m,2H),1.60-1.74(m,2H),1.75-1.85(m,2H),1.99-2.11(m,2H),2.28(s,3H),3.09-3.20(m,1H),3.21(s,3H),3.52(s,3H),3.58(s,2H),7.24(d,1H),7.46-7.55(m,2H),7.57(d,1H),7.61-7.72(m,2H),8.30(s,1H)。

LC-MS(方法2):R_t=1.36min;MS(ESIpos):m/z=448[M+H]⁺。

b)最终产物化合物A

(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氮气下，将4.32g(38.5mmol)叔丁醇钾加入在60ml的N,N-二甲基甲酰胺中的15.7g(35.0mmol)中间体A.2中。将反应混合物在室温下搅拌20分钟。然后将反应混合物加入冰水中，逐滴加入160ml的1N氯化氢水溶液，将混合物搅拌30分钟，将沉淀抽滤，用水洗涤并干燥。这给出14.2g(理论值的97%)标题化合物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ[ppm]=1.40-1.62(m,4H),1.85-2.04(m,4H),2.19(s,3H),3.07-3.20(m,1H),3.27(s,3H),7.31(d,1H),7.39(d,1H),7.48-7.57(m,2H),7.60-7.73(m,2H),8.20(s,1H),10.82(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.22min;MS(ESIpos):m/z=416[M+H]⁺。

3.测定

人ACC1酶测定

利用两种不同的测定(A1和B1)获得ACC1抑制数据。

测定A1(=(A1))

利用以下段落中描述的ACC1测定测量本发明的物质关于酰基-CoA羧化酶1(ACC1)的抑制活性。该测定的基本原理是通过基于

的竞争性免疫测定(HTRF=均相时间分辨荧光)测量作为副产物形成的腺苷二磷酸(ADP)。

所用的酶是在杆状病毒转染的昆虫细胞(Hi5)中表达并通过在M2亲和凝胶(Sigma-Aldrich)上亲和色谱分离的C末端FLAG标记的重组人ACC1(GenBank登录号NM_198834，氨基酸39-末端)。或者，可以使用来自BPS Bioscience的商业的C末端His标记的ACC1(San Diego,CA，目录号50200，氨基酸39-末端)。对于测定，将50nl测试物质在DMSO中的100倍浓缩的溶液移液至黑色低容积384-孔微量滴定板(GreinerBio-One,Frickenhausen,Germany)中，加入2μl的ACC1在测定缓冲液[50mM HEPES/NaOH pH7.5、12mM碳酸氢钠、2mM MgCl₂、2mM柠檬酸钾、0.005%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)]中的溶液，并且将混合物温育15min以使所述物质在酶反应之前预结合至酶。然后通过加入3μl腺苷三磷酸(ATP,83.5μM=>在5μl测定体积中的终浓度为50μM，AmershamPharmacia Biotech#27-2056-01)和乙酰基-CoA(33.4μM=>在5μl测定体积中的终浓度为20μM，Roche Bioscience#10101893001)在测定缓冲液中的溶液来开始酶反应，并且将所得的混合物在22℃下温育20min的反应时间。将ACC1的浓度调整至各自的酶活性并设置，从而测定在线性范围中进行。典型浓度在2.5ng/μl的范围中。

通过连续加入2.5μl的d2标记的ADP(

Transscreener^TMADP试剂盒,Cis biointernational,Marcoule,France)在包含EDTA的Transscreener^TMADP检测缓冲液(包含在

Transscreener^TMADP试剂盒中，50mM HEPES pH7.0、60mM EDTA、0.1%(w/v)BSA、0.02%叠氮化钠、400mM氟化钾)中的溶液和2.5μl铕穴状化合物(europium cryptate)标记的抗ADP抗体(

Transscreener^TMADP试剂盒)在

Transscreener^TMADP检测缓冲液中的溶液来终止反应。

将所得的混合物在22℃下温育1h以使铕穴状化合物标记的抗ADP抗体结合至酶反应形成的ADP和d2标记的ADP。然后通过测量铕穴状化合物至d2的共振能量转移来测定d2标记的ADP与铕穴状化合物标记的抗ADP抗体的复合物的量。为此，在HTRF测量仪器如Rubystar或Pherastar(均为BMG Labtechnologies,Offenburg,Germany)中测量在350nm处激发后在620nm和665nm处的荧光发射。在665nm和622nm处的发射比用作d2标记的ADP与铕穴状化合物标记的抗ADP抗体的复合物的量的度量，因此间接用作酶反应中形成的未标记的ADP的量的度量(在665nm和622nm处的发射比越高

标记的ADP与铕穴状化合物标记的抗ADP抗体的复合物越多

越少)。将数据归一化(没有抑制剂的酶反应=0%抑制，所有其他测定组分但没有酶=100%抑制)。通常在相同微量滴定板上以20μM-1nM范围中的10个不同浓度(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nM和1nM，稀释系列在测定之前基于100倍浓溶液通过1:3系列稀释来制备)测试受试物质，每个浓度2个重复，并且利用内部软件通过4-参数拟合计算IC50值。

测定B1(=(B1))

在以下段落中描述的hACC1测定中测量本发明的物质的hACC1抑制作用。

基本上，通过利用来自Promega的ADP-Glo^TM检测系统定量作为酶反应的副产物形成的腺苷二磷酸(ADP)来测量酶活性。在这个测试中，首先用腺苷酸环化酶(“ADP-GLO试剂”)将酶反应中未消耗的腺苷三磷酸(ATP)定量转化为cAMP，然后终止腺苷酸环化酶(“激酶检测试剂”)，随后将形成的ADP转化为ATP，ATP在基于萤光素酶的反应中转化为辉光发光信号。

所用的酶是在杆状病毒感染的昆虫细胞(Hi5)中表达并通过抗FLAG亲和层析纯化的重组C末端FLAG标记的人ACC1(乙酰基-辅酶A羧化酶α转录变体1)(GenBank登录号NM_198834)(氨基酸39-末端)。

对于测定，将50nl测试物质在DMSO中的100倍浓缩的溶液移液至白色低容积384-孔微量滴定板(Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中，加入2.5μl的hACC1在测定缓冲液[50mM HEPES/NaOH pH7.5、2mMMgCl₂、2mM柠檬酸钾、12mM NaHCO₃、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.005%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)]中的溶液，并且将混合物温育15min以使所述物质在酶反应之前预结合至酶。然后通过加入2.5μl腺苷三磷酸(ATP,100μM=>在5μl测定体积中的终浓度：50μM)和乙酰基-CoA(20μM=>在5μl测定体积中的终浓度：10μM)在测定缓冲液中的溶液来开始酶反应，并且将所得的混合物在22℃下温育20min的反应时间。使hACC1的浓度适应各自的酶活性并调整，从而测定在线性范围中进行。典型浓度在1.75ng/μl的范围中。通过加入2.5μl的“ADP-GLO试剂”(1:1.5倍稀释)来终止反应，并且将所得的混合物在22℃下温育1h以将未反应的ATP完全转化为cAMP。然后加入2.5μl的“激酶检测试剂”(制造商推荐的浓度1.2倍多)，将所得的混合物在22℃下温育1h，然后利用合适的测量仪器(来自Perkin-Elmer的Viewlux或Topcount或者来自BMG Labtechnologies的Pherastar)测量发光。发射的光的量用作形成的ADP的量的度量，并且因此用作hACC1的酶活性的度量。将数据归一化(没有抑制剂的酶反应=0%抑制，所有其他测定组分但没有酶=100%抑制)。通常，在相同微量滴定板上以20μM-1nM范围中的10个不同浓度(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nM和1nM，稀释系列在测定之前基于100倍浓溶液通过1:3系列稀释来制备)测试受试物质，每个浓度2个重复，并且利用内部软件通过4-参数拟合计算IC₅₀值。

人ACC2酶测定

利用两种不同的测定(A2和B2)获得ACC2抑制数据。

测定A2(=(A2))

利用以下段落中描述的ACC2测定测量本发明的物质关于酰基-CoA羧化酶2(ACC2)的抑制活性。该测定的基本原理是通过基于的竞争性免疫测定(HTRF=均相时间分辨荧光)测量作为副产物形成的腺苷二磷酸(ADP)。

所用的酶是可商购的来自BPS Bioscience的C末端His标记的ACC2(San Diego,CA，目录号50201，氨基酸39-末端，在杆状病毒转染的Sf9昆虫细胞中表达并通过Ni-NTA亲和层析纯化)。

对于测定，将50nl测试物质在DMSO中的100倍浓缩的溶液移液至黑色低容积384-孔微量滴定板(Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中，加入2μl的ACC2在测定缓冲液[50mM HEPES/NaOH pH7.5、12mM碳酸氢钠、2mM MgCl₂、2mM柠檬酸钾、0.005%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)]中的溶液，并且将混合物温育15min以使所述物质在酶反应之前预结合至酶。然后通过加入3μl腺苷三磷酸(ATP,83.5μM=>在5μl测定体积中的终浓度为50μM，Amersham Pharmacia Biotech#27-2056-01)和乙酰基-CoA(33.4μM=>在5μl测定体积中的终浓度为20μM，Roche Bioscience#10101893001)在测定缓冲液中的溶液来开始酶反应，并且将所得的混合物在22℃下温育20min的反应时间。将ACC2的浓度调整至各自的酶活性并设置，从而测定在线性范围中进行。典型浓度在0.6ng/μl的范围中。

通过连续加入2.5μl的d2标记的ADP(

Transscreener^TMADP试剂盒,Cis biointernational,Marcoule,France)在包含EDTA的Transscreener^TMADP检测缓冲液(包含在

Transscreener^TMADP试剂盒中，50mM HEPES pH7.0、60mM EDTA、0.1%(w/v)BSA、0.02%叠氮化钠、400mM氟化钾)中的溶液和2.5μl铕穴状化合物标记的抗ADP抗体(

Transscreener^TMADP试剂盒)在

Transscreener^TMADP检测缓冲液中的溶液来终止反应。

将所得的混合物在22℃下温育1h以使铕穴状化合物标记的抗ADP抗体结合至酶反应形成的ADP和d2标记的ADP。然后通过测量铕穴状化合物至d2的共振能量转移来测定d2标记的ADP与铕穴状化合物标记的抗ADP抗体的复合物的量。为此，在HTRF测量仪器如Rubystar或Pherastar(均为BMG Labtechnologies,Offenburg,Germany)中测量在350nm处激发后在620nm和665nm处的荧光发射。在665nm和622nm处的发射比用作d2标记的ADP与铕穴状化合物标记的抗ADP抗体的复合物的量的度量，因此间接用作酶反应中形成的未标记的ADP的量的度量(在665nm和622nm处的发射比越高

标记的ADP与铕穴状化合物标记的抗ADP抗体的复合物越多

越少)。将数据归一化(没有抑制剂的酶反应=0%抑制，所有其他测定组分但没有酶=100%抑制)。通常在相同微量滴定板上以20μM-1nM范围中的10个不同浓度(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nM和1nM，稀释系列在测定之前基于100倍浓溶液通过1:3系列稀释来制备)测试受试物质，每个浓度2个重复，并且利用内部软件通过4-参数拟合计算IC50值。

测定B2(=(B2))

在以下段落中描述的hACC2测定中测量本发明的物质的hACC2抑制作用。

基本上，通过利用来自Promega的ADP-Glo^TM检测系统定量作为酶反应的副产物形成的腺苷二磷酸(ADP)来测量酶活性。在这个测试中，首先用腺苷酸环化酶(“ADP-GLO试剂”)将酶反应中未消耗的腺苷三磷酸(ATP)定量转化为cAMP，然后终止腺苷酸环化酶(“激酶检测试剂”)，随后将形成的ADP转化为ATP，ATP在基于萤光素酶的反应中转化为辉光发光信号。

所用的酶是在杆状病毒感染的昆虫细胞(Hi5)中表达并通过抗FLAG亲和层析纯化的重组C末端FLAG标记的人ACC2(乙酰基-辅酶A羧化酶2)(GenBank登录号NP_001084)(氨基酸27-末端)。

对于测定，将50nl测试物质在DMSO中的100倍浓缩的溶液移液至白色低容积384-孔微量滴定板(Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中，加入2.5μl的hACC2在测定缓冲液[50mM HEPES/NaOH pH7.5、2mMMgCl₂、2mM柠檬酸钾、12mM NaHCO₃、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.005%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)]中的溶液，并且将混合物温育15min以允许所述物质在酶反应之前预结合至酶。然后通过加入2.5μl腺苷三磷酸(ATP,100μM=>在5μl测定体积中的终浓度：50μM)和乙酰基-CoA(20μM=>在5μl测定体积中的终浓度：10μM)在测定缓冲液中的溶液来开始酶反应，并且将所得的混合物在22℃下温育20min的反应时间。使hACC2的浓度适应各自的酶活性并调整，从而测定在线性范围中进行。典型浓度在2ng/μl的范围中。通过加入2.5μl的“ADP-GLO试剂”(1:1.5倍稀释)来终止反应，并且将所得的混合物在22℃下温育1h以将未反应的ATP完全转化为cAMP。然后加入2.5μl的“激酶检测试剂”(制造商推荐的浓度1.2倍多)，将所得的混合物在22℃下温育1h，然后利用合适的测量仪器(来自Perkin-Elmer的Viewlux或Topcount或者来自BMG Labtechnologies的Pherastar)测量发光。发射的光的量用作形成的ADP的量的度量，并且因此用作hACC2的酶活性的度量。将数据归一化(没有抑制剂的酶反应=0%抑制，所有其他测定组分但没有酶=100%抑制)。通常，在相同微量滴定板上以20μM-1nM范围中的10个不同浓度(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nM和1nM，稀释系列在测定之前基于100倍浓溶液通过1:3系列稀释来制备)测试受试物质，每个浓度2个重复，并且利用内部软件通过4-参数拟合计算IC₅₀值。

非人ACCase测定

在室温下于透明384-孔微量滴定板中进行测定。其测定在ACCase反应中从ATP释放的无机磷酸盐。

测试混合物在40μl的最终体积中包含50mM Tris-HCl pH8.3、50mMKCl、2.5mM MgCl₂、0.5mM ATP、0.8mM二硫苏糖醇(DTT)、30mMNaHCO₃、0.1mM乙酰基-CoA、0.04%牛血清白蛋白和0.4μg部分纯化的ACCase酶。温育45分钟后，用150μl孔雀石绿溶液终止反应，并且在30分钟后读取在620处的吸收。

通过将3份在蒸馏水中的0.6mM MG-HCl溶液与1份在4M HCl中的8.5mM钼酸铵混合来制备孔雀石绿(MG)溶液。将溶液静置30分钟。通过0.45μm聚四氟乙烯(PTFE)滤器过滤之后，加入0.1份在蒸馏水中的TritonX-100(1.5%)。

播种后9天从燕麦幼苗提取ACCase酶，并且通过用0-40%硫酸铵沉淀然后在Q-Sepharose上离子交换色谱来部分纯化。

作用模式实验

在于MCF-7模型中测定活性之前，在“作用模式”实验中测试一些受试物质。这个实验的原理是口服给药后，在生物体中能够抑制ACC1和/或ACC2的受试物质的短期应用减少肿瘤中的丙二酰基-CoA。为此，在实验中，将2×10⁶个人MCF-7乳腺癌细胞皮下注射入雌性裸鼠(NMRI-裸鼠(nu/nu)，Taconic M&B A/S，提前1天给药小丸以在至少60天的时间中释放雌激素)。一旦肿瘤扩大至约60-70mm²的面积，在1-3天的时间中口服给药受试物质，然后在规定的时间点测定肿瘤内的丙二酰基-CoA含量并与媒介物对照进行比较。该方法描述于Anal Chem.2008Aug1;80(15):5736-42.Epub2008Jul9。)

细胞测定

按照本发明，在基于细胞的测定中测试所述物质在96小时的温育后抑制肿瘤细胞增殖的能力。利用

发光细胞活力测定(Promega)测试细胞活力。将细胞以2000-5000个细胞/孔的密度(取决于细胞系)接种于96-孔微量滴定板上的100μl生长培养基中。对于检测的每个细胞系，将细胞接种在单独的板上以确定在t=0小时和t=96小时的发光。在37℃下温育过夜后，确定t=0样品的发光值。t=96小时点的剂量平板用生长培养基稀释的物质及时处理。然后将细胞在37℃下温育96小时，然后确定t=96小时样品的发光值。对于数据分析，对于处理和未处理的样品，从t=96小时值减去t=0值。物质处理的样品与对照值之间的以百分比计的发光差异用来确定以百分比计的生长抑制。

在以示例性方式代表所述适应症的以下细胞系中测试所述物质：

细胞系	来源	适应症
			MCF7	ATCC	激素受体阳性的乳腺癌
PC3	ATCC	前列腺癌
			Du145	NCI	前列腺癌
ECC1	ATCC	子宫内膜癌
			KM12	NCI	结肠直肠癌
HEC1A	ATCC	子宫内膜癌
			DNA-G	CLS	胰腺癌
BxPC3	ATCC	胰腺癌
			H460	ATCC	非小细胞支气管癌
CAL-120	ATCC	激素受体阴性的乳腺癌
			BT-20	ATCC	激素受体阴性的乳腺癌
SNU16	ATCC	胃癌
			LNCaP	ATCC	前列腺癌

异种移植模型

使用免疫抑制小鼠中的异种移植模型测定在生物体中的抗肿瘤活性。

为此，首先利用以下方案确定最大耐受剂量(MTD)：

在1、2或3周的时间中，向雌性裸鼠(NMRI-裸鼠(nu/nu)，Taconic M&BA/S)口服给药规定剂量的受试物质，并且每天观察小鼠的死亡率和体重。MTD定义为在治疗阶段和7天额外的观察阶段期间没有任何动物死亡，并且没有任何与初始体重相比超过10%的体重损失的可以给药的最高剂量。

然后其中以它们的MTD和较低剂量给药受试物质的各种异种移植模型用来确定抗肿瘤活性。除了各种其他模型，在雌性裸鼠(NMRI-裸鼠(nu/nu)，Taconic M&B A/S)中主要使用激素依赖性人MCF-7细胞的乳腺癌模型。为此，在植入肿瘤细胞的前一天，向小鼠皮下给药释放雌激素的小丸(17β-雌二醇0.36mg，在60天中释放)。第二天，然后将2×10⁶个肿瘤细胞(悬浮于培养基+Matrigel1:1中，最终0.1ml)皮下注射至每只动物的一侧。当肿瘤扩大至20-25mm²的面积时，将小鼠随机分入治疗组并开始治疗。然后继续治疗直至在对照组(仅给予受试物质的媒介物)中或者在治疗组之一中达到120mm²的平均肿瘤大小，每周测量肿瘤面积和体重2-3次。在这个时间点，在所有组中终止实验，并且称量切除的肿瘤。

利用对肿瘤重量的影响或者利用对肿瘤面积的影响计算T/C值作为主要成功参数：治疗组中的平均肿瘤重量/面积除以媒介物组中的平均肿瘤重量/面积。

在肿瘤组织和正常组织中分析ACC1表达

利用微阵列测定ACC1表达。为此，分离各种肿瘤组织和相应的正常组织的RNA。该方法使用Trizol RNA提取试剂(Invitrogen)，随后的纯化使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)。

此外，进行DNase I(Qiagen)消化以消除基因组DNA。对于质量控制，在RNA LabChip的辅助下于Agilent生物分析仪2100平台(AgilentTechnologies)上分析总RNA，并且利用Peqlab NanoDrop系统测定RNA浓度。对于杂交，使用来自Affymetrix的一个周期的真核靶标记测定，然后在AffymetrixGeneChip3000扫描仪(Affymetrix)上读取阵列。利用Expressionist Pro4.0Refiner(GeneData)软件进行评价和质量控制。

4.结果：

4.1.酶测定

表1总结了来自酶测定的化合物A和比较例的结果。

表1

这些值显示化合物A和比较例C.1以比较强的方式抑制酶，而比较例C.2较差。

4.2细胞测定

表2总结了关于化合物A和比较例的细胞测定的结果。

表2

4.3最大耐受剂量(MTD)

比较例C.1

向雌性裸鼠(NMRI nu/nu)给药比较例C.1：

剂量：见表3

给药模式：口服

媒介物：PEG400/乙醇/Solutol HS15(70/5/25,v/v/v)

(Solutol HS15：12-羟基硬脂酸的聚氧乙烯酯)

给药体积：10ml/kg

方案：见表3

治疗阶段之后是7天的观察阶段。表3中总结了在此期间发生的死亡和对体重的影响。

表3

物质	剂量(mg/kg)	方案	体重(%)	死亡
					C.1	10	14天，1天2次	减少12	3只中1只
C.1	20	14天，1天2次	减少29	3只中2只
					C.1	30	14天，1天2次	减少11	3只中2只
					媒介物		21天，每天1次	增加15	5只中0只
C.1	15	21天，每天1次	减少1	5只中1只
					C.1	20	21天，每天1次	减少2	5只中1只
C.1	25	21天，每天1次	减少3	5只中1只

因此，每天2次给药的14天治疗的MTD少于10mg/kg。

因此，每天1次给药的21天治疗的MTD少于15mg/kg。

因为死亡和体重减少的确在所有组中均存在，所以无法确定MTD。

随后在MCF-7乳腺癌异种移植模型中向雌性裸鼠(NMRI nu/nu)给药比较例C.1：

剂量：7.5mg/kg

给药模式：口服

媒介物：PEG400/乙醇/Solutol HS15(70/5/25,v/v/v)

给药体积：10ml/kg

方案：27天，每天2次(2qd)

小鼠：10只

直到实验的第37天，这个剂量相对耐受良好(低体重减少，10只动物中1只死亡)。在这个剂量组中，与媒介物对照(基于肿瘤面积的T/C值=0.86)相比，未能观察到疗效（定义为<=0.5的T/C值）。

图2示出植入肿瘤细胞之后作为天数的函数的肿瘤面积。

继续用10mg/kg2qd或12.5mg/kg2qd治疗剩余的动物直至第43天。但是，这两个较高的剂量方案耐受不良(分别为4只中1只死亡或5只中4只死亡)。

总结：推测比较例C.1的治疗窗口（如果存在的话）非常小。

化合物A

向雌性裸鼠(NMRI nu/nu)给药化合物A：

剂量：见表4

给药模式：口服

媒介物：PEG400/乙醇/Solutol HS15(70/5/25,v/v/v)

给药体积：10ml/kg

方案：见表4

治疗阶段之后是7天的观察阶段。表4中总结了在此期间发生的死亡和对体重的影响。

表4

物质	剂量(mg/kg)	方案	体重(%)	死亡
					媒介物		21天，每天1次	增加5	5只中0只
化合物A	20	21天，每天1次	增加2	5只中0只
					化合物A	30	21天，每天1次	增加1	5只中0只
化合物A	40	21天，每天1次	减少3	5只中1只
					化合物A	50	21天，每天1次	减少29	5只中5只
化合物A	60	21天，每天1次	减少24	5只中5只

因此，每天1次给药的21天治疗的MTD小于40mg/kg且大于30mg/kg。

随后在MCF-7乳腺癌异种移植模型中向雌性裸鼠(NMRI nu/nu)给药化合物A：

剂量：见表5

给药模式：口服

媒介物：PEG400/乙醇/Solutol HS15(70/5/25,v/v/v)

给药体积：10ml/kg

方案：30天，每天1次(qd)

每剂量组的小鼠：10-13只

表5

对于实验的统计评价，非参数ANOVA检验用于基于肿瘤面积的T/C值，因为没有测量值的正态分布。然后利用Dunns Post检验将所有治疗组与媒介物组进行比较。所得的p值在表中示出(ns：不显著=p>0.05)。因为没有基于肿瘤重量的T/C值的正态分布，所以将参数值的ANOVA检验用于分析。然后利用Bonferroni Post检验将所有治疗组与媒介物组进行比较。所得的p值在表5中示出。

因为在这个实验中，所用的所有剂量组均达到<0.5的T/C(基于肿瘤重量)目标值，统计评价这个实验，评价的结果也在表5中示出。当每天1次给药时，化合物A在25mg/kg的剂量以上以统计显著的方式抑制肿瘤生长(基于肿瘤重量和肿瘤面积)。基于肿瘤重量，这个效果甚至从每天1次给药的20mg/kg的剂量开始统计显著。

图3示出植入肿瘤细胞之后作为天数的函数的肿瘤面积。

因此，比较例C.1与化合物A的比较表明比较例C.1即使在耐受不良的剂量下也未表现出抗肿瘤效力，而对于化合物A，在20mg/kg qd-35mg/kg qd的耐受剂量范围中发现了生物学上有意义和显著的抗肿瘤效果。

在肿瘤和正常组织中的ACC1表达

通过微阵列测定在肿瘤和相应的正常组织中的ACC1表达(图1)。在乳癌、结肠直肠癌、支气管癌和胰腺癌中，与正常组织相比，ACC1的表达显著上调。

5.制剂

包含化合物A的片剂

a)通过直接压片制备药物制剂

通过直接压片制备根据来自表6的组成的包含化合物A的片剂。

表6

原料	质量/片[mg]
		化合物A	80.0
喷雾干燥的甘露醇	67.0
		微晶纤维素	40.0
交联羧甲基纤维素钠	10.0
		硬脂酸镁	3.0
总计	200.0

可以通过合适的方法，特别是通过粉末混合和直接压片，以任何规模制备药物制剂。

为了制备50片，将

3.351g喷雾干燥的甘露醇

2.004g微晶纤维素

0.499g交联羧甲基纤维素钠以及

3.992g示例性化合物1-118

在研钵中通过小心研磨来预混合。将混合物转移至100-ml螺旋盖管中并在Turbula混合器中均质化10分钟。加入0.149g硬脂酸镁后，将混合物在Turbula混合器中再混合1min。

将以这种方式获得的成型材料在偏心型压片机(Korsch EK2)中压片以得到直径8mm和曲度12mm的双凸片。

b)断裂力

在压片过程的开始、中间和结束时测试获得片剂的断裂力(使用Schleuniger断裂力测试仪)、质量以及在37℃下于水中的崩解时间(使用专著2.9.1欧洲药典中所述的装置)。

c)体外溶出

按照USP，利用装置2(桨法)测定化合物A从制备的片剂的体外释放。在每种情况下，在37℃下于900ml不同介质中以及在75转/分钟的搅拌速度下进行释放测试。每个测定重复进行3次。通过HPLC测定含量。结果在图7和表4中示出。

表7

*SDS=十二烷基硫酸钠(因为在pH1和pH6.8下溶解性不足而添加)

d)药物制剂的短期稳定性

使完成的片剂在25℃/60%相对湿度和40℃/75%相对湿度下进行1个月的短期稳定性测试。在任一种条件下，通过HPLC检测，在含量和降解产物方面，该片剂均稳定。

附图说明

图1：在肿瘤组织和相应的正常组织中的ACC1表达

1:健康乳房组织(2个样品)

2:乳房肿瘤组织(26个样品)

3:健康结肠组织(30个样品)

4:结肠肿瘤组织(71个样品)

5:健康肺组织(27个样品)

6:肺肿瘤组织(40个样品)

7:健康胰组织(22个样品)

8:胰肿瘤组织(19个样品)

图2：比较例C.1在激素依赖性MCF-7乳腺癌异种移植模型中的疗效。

图3：化合物A在激素依赖性MCF-7乳腺癌异种移植模型中的疗效。

图4：化合物A从片剂的释放曲线。

Claims (11)

1.(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮在制备药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其用于制备用于肿瘤病症的预防和/或治疗的药物。

3.权利要求2的用途，其用于制备用于乳腺癌、胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胃癌和前列腺癌的预防和/或治疗的药物。

4.(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮在预防和/或治疗人或其他哺乳动物的病症中的用途。

5.权利要求4的用途，其用于肿瘤病症的预防和/或治疗。

6.权利要求5的用途，其用于乳腺癌、胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胃癌和前列腺癌的预防和/或治疗。

7.(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，其用作药物。

8.(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，其用于肿瘤病症的预防和/或治疗。

9.(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，其用于乳腺癌、胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胃癌和前列腺癌的预防和/或治疗。

10.片剂形式的药物制剂，其包含(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，其用于乳腺癌、胰腺癌、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胃癌和前列腺癌的预防和/或治疗。

11.(5s,8s)-3-(4’-氯-3’-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，其与其他活性化合物组合。

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