CN103525838B

CN103525838B - 一种苹果酸酶基因SgME1及其应用

Info

Publication number: CN103525838B
Application number: CN201310290850.5A
Authority: CN
Inventors: 田江; 廖红; 孙丽莉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN103525838A

Abstract

本发明公开了一种编码苹果酸酶的基因SgME1及其应用。该苹果酸酶基因SgME1的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:2所示。SgME1基因调控柱花草苹果酸的合成，过量表达SgME1促进酵母、菜豆毛根和拟南芥苹果酸的合成，并增加其耐铝性。

Description

一种苹果酸酶基因SgME1及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及苹果酸酶基因SgME1及其应用。

背景技术

铝毒害是酸性土壤上限制作物生长的主要障碍因素之一(Kochianetal.,2004)。pH小于5时，土壤中的铝就以活性形式存在，能够快速地被植物根系吸收(Kinraide,1991)，对根尖的生长产生毒害作用，最终导致作物产量的降低。

铝离子可以与细胞壁和共质体相互作用，进而扰乱植物细胞正常的生理生化反应(Kochianetal.,2005)。研究表明，铝容易结合在带负电荷的细胞壁果胶质上，从而降低细胞壁的延展性，限制细胞的伸长(Yangetal.,2011)。铝除了与细胞壁结合之外，还能够累积在共质体内，扰乱细胞骨架的形成(Sivaguruetal.,1999)和抑制细胞的分裂(Royetal.,1989)等，并能够使脂质过氧化(Yamamotoetal.,2001)，从而影响根系生长发育。

植物适应铝毒的机制主要包括内部忍耐和外部排斥机制(Kochianetal.,2005;Maetal.,2001)。内部忍耐机制主要是指进入到细胞质中的铝与有机酸或其它化合物螯合，形成稳定的络合物，并隔离在液泡中，起到解除铝毒害的作用(Maetal.,1998)。外部排斥机制主要是通过根系分泌有机酸螯合铝离子，形成稳定的有机酸-铝复合物，减少对铝的吸收，从而起到缓解铝毒害的作用。大量的证据表明，苹果酸、柠檬酸和草酸等的分泌能够有效降低铝的毒害能力。目前，介导苹果酸和柠檬酸分泌的转运蛋白苹果酸转运子ALMT1和柠檬酸转运子MATE已成功分离克隆，这些基因的表达受到铝的调控，过量表达ALMT1与MATE分别促进苹果酸和柠檬酸的分泌，并能够提高植物的耐铝性(Sasakietal.,2004;Magalhaesetal.,2007)。同时，在铝胁迫下，通过调控编码三羧酸循环关键酶基因(PEPC、CS、MDH和ICDH)的表达，有利于柠檬酸和苹果酸的合成与分泌，通过有机酸的分泌缓解铝毒害(Rangeletal.,2010；Wangetal.,2010)。

柱花草是公认的适应热带和亚热带生长的先锋豆科作物，是我国南方重要的优质豆科牧草(Liuetal.,1997)，属于豆科柱花草属(Stylosanthesspp.)，因富含蛋白质、糖类和纤维，在澳大利亚、南美、南非、东南亚等热带和亚热带地区大面积种植，并具有较高的产量和品质(Nobleetal.,2000)。据报道，世界上60%的酸性土壤分布于热带和亚热带地区，因此，适应于热带和亚热带生长的植物有可能具有独特的耐铝机制(Metalietal.,2012)，长期种植于热带和亚热带酸性土壤上的柱花草可能具有潜在的适应酸性土壤生长的能力。

通过早期的耐铝性筛选，我们发现磷低效柱花草基因型Fine-stem对铝胁迫敏感，磷高效柱花草基因型TPRC2001-1对铝毒具有良好的忍耐能力(Duetal.,2009)，并且TPRC2001-1的耐铝能力与耐铝作物水稻相当，然而鲜有对柱花草耐铝机制的研究。

针对上述研究背景，申请人通过蛋白质双向电泳的方法，从柱花草耐铝基因型TPRC2001-1中分离到一个受铝调控的编码苹果酸酶的蛋白SgME1，并利用RACE技术，获得编码该蛋白的基因全长序列。利用酵母、菜豆毛状根和拟南芥等表达体系，证明SgME1基因编码的蛋白具有合成苹果酸的功能，最终提高转基因材料耐铝毒的能力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种苹果酸酶基因SgME1，本发明的另一个目的是提供上述基因编码的蛋白质，本发明的进一步目的是提供上述基因及其编码的蛋白质的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明所提供的苹果酸酶基因SgME1，可以来源于柱花草，其包含或具有选自如下的核苷酸序列：

(1)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在低等严格条件、中等严格条件、优选高严格条件下杂交的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；

(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

SEQIDNO:1由1758个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为第1-1758位碱基，编码具有序列SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列组成的蛋白质在本发明中称为SgME1蛋白。

本发明提供的苹果酸酶基因SgME1编码的蛋白质，其包含或具有选自如下的氨基酸序列：

(1)SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列；

(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；

(3)与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；

(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；

(5)本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

本发明提供的基因SgME1和蛋白质能够调控包含它的转基因生物体内苹果酸的合成。

扩增上述SgME1基因全长或其任一片段的引物对属于本发明的保护范围。

本发明还提供含有上述SgME1基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有SgME1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pYLRNAi(由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献：胡旭霞和刘耀光，2006，分子植物育种)或其它衍生植物表达载体。

本发明还提供一种基因工程菌，其含有上述的表达载体。

本发明还涉及细胞，其包含本发明的SgME1基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。还涉及来自所述植物的转基因种子。

本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括：从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明还涉及本发明的方法生产的植物。

本发明还涉及本发明的SgME1基因或重组载体在调控植物苹果酸的合成中的用途，包括制备转基因植物以及制备促进植物适应酸性土壤的制剂。

本发明还涉及调控植物适应酸性土壤的方法，该方法包括制备含有本发明的SgME1基因或重组载体的植物，例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明所提供的一个优选实施方案是将上述基因SgME1导入菜豆毛根和拟南芥中，得到转基因材料；所述转基因材料耐铝能力等高于所述目的对照植物。

所述基因SgME1可以例如是通过所述重组表达载体导入受体植物的。

携带有本发明的基因SgME1的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的下胚轴转化法转化到菜豆毛状根和拟南芥中。

本发明的优点和效果：

1.基因SgME1所属的苹果酸酶家族在拟南芥，小麦和水稻中虽已被克隆及报道，但其在参与苹果酸合成方面的生物学功能并不清楚。本发明克隆的基因SgME1对柱花草苹果酸合成有显著的影响，这对阐明苹果酸酶基因在豆科作物适应酸性土壤的生物学功能有着重要意义。

2.基因SgME1不仅影响了苹果酸的合成，超量表达该基因还增加了酵母、菜豆毛根和拟南芥对铝毒的忍耐能力。该基因的功能研究对于解析豆科作物适应酸性土壤的分子机理有着深远的研究意义。

附图说明

图1：50μM铝处理对柱花草和水稻根伸长的影响；试验中每个处理设4个重复，图中柱子和误差线分别为4个重复数据的平均值和标准误差（下同）。大小写字母分别表示24和72小时根相对伸长量的显著性分析，不同字母表示在P=0.05水平基因型间差异显著。

图2：铝处理对柱花草根部铝含量的影响；*号表示同一处理在不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，**表示显著水平0.001<P<0.01时，差异极显著。

图3：铝处理对根部苹果酸浓度和苹果酸分泌的影响；A，100μMAlCl₃处理24小时后根部苹果酸浓度；B，铝处理72小时后根部苹果酸浓度；C，铝处理24小时后苹果酸分泌速率；D，铝处理72小时后苹果酸分泌速率；图中柱子和误差线分别为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差；星号表示同一基因型在不同处理间差异显著性比较的结果，**表示显著水平0.001<P<0.01时，差异极显著。

图4：通过双向电泳技术分离鉴定获得苹果酸酶SgME1；A，不加铝处理24小时后，SgME1蛋白点在TPRC2001-1根部的蛋白图；B，加铝处理24小时后SgME1的蛋白图；C，不加铝处理72小时后SgME1的蛋白图；D，加铝处理72小时后SgME1的蛋白图；方框表示SgME1蛋白点。

图5：SgME1融合GFP洋葱表皮亚细胞定位分析；前两排分别显示的是pBEGFP空载体转化洋葱表皮细胞质壁分离前后的图片；后两排分别显示SgME1融合GFP载体转化洋葱表皮细胞质壁分离前后的图片；显微镜观察的内容分别有绿色荧光通道(GFP荧光)、光镜通道(明场)、红色荧光通道(PI染色)和重叠后的图片(融合)。

图6：SgME1转化酵母、菜豆毛根和拟南芥对内源苹果酸浓度的影响；A，pYES2空载体和pYES2-SgME1转化酵母后的内源苹果酸浓度；B，pYL空载体和pYL-SgME1转化菜豆毛根后的内源苹果酸浓度；C，pYL空载体和pYL-SgME1转化拟南芥的内源苹果酸浓度。CK，转化空载的对照株系；OX，SgME1基因的超表达株系。星号表示同一指标在不同转化株系间差异显著性比较的结果，*表示显著水平P<0.05时，差异显著，**表示显著水平0.001<P<0.01时，差异极显著。

图7：铝处理对SgME1表达量的影响；A，铝处理24小时对SgME1在柱花草根部表达量的影响；B，铝处理72小时对SgME1在柱花草根部表达量的影响；*表示显著水平P<0.05时，差异显著。

图8：超量表达SgME1对酵母、菜豆毛根与拟南芥转化株系耐铝性的影响；A，转化pYES2空载体和pYES2-SgME1的酵母在铝处理条件的表型分析；B，SgME1不同菜豆毛根转基因株系和空载体对照在铝处理条件下的表型分析；C，SgME1不同菜豆毛根转基因株系和空载体对照相对根伸长量的比较。D，SgME1不同拟南芥转基因株系和空载体对照在铝处理条件下的表型分析；E，SgME1不同拟南芥转基因株系和空载体对照相对根伸长量的比较。CK，转化空载的对照株系；OX，SgME1基因的超表达株系。星号表示同一指标在不同转化株系间差异显著性比较的结果，*表示显著水平P<0.05时，差异显著。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

SgME1基因的克隆

1.SgME1蛋白的分离与鉴定

参照陈志坚等(2011)方法提取柱花草根系蛋白质，进行双向电泳。每个试验处理设置3个重复，筛选不加铝对照与加铝处理间显著差异表达的蛋白点，并用ABI4700TOF-TOF(AppliedBiosystems公司，美国)进行MALDI-TOF/TOFMS质谱分析。

结果如图4所示，由结果可知：与对照相比，在铝胁迫24小时柱花草根部的SgME1蛋白的累积量没有显著的变化。但是在铝胁迫72小时后，SgME1蛋白的累积量显著在根部增加，说明SgME1蛋白的表达量受长期铝胁迫的加强。

2.SgME1基因的克隆

根据菜豆(J03825.1)，大豆(XM_003526456.1)，葡萄(XM_003631725.1)和苜蓿(XM_003630679.1)ME基因的保守结构域设计引物SgME1-EST-F(SEQIDNO:3)和SgME1-EST-R(SEQIDNO:4)。20μLPCR反应体系为，灭菌ddH₂O13.68μL，10×PCRbuffer2μL，2.5mMdNTP1.6μL，10μM正反向引物各0.8μL，ExTaq酶(TAKARA公司，日本)0.12μL，cDNA模板1μL。反应程序为，95℃变性1min，然后94℃30s，58℃30s，72℃30s，进行30次循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增后获得443bp的片断，通过加有Golderview核酸染料(鼎国公司，中国)的1%琼脂糖凝胶(Genetech公司，美国)电泳和凝胶成像系统成像确认片断大小正确后，参照Tiangen公司(德国)凝胶回收试剂盒说明将目的片断切胶回收，连入pGEM-T载体(Promega公司，美国)并测序。

根据SgME1EST序列设计5’端RACE引物SgME1-RACE5’-R(SEQIDNO:5)和3’端特异引物SgME1-RACE3’-F(SEQIDNO:6)，以铝处理后的柱花草TPRC2001-1根系的cDNA为模板，采用Clotech公司(美国)的SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit试剂盒进行cDNA末端快速扩增，获得5’端和3’端cDNA序列。采用MEGA4.1软件，将两端序列与EST序列拼接，获得全长序列。

SEQIDNO:3：5’-GTTTGAAGACTTCGCGAATCATAATG-3’

SEQIDNO:4：5’-CTTTGGTAAATGTCTTCCCTACTCC-3’

SEQIDNO:5：5’-CCACTTCTTTGGTAAATGTCTTCCCTACTCCAG-3’

SEQIDNO:6：5’-CTTATACAGTTTGAAGACTTCGCGAATCATAATG-3’

3.载体的构建

(1)亚细胞定位分析表达载体的构建

瞬时表达载体采用35S驱动的pBEGFP，用SgME1-GFP-F(SEQIDNO:7)和SgME1-GFP-R(SEQIDNO:8)扩增SgME1全长ORF，分别在引物的5’端加KpnⅠ和BamHⅠ两个酶切位点及ATG前加4个保护碱基，确保编码的目的蛋白与GFP蛋白能正确融合。PCR产物切胶回收并成功连入pGEM-T载体后，采用质粒小量提取试剂盒(Tiangen公司，德国)提取质粒。用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切pBEGFP和装载有SgME1基因的T载体质粒，回收目的片段后连接转化DH10B，测序确认SgME1基因的序列正确。

(2)酵母表达载体的构建

用分别含有BamHI和EcoRI酶切位点的SgME1-pYES2-F(SEQIDNO:9)和SgME1-pYES2-R(SEQIDNO:10)，通过PCR扩增SgME1的ORF序列，并连入pGEM-T载体。用BamHI和EcoRI对pYES2(Invitrogen公司，美国)和装载有SgME1基因的T载体质粒进行双酶切，回收目的片段后连接转化DH10B。测序准确后，挑选阳性克隆大量摇菌抽提质粒，获得装载有SgME1基因的pYES2载体。

(3)SgME1过量表达载体的构建

用分别含有SacI和MluI酶切位点的SgME1-pYL-F(SEQIDNO:11)和SgME1-pYL-R(SEQIDNO:12)，通过PCR扩增SgME1的ORF序列，并连入pGEM-T载体。用SacI和MluI对pYL和装载有SgME1基因的T载体质粒进行双酶切，回收目的片段后连接转化DH10B。挑选阳性克隆大量摇菌抽提质粒，获得装载有SgME1基因的pYL载体。测序确认无误后，采用冻融法分别转化农杆菌K599和Gv3101，用于菜豆毛根和拟南芥整株的转化，空载体转化为对照。

SEQIDNO:7：5’-GGTACCAGTCATGTCAAGCACATTGG-3’

SEQIDNO:8：5’-GGATCCCAACGGTAGTTTCTGTAGCCT-3’

SEQIDNO:9：5’-GGATCCAACACAATGTCCTCAAGCACATTGGTGAATGGTGG-3’

SEQIDNO:10：5’-CACTGCTACTATGAATTCTTTGGTTTAGTTCA-3’

SEQIDNO:11：5’-TTGTTAGAGCTCATGTCAAGCACATTG-3’

SEQIDNO:12：5’-ACGCGTTCAACGGTAGTTTCTGTAGC-3’

4.SgME1的亚细胞定位及其基因的表达模式分析

(1)SgME1的亚细胞定位分析

通过基因枪转化法，将装载了SgME1的EGFP载体和EGFP空载体导入洋葱表皮细胞和大豆原生质体进行瞬时表达。然后用荧光显微镜(LEICADM5000B,Germany)观察洋葱表皮细胞的GFP和PI荧光信号。

结果如图5所示。由结果可知，SgME1-GFP的荧光主要分布于细胞质中，说明SgME1蛋白定位于细胞质中。

(2)SgME1基因的表达模式分析

参照TAKARA公司(日本)SYBRGreen定量试剂盒说明书的方法进行定量PCR，用Rotor-Gene3000qRT-PCR系统(CorbettResearch，澳大利亚)运行。将cDNA样品稀释100倍作为定量PCR反应模板，选取适当的cDNA原液稀释4倍作为1倍标样制作标准曲线。20μL反应体系为，2×SYBRGreenPCRmastermix10μL，Mili-Q水6.4μL，10μM正反向引物各0.8μL，稀释的cDNA模板2μL。反应程序为，95℃变性1min，然后94℃15s，60℃15s，72℃30s，进行40次循环。用Real-TimeAnalysisSoftware6.0(CorbettResearch，澳大利亚)计算分析每个样品的表达量，相对表达量为目的基因的表达量与看家基因表达量的比值，看家基因的引物为SgEF-1a-F(SEQIDNO:13)与SgEF-1a-R(SEQIDNO:14)SgME1基因的定量引物为SgME1-F(SEQIDNO:15)与SgME1-R(SEQIDNO:16)。

SEQIDNO:13：5’-CACTTCAGGACGTGTACAAGATC-3’

SEQIDNO:14：5’-CTTGGAGAGCTTCATGGTGCA-3’

SEQIDNO:15：5’-GTTTGAAGACTTCGCGAATCATAATG-3’

SEQIDNO:16：5’-CTATCAACTCAGCAATACCAGTTCC-3’

结果如图7所示，与蛋白表达模式相似，铝处理24h对SgME1基因在TPRC2001-1根部的表达影响不大，而铝处理72h显著增强了SgME1基因在TPRC2001-1根部的表达，但对Fine-stem根部SgME1基因表达影响不大。

实施例2

转基因材料的研究

1.转基因材料的获得

(1)酵母转基因株系的获得

参照SCeasycomptransformationkit(Invitrogen公司，美国)，将pYES2-SgME1与pYES2空载体分别转化酵母INVSC1。

(2)转基因菜豆毛根的获得

将构建好的表达载体转化至发根农杆菌K599中，采用农杆菌介导的菜豆离体毛根诱导法获得转基因毛根。

(3)转基因拟南芥植株的获得

将构建好的表达载体质粒转化至根癌农杆菌Gv3101中，采用农杆菌介导的拟南芥花序转染法获得转基因拟南芥植株。

2.转基因材料的检测

(1)酵母转基因株系的检测

通过缺尿氨酸筛选培养基筛选阳性转化子，并通过PCR检测。

(2)转基因菜豆毛根的检测

从外植体上长出的一条根为一个系，继代3次后，毛状根提取RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测过表达的效果。

(3)转基因拟南芥植株的检测

采集T1代拟南芥种子经潮霉素抗性筛选后，获得T1代转基因植株；采集T2代种子用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为60%的T2代植株；采集T3代种子，用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为100%的转基因系。提取该转基因系植株的RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测过表达的效果。

菜豆看家基因PvEF-1a（SEQIDNO:17和SEQIDNO:18）和拟南芥的tubulin（SEQIDNO:19和SEQIDNO:20）作为分别作为菜豆毛根和拟南芥定量检测的参照基因，相对表达量为目的基因SgME1的表达量与参照基因表达量的比值。SgME1的检测引物为SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。

SEQIDNO:17：5’-TGAACCACCCTGGTCAGATT-3’

SEQIDNO:18：5’-TCCAGCATCACCATTCTTCA-3’

SEQIDNO:19：5’-TGTCGTCCAACCTTACAACTCACT-3’

SEQIDNO:20：5’-TCTCCAGGGTCCTCCATTCC-3’

3.转基因材料苹果酸浓度的变化

(1)酵母细胞苹果酸含量的测定

将装载pYES2-SgME1与pYES2空载体的酵母分别在100mL液体诱导培养基中培养1d后，转移到50mL离心管中，在4℃下6000g离心10min收集菌体沉淀。用1mLMillipore水清洗2次，吸走水后，用冷冻浓缩机(Labconco公司，美国)冻干样品。然后用液氮研磨样品，破碎菌体细胞壁。最后用1.2mLMillipore水溶解并转移样品至1.5mL离心管中，在4℃下12000g离心10min，小心吸取上清，过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱仪测定苹果酸含量。

(2)转基因菜豆毛状根苹果酸含量的测定

称取0.3g毛根置于30mL有机酸收集液中，28℃下60rpm黑暗培养1d后，提取毛根样品内源有机酸，并采用高效液相色谱仪测定苹果酸含量。

(3)转基因拟南芥苹果酸含量的测定

转基因和野生型拟南芥在MS培养基萌发5天后，将大小一致的幼苗转移到液体MS培养基中继续培养10天。将液体MS培养倒掉，用pH值为4.2的0.5mMCaCl₂溶液清洗植株3遍，将培养液换成0.5mMCaCl₂溶液(pH值为4.2)，培养24小时后，测定拟南芥内源苹果酸的含量。

结果如图6所示。由结果可知，在酵母、菜豆毛根和拟南芥中超量表达SgME1显著提高了转基因材料中苹果酸的含量，说明SgME1可以调控苹果酸的合成。

4.铝对转基因材料生长的影响

(1)铝处理对酵母生长的影响

将装载pYES2-SgME1与pYES2空载体的酵母分别在液体筛选培养基中培养过夜，OD600达到0.6后调至0.2，然后稀释成0.02、0.002、0.0002，每个OD值菌液分别吸取10μL，点在诱导培养基上。30℃培养4d，每天定时拍照，观察酵母生长的状况。

(2)铝处理对转基因毛状根生长的影响

切1-2cm毛根平铺在铝处理培养基上，铝处理开始每天扫根并计算相对根长。

(3)铝处理对转基因毛状根生长的影响

转基因和野生型拟南芥在MS培养基萌发4天后，将大小一致的幼苗转移到含0或400μMAlCl₃的CaCl₂固体培养基(CaCl₂浓度为4.3mM，pH值为4.2)，并测定根长。铝处理2天后，再次测定根长，计算根的相对伸长量。

结果如图8所示，由结果可知，在酵母中，相对pYES2空载体对照酵母菌株，装载有pYES2-SgME1酵母菌株在铝处理2d和4d下生长均比空载体对照菌株好（图8A），表明在酵母中表达SgME1可以增加酵母细胞苹果酸的合成，并提高了酵母对铝毒害的忍耐能力。在菜豆毛根中，对3个转基因菜豆毛根和空载体对照株系进行耐铝性分析(图8B和C)，结果表明，铝处理显著抑制了菜豆毛根的生长，但对转基因株系根的生长抑制程度低于对照株系，转基因株系的根相对伸长量是对照株系1.5倍以上，说明超量表达SgME1基因可以提高转基因菜豆毛根的耐铝性。在拟南芥中，铝处理显著抑制了拟南芥根的生长，但对转基因株系根的生长抑制程度低于对照株系，转基因株系的根相对伸长量是对照株系的2倍(图8D和E)，说明超量表达SgME1基因可以提高转基因拟南芥的耐铝性

5.水培试验

1）柱花草与水稻耐铝性分析

挑选饱满的水稻种子，5%次氯酸钠消毒10min后用水冲洗干净，蒸馏水浸泡24h后，移入CaSO₄中，28℃培养箱中黑暗条件下催芽，期间保持种子湿润。柱花草种子剥去种壳，80℃水浴3min后，播种于CaSO₄中，28℃培养箱中催芽。柱花草与水稻根长至1cm时进行50μMl铝处理，每天扫描根长，并计算相对根长，每个处理设置4个生物学重复。

2）柱花草幼苗的培养。将柱花草剥去种壳，80℃水浴3min后，75%酒精消毒30s，然后用10%次氯酸钠消毒10min，灭菌水清洗3-5次，然后播种于MS培养基上28℃黑暗培养1.5d。将萌发的柱花草移至加有琼脂胶的离心管(切去底部)中，置于水培箱中于温室进行1/2Hoagland营养液栽培，培养温度为28℃/25℃(昼/夜)，湿度75%。第一片真叶展开后移栽至14L塑料盆中，每7天更换1次营养液，每2天用KOH或H₂SO₄调节pH值至5.8。

3）铝处理与收获。柱花草在正常营养液中生长1个月后进行铝处理，对照处理为0.5mMCaCl₂，铝处理为0.5mMCaCl₂加100μMAlCl₃。每个处理设置4个生物学重复，处理24h和72h后分别收获样品，溶液收集用于测定有机酸的分泌，植物样品烘干用于铝含量的测定，部分样品于-80℃保存用于测定内源有机酸、根系总蛋白和RNA的提取。

结果如图1所示。TPRC2001-1在短期(24h)铝(50μMAl)胁迫下，与水稻XN1一样，具有比Fine-stem更强的耐铝能力；而在短期高铝处理下，其耐铝能力与Fine-stem差异不显著，但远低于XN1。而在长期铝胁迫下，TPRC2001-1具有与XN1相当，比Fine-stem更强的耐铝能力。

对生长1个月的柱花草进行100mM铝处理，比较不同铝处理时间对不同柱花草基因型根部铝含量的影响。结果如图2所示，铝处理24h和72h均显著增加了柱花草TPRC2001-1和Fine-stem根部的铝含量，且TPRC2001-1的根部铝含量显著高于Fine-stem，分别为Fine-stem2.5倍和2.3倍，说明TPRC2001-1根部能累积铝，其耐铝机制可能主要是内部忍耐机制。

本试验进一步研究了铝毒害对柱花草根部苹果酸合成与分泌的影响。结果如图3所示，铝处理24h对柱花草TPRC2001-1和Fine-stem根系苹果酸的浓度影响不明显。铝处理72h显著促进了TPRC2001-1根系苹果酸的浓度，表现为TPRC2001-1根系苹果酸浓度为其不加铝对照处理的2.6倍。从图3还可以看出，铝处理24h对两个柱花草基因型根系苹果酸的分泌影响不显著。但是，铝处理72h显著增加TPRC2001-1根系苹果酸的分泌，为其不加铝对照处理的5倍，是铝处理下Fine-stem的3.5倍。

SEQIDNO:1

ATGTCAAGCACATTGGTGAATGGTGGTGTTGAAGAAGCTTCTGCTACTGTTGATGGTGGTGTTAGAGACTTTTATGGTGAAGAAAGAGCCACGGAGGACCAGCTTATCACTCCTTGGAACTTCTCTGTCTCAAGTGGCAGCACTCTGCTGCGCGATCCGCGCTACAACAAAGGCCTCGCCTTCACCGAGAAAGAAAGAGATGCTCATTACCTGCGCGGCCTTTTGCCCCCAGCAGTATTCAATCAAGAACTTCAGGAGAAGAGGTTGATGTATAACCTTCGCCAGTATGAAGTTCCTCTGCATAGGTACATGGCCTTGATGGATCTTCAGGAGAGGAATGAGAGGCTGTTTTACAAGGTTCTGATTGATAACGTGGAGGAGCTGCTTCCTGTTGTTTACACTCCAACTGTTGGAGAAGCCTGCCAGAAATATGGAAGCATTTTCCGCCGCCCGCAGGGTCTATACATCAGTTTGAAAGAGAAAGGCAAGATCCTTGAGGTACTGAAAAACTGGCCAGAGAAGAACATTCAAGTTATTGTTGTCACTGATGGCGAGCGTATATTAGGACTTGGAGATCTTGGCTGCCAGGGAATGGGGATTCCTGTTGGGAAGCTTTCGCTCTATACTGCATTGGGAGGCGTTCGTCCTTCATCGTGCCTGCCTATAACCATTGATGTTGGCACAAACAATGAAAAGTTGCTGAATGATGAGTTTTACATCGGTCTTAGACAAAAGCGTGCAACTGGGAAGGAATATGCTGAGCTTCTAGATGAGTTCATGTGCGCCGTTAAGAAGAACTATGGGGAGAAAGTTCTTATACAGTTTGAAGACTTCGCGAATCATAATGCATTCGATCTGCTCGCAAAATACAGTTCATCTCATCTTGTTTTCAATGATGATATTCAGGGTACAGCATCTGTGGTATTAGCAGGATTGCTTGCTTCCTTAAAATTAGTTGGGGGAAACTTAGCTGACCATACCTTCTTATTTTTGGGTGCTGGAGAGGCTGGAACTGGTATTGCTGAGTTGATAGCACTTGAGATATCAAAACAGACAAAAGCTCCAGTGGAAGAAACCCGCAAAAAGATTTGGCTTGTTGACTCTAAGGGTCTTATTGTTAGCTCTCGCCTCGGATCACTTCAGCACTTCAAAAAGCCTTGGGCACATGAGCATGAACCTGTGAAGGAGCTTGTTGACGCTGTCAAGGCAATCAAGCCAACAGTGTTGATTGGATCATCTGGAGTAGGGAAGACATTTACCAAAGAAGTGGTTGAAACCATGGCATCATTGAATAAGAAACCACTCATTCTTGCTCTCTCGAATCCAACATCGCAATCCGAGTGCACTGCAGAAGAAGCTTATACATGGAGCAAGGGCCAAGCAATCTTTGCTAGCGGTAGCCCATTTGATCCTGTTGAATATGAAGGAAAAGTCTTTGTTCCTGGACAGGCTAACAACGCTTACATATTCCCTGGTTTCGGCTTGGGTTTGATCATGTCTGGAGCAATCCGCGTCCGCGATGAGATGCTCTTAGCAGCCTCTGAAGCTTTGGCTGCACAAGTGTCACAGGAGAACTATGATAAAGGACTGATTTACCCTCCATTCACAAATATCAGAAAGATATCAGCGCACATTGCTGCTAATGTGGCTGCCAAGGCATATGAACTTGGTCTTGCCTCTAATCTACCTCAACCTAAGGATCTTGTCAAATATGCAGAAAGTTGCATGTACAGCCCAGGCTACAGAAACTACCGTTGA

SEQIDNO:2

MSSTLVNGGVEEASATVDGGVRDFYGEERATEDQLITPWNFSVSSGSTLLRDPRYNKGLAFTEKERDAHYLRGLLPPAVFNQELQEKRLMYNLRQYEVPLHRYMALMDLQERNERLFYKVLIDNVEELLPVVYTPTVGEACQKYGSIFRRPQGLYISLKEKGKILEVLKNWPEKNIQVIVVTDGERILGLGDLGCQGMGIPVGKLSLYTALGGVRPSSCLPITIDVGTNNEKLLNDEFYIGLRQKRATGKEYAELLDEFMCAVKKNYGEKVLIQFEDFANHNAFDLLAKYSSSHLVFNDDIQGTASVVLAGLLASLKLVGGNLADHTFLFLGAGEAGTGIAELIALEISKQTKAPVEETRKKIWLVDSKGLIVSSRLGSLQHFKKPWAHEHEPVKELVDAVKAIKPTVLIGSSGVGKTFTKEVVETMASLNKKPLILALSNPTSQSECTAEEAYTWSKGQAIFASGSPFDPVEYEGKVFVPGQANNAYIFPGFGLGLIMSGAIRVRDEMLLAASEALAAQVSQENYDKGLIYPPFTNIRKISAHIAANVAAKAYELGLASNLPQPKDLVKYAESCMYSPGYRNYR。

SEQUENCELISTING

<110>华南农业大学

<120>一种苹果酸酶基因SgME1及其应用

<130>

<160>20

<170>PatentInversion3.2

<210>1

<211>1758

<212>DNA

<213>序列

<400>1

atgtcaagcacattggtgaatggtggtgttgaagaagcttctgctactgttgatggtggt60

gttagagacttttatggtgaagaaagagccacggaggaccagcttatcactccttggaac120

ttctctgtctcaagtggcagcactctgctgcgcgatccgcgctacaacaaaggcctcgcc180

ttcaccgagaaagaaagagatgctcattacctgcgcggccttttgcccccagcagtattc240

aatcaagaacttcaggagaagaggttgatgtataaccttcgccagtatgaagttcctctg300

cataggtacatggccttgatggatcttcaggagaggaatgagaggctgttttacaaggtt360

ctgattgataacgtggaggagctgcttcctgttgtttacactccaactgttggagaagcc420

tgccagaaatatggaagcattttccgccgcccgcagggtctatacatcagtttgaaagag480

aaaggcaagatccttgaggtactgaaaaactggccagagaagaacattcaagttattgtt540

gtcactgatggcgagcgtatattaggacttggagatcttggctgccagggaatggggatt600

cctgttgggaagctttcgctctatactgcattgggaggcgttcgtccttcatcgtgcctg660

cctataaccattgatgttggcacaaacaatgaaaagttgctgaatgatgagttttacatc720

ggtcttagacaaaagcgtgcaactgggaaggaatatgctgagcttctagatgagttcatg780

tgcgccgttaagaagaactatggggagaaagttcttatacagtttgaagacttcgcgaat840

cataatgcattcgatctgctcgcaaaatacagttcatctcatcttgttttcaatgatgat900

attcagggtacagcatctgtggtattagcaggattgcttgcttccttaaaattagttggg960

ggaaacttagctgaccataccttcttatttttgggtgctggagaggctggaactggtatt1020

gctgagttgatagcacttgagatatcaaaacagacaaaagctccagtggaagaaacccgc1080

aaaaagatttggcttgttgactctaagggtcttattgttagctctcgcctcggatcactt1140

cagcacttcaaaaagccttgggcacatgagcatgaacctgtgaaggagcttgttgacgct1200

gtcaaggcaatcaagccaacagtgttgattggatcatctggagtagggaagacatttacc1260

aaagaagtggttgaaaccatggcatcattgaataagaaaccactcattcttgctctctcg1320

aatccaacatcgcaatccgagtgcactgcagaagaagcttatacatggagcaagggccaa1380

gcaatctttgctagcggtagcccatttgatcctgttgaatatgaaggaaaagtctttgtt1440

cctggacaggctaacaacgcttacatattccctggtttcggcttgggtttgatcatgtct1500

ggagcaatccgcgtccgcgatgagatgctcttagcagcctctgaagctttggctgcacaa1560

gtgtcacaggagaactatgataaaggactgatttaccctccattcacaaatatcagaaag1620

atatcagcgcacattgctgctaatgtggctgccaaggcatatgaacttggtcttgcctct1680

aatctacctcaacctaaggatcttgtcaaatatgcagaaagttgcatgtacagcccaggc1740

tacagaaactaccgttga1758

<210>2

<211>585

<212>PRT

<213>序列

<400>2

MetSerSerThrLeuValAsnGlyGlyValGluGluAlaSerAlaThr

151015

ValAspGlyGlyValArgAspPheTyrGlyGluGluArgAlaThrGlu

202530

AspGlnLeuIleThrProTrpAsnPheSerValSerSerGlySerThr

354045

LeuLeuArgAspProArgTyrAsnLysGlyLeuAlaPheThrGluLys

505560

GluArgAspAlaHisTyrLeuArgGlyLeuLeuProProAlaValPhe

65707580

AsnGlnGluLeuGlnGluLysArgLeuMetTyrAsnLeuArgGlnTyr

859095

GluValProLeuHisArgTyrMetAlaLeuMetAspLeuGlnGluArg

100105110

AsnGluArgLeuPheTyrLysValLeuIleAspAsnValGluGluLeu

115120125

LeuProValValTyrThrProThrValGlyGluAlaCysGlnLysTyr

130135140

GlySerIlePheArgArgProGlnGlyLeuTyrIleSerLeuLysGlu

145150155160

LysGlyLysIleLeuGluValLeuLysAsnTrpProGluLysAsnIle

165170175

GlnValIleValValThrAspGlyGluArgIleLeuGlyLeuGlyAsp

180185190

LeuGlyCysGlnGlyMetGlyIleProValGlyLysLeuSerLeuTyr

195200205

ThrAlaLeuGlyGlyValArgProSerSerCysLeuProIleThrIle

210215220

AspValGlyThrAsnAsnGluLysLeuLeuAsnAspGluPheTyrIle

225230235240

GlyLeuArgGlnLysArgAlaThrGlyLysGluTyrAlaGluLeuLeu

245250255

AspGluPheMetCysAlaValLysLysAsnTyrGlyGluLysValLeu

260265270

IleGlnPheGluAspPheAlaAsnHisAsnAlaPheAspLeuLeuAla

275280285

LysTyrSerSerSerHisLeuValPheAsnAspAspIleGlnGlyThr

290295300

AlaSerValValLeuAlaGlyLeuLeuAlaSerLeuLysLeuValGly

305310315320

GlyAsnLeuAlaAspHisThrPheLeuPheLeuGlyAlaGlyGluAla

325330335

GlyThrGlyIleAlaGluLeuIleAlaLeuGluIleSerLysGlnThr

340345350

LysAlaProValGluGluThrArgLysLysIleTrpLeuValAspSer

355360365

LysGlyLeuIleValSerSerArgLeuGlySerLeuGlnHisPheLys

370375380

LysProTrpAlaHisGluHisGluProValLysGluLeuValAspAla

385390395400

ValLysAlaIleLysProThrValLeuIleGlySerSerGlyValGly

405410415

LysThrPheThrLysGluValValGluThrMetAlaSerLeuAsnLys

420425430

LysProLeuIleLeuAlaLeuSerAsnProThrSerGlnSerGluCys

435440445

ThrAlaGluGluAlaTyrThrTrpSerLysGlyGlnAlaIlePheAla

450455460

SerGlySerProPheAspProValGluTyrGluGlyLysValPheVal

465470475480

ProGlyGlnAlaAsnAsnAlaTyrIlePheProGlyPheGlyLeuGly

485490495

LeuIleMetSerGlyAlaIleArgValArgAspGluMetLeuLeuAla

500505510

AlaSerGluAlaLeuAlaAlaGlnValSerGlnGluAsnTyrAspLys

515520525

GlyLeuIleTyrProProPheThrAsnIleArgLysIleSerAlaHis

530535540

IleAlaAlaAsnValAlaAlaLysAlaTyrGluLeuGlyLeuAlaSer

545550555560

AsnLeuProGlnProLysAspLeuValLysTyrAlaGluSerCysMet

565570575

TyrSerProGlyTyrArgAsnTyrArg

580585

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>序列

<400>3

gtttgaagacttcgcgaatcataatg26

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>序列

<400>4

ctttggtaaatgtcttccctactcc25

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>序列

<400>5

ccacttctttggtaaatgtcttccctactccag33

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>序列

<400>6

cttatacagtttgaagacttcgcgaatcataatg34

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>序列

<400>7

ggtaccagtcatgtcaagcacattgg26

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>序列

<400>8

ggatcccaacggtagtttctgtagcct27

<210>9

<211>41

<212>DNA

<213>序列

<400>9

ggatccaacacaatgtcctcaagcacattggtgaatggtgg41

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>序列

<400>10

cactgctactatgaattctttggtttagttca32

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>序列

<400>11

ttgttagagctcatgtcaagcacattg27

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>序列

<400>12

acgcgttcaacggtagtttctgtagc26

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>序列

<400>13

cacttcaggacgtgtacaagatc23

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>序列

<400>14

cttggagagcttcatggtgca21

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>序列

<400>15

gtttgaagacttcgcgaatcataatg26

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>序列

<400>16

ctatcaactcagcaataccagttcc25

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>序列

<400>17

tgaaccaccctggtcagatt20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>序列

<400>18

tccagcatcaccattcttca20

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>序列

<400>19

tgtcgtccaaccttacaactcact24

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>序列

<400>20

tctccagggtcctccattcc20

Claims

1.一种编码苹果酸酶的基因SgME1，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

2.一种权利要求1所述的苹果酸酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

3.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述编码苹果酸酶的基因SgME1。

4.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述苹果酸酶基因SgME1在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物。

6.权利要求1所述苹果酸酶基因SgME1在制备促进植物适应酸性土壤的制剂或提高植物耐铝能力上的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物。

7.权利要求3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物。

8.权利要求3所述的表达载体在制备促进植物适应酸性土壤的制剂或提高植物耐铝能力上的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物。