CN103525689A - 基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器及培养控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器及培养控制方法。该反应器包括罐体，罐体顶部设有搅拌驱动电机，搅拌驱动电机输出轴与搅拌桨传动连接；罐体底部设有转子驱动电机，转子驱动电机输出轴与气液分散转子传动连接，气液分散转子具有顶部设进气口且下部设出气口的通气内腔，进气口经管路与带压空气源连接；罐体底部内侧还固连有气液分散定子，气液分散定子具有导流槽；气液分散定子位于气液分散转子周向，气液分散定子与气液分散转子同轴并构成转动副。该方法包括气液分散转子通气量控制过程、气液分散转子转速控制过程、以及搅拌桨搅拌转速控制过程。本发明溶氧水平高，适于基因工程菌高密度培养。

Description

基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器及培养控制方法

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，以及采用该反应器的培养控制方法，属于生物发酵工程技术领域。

背景技术

随着基因工程技术的发展，越来越多的生物制品可通过基因工程工艺制得。其中，大肠杆菌与毕赤酵母已广泛应用于基因工程菌的构建，用以获得对人们有利用价值的外源基因产物。

利用基因工程菌发酵旨在获得大批量的高质量外源基因产物，同时还要尽可能减少宿主细胞自身组成成分的污染，因而其发酵工艺不同于传统微生物的发酵工艺。

传统的分批式培养采用一次性投料和放罐，其培养液初始浓度较高，容易产生底物和代谢产物的抑制作用，而且较高的发酵液浓度亦不利于氧的传递。

据申请人所知，目前，高密度发酵工艺日渐成熟，已成为生物技术中试生产的主要工艺，具有工艺稳定、发酵周期短、外源基因表达量高的优点，在某些发酵过程中其发酵周期可缩短50%以上，而菌体产量和外源基因表达量是非高密度培养的10-50倍。高密度培养工艺也已成为基因工程菌提高外源基因表达量的重要手段之一。

然而，影响基因工程菌外源基因表达量的因素较多，如：基因工程菌的特性，培养基成分，发酵时的温度、pH值、溶解氧的浓度，发酵罐中物料的混合程度，诱导物的流加方式和流加量等，其中，溶解氧的浓度和发酵罐中物料的混合程度对高密度培养基因工程外源基因表达量的影响尤为显著。

按现有基因工程菌高密度培养的方法，一般在菌体生长期溶氧浓度控制在30%左右，在诱导期溶氧浓度控制在20%左右。在菌体生长期，由于菌体中菌体数量相对稳定期的菌体数量较少，通过调控进气量等条件很容易达到30%溶氧浓度的要求。而在菌体诱导期，溶氧浓度控制在20%左右则不易达到，其原因在于：菌体诱导期属于高密度培养后期，菌体数量呈指数型扩增，对溶解氧的需求急剧增加，而普通生物反应器的气液分散性能有限，仅通过增大通气量和提高搅拌转速的手段很难满足菌体对溶解氧及混合传质的需求。针对这一难题，不少发酵工艺会使用纯氧代替空气来解决问题，然而使用纯氧不但会增加生产成本，而且会给整个发酵过程的控制带来不便。

目前，基因工程菌高密度培养常用生物反应器主要有三大类：气升式反应器、通风搅拌反应器、自吸式反应器。

气升式反应器分为气升式外环流反应器和气升式内环流反应器。由于其具有结构简单、运行时剪应力较小等特点，广泛应用于剪切敏感型微生物发酵过程。气升式反应器主要利用气体的喷射功能和流体介质的密度差来推动反应体系循环流动。在气升式反应器中可通过安装导流筒来增强发酵罐内反应体系循环流动和混合传质的效果。气升式反应器可提高气液分布的均匀性和溶氧速率，但它要求较高的通气量和通气压力，这在一定程度上导致能耗增加，尤其对于粘度较高的发酵体系，其氧传质系数较小，混合效果较差。在用于基因工程菌高密度培养时，其混合传质效果难以达到要求，当通气量较大时容易产生大量的泡沫，增大染菌的几率。

与气升式反应器相比，通风搅拌反应器结构较为复杂。通风搅拌反应器通常由罐体、搅拌装置、通气装置和其它附属装置构成。其中，搅拌装置设于罐体中间并与罐体采用无菌密封，通气装置的气体分布器设于罐体底部位置。气体经通气装置从气体分布器喷射出来，依靠高速旋转的搅拌桨叶实现混合传质。通风搅拌反应器适用于大多数好氧发酵过程，但也存在不足，如，为实现较高的溶氧浓度和混合传质就要增大搅拌转速和通气量，这会增加能耗，并使罐体中整体剪应力增大，不利于剪切敏感型微生物生长，尤其是在丝状菌体培养时对细胞的损伤较大。

自吸式反应器是一种利用气液分散转子高速转动、主动将外界气体吸入罐体的反应器，因具有优秀的气液分散性能和低耗能的特性而得到广泛的应用，尤其在食醋和酵母的发酵生产中应用更加成熟。然而，现有自吸式反应器的结构也存在不尽合理的地方，主要体现在：气液分散转子吸气量小、罐体高径比不能过大、罐体体积也不可太大，这就限制了反应器的发酵容量。

现有自吸式反应器的气液分散转子一般设于罐体底部或中间位置处。

气液分散转子设于罐体底部时由于有较高的液位差，导致气液分散转子临界转速增大、吸气量减小，随着罐体高径比的增大这种现象更加严重。由于气液分散转子较小且放置于罐体底部，在发酵过程中罐体中上部的发酵液只是在气泡的带动下进行整体宏观循环，其宏观混合强度较弱，会导致传质效果下降，物料混合不均匀。在粘度较大的反应体系中混合传质效果会更差。

气液分散转子设于罐体中间位置时，与气液分散转子置于罐体底部的反应器相比其临界转速降低、同等转速下的吸气量增大，但会出现罐体上部气含率大于罐体下部气含率的现象，而该现象极不利于微生物的生长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，可满足高溶氧浓度的需求，利于实施基因工程菌高密度培养。此外，还提供采用该反应器的培养控制方法。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，包括上部设加料孔、下部设放料口的罐体，其特征是，所述罐体顶部外侧设有搅拌驱动电机，所述搅拌驱动电机输出轴与伸入罐体的搅拌桨传动连接；所述罐体底部外侧设有转子驱动电机，所述转子驱动电机输出轴与位于罐体内部的气液分散转子传动连接，所述气液分散转子具有顶部设进气口且下部设出气口的通气内腔，所述进气口经管路与带压空气源连接；所述罐体底部内侧还固连有气液分散定子，所述气液分散定子具有设进水口和出水口的导流槽，所述导流槽的进水口靠近气液分散转子、出水口远离气液分散转子；所述气液分散定子位于气液分散转子周向，所述气液分散定子与气液分散转子同轴并构成转动副。

该结构在使用时，一方面以顶置式搅拌桨持续搅拌罐内混合物，另一方面气液分散转子持续转动，使空气源输入的气体与罐内液体很好地混合在一起，并使气液混合物经气液分散定子喷射入罐体，分散效果好，溶氧效率高，可满足高溶氧浓度的需求。

本发明反应器进一步完善的技术方案如下：

优选地，所述气液分散转子为多弯叶空腔转子，所述各弯叶由上部弧形部分和下部垂直部分构成，所述各弯叶上部弧形部分沿转子转动方向扭曲；所述各弯叶上部弧形部分的顶端与转子上端口固连，所述各弯叶下部垂直部分的底端与转子底面固连；所述各弯叶与转子底面及转子上端口共同围成通气内腔，所述各弯叶内侧形成空气导流弯道、外侧形成液体导流弯道；所述通气内腔的进气口位于转子上端口，所述通气内腔的出气口有多个、分别位于各弯叶下部垂直部分。

申请人在深入实践研究中发现，气液分散转子采用这种结构可增大其内部空腔的空间，有利于提高气液分散转子的吸气量，气液分散转子内部与转动方向一致的空气导流弯道，可使空腔内部的气体获得更大的动力，喷射速度更大、气液分散更均匀；气液分散转子外部与转动方向一致的液体导流弯道，可在高速转动的情况下带动气液分散转子上部周围的液体以高度湍动的状态向下运动。这样可增加气液分散转子的排液量和吸气量，可使液体与空腔喷出的气体有效混合，提高溶氧水平。

更优选地，所述各弯叶上部弧形部分的弧度直径为整个气液分散转子直径的2/5-3/5；所述各弯叶下部垂直部分的高度为整个气液分散转子高度的1/3-1/2；所述各弯叶上部弧形部分的扭曲角度为20°-60°。

申请人在深入实践研究中发现，以上结构可进一步优化气液分散转子的性能，进一步提高溶氧水平。

优选地，所述气液分散定子呈环形；所述气液分散定子顶面的外边缘部分向下倾斜、且中间部分与底面平行并设有用以安置气液分散转子的开孔；所述气液分散定子的顶面和底面之间设有若干导流槽，所述各导流槽的进水口为位于顶面且均匀分布于开孔周围的进水孔；所述各导流槽的出水口位于气液分散定子的外侧面。

申请人经深入实践研究发现，气液分散定子采用该结构后，导流槽内端开口面积大于外端开口面积，可大大减小流体通过气液分散定子的阻力，能使气液分散转子甩出的流体更加顺畅地通过导流槽分散开来；进水孔的位置及布置方式可增大气液分散转子的排液量，提高气液分散效果。

更优选地，所述气液分散定子顶面外边缘部分与底面之间夹角为8°-20°；导流槽与过导流槽外端点的径向夹角为15°-45°。

申请人经深入实践研究发现，以上结构可有效地使导流槽方向与气液分散转子甩出流体方向保持一致，进一步减少流体通过时的阻力。

此外，本发明反应器还可具有如下优选特征：

优选地，所述空气源包括依次连接的空压机、油水分离器、空气储罐、空气过滤器以及空气流量计；所述空气流量计的出气口与进气管上端口连通，所述进气管下端口与气液分散转子通气内腔的进气口连通；所述进气管下端口与气液分散转子密封转动连接。

优选地，所述搅拌桨包括与搅拌驱动电机输出轴传动连接的驱动轴，所述驱动轴周向设有搅拌桨叶，所述驱动轴上部周向设有消泡器。

优选地，所述罐体包括平面罐底、圆柱形罐身以及椭圆形封头罐顶；所述罐底经过渡圆弧面与罐身密封连接，所述圆弧面直径为罐身直径的1/6-1/2；所述罐顶经法兰与罐身固定连接；所述加料孔位于罐顶，所述放料口位于罐底；所述罐顶还设有人孔；所述搅拌驱动电机经无菌机械密封与罐顶密封连接，所述转子驱动电机经无菌机械密封与罐底密封连接；所述罐身中下部内侧设有若干挡板、外侧设有具有冷却水进口和冷却水出口的夹套；所述罐身还设有传感器接口。

本发明还提供：

一种采用前述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器的高密度培养控制方法，其特征是，包括气液分散转子通气量控制过程、气液分散转子转速控制过程、以及搅拌桨搅拌转速控制过程；

所述气液分散转子通气量控制过程为：将气液分散转子通气量控制在气液分散转子临界通气量的70-95%；所述气液分散转子临界通气量的确定过程为：先控制气液分散转子以预定转速转动，再通过空气源逐渐加大气液分散转子通气内腔进气口的通气量，当气体不再以气液分散形式而是以鼓泡形式从气液分散转子通气内腔出气口进入罐体时，此时的通气量即为气液分散转子临界通气量；

所述气液分散转子转速控制过程为：将气液分散转子转速控制在气液分散转子临界转速的110-150％；所述气液分散转子临界转速的确定过程为：先控制空气源以预定通气量向气液分散转子通气，再逐渐增大气液分散转子的转速，当气体能以气液分散形式随气液分散转子甩出的液体沿罐体底面运动至罐体径向最远端时，此时的转速即为气液分散转子临界转速；

所述搅拌桨搅拌转速控制过程为：将搅拌桨搅拌转速控制在搅拌桨搅拌最大转速的60-90％；所述搅拌桨搅拌最大转速的确定过程为：先控制气液分散转子以预定转速转动、并控制空气源以预定通气量向气液分散转子通气，再逐渐增大搅拌桨的搅拌转速，在此过程中容积氧传质系数K_La随搅拌转速的增大而增大、并最后趋于稳定，当K_La达到最大K_La的85%时所对应的搅拌转速即为搅拌桨搅拌最大转速。

申请人在前述反应器基础上经深入实践研究发现，气液分散转子通气量大于临界通气量时，气体以鼓泡的形式溢出，分散效果较差，气泡较大且在液相中停留时间较短，导致氧传质系数变低。气液分散转子转速低于临界转速时，不但会使部分气泡以鼓泡的形式溢出，而且会使罐体底部靠外的边缘产生死区，容易导致此处物料堆积。在一定通气量和一定气液分散转子转速的条件下，搅拌桨搅拌转速大于最大转速时，其K_La增加幅度较少，混合传质效果的提高亦不明显，而且会导致整体剪应力和搅拌功率的增加。申请人在此基础上进一步深入研究，终于得出上述高密度培养控制方法。采用该控制方法后，使前述反应器更加适合基因工程菌高密度培养发酵生产，尤其适合高粘度、高密度和剪切敏感型微生物的发酵生产，进一步地有效解决基因工程菌高密度培养中供氧不足的技术难题，进一步提高混合传质的效果并减少能耗。

优选地，还包括培养前搅拌桨选择过程：

当罐体高径比小于1.5、且装液高度与罐体直径比小于1时，采用一层搅拌桨；当罐体高径比大于或等于1.5、且装液高度与罐体直径比在1-2之间时，采用两层或三层搅拌桨；所述搅拌桨的桨叶为径向桨或下压式轴流桨。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、气液分散性能好、氧传质速率高，通气量与现有生物反应器相比较小，空气利用率高，可有效减少空压机工作负荷，降低生产能耗。

2、所需搅拌桨的搅拌转速可低于现有机械搅拌生物反应器，使本发明反应器具有剪应力低的特点，可适用于剪切敏感型的菌体培养。

3、溶氧水平高，混合效果好，适合于高粘度、高密度微生物的培养，尤其适于基因工程菌高密度培养，可满足高密度菌体对溶解氧的需要，克服了现有生物反应器用于基因工程菌高密培养溶氧不足的技术难题，提高了混合传质的效果。

4、装置操作弹性大，可满足各种不同的发酵条件，适用范围广泛。

5、具有一整套的装置系统，可以对各个环节进行优化，在保证溶氧和混合传质效果不变的条件下方便进行装置的大型化操作。

附图说明

图1为本发明实施例反应器的结构示意图。

图2为图1实施例气液分散转子的结构示意图。

图3为图2的俯视图。

图4为图3的A-A剖视图。

图5为图1实施例气液分散定子的俯视图。

图6为图5的B-B剖视图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例

如图1至图6所示，本实施例的基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，包括上部设加料孔4、下部设放料口15的罐体，罐体顶部外侧设有搅拌驱动电机6，搅拌驱动电机6输出轴与伸入罐体的搅拌桨传动连接；罐体底部外侧设有转子驱动电机16，转子驱动电机16输出轴与位于罐体内部的气液分散转子18传动连接，气液分散转子18具有顶部设进气口且下部设出气口的通气内腔，进气口经管路与带压空气源连接；罐体底部内侧还固连有气液分散定子19，气液分散定子19具有设进水口和出水口的导流槽；气液分散定子19位于气液分散转子18周向，气液分散定子19与气液分散转子18同轴并构成转动副；导流槽的进水口靠近气液分散转子、出水口远离气液分散转子。

罐体包括平面罐底、圆柱形罐身以及椭圆形封头罐顶。罐底为平面可以减小气液流体在罐体底部运动的阻力，可有效减少物料沉淀堆积到罐底气液分散转子周围的机率，可减少气液分散转子转动的阻力和设备维修的次数。椭圆形封头罐顶可以增强罐体的强度。

罐底经过渡圆弧面14与罐身密封连接，圆弧面14直径为罐身直径的1/6-1/2。这样可减少罐体底部外边缘的死区，还可以增强罐体强度，有利于大型罐体的制造。

罐顶经法兰3与罐身固定连接；加料孔4位于罐顶，放料口15位于罐底；罐顶还设有人孔7；搅拌驱动电机6经无菌机械密封5与罐顶密封连接，转子驱动电机16经无菌机械密封17与罐底密封连接；罐身中下部内侧设有若干挡板11、外侧设有具有冷却水进口13和冷却水出口21的夹套10；罐身还设有传感器接口20。本实施例中，挡板11有四块，其宽度为罐身直径的1/10。

空气源包括依次连接的空压机25、油水分离器24、空气储罐23、空气过滤器22以及空气流量计21；空气流量计21的出气口与进气管2上端口连通，进气管2下端口与气液分散转子18通气内腔的进气口连通；进气管2下端口与气液分散转子18密封转动连接。利用空压机供气，可增大进气量，提高溶氧水平，减少罐体中液位差对进气量的影响，可方便反应器的大型化操作。

如图2至图4所示，气液分散转子18为多弯叶空腔转子（具体可采用九弯叶空腔转子），各弯叶由上部弧形部分27和下部垂直部分26构成，各弯叶上部弧形部分27沿转子转动方向扭曲；各弯叶上部弧形部分27的顶端与转子上端口28固连，各弯叶下部垂直部分26的底端与转子底面固连；各弯叶与转子底面及转子上端口28共同围成通气内腔，各弯叶内侧形成空气导流弯道、外侧形成液体导流弯道；通气内腔的进气口位于转子上端口28，通气内腔的出气口29有多个、分别位于各弯叶下部垂直部分26。

各弯叶上部弧形部分27的弧度30直径为整个气液分散转子18直径的2/5-3/5；各弯叶下部垂直部分26的高度为整个气液分散转子18高度的1/3-1/2；各弯叶上部弧形部分27的扭曲角度C为20°-60°。

气液分散定子19呈环形；气液分散定子19顶面的外边缘部分向下倾斜、且中间部分与底面平行并设有用以安置气液分散转子18的开孔；气液分散定子19的顶面和底面之间设有若干导流槽（具体可采用12-18个导流槽），各导流槽的进水口为位于顶面且均匀分布于开孔周围的进水孔31；各导流槽的出水口位于气液分散定子19的外侧面。

气液分散定子19顶面外边缘部分与底面之间夹角E为8°-20°；导流槽与过导流槽外端点的径向夹角D为15°-45°。

搅拌桨包括与搅拌驱动电机6输出轴传动连接的驱动轴9，驱动轴9周向设有搅拌桨叶12，驱动轴9上部周向设有消泡器8。

搅拌桨叶可使发酵液中的气体随桨叶在罐体中循环，增加气液接触时间，提高氧传质效率，同时桨叶的转动可增加液体湍动强度，减少液相的混合时间，提高混合效率。由于在气液分散转子的作用下，气液分散性较好、气泡直径较小，搅拌桨不需要靠高转速来提高气液分散度，仅需保持较低转速来加强发酵液的整体宏观混合即可，这样即可使整个反应器的剪应力较现有通风搅拌式的生物反应器小。消泡器可以将发酵过程中产生的气泡破碎消除，减少染菌机率。

采用本实施例基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器的高密度培养控制方法，包括气液分散转子通气量控制过程、气液分散转子转速控制过程、以及搅拌桨搅拌转速控制过程。

气液分散转子通气量控制过程为：将气液分散转子通气量控制在气液分散转子临界通气量的70-95%；气液分散转子临界通气量的确定过程为：先控制气液分散转子以预定转速转动，再通过空气源逐渐加大气液分散转子通气内腔进气口的通气量，当气体不再以气液分散形式而是以鼓泡形式从气液分散转子通气内腔出气口进入罐体时，此时的通气量即为气液分散转子临界通气量。

由于通入空气的动能来源于空压机的压力、以及气液分散转子转动导致转子周围液体被高速甩出而在其周围形成的负压吸力，因此，整个反应器所需的通气压力比较低，可有效降低空压机负荷，减少能耗。

当通气量逐渐增大，气液分散转子周围液体逐渐被空气排开，气液分散转子的排液量逐渐减少，转动形成的真空度也随之减小，由液体夹带甩出的气体逐渐减少，最终气体会以鼓泡的方式从气液分散转子进入罐体。申请人将这一过程的临界点定为气液分散转子临界通气量。

申请人发现，若通气量过小，体系供氧不足，反应器性能无法得到充分发挥；若通气量大于临界通气量，则气体将以鼓泡的形式进入液体，无法发挥气液分散转子的气液分散作用，气泡的直径将明显增大，氧传质速率下降，同时罐体中液面将发生剧烈的抖动，影响装液量。申请人经进一步深入研究，并综合考虑通气的不稳定性以及气体在液体中运动特性等因素，终于得出上述气液分散转子通气量控制过程。

气液分散转子转速控制过程为：将气液分散转子转速控制在气液分散转子临界转速的110-150％；气液分散转子临界转速的确定过程为：先控制空气源以预定通气量向气液分散转子通气，再逐渐增大气液分散转子的转速，当气体能以气液分散形式随气液分散转子甩出的液体沿罐体底面运动至罐体径向最远端时，此时的转速即为气液分散转子临界转速。

在一定量的通气条件下，气液分散转子以一定的转速转动，其周围液体剧烈湍动并产生离心运动向所述罐体直边壁面运动，在气液分散转子周围形成负压。空气在空压机的压力和由气液分散转子转动形成的负压吸力作用下，随液体甩出并沿罐体底面运动，在此过程中液体喷射强度较大，空气被分割成较小的气泡，气泡沿罐底均匀地向罐壁面运动，达到罐体径向最远端所需的最小转速即为气液分散转子临界转速。气液沿罐体底部运动可避免物料在罐底和气液分散转子部位的堆积，提高原料的混合均匀度、减少设备维修的机率。

申请人发现，当气液分散转子转速小于临界转速时，气体不能到达罐壁位置，容易形成溶氧死区，不利于微生物的生长；当气液分散转子转速大于临界转速时，液相喷射强度较为强烈，空气被撕裂成更小的气泡，有利于氧的混合传质，但过高的转速会使剪应力和耗能增加。申请人经进一步深入研究，终于得出上述气液分散转子转速控制过程。

搅拌桨搅拌转速控制过程为：将搅拌桨搅拌转速控制在搅拌桨搅拌最大转速的60-90％；搅拌桨搅拌最大转速的确定过程为：先控制气液分散转子以预定转速转动、并控制空气源以预定通气量向气液分散转子通气，再逐渐增大搅拌桨的搅拌转速，在此过程中容积氧传质系数K_La随搅拌转速的增大而增大、并最后趋于稳定，当K_La达到最大K_La的85%时所对应的搅拌转速即为搅拌桨搅拌最大转速。

反应器传氧效率的高低可以通过容积氧传质系数K_La的大小来表征。当以一定的通气量进气并以一定气液分散转子转速转动时，K_La随着搅拌转速的增大而增大，最后趋于稳定。由于气液分散转子具有很好的气液分散性能，减弱了高搅拌转速对于撕裂气泡、增大气液比表面积以提高K_La的作用，从而避免高搅拌转速会增加的剪切和能耗。本实施例反应器的搅拌桨只需在较低的搅拌转速下，起到增强气液宏观混合的效果即可。申请人经进一步深入研究，终于得出上述搅拌桨搅拌转速控制过程，既可保证气液的整体宏观混合，又可降低整个装置的能耗。

此外，与最大搅拌转速相关的因素较多，其中，桨叶类型和桨叶层数对最大搅拌转速影响较大。

对于本实施例罐体中发酵液而言：气液分散转子转动，其周围液体产生离心运动，形成负压，将气液分散转子上部液体和由进气管通入的气体混合，沿罐体底部射向罐体壁面，在壁面的阻挡下沿罐体壁面向上运动，在上升过程中多个小气泡相互碰撞导致气泡间液膜厚度变薄，最终气泡发生聚并，气泡直径变大；当到达液面处，部分气体溢出液面，剩余气体随液体沿搅拌轴向下流向气液分散转子，形成循环。

当罐体高径比小于1.5、且装液量高度与罐体直径比小于1时，可设一层搅拌桨。当罐体高径比大于或等于1.5、且装液高度与罐体直径比在1～2之间时，可根据发酵液体系特性采用两层或三层搅拌桨。同时，要根据发酵液体系粘度确定搅拌桨叶类型，当粘度较高、混合效果较差、气泡聚并现象严重的情况下，搅拌桨叶可采用功率准数较小的径向桨，如六抛物线涡轮桨和六半圆管涡轮桨，但并不限制使用这两种桨叶。当粘度不大时可采用排量较大的下压式轴流桨，如三宽叶桨和四梅花叶桨，但并不限制使用这两种桨叶。根据实际情况选用桨叶类型和桨叶层数可以有效降低最大搅拌转速，从而减小剪切力和能耗。

具体应用案例如下：

冷模实验1：（冷模实验即无化学反应的模拟实验，下同）

反应器尺寸为：罐体直径为700mm，有效容积为300L；气液分散转子直径为96mm；气液分散定子采用12导流槽设计，外径为168mm；四块挡板宽度均为70mm。装液高度为700mm，设一层搅拌桨，桨叶为四梅花轴流桨，桨叶径为200mm。

测定体系为自来水，体系温度为25℃。

气液分散转子不同转速下的临界通气量测定结果如表1所示，不同通气量下气液分散转子临界转速测定结果如表2所示。

表1、气液分散转子不同转速下的临界通气量

先在以气液分散转子转速为1500r/min、85%临界通气量的条件下进行反应器控制条件测定，即以通气量为7.2m³/h的条件下测定气液分散转子临界转速，测定结果为1320r/min，将气液分散转子转速设定为临界转速的120%，即为1584r/min。再以通气量为7.2m³/h、气液分散转子转速1584r/min的条件测定搅拌最大转速，测定结果为240r/min，将搅拌转速设定为最大搅拌转速的75%，即为180r/min。

在此条件下测得K_La值为0.065S^-1，比相同条件下现有通风搅拌反应器的K_La提高30%以上。

冷模实验2：

反应器尺寸为：罐体直径为700mm，有效容积为300L；气液分散转子直径为96mm；气液分散定子采用12导流槽设计，外径为168mm；四块挡板宽度均为70mm。装液高度为700mm，设一层搅拌桨，桨叶为四梅花轴流桨，桨叶径为200mm。

测定体系为质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，体系温度为25℃。

气液分散转子不同转速下的临界通气量测定结果如表3所示，不同通气量下气液分散转子临界转速测定结果如表4所示。

表3、气液分散转子不同转速下的临界通气量

先在以气液分散转子转速为1500r/min、85%临界通气量的条件下进行反应器控制条件测定，即以通气量为6.9m³/h的条件下测定气液分散转子临界转速，测定结果为1300r/min，将气液分散转子转速设定为临界转速的120%，即为1560r/min。再以通气量为6.9m³/h、气液分散转子转速1560r/min的条件测定搅拌最大转速，测定结果为260r/min，将搅拌转速设定为最大搅拌转速的75%，即为195r/min。

在此条件下测得K_La值为0.055S^-1，比相同条件下现有通风搅拌反应器的K_La提高35%以上。

实施案例1：

反应器尺寸为：罐体体积为5m³，罐体高径比为2.2﹕1，气液分散转子直径为215mm，气液分散定子采用16导流槽设计，外径为405mm，四块挡板宽度均为140mm。设两层搅拌桨，桨叶直径为500mm。

本实施案例在装液量为2.8t的条件下，测定气液分散转子转速为2100r/min的临界通气量、该通气量下的气液分散转子临界转速以及最大搅拌转速。

测得临界通气量为134.4m³/h，按照85%的临界通气量即114.2m³/h进气，测得气液分散转子临界转速为1950r/min。设定气液分散转子转速为临界转速的120%即2340r/min，测得最大搅拌转速为210r/min，将搅拌转速设定为最大搅拌转速的75%即158r/min。

以产谷胱甘肽的基因工程菌毕赤酵母作为菌种，经过一级、二级种子培养后，按照3%（v/v）的接种量接种到含发酵培养基的反应器中进行高密度培养。

装液量为2.8t，发酵过程中流加甘油来满足菌体生长，通过流加氨水控制pH为6.5，温度控制在31℃，在发酵后期添加L-半胱氨酸、L-甘氨酸以及L-谷氨酸保证菌体的生长，培养51h，利用四氧衍生物法测定发酵液中谷胱氨酸的含量，谷胱氨酸的含量为6.5g/L。

与此相比，在相同发酵和操作条件下以现有通用式机械通风搅拌反应器培养，最终测定谷胱氨酸的含量仅为4.1g/L。本实施案例所得发酵液中的谷胱氨酸含量是其1.59倍。

实施案例2：

反应器尺寸为：罐体体积为5m³，罐体高径比为2.2﹕1，气液分散转子直径为215mm，气液分散定子采用16导流槽设计，外径为405mm，四块挡板宽度均为140mm。设两层搅拌桨，桨叶直径为500mm。

本实施案例在装液量为2.8t的条件下，测定气液分散转子转速为2100r/min的临界通气量、该通气量下的气液分散转子临界转速以及最大搅拌转速。

测得临界通气量为134.4m³/h，按照70%的临界通气量即94m³/h进气，测得气液分散转子临界转速为1780r/min。设定气液分散转子转速为临界转速的120%即2136r/min，测得最大搅拌转速为240r/min，将搅拌转速设定为最大搅拌转速的75%即180r/min。

以产谷胱甘肽的基因工程菌毕赤酵母作为菌种，经过一级、二级种子培养后，按照3%（v/v）的接种量接种到含发酵培养基的反应器中进行高密度培养。

装液量为2.8t，发酵过程中流加甘油来满足菌体生长，通过流加氨水控制pH为6.5，温度控制在31℃，在发酵后期添加L-半胱氨酸、L-甘氨酸以及L-谷氨酸保证菌体的生长，培养51h，利用四氧衍生物发测定发酵液中谷胱氨酸的含量，谷胱氨酸的含量为5.2g/L。

与此相比，在相同发酵和操作条件以现有通用式机械通风搅拌反应器培养，最终测定谷胱氨酸的含量仅为3.3g/L。本实施案例所得发酵液中的谷胱氨酸含量是其1.58倍。

实施案例3：

反应器尺寸为：罐体体积为5m³，罐体高径比为2.2﹕1，气液分散转子直径为215mm，气液分散定子采用16导流槽设计，外径为405mm，四块挡板宽度均为为140mm。设两层搅拌桨，桨叶直径为500mm。

本实施案例在装液量为2.8t的条件下，测定气液分散转子转速为2100r/min的临界通气量、该通气量下的气液分散转子临界转速以及最大搅拌转速。

测定临界通气量为134.4m³/h，按照95%的临界通气量即127.7m³/h进气，测得气液分散转子临界转速为2020r/min。设定气液分散转子转速为临界转速的120%即2424r/min，测得最大搅拌转速为195r/min，将搅拌转速设定为最大搅拌转速的75%即146r/min。

以产谷胱甘肽的基因工程菌毕赤酵母作为菌种，经过一级、二级种子培养后，按照3%（v/v）的接种量接种到含发酵培养基的反应器中进行高密度培养。

装液量为2.8t，发酵过程中流加甘油来满足菌体生长，通过流加氨水控制pH为6.5，温度控制在31℃，在发酵后期添加L-半胱氨酸、L-甘氨酸以及L-谷氨酸保证菌体的生长，培养51h，利用四氧衍生物发测定发酵液中谷胱氨酸的含量，谷胱氨酸的含量为5.4g/L。

与此相比，在相同发酵和操作条件下以现有通用式机械通风搅拌反应器培养，最终测定谷胱氨酸的含量仅为4.5g/L。本实施案例所得发酵液中的谷胱氨酸含量是其1.2倍。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，包括上部设加料孔、下部设放料口的罐体，其特征是，所述罐体顶部外侧设有搅拌驱动电机，所述搅拌驱动电机输出轴与伸入罐体的搅拌桨传动连接；所述罐体底部外侧设有转子驱动电机，所述转子驱动电机输出轴与位于罐体内部的气液分散转子传动连接，所述气液分散转子具有顶部设进气口且下部设出气口的通气内腔，所述进气口经管路与带压空气源连接；所述罐体底部内侧还固连有气液分散定子，所述气液分散定子具有设进水口和出水口的导流槽，所述导流槽的进水口靠近气液分散转子、出水口远离气液分散转子；所述气液分散定子位于气液分散转子周向，所述气液分散定子与气液分散转子同轴并构成转动副。

2.根据权利要求1所述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，其特征是，所述气液分散转子为多弯叶空腔转子，所述各弯叶由上部弧形部分和下部垂直部分构成，所述各弯叶上部弧形部分沿转子转动方向扭曲；所述各弯叶上部弧形部分的顶端与转子上端口固连，所述各弯叶下部垂直部分的底端与转子底面固连；所述各弯叶与转子底面及转子上端口共同围成通气内腔，所述各弯叶内侧形成空气导流弯道、外侧形成液体导流弯道；所述通气内腔的进气口位于转子上端口，所述通气内腔的出气口有多个、分别位于各弯叶下部垂直部分。

3.根据权利要求2所述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，其特征是，所述各弯叶上部弧形部分的弧度直径为整个气液分散转子直径的2/5-3/5；所述各弯叶下部垂直部分的高度为整个气液分散转子高度的1/3-1/2；所述各弯叶上部弧形部分的扭曲角度为20°-60°。

4.根据权利要求1所述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，其特征是，所述气液分散定子呈环形；所述气液分散定子顶面的外边缘部分向下倾斜、且中间部分与底面平行并设有用以安置气液分散转子的开孔；所述气液分散定子的顶面和底面之间设有若干导流槽，所述各导流槽的进水口为位于顶面且均匀分布于开孔周围的进水孔；所述各导流槽的出水口位于气液分散定子的外侧面。

5.根据权利要求4所述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，其特征是，所述气液分散定子顶面外边缘部分与底面之间夹角为8°-20°；导流槽与过导流槽外端点的径向夹角为15°-45°。

6.根据权利要求1至5任一项所述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，其特征是，所述空气源包括依次连接的空压机、油水分离器、空气储罐、空气过滤器以及空气流量计；所述空气流量计的出气口与进气管上端口连通，所述进气管下端口与气液分散转子通气内腔的进气口连通；所述进气管下端口与气液分散转子密封转动连接。

7.根据权利要求1至5任一项所述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，其特征是，所述搅拌桨包括与搅拌驱动电机输出轴传动连接的驱动轴，所述驱动轴周向设有搅拌桨叶，所述驱动轴上部周向设有消泡器。

8.根据权利要求1至5任一项所述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器，其特征是，所述罐体包括平面罐底、圆柱形罐身以及椭圆形封头罐顶；所述罐底经过渡圆弧面与罐身密封连接，所述圆弧面直径为罐身直径的1/6-1/2；所述罐顶经法兰与罐身固定连接；所述加料孔位于罐顶，所述放料口位于罐底；所述罐顶还设有人孔；所述搅拌驱动电机经无菌机械密封与罐顶密封连接，所述转子驱动电机经无菌机械密封与罐底密封连接；所述罐身中下部内侧设有若干挡板、外侧设有具有冷却水进口和冷却水出口的夹套；所述罐身还设有传感器接口。

9.一种采用前述基因工程菌高密度培养用高溶氧生物反应器的高密度培养控制方法，其特征是，包括气液分散转子通气量控制过程、气液分散转子转速控制过程、以及搅拌桨搅拌转速控制过程；

所述气液分散转子通气量控制过程为：将气液分散转子通气量控制在气液分散转子临界通气量的70-95%；所述气液分散转子临界通气量的确定过程为：先控制气液分散转子以预定转速转动，再通过空气源逐渐加大气液分散转子通气内腔进气口的通气量，当气体不再以气液分散形式而是以鼓泡形式从气液分散转子通气内腔出气口进入罐体时，此时的通气量即为气液分散转子临界通气量；

所述气液分散转子转速控制过程为：将气液分散转子转速控制在气液分散转子临界转速的110-150％；所述气液分散转子临界转速的确定过程为：先控制空气源以预定通气量向气液分散转子通气，再逐渐增大气液分散转子的转速，当气体能以气液分散形式随气液分散转子甩出的液体沿罐体底面运动至罐体径向最远端时，此时的转速即为气液分散转子临界转速；

所述搅拌桨搅拌转速控制过程为：将搅拌桨搅拌转速控制在搅拌桨搅拌最大转速的60-90％；所述搅拌桨搅拌最大转速的确定过程为：先控制气液分散转子以预定转速转动、并控制空气源以预定通气量向气液分散转子通气，再逐渐增大搅拌桨的搅拌转速，在此过程中容积氧传质系数K_La随搅拌转速的增大而增大、并最后趋于稳定，当K_La达到最大K_La的85%时所对应的搅拌转速即为搅拌桨搅拌最大转速。

10.根据权利要求9所述高密度培养控制方法，其特征是，还包括培养前搅拌桨选择过程：

当罐体高径比小于1.5、且装液高度与罐体直径比小于1时，采用一层搅拌桨；当罐体高径比大于或等于1.5、且装液高度与罐体直径比在1-2之间时，采用两层或三层搅拌桨；所述搅拌桨的桨叶为径向桨或下压式轴流桨。

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