CN103508910B - β-兴奋剂类半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种β-兴奋剂类半抗原。本发明还公开了所述半抗原的制备方法及其应用。基于β-兴奋剂类半抗原建立的试剂盒快速检测产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于动物源性样品中β-兴奋剂类药物残留的现场监控和大量样本的筛查。<!--1-->

Description

β-兴奋剂类半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及β-兴奋剂类半抗原及其制备方法和应用。

技术背景

β-兴奋剂（β-agonist）全称β-肾上腺素受体激动剂（β-adrenoceptoragonist），又叫β-激动剂，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物。常见的β-兴奋剂为克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、非诺特罗、特布他林等。β-兴奋剂能选择性地与细胞膜上的β-肾上腺素受体结合，起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，因此在临床上常用于人和动物哮喘类病症的治疗。20世纪80年代有研究表明，β-兴奋剂影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，使体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加，显著提高瘦肉率。β-兴奋剂残留会聚集在动物可食用组织中，由于这类化合物具有口服活性，如果违法超量使用将会对人与动物的肝、肾等内脏器官产生毒副作用。因此世界各国已将这类物质列为禁止用于食品动物的化学物质。

目前国内外关于β-兴奋剂类药物残留的主要检测方法有色谱法，如气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气质联用法（GC-MS）、液质联用法（LC-MS）；免疫分析法，如酶联免疫法、胶体金免疫法、时间分辨免疫荧光测定等。色谱方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用；与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-兴奋剂类半抗原及其制备方法。

本发明提供的β-兴奋剂类半抗原，分子结构式为：

。

本发明提供的β-兴奋剂类半抗原的制备方法，包括如下步骤：

1.0g沙丁胺醇，溶入20mlN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入10%摩尔当量的四甲基哌啶氧化物、10%摩尔当量的四丁基氯化铵和20ml0.5mol/L的NaHCO₃水溶液，室温下搅拌30min后，加入1.1摩尔当量的N-氯代琥珀酰亚胺，室温反应2~5h后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体沙丁胺醇单氧化物，即为β-兴奋剂类半抗原。

本发明的另一个目的是上述β-兴奋剂类半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述β-兴奋剂类半抗原与载体蛋白偶联得到的β-兴奋剂类抗原，及由所得β-兴奋剂类抗原免疫动物制备得到的β-兴奋剂类抗体。

其中所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述抗体为β-兴奋剂类单克隆抗体。

本发明还提供由上述β-兴奋剂类抗体制备的酶联免疫试剂盒，及其在检测组织、肝脏、尿液、血清、饲料、牛奶、奶粉样品中β-兴奋剂类残留的应用。

本发明提供的β-兴奋剂类半抗原既最大程度地保留了β-兴奋剂类母核的化学结构，又通过化学合成改造引入了可以与蛋白质偶联的—CHO，合成方法简单，纯度、产率较高；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，可以同时检测克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗六种药物，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于组织、肝脏、尿液、血清、饲料、牛奶、奶粉样品中β-兴奋剂类残留的现场监控和大量样本的筛查。本发明的β-兴奋剂类半抗原在β-兴奋剂类药物的残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：β-兴奋剂类半抗原合成路线图

图2：β-兴奋剂类半抗原核磁共振氢谱图

图3：β-兴奋剂类酶联免疫试剂盒标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1β-兴奋剂类半抗原的合成和鉴定

一、β-兴奋剂类半抗原的合成（合成路线如图1）

1.0g沙丁胺醇，溶入20mlN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入10%摩尔当量的四甲基哌啶氧化物、10%摩尔当量的四丁基氯化铵和20ml0.5mol/L的NaHCO₃水溶液，室温下搅拌30min后，加入1.1摩尔当量的N-氯代琥珀酰亚胺，室温反应2~5h后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体沙丁胺醇单氧化物，即为β-兴奋剂类半抗原。

二、β-兴奋剂类半抗原的鉴定

取合成的β-兴奋剂类半抗原经核磁共振氢谱测定，如图2所示，图谱中10.2ppm左右增加的醛基信号峰说明半抗原合成成功。

实施例2β-兴奋剂类抗原

将β-兴奋剂类半抗原与载体蛋白进行偶联得到β-兴奋剂类抗原。

一、免疫原的制备——β-兴奋剂类半抗原-牛血清白蛋白偶联物合成

取7mg半抗原，溶解于1mlN,N-二甲基甲酰胺中，取碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各30mg用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mlPBS（pH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到β-兴奋剂类免疫原；分装，于-20℃保存备用。

二、包被原的制备——β-兴奋剂类半抗原-卵清蛋白偶联物合成

取7mg半抗原，溶解于1mlN,N-二甲基甲酰胺中，取30mg碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mlPBS（pH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到β-兴奋剂类包被原；分装，于-20℃保存备用。

三、β-兴奋剂类抗原的鉴定

将载体蛋白、β-兴奋剂类半抗原、β-兴奋剂类半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到载体蛋白、β-兴奋剂类半抗原、β-兴奋剂类半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果发现，三者出现不同的吸收曲线，表明β-兴奋剂类半抗原与载体蛋白偶联成功，半抗原与牛血清白蛋白的结合比为(16~20):1，与卵清蛋白的结合比为(14~18):1。

实施例3β-兴奋剂类单克隆抗体

一、β-兴奋剂类单克隆抗体的制备

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将β-兴奋剂类单克隆抗体杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射β-兴奋剂类单克隆抗体杂交瘤细胞株4×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

二、单克隆抗体效价的测定

用直接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(70000~150000)。

直接竞争ELISA方法：用β-兴奋剂类单克隆抗体包被酶标板，加入克仑特罗标准品溶液、辣根过氧化物酶标记的β-兴奋剂类半抗原-卵清蛋白偶联物，25℃反应40min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3~5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

三、单克隆抗体的特异性

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗、特步它林、西马特罗、羟甲基克仑特罗、莱克多巴胺做系列稀释，分别与单克隆抗体进行直接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC₅₀，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示各类似物的交叉反应率为：克仑特罗100%、沙丁胺醇106%、塞布特罗99%、妥布特罗95%、溴布特罗69%、溴氯布特罗60%、特步它林22%、西马特罗2.3%、羟甲基克仑特罗2.7%、莱克多巴胺＜0.1%。本发明抗体可以同时检测克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗6种β-兴奋剂类药物。

实施例4由β-兴奋剂类单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒

一、酶联免疫试剂盒的组成

（1）包被β-兴奋剂类单克隆抗体的酶标板；

（2）用辣根过氧化物酶标记的β-兴奋剂类半抗原-卵清蛋白偶联物；

（3）标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L、25.6μg/L；

（4）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

（5）终止液为2mol/L硫酸；

（6）浓缩洗涤液为pH7.2，含0.8%~1.2%吐温-20、0.01‰~0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1~0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

（7）浓缩复溶液为pH7.6，含8%~12%酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点，同时采用直接竞争法，节省了检测时间。

二、酶联免疫试剂盒检测实际样本的应用

1.样品前处理

（1）尿液（猪尿、牛尿、羊尿）前处理方法

取50μl清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或离心），暂不使用的样本应冷冻保存。

（2）猪肉、猪肝前处理方法

称取2.0g±0.05g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入6ml0.5mol/LPB溶液和2ml0.2mol/LHCl溶液，用涡旋仪涡动至均匀；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；肝脏样本：取1ml上清液加入80μl1mol/L氢氧化钠溶液混匀（混匀以后测定pH值，大约为6.5）；肌肉样本：取1ml上清液加入50μl1mol/L氢氧化钠溶液混匀（混匀以后测定pH值，大约为6.5）；取50μl用于分析。

（3）鸡肉、牛肉、羊肉前处理方法

称取2.0g±0.05g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入8ml牛羊肉提取液（称取0.44g十二水合磷酸氢二钠，1.37g磷酸二氢钠和0.75g柠檬酸加入500ml去离子水充分溶解），用涡旋仪涡动至均匀；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；取1ml上清液加入20μl1mol/L氢氧化钠溶液混匀（混匀以后测定pH值为6.5-7）；取50μl用于分析。

（4）饲料（原料、浓缩料、配合料）前处理方法

称取1.0g±0.05g样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml甲醇，振荡1min；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；移取1ml上层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50-60℃水浴氮气/空气流下吹干；加入1ml正已烷，涡动1min，再加入1ml复溶工作液（用去离子水将浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释），涡动30s；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；去除上层有机相，取100μl下层水相，加400μl复溶工作液混匀；取50μl用于分析。

（5）血清（猪血清、牛血清）前处理方法

取200μl血清样本于2ml聚苯乙烯离心管中，再加入600μl复溶工作液，充分混匀；取50μl用于分析。

（6）牛奶（原奶、成品奶）前处理方法

取50μl牛奶样本直接测定，暂不使用的样本应冷藏保存。

（7）奶粉前处理方法

称取0.5g±0.05g奶粉样本于10ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml去离子水充分振荡混匀；取50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有β-兴奋剂类单克隆抗体的酶标板微孔中加入克仑特罗标准品溶液或样品溶液50μl，随即加入辣根过氧化物酶标记的β-兴奋剂类半抗原-卵清蛋白偶联物100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置25℃恒温箱中避光反应40min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤工作液（用去离子水将浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释），30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺（TMB）50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃恒温箱中避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B）除以第一个标准品溶液（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，得到百分吸光度值。以克仑特罗标准品浓度（μg/L）的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图3所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即为样本中β-兴奋剂类药物的实际浓度。

三、酶联免疫试剂盒技术参数的确定

最低检测限：对20份空白样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本β-兴奋剂类药物浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对尿液、牛奶样本的最低检测限为0.3μg/L，对组织、肝脏样本的最低检测限为0.5μg/kg，对血清样本的最低检测限为0.4μg/L，对奶粉样本的最低检测限为1μg/kg，对饲料样本的最低检测限为5μg/kg。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白尿液、牛奶样本，分别以0.3、0.6、1.2μg/L三个浓度的β-兴奋剂类药物（克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗）对其进行添加回收试验；取空白组织、肝脏样本，以0.5、1.0、2.0μg/kg三个浓度的β-兴奋剂类药物（克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗）对其进行添加回收试验；取空白血清样本，以0.4、0.8、1.6μg/L三个浓度的β-兴奋剂类药物（克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗）对其进行添加回收试验；取空白奶粉样本，以1、2、4μg/kg三个浓度的β-兴奋剂类药物（克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗）对其进行添加回收试验；取空白饲料样本，以5、10、20μg/kg三个浓度的β-兴奋剂类药物（克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、溴布特罗、溴氯布特罗）对其进行添加回收试验，结果得该方法对尿液、血清样本的回收率为100%±20%，对组织、肝脏、牛奶、奶粉、饲料样本的回收率为90%±20%，批内变异系数＜15%，批间变异系数＜25%。

经测定本发明试剂盒在2~8℃至少可以保存12个月。

Claims (6)

1.一种β-兴奋剂类抗原，其特征在于是由β-兴奋剂类半抗原与载体蛋白偶联得到的；

其中，所述β-兴奋剂类半抗原的制备方法为：1.0g沙丁胺醇，溶入20mlN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入10％摩尔当量的四甲基哌啶氧化物、10％摩尔当量的四丁基氯化铵和20ml0.5mol/L的NaHCO₃水溶液，室温下搅拌30min后，加入1.1摩尔当量的N-氯代琥珀酰亚胺，室温反应2～5h后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体沙丁胺醇单氧化物，即为β-兴奋剂类半抗原，其分子结构式为：

2.一种制备权利要求1所述的β-兴奋剂类抗原的方法，其包括如下步骤：

取7mg半抗原，溶解于1mlN,N-二甲基甲酰胺中，取碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各30mg用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取载体蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mlPBS(pH7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到β-兴奋剂类抗原；分装，于-20℃保存备用。

3.一种β-兴奋剂类抗体，其特征在于由权利要求1所述的β-兴奋剂类抗原免疫动物制备得到。

4.如权利要求3所述的β-兴奋剂类抗体，其特征在于所述抗体为β-兴奋剂类单克隆抗体。

5.由权利要求4所述的抗体制备的β-兴奋剂类酶联免疫试剂盒。

6.权利要求5所述的β-兴奋剂类酶联免疫试剂盒在检测动物源性样品中β-兴奋剂类残留的应用。