CN103018451A

CN103018451A - 检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103018451A
Application number: CN2011102790985A
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 吴鹏; 段盈盈; 浦小容; 李勇; 崔廷婷; 陈炜玲; 齐向武
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-09-20
Also published as: CN103018451B

Abstract

本发明提供了一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶标板，酶标记物，氯霉素特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)，氯霉素标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测氯霉素的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测动物组织(肌肉、肝脏等)、熟食、水产、蜂王浆、尿液、饲料和牛奶等样品中氯霉素的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，其特别适于动物组织(肌肉、肝脏等)、熟食、水产、蜂王浆、尿液、饲料和牛奶等样本中氯霉素残留的检测。

技术背景

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是20世纪中叶发现的一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抑制作用，由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而，在使用中人们发现氯霉素具有毒性，在动物性食品中的残留会通过肉、蛋、奶等动物性食品对人的健康产生毒害作用。因此，我国农业部公告第235号文件规定，氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于氯霉素的抑菌效果好，价格低，仍有人将其用于家禽、畜类、水产品中。为了保障人民的身体健康以及扩大食品的贸易往来，建立灵敏度高、特异性强、快速、经济的氯霉素残留检测方法是很有必要的。

目前，用来检测氯霉素的最常用方法主要是气相色谱、液相色谱及色谱-质谱法，这些方法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但仍存在一定缺点，如样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，已逐渐不能满足发达国家及食品加工企业对检测方法检测限的要求。与之相比，免疫学测定方法灵敏度较高、特异性强、试样预处理简单、分析时间短，适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于氯霉素检测的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它含有：

(1)包被有包被原的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)氯霉素标准品溶液；

(4)底物显色液；

(5)终止液；

(6)浓缩洗涤液；

(7)浓缩复溶液。

本发明所提供的检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，包括预包被包被原的酶标板和酶标记物工作液；所述包被原为氯霉素抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记氯霉素半抗原、酶标记氯霉素抗体或酶标记抗抗体，当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有氯霉素特异性抗体工作液。

所述氯霉素半抗原是将氯霉素分子结构中的硝基通过催化加氢反应得到的。

所述氯霉素特异性抗体为氯霉素单克隆抗体；所述氯霉素单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为氯霉素鼠单克隆抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

以上抗体均可以用氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白和纤维蛋白原等常用载体蛋白；所述氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将氯霉素半抗原和载体蛋白用戊二醛法进行偶联得到。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的；酶标记氯霉素半抗原是采用重氮化法或戊二醛法将标记酶与氯霉素半抗原偶联得到的；酶标记特异性抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与特异性抗体偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法、过碘酸钠法等，本发明经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氯霉素标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。

所述氯霉素标准品溶液：6瓶，浓度分别为0μg/L、0.025μg/L、0.075μg/L、0.3μg/L、1.2μg/L、4.8μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由显色液A液和显色液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述浓缩洗涤液优选为pH值为7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述浓缩复溶液优选为pH值为7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中在酶标板制备过程中所用的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH值为9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐温-20、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明中免疫原的合成过程为：

1.氯霉素半抗原合成(合成路线如图2)

氯霉素半抗原是将氯霉素(结构式如图1)分子结构中的硝基通过催化加氢反应得到的，具体反应步骤如下：

将氯霉素溶于甲醇中，加入5％的钯炭催化剂(Pd/C)，通入氢气，保持一定压力，室温反应2h，过滤除去Pd/C，蒸干溶剂得到淡黄色黏稠液体，即为氯霉素半抗原；其中所述Pd/C与氯霉素的摩尔比为1∶10。

2.免疫原的合成

将氯霉素半抗原与载体蛋白采用戊二醛法进行偶联得到免疫原，具体制备方法如下：

取氯霉素半抗原30mg，用1.5ml水溶解，得到(I)液；取50％的戊二醛(GA)10μl加入(I)中，室温下搅拌反应18h，得到(II)液；取牛血清白蛋白(BSA)100mg用1.5ml水稀释后加入(II)液中，反应过夜后加入24mg NaBH₄反应3h；用三蒸水透析48h即得免疫原。

本发明中氯霉素单克隆抗体的制备过程为：

(1)动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以氯霉素半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，得到较好的多抗血清后，取出脾脏进行细胞融合。

(2)细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明中羊抗鼠抗抗体的制备过程为：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被氯霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记氯霉素特异性抗体溶液，样本中的氯霉素与酶标板上包被的氯霉素偶联抗原竞争氯霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与氯霉素的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的氯霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中氯霉素残留量的浓度范围。

当在微孔条上预包被氯霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入氯霉素特异性抗体溶液，样本中的氯霉素与酶标板上包被的氯霉素偶联抗原竞争氯霉素特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与氯霉素的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中氯霉素的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的氯霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中氯霉素残留量的浓度范围。

当在微孔条上预包被氯霉素特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记氯霉素半抗原溶液，样本中的氯霉素与酶标记半抗原竞争包被在酶标板上的氯霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与氯霉素的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的氯霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中氯霉素残留量的浓度范围。

当在微孔条上预包被抗抗体时，加入氯霉素抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记氯霉素半抗原溶液，样本中的氯霉素与酶标记氯霉素半抗原竞争抗氯霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与氯霉素的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的氯霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中氯霉素残留量的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测氯霉素的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

样品的前处理主要是为了从样品中获得氯霉素溶液，从而用于后续的检测。下面是常见的几种样品的前处理方法：

1.组织(鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)前处理方法

用均质器均质组织样本后，称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡5min，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；移取4ml上层有机相(约相当于2g的样本)至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动15s，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层有机相，取下层50μl用于分析。

2.熟食前处理方法

用均质器均质样本后，称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入3ml去离子水，再加入6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min；移取4ml上层有机相(约相当于2g的样本)至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动15s，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层有机相，取下层50μl用于分析。

3.尿液前处理方法

取100μl清亮尿液样本，加入900μl洗涤工作液，混匀，取50μl用于分析(若尿液样本不清亮，需将尿液4000rpm，室温离心5min)。

4.蜂王浆前处理方法

称取1.0±0.05g样品至50ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml 0.1mol/L CB(称取4.66g无水碳酸钠、0.5g碳酸氢钠加入500ml去离子水溶解混匀)，8ml乙酸乙酯，再加入2g无水碳酸钠，用振荡器振荡5min，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；移取2ml上层有机相(约相当于0.25g的样本)至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，涡动1min，再加入1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动15s，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层有机相，取50μl液体用于分析。

5.牛奶前处理方法

移取500μl牛奶，加入500μl洗涤工作液，充分震荡混匀，取50μl用于分析。

6.饲料前处理方法

称取1.0±0.05g饲料至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml乙酸乙酯振荡5min，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；移取2ml上层有机相至10ml干净玻璃管中，于50～60℃氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动15s，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层有机相，取50μl用于分析。

7.鸡蛋前处理方法

用均质器均质样本后，称取1±0.05g鸡蛋至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml乙酸乙酯，1ml 0.1mol/L CB(称取4.66g无水碳酸钠、0.5g碳酸氢钠加入500ml去离子水溶解混匀)，用振荡器振荡5min，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；移取4ml上层有机相(约相当于0.5g的样本)至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动15s，4000rpm，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层有机相，取下层50μl用于分析。

本发明中用试剂盒检测时：当包被原为氯霉素偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为氯霉素偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入抗体，温育后洗涤拍干，再加入酶标抗抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为氯霉素特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记氯霉素半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为抗抗体时，向酶标板微孔中加入氯霉素抗体，温育后洗涤拍干，再加入标准品溶液或样本溶液后加入酶标氯霉素半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。

本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

以氯霉素标准品溶液的浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的氯霉素含量则可从标准曲线上读出。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程最多只需75分钟即可完成。

本发明检测氯霉素的酶联免疫试剂盒主要采用竞争ELISA方法定性或定量检测样品中氯霉素的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的氯霉素单克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。本发明的试剂盒将在氯霉素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：氯霉素结构图

图2：氯霉素半抗原合成路线图

图3：以氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物为包被原、酶标记抗体为酶标记物的试剂盒的标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1试剂盒组分的制备

1.抗原的合成

a.氯霉素半抗原合成

b.免疫原合成

将氯霉素半抗原与牛血清白蛋白采用戊二醛法进行偶联得到免疫原。

免疫原的制备过程：

c.包被原合成

将氯霉素半抗原与卵清蛋白偶联得到包被原。

包被原的制备过程：

取氯霉素半抗原30mg，用1.5ml水溶解，得到(I)液；取50％的戊二醛(GA)10μl加入(I)中，室温下搅拌反应18h，得到(II)液；取卵清蛋白(OVA)30mg用1.5ml水稀释后加入(II)液中，反应过夜后加入24mg NaBH₄反应3h；用三蒸水透析48h即得包被原。

2.单克隆抗体的合成

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生多克隆抗体血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经筛选得到氯霉素的单克隆杂交瘤细胞株，可以无限量的产生氯霉素特异性抗体，且该抗体特异性是针对氯霉素的，灵敏度能达到0.025μg/L。

细胞冻存和复苏：将氯霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的氯霉素单克隆杂交瘤细胞株1×10⁶个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

3.酶标记氯霉素单克隆抗体的制备

将氯霉素单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4∶1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

(1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；

(2)降低了辣根过氧化物酶∶抗体的摩尔浓度比率至2∶1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。

4.酶标板的制备

用包被缓冲液将氯霉素偶联抗原稀释成0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后再每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存，

实施例2检测氯霉素的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被氯霉素偶联抗原的酶标板；

(2)氯霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.025μg/L、0.075μg/L、0.3μg/L、1.2μg/L、4.8μg/L；

(3)氯霉素高浓度标准品溶液1瓶，浓度为100μg/L；

(4)用辣根过氧化物酶标记的氯霉素单克隆抗体工作液；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L硫酸；

(7)浓缩洗涤液为pH值为7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为pH值为7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

实施例3样品中氯霉素的检测

1.样品前处理

(1)组织(鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)前处理方法

(2)熟食前处理方法

(3)尿液前处理方法

(4)蜂王浆前处理方法

(5)牛奶前处理方法

(6)饲料前处理方法

(7)鸡蛋前处理方法

2.用试剂盒检测

向包被有氯霉素偶联抗原的酶标板微孔中加入氯霉素标准品溶液或样品溶液50μl，再加入辣根过氧化物酶标记的氯霉素单克隆抗体工作液50μl/孔，用盖板膜盖板后，置25℃恒温箱中避光反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃恒温箱中避光显色20min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以氯霉素标准品浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图3所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的氯霉素含量则可从标准曲线上读出。

实施例4试剂盒技术参数的确定试验

1.标准品精密度试验

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定0.3μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。

表1标准可重复性试验(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各10次标准品变异系数在3.8％～10.2％之间，符合精密度小于或等于25％的规定。

2.样本精密度和准确度试验

(1)样品精密度试验

以0.2μg/kg浓度的氯霉素对鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本进行添加测定，以1μg/kg(L)浓度的氯霉素对鸡蛋、牛奶样本进行添加测定，以2μg/kg浓度的氯霉素对蜂王浆、饲料样本进行添加测定，以5μg/L浓度的氯霉素对猪尿样本进行添加测定，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次，计算变异系数，结果见表2～10。

表2鸡肉样本可重复性试验

表3猪肉样本可重复性试验

表4猪肝样本可重复性试验

表5虾样本可重复性试验

表6鸡蛋样本可重复性试验

表7牛奶样本可重复性试验

表8蜂王浆样本可重复性试验

表9饲料样本可重复性试验

表10猪尿样本可重复性试验

结果表明，鸡肉、猪肉、猪肝、虾、鸡蛋、牛奶、蜂王浆、饲料、猪尿样本的变异系数均在4.7％～12.1％之间，符合了《农业部文件》农医法【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第四点精密度标准。

(2)样本准确度试验

以0.2、0.4μg/kg浓度的氯霉素对鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本进行添加测定，以1、2μg/kg(L)浓度的氯霉素对鸡蛋、牛奶样本进行添加测定，以2、4μg/kg浓度的氯霉素对蜂王浆、饲料样本进行添加测定，以5、10μg/L浓度的氯霉素对猪尿样本进行添加测定，每个浓度做4个平行，分别计算准确度，结果见表11。

表11试剂盒的准确度

结果表明，鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本添加回收率在76.5％～98.3％之间，鸡蛋样本添加回收率在83.9％～102.4％之间，牛奶样本添加回收率在81.5％～97.4％之间，蜂王浆样本添加回收率在86.2％～103.0％之间，饲料样本添加回收率在84.2％～98.7％之间，猪尿样本添加回收率在80.7％～95.6％之间。

3.交叉反应率试验

选择与氯霉素具有类似结构和类似功能的药物测定交叉反应率，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度，用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应率越大，那么此试剂盒对氯霉素的检测的特异性就越好。

交叉反应率(％)＝(引起50％抑制的氯霉素浓度/引起50％抑制的类似物浓度)×100％

表12试剂盒的特异性

4.试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、氯霉素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置15天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻15天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。

Claims

1.一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：

(1)包被有包被原的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)氯霉素标准品溶液；

(4)底物显色液；

(5)终止液；

(6)浓缩洗涤液；

(7)浓缩复溶液，

所述包被原为氯霉素抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记氯霉素抗原、酶标记氯霉素抗体或酶标记抗抗体，

当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有氯霉素特异性抗体工作液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述氯霉素抗原是由氯霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述氯霉素抗体是由所述偶联抗原制备获得，其中所述氯霉素半抗原是将氯霉素分子结构中的硝基通过催化加氢反应得到的。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述氯霉素抗体为单克隆抗体。

5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所用包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所用封闭液为pH值为9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐温-20、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠。

7.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所用浓缩洗涤液为pH值为7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液；所用浓缩复溶液为pH值为7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于氯霉素标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.025μg/L、0.075μg/L、0.3μg/L、1.2μg/L、4.8μg/L。

9.一种检测样品中氯霉素残留的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1～8任一项所述的试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。