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CN103459422A - 靶向hgf的多特异性抗原结合蛋白 - Google Patents

靶向hgf的多特异性抗原结合蛋白 Download PDF

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CN103459422A
CN103459422A CN2011800651882A CN201180065188A CN103459422A CN 103459422 A CN103459422 A CN 103459422A CN 2011800651882 A CN2011800651882 A CN 2011800651882A CN 201180065188 A CN201180065188 A CN 201180065188A CN 103459422 A CN103459422 A CN 103459422A
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binding proteins
seq
antibody
binding
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J·格里格斯
R·S·帕马
M·斯特瓦德
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Glaxo Group Ltd
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Abstract

本发明涉及HGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合，并且提供了结合HGF的抗原结合蛋白，其包含连接一个或多个表位结合结构域的蛋白骨架，其中所述抗原结合蛋白具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位结合结构域和其中至少一个来自配对的VH/VL结构域；还提供了制备该构建体的方法及其用途。

Description

靶向HGF的多特异性抗原结合蛋白
发明背景
将抗体用于治疗应用中是公知的。抗体是包含至少两个重链和两个轻链的杂多亚基糖蛋白。除了IgM以外，完整的抗体通常是大约150KDa的杂四聚糖蛋白，由两个相同的轻（L）链和两个相同的重（H）链组成。通常，各个轻链通过一个共价二硫键连接重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目是不同的。各个重链和轻链还具有链内二硫桥。各个重链在一端具有可变结构域（VH），接着是多个恒定区。各个轻链在其另一端具有可变结构域（VL）和恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区对齐，而轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。基于恒定区的氨基酸序列，来自大部分脊椎动物物种的抗体的轻链可以归入称为κ和λ的两种类型中的一种。根据其重链的恒定区的氨基酸序列，人抗体可以分成五个不同种类，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可以进一步细分成亚类，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；以及IgA1和IgA2。小鼠和大鼠存在物种变体，具有至少IgG2a、IgG2b。抗体的可变结构域对于具有称为互补决定区（CDR）的表现出特定变异性的特定区域的抗体赋予结合特异性。可变区的更保守部分称为框架区（FR）。完整重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个CDR连接的四个FR。各个链中的CDR通过FR区紧密地保持在一起，并且与来自其他链的CDR一起帮助形成抗体的抗原结合位点。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但呈现出各种效应子功能，如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、通过结合Fcγ受体的吞噬作用、通过新生Fc受体（FcRn）的半衰期/清除率和通过补体级联的C1q成分的补体依赖性细胞毒性。
IgG抗体结构的性质使得存在两个抗原结合位点，它们都对相同的表位是特异性的。因此，它们是单特异性的。双特异性的抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。制备这样的抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白H链-L链对的共表达，其中两个H链具有不同的结合特异性，参见Millstein等，Nature305 537-539（1983）、WO93/08829和Traunecker等，EMBO，10，1991，3655-3659。由于H链和L链的随意分配，产生了十种不同抗体结构的潜在混合物，其中只有一种具有所需的结合特异性。替代的方法涉及将具有所需结合特异性的可变结构域与包含至少部分铰链区（CH2和CH3区）的重链恒定区融合。优选至少一个融合体中存在含有轻链结合必需的位点的CH1区。将编码这些融合体和（如果需要的话）L链的DNA插入单独的表达载体中，然后共转染至合适的宿主生物体中。虽然有可能将两条或全部三条链的编码序列插入一个表达载体中。在一种方法中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的H链和在另一个臂中的提供第二结合特异性的H-L链对组成，参见WO94/04690。还参见Suresh等Methods in Enzymology,121,210,1986。其它途径包括包含单结构域结合位点的抗体分子，其在WO2007/095338中给出。已经描述了双特异性抗体的多种形式，其中一些使用接头以将一个蛋白质结构域与另一个连接。这些形式的实例包括如WO0190192中所述的连接单链Fv结构域的抗体分子、如WO2007/095338中所示的连接单结构域结合位点的抗体分子、如WO2009/068649中所述的mAbdAb形式、如WO2007/024715中所述的双可变结构域形式和如WO2009/040562中所述的双特异性抗体融合体。
HGF（肝细胞生长因子或分散因子，SF）是多效性细胞因子，其与其受体MET（间质上皮转化因子，也称为c-MET或肝细胞生长因子受体）一起能够在细胞中传送促迁移（pro-migratory）、抗凋亡和促有丝分裂信号的独特组合。对于大部分组织是天生的，HGF由间质来源的细胞表达，并且定位于细胞外基质内，它在此处保持其无活性（原-HGF）形式直至被蛋白酶切割。在正常的生理条件下，这种情况响应于组织损伤或在胚胎发育过程中发生。MET由上皮来源的细胞表达，并与其组织定位相一致，HGF/MET信号传导的效应在上皮-间质相互作用、细胞动员、迁移和快速细胞分裂（其对于成人的组织修复和胚胎中的器官发生是必需的）中是重要的。HGF/MET信号传导的激活协调了广泛的细胞过程，包括增殖、分散/迁移、细胞极性的诱导和血管生成，其中这些效应取决于细胞类型和环境。在成年动物中，该途径是相对静止的，尽管它是如肝再生、肾脏损伤修复、皮肤愈合和肠损伤的过程的组成部分，在这些过程中通过伤口边缘处的细胞中HGF/MET信号传导介导的协调的侵入性生长过程是恢复组织完整性必需的。尽管受调控的HGF/MET，与编排胚胎发育和组织形态发生的协调的遗传程序一起，是正常生理的必要特征，癌细胞中不受调控的HGF/MET表达是肿瘤的瘤性散布的关键特征。这种不受调控的表达可以作为激活突变、基因组扩增、转录上调和旁分泌或自分泌激活的结果而发生。实际上，已经表明HGF/MET-依赖性的侵入性生长信号的传播是高侵袭性肿瘤的一般特征，所述肿瘤可以产生迁移和浸润邻近组织的细胞并在远离原发肿瘤的部位建立转移性病灶。与HGF是强效血管生成因子和MET已知由内皮细胞表达的事实相结合，HGF/MET的治疗靶向对抑制癌症发作、肿瘤进展和转移具有相当大的潜能。
生长因子的血管内皮生长因子（VEGF）家族及其受体是血管生成和血管渗透性的必要调节剂。VEGF家族包括VEGF-A、PIGF（胎盘生长因子）、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-E和蛇毒VEGF，并且认为各自在血管形成模式和血管发育中具有截然不同的作用。由于从单一的8-外显子基因转录的mRNA的可变剪接，通过在信号肽切割后剩余氨基酸的数目确定，VEGF-A具有至少9个亚型（同型体）。例如，在人体中，最显著的同型体是VEGF165，其在可溶性的和细胞结合的形式之间存在平衡。较长的同型体（VEGF183、VEGF189&VEGF206）具有高正电荷的C-端区域并介导与细胞表面聚糖和肝素的结合（这调节它们的生物利用率）。所有VEGF-A同型体形成同型二聚体，其中通过构成受体结合VEGF片段的大约110个N-末端残基的核心来发生结合。在正常的环境下，并且在实体肿瘤的中心，VEGF的表达主要受低含氧量条件介导，意味着血管供应的不足。缺氧引起缺氧诱导因子HIF-1α与组成型表达的HIF-1α的二聚化，因而形成结合VEGF启动子区域中的缺氧反应元件的转录因子。在常氧情况下，作为多脯氨酸羟基化事件的结果，HIF-1α蛋白经历泛素介导的降解。由于通过经由炎性细胞因子&生长因子的致癌基因途径（即，ras）的激活以及通过机械力，发生了其他肿瘤相关的VEGF上调。
活性VEGF同型二聚体通过VEGFR家族的受体结合在细胞表面。VEGF-A的主要血管内皮相关受体是VEGFR1（Flt1）和VEGFR2（Flk-2；KDR）。两种受体都是酪氨酸激酶家族的成员，并且需要配体介导的二聚化来用于激活。在二聚化时，激酶结构域经历自身磷酸化，尽管VEGFR2中激酶活性的程度高于VEGFR1中。已经证明了VEGF的血管生成信号传导很大程度上是通过VEGF2介导的，尽管VEGF对VEGF1的亲和性大约高3倍（与VEGF2的100pM相比，其KD为～30pM）。这导致了如下建议：VEGF1主要作为诱捕受体发挥作用以螯合VEGF并调节VEGF2激活的程度。尽管VEGF1表达与一些肿瘤相关，其主要作用看来是在胚胎发育&器官发生过程中。VEGF-A165还通过神经纤毛蛋白受体NRP1&NRP2结合。尽管这些受体缺少TK结构域，但认为它们作为VEGF2的共受体发挥作用并且通过将VEGF转移至VEGFR2来增强信号传导。
多种研究已经帮助证实VEGF-A作为肿瘤血管生成中的关键因子。例如，VEGF-A在大部分肿瘤和肿瘤相关基质中表达。在不存在发育良好的和扩展的脉管系统来支持生长的情况下，肿瘤细胞变得坏死和凋亡，因此施加对于可能由连续细胞增殖引起的（大约1mm3的）肿瘤体积增加的限制。VEGF-A的表达在邻近坏死区域的低含氧肿瘤细胞中最高，表明由生长肿瘤中缺氧诱导VEGF-A可以改变血管生成的激活剂和抑制剂的平衡，从而导致肿瘤中新血管的生长。与该假设一致，已经开发了多种抑制或捕获VAGF-A或阻断其信号传导受体VEGFR-2的途径作为治疗剂，包括小分子量酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、反义寡核苷酸等。
因此，对双重特异性的HGF和VEGF拮抗剂存在需求。
发明概述
本发明涉及新的抗人生长因子（HGF）拮抗剂、双特异性HGF拮抗剂和血管内皮生长因子（VEGF）拮抗剂以及这些拮抗剂在治疗中的用途。更具体地，本发明涉及一组新的人源化抗HGF抗体，其源自鼠抗HGF抗体S260116C12（在本文中也称为“16C12”）。本发明还涉及一种抗原结合蛋白，其包含与一个或多个表位结合结构域连接的至少一个配对的VH/VL结构域，其中抗原结合蛋白具有至少两个抗原结合位点，并且其中至少一个抗原结合位点结合HGF或VEGF，或其中至少一个抗原结合位点结合HGF和至少一个抗原结合位点结合VEGF。特别地，配对的VH/VL结构域可以包含源自16C12的VH和VL区。
因此，在第一个方面中，本发明提供了一种抗原结合蛋白，其包含与一个或多个表位结合结构域连接的至少一个配对的VH/VL结构域，其中抗原结合蛋白包含至少两个抗原结合位点，其中至少一个抗原结合位点由该至少一个表位结合结构域提供和至少一个抗原结合位点由该至少一个配对的VH/VL结构域提供，其中该配对的VH/VL结构域或各个配对的VH/VL结构域特异性地结合HGF并且包含SEQ ID NO:92、94、96或98的VH氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供了一种抗HGF抗体，其包含具有SEQID NO:21中所示序列的CDRH3。在一个实施方案中，抗HGF抗体包含CDRH1（SEQ ID NO:19）、CDRH2（SEQ ID NO:20）、CDRH3（SEQID NO:21）、CDRL1（SEQ ID NO:22）、CDRL2（SEQ ID NO:23）和CDRL3（SEQ ID NO:24）。在一个实施方案中，抗HGF抗体包括包含SEQ ID NO:90、92、94、96或98任一个所示氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:100或102中所示氨基酸序列的轻链可变结构域。在另一个实施方案中，抗HGF抗体包含SEQ ID NO:76、78、80、82或84中所示的重链序列和SEQ ID NO:86或88中所示的轻链序列。
在另一个方面中，本发明提供了根据本发明上述方面的抗HGF抗体，其通过接头连接表位结合结构域，其中该表位结合结构域特异性地结合VEGF。在一个实施方案中，表位结合结构域是抗VEGF免疫球蛋白单可变结构域，任选地具有SEQ ID NO:104、106、108、110、191、192、193或194中所示的氨基酸序列，或在与其80、85、90、95、98或99%同一性范围内的氨基酸序列。
在特定的实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是具有SEQ ID NO:194的氨基酸序列的域抗体。
在一个实施方案中，表位结合结构域通过具有SEQ ID NO:163、164、165、166、167、168、169、170、195或196所示氨基酸序列的接头连接抗HGF抗体。在一个实施方案中，表位结合结构域连接抗HGF抗体的重链，任选在其C-或N-末端。
在另一方面中，本发明提供了一种双特异性抗原结合蛋白，其包含连接抗VEGF表位结合结构域的抗HGF抗体，该抗HGF抗体至少包含SEQ ID NO:21中所示的CDRH3，其中抗VEGF表位结合结构域具有SEQ ID NO:104、106、108、110、191、192、193或194中所示的序列。在一个实施方案中，抗HGF抗体包含CDRH1（SEQ ID NO:19）、CDRH2（SEQ ID NO:20）、CDRH3（SEQ ID NO:21）、CDRL1（SEQ ID NO:22）、CDRL2（SEQ ID NO:23）和CDRL3（SEQ ID NO:24）。在一个实施方案中，抗HGF抗体包括包含SEQ ID NO:76、78、80、82或84任一个所示的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:86或88中所示的氨基酸序列的轻链可变结构域。在特定的实施方案中，抗HGF抗体包含SEQ ID NO:78的重链可变结构域和SEQ ID NO:86的轻链可变结构域。
在另一个方面中，本发明提供了一种包含抗HGF抗体和至少一个通过包含1至20个氨基酸的接头连接所述抗体的表位结合结构域的抗原结合蛋白，所述抗HGF抗体包含具有SEQ ID NO:90、92、94、96或98的VH氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:100或102的VL序列的轻链，所述表位结合结构域特异性地结合VEGF。
表位结合结构域可以具有SEQ ID NO:191、192、193或194的氨基酸序列。在特定的实施方案中，抗HGF抗体包含SEQ ID NO:92的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:100的VL结构域。
本发明还提供了编码本文中所述的任一种抗原结合蛋白的重链的多核苷酸序列和编码本文中所述的任一种抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。这些多核苷酸表示对应于等价多肽序列的编码序列，然而应理解这些多核苷酸序列可以与起始密码子、合适的信号序列和终止密码子一起克隆至表达载体中。
本发明还提供了重组的转化或转染的宿主细胞，其包含一个或多个编码本文中所述的任一种抗原结合蛋白的重链和轻链的多核苷酸。
本发明进一步提供了一种用于产生本文中所述的任一种抗原结合蛋白的方法，该方法包括在合适的培养基（例如，无血清培养基）中培养包含第一和第二载体的宿主细胞的步骤，所述第一载体包含编码本文中所述的任一种抗原结合蛋白的重链的多核苷酸和所述第二载体包含编码本文中所述的任一种抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。
本发明进一步提供了包含在药物学上可接受的载体中的本文中所述的抗原结合蛋白的药物组合物。
附图简述
图1-双特异性抗体与VEGF和HGF的Biacore结合数据。
图2-Mv1Lu细胞的细胞增殖试验。
图3-人脐带内皮细胞（HUVEC）中对于HGF的PcMET。
图4-人脐带内皮细胞（HUVEC）中对于HGF和VEGF的PcMET。
图5-Bx-PC3 pMET检测试验。
图6-Bx-PC3细胞迁移试验。
定义
如本文中所用的术语“蛋白骨架”包括但不限于免疫球蛋白（Ig）骨架，例如，IgG骨架，其可以是四链或二链抗体，或者其可以只包含抗体的Fc区，或者其可以包含一个或多个来自抗体的恒定区，该恒定区可以是人或灵长类动物来源的，或者其可以是人和灵长类动物恒定区的人工嵌合体。除了一个或多个恒定区外，这样的蛋白骨架可以包含抗原结合位点，例如，其中蛋白骨架包含完整的IgG。这样的蛋白骨架将能够连接其他蛋白质结构域，例如，具有抗原结合位点的蛋白质结构域，例如表位结合结构域或SvFv结构域。本发明实施方案的VH和VL结构域或重链和轻链可以作为蛋白骨架的部分存在。
因此，在一个方面中，本发明提供了包含蛋白骨架的抗原结合蛋白，所述蛋白骨架包含连接一个或多个表位结合结构域的至少一个配对的VH/VL结构域，其中配对的VH/VL结构域特异性地结合HGF，并且表位结合结构域特异性地结合VEGF，并且其中该至少一个配对的VH结构域的VH包含SEQ ID NO:92、94、96或98的氨基酸序列。
“结构域”是折叠的蛋白质结构，其具有与蛋白质其余部分无关的三级结构。通常，结构域负责蛋白质的离散功能特性并且，在许多情况中，可以添加、移动或转移至其他蛋白质而不丧失蛋白质其余部分和/或结构域的功能。“抗体单可变结构域”是包含抗体可变结构域特征性序列的折叠多肽结构域。因此，其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域（例如，其中一个或多个环被非抗体可变结构域特征性的序列替代）或已经截短的或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段（其至少保留全长结构域的结合活性和特异性）。
短语“免疫球蛋白单可变结构域”指的是与不同的V区或结构域无关地特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域（VH、VHH、VL）。免疫球蛋白单可变结构域可以以与其他不同的可变区或可变结构域一起的形式（例如，同型-或杂-多聚体）存在，其中其他区域或结构域对于通过单免疫球蛋白可变结构域的抗原结合不是所需的（即，其中免疫球蛋白单可变结构域与另外的可变结构域无关地结合抗原）。“域抗体”或“dAb”与“免疫球蛋白单可变结构域”相同，与本文中所用的术语相同，其能够结合抗原。免疫球蛋白单可变结构域可以是人抗体可变结构域，但也包括来自其他物种的单抗体可变结构域，如啮齿动物（例如，如WO00/29004中所公开的）、铰口鲨和骆驼抗体(Camelid)VHH dAb。骆驼抗体VHH是源自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种的免疫球蛋白单可变结构域多肽，其产生天然缺少轻链的重链抗体。可以根据本领域中可用的标准技术将这样的VHH结构域人源化，并且根据本发明，这些结构域仍然认为是“域抗体”。如本文中所用的，“VH”包括骆驼抗体VHH结构域。NARV是在包括铰口鲨的软骨鱼中鉴别出的另一种类型的免疫球蛋白单可变结构域。这些结构域也称为新抗原受体可变区（通常缩写为V(NAR)或NARV）。对于更多的详细内容，参见Mol.Immunol.44，656-665（2006）和US20050043519A。
术语“表位结合结构域”指的是与不同的V区或结构域无关地特异性结合抗原或表位的结构域，这可以是免疫球蛋白单可变结构域，例如，人、骆驼抗体或鲨鱼免疫球蛋白单可变结构域，或可以是作为非免疫球蛋白骨架的衍生物的结构域，所述非免疫球蛋白骨架选自CTLA-4（Evibody）；脂质运载蛋白(lipocalin)；蛋白A衍生分子如蛋白A的Z-结构域（亲和体，SpA）；A-结构域（亲和性多聚体(Avimer)/Maxibody）；热休克蛋白如GroEI和GroES；转铁蛋白（穿膜抗体(trans-body)）；锚蛋白重复蛋白（DARPin）；肽适体；C-型凝集素结构域（四连接素(Tetranectin)）；人γ-晶体蛋白和人泛素（affilins）；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白（adnectin）；其已经进行蛋白工程化以获得与其天然配体以外的配体的结合。
CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4）是主要在CD4+T细胞上表达的CD28-家族受体。其胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可以被异源序列取代以赋予不同的结合特性。进行工程化而具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody。对于更多的详细内容，参见Journal of Immunological Methods248（1-2），31-45（2001）。
脂质运载蛋白是转运小的疏水性分子（如，类固醇、后胆色素、类维生素A和脂质）的细胞外蛋白的家族。它们具有在锥形结构的开放端具有多个环的刚性β-折叠二级结构，其可以工程化以结合不同的目标抗原。抗运载蛋白(Anticalin)为160-180个氨基酸大小，并且源自脂质运载蛋白。对于更多的详细内容，参见Biochim Biophys Acta1482:337-350（2000），US7250297B1和US20070224633。
亲和体是源自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的蛋白A的骨架，其可以工程化以结合抗原。该结构域由大约58个氨基酸的三-螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化产生了文库。对于更多的详细内容，参见Protein Eng.Des.Sel.17，455-462（2004）和EP1641818A1。
亲和性多聚体是源自A-结构域骨架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采取了限定的二硫键合的结构。通过由A-结构域家族呈现的天然变异的重组产生多样性。对于更多的详细内容，参见NatureBiotechnology23(12)，1556-1561（2005）和Expert Opinion onInvestigational Drugs16(6)，909-917（2007年6月）。
转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在容许的表面环中插入肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的目标抗原。工程化转铁蛋白骨架的实例包括穿膜抗体。对于更多的详细内容，参见J.Biol.Chem274，24066-24073（1999）。
设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）源自锚蛋白，其是介导整体膜蛋白连接到细胞骨架上的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33个残基的基序。它们可以通过在各个重复的第一α-螺旋和β-转角中将残基随机化来工程化以结合不同的目标抗原。可以通过增加模块的数量来增加它们的结合界面（亲和性成熟的方法）。对于更多的详细内容，参见J.Mol.Biol.332，489-503（2003），PNAS100(4)，1700-1705（2003）和J.Mol.Biol.369，1015-1028（2007）和US20040132028A1。
纤连蛋白是可以工程化以结合抗原的骨架。Adnectin由人III型纤连蛋白（FN3）的15个重复单元中第10个结构域的天然氨基酸序列的骨架组成。可以将β-夹层一个末端的三个环进行工程化以使得Adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。对于更多的详细内容，参见ProteinEng.Des.Sel.18，435-444（2005），US20080139791，WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子，所述骨架蛋白通常是含有在活性位点插入的约束可变肽环的硫氧还蛋白（TrxA）。对于更多的详细内容，参见Expert Opin.Biol.Ther.5，783-797（2005）。
微体源自长度25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataB1以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸的环而不影响微单白的整体折叠。对于工程化的半胱氨酸结肽结构域的更多详细内容，参见WO2008098796。
其他表位结合结构域包括已经用作骨架来工程化不同目标抗原结合特性的蛋白，包括人γ-晶体蛋白和人泛素（affilin）、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素（卡律布德蝎毒素）、C-型凝集素结构域（四连接素），综述于Non-AntibodyScaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies（来自治疗抗体手册的非抗体骨架）的第7章（2007，Stefan Dubel编辑）和Protein Science15:14-27（2006）中。本发明的表位结合结构域可以源自这些替代蛋白结构域中的任何一种。
如本文中所用的，术语“配对的VH结构域”、“配对的VL结构域”和“配对的VH/VL结构域”指的是只有当与它们的伴体可变结构域配对时才特异性结合抗原的抗体可变结构域。在任何配对中总是存在一个VH和一个VL，并且术语“配对的VH结构域”指的是VH伴体，术语“配对的VL结构域”指的是VL伴体，而术语“配对的VH/VL结构域”指的是在一起的两个结构域。
如本文中所用的术语“抗原结合蛋白”指的是能够结合HGF和/或VEGF的抗体、抗体片段，例如域抗体（dAb）、ScFv、FAb、FAb2和其他蛋白构建体。抗原结合分子可以包含至少一个Ig可变结构域，例如，抗体、域抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双体、mAbdAb、亲和体、异偶联抗体或双特异性抗体。在一个实施方案中，抗原结合分子是抗体。在另一个实施方案中，抗原结合分子是dAb，即，与不同V区或结构域无关地特异性结合抗原或表位的免疫球蛋白单可变结构域，如VH、VHH或VL。抗原结合分子可能能够结合两个靶标，即，它们可以是双重靶向蛋白。抗原结合分析可以是抗体和抗原结合片段的组合，如例如，连接单克隆抗体的一个或多个域抗体和/或一个和多个ScFv。抗原结合分子还可以包含非免疫球蛋白结构域，例如，作为骨架衍生物的结构域，所述骨架选自CTLA-4（Evibody）；脂质运载蛋白；蛋白A衍生分子如蛋白A的Z-结构域（亲和体，SpA）；A-结构域（亲和性多聚体/Maxibody）；热休克蛋白如GroEI和GroES；转铁蛋白（穿膜抗体）；锚蛋白重复蛋白（DARPin）；肽适体；C-型凝集素结构域（四连接素）；人γ-晶体蛋白和人泛素（affilin）；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白（adnectin）；其已经进行蛋白工程化以获得对HGF和VEGF的结合。如本文中所用的“抗原结合蛋白”将能够拮抗和/或中和人HGF和/或VEGF。此外，抗原结合蛋白可以通过结合HGF和/或VEGF并防止天然配体结合和/或激活受体来阻断HGF和/或VEGF活性。
如本文中所用的，“VEGF拮抗剂”包括能够降低和/或消除VEGF的至少一种活性的任何化合物。例如，VEGF拮抗剂可以结合VEGF并且这种结合可以直接降低或消除VEGF活性或可以通过阻断至少一种配体与受体的结合来间接发挥作用。
如本文中所用的，“HGF拮抗剂”包括能够降低和/或消除HGF的至少一种活性的任何化合物。例如，HGF拮抗剂可以结合HGF并且这种结合可以直接降低或消除HGF活性或可以通过阻断至少一种配体与受体的结合来间接发挥作用。
在本发明的一个实施方案中，抗原结合位点以至少1mM的Kd结合抗原，例如，以10nM、1nM、500pM、200pM、100pM的Kd结合各个抗原，如通过BiacoreTM测量的。
如本文中所用的，术语“抗原结合位点”指的是构建体上能够特异性结合抗原的位点，这可以是单结构域，例如，表位结合结构域，或可以是配对的VH/VL结构域，如可以在标准抗体上发现的。在本发明的一些方面中，单链Fv（ScFv）结构域可以提供抗原结合位点。
本文中所用的术语“恒定轻链”指的是免疫球蛋白轻链的恒定结构域。
发明详述
本发明提供了包含人生长因子（HGF）拮抗剂和/或血管内皮生长因子（VEGF）拮抗剂的组合物。本发明还提供了HGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合，例如，用于治疗中。本发明还提供了通过与VEGF拮抗剂组合施用HGF拮抗剂来治疗疾病的方法。HGF拮抗剂和VEGF拮抗剂可以单独、顺序或同时施用。
血管生成的抑制是已经确立的治疗途径，目的在于使对生长肿瘤的血液供应不足（并且因此限制氧和营养供应）。已经在临床前癌症模型和几个临床试验中在治疗上验证了多种血管生成抑制剂。阿瓦斯汀（贝伐单抗），一种靶向于VEGF的单克隆抗体，已经批准作为一线疗法用于结合化疗来治疗转移性结肠直肠癌（CRC）和非小细胞肺癌（NSCLC），并且许多小分子化合物处于临床前和临床开发中。在特定的癌症中，如乳腺癌和结肠癌，如上述这些的药剂在与化疗结合时可以减缓疾病的进展并且导致病人存活时间延长数月，但单独给予时没有这种效果。实际上，在几个临床试验中，由于相对于加化疗（CT）组的较差性能，仅贝伐单抗组早期就终止了。最初，这种观察看来是矛盾的，因为减少肿瘤血液供应已经证明限制CT可以递送至肿瘤的程度。使该观察合理化的尝试是基于贝伐单抗的作用是使肿瘤的特征性失调的脉管系统“正常化”的主张。脉管正常化的一个假定效应是降低间隙液压（IFP），从而导致血流增加和CT剂渗透至肿瘤的核心。对于与CT结合的贝伐单抗的有效性的替代理论表明VEGF的阻断减少了营养物质和氧的供应并且引发了促凋亡事件，这增强了由CT诱发的那些效应。
最近在体内模型中的工作已经开始更多地关注当临床上用于靶向于VEGF途径抑制的单一疗法中时抗血管生成抑制剂长期效力的缺乏。几个报道证明了这样的方法的抗肿瘤作用，但同时也显示出肿瘤的伴随适应并发展至更高恶性的阶段，具有提高的侵染力并且在一些情况中，具有提高的淋巴和远距转移。因此，使癌细胞的氧“供应不足”（缺氧）的结果，除了对原发性肿瘤生长的有益作用外，似乎驱使肿瘤细胞转移至别处来寻求氧。换句话说，通过有效抑制新血管生成产生抗肿瘤作用和存活益处的抗血管生成治疗可能另外地通过提高侵入和转移而改变肿瘤的表型。其他报道已经表明缺氧诱使癌细胞产生MET并且具有提高的经由HGF/MET介导的途径的信号传导，其随后引起那些细胞变成高度能动的并且移动至远端位点（转移性扩散）。此外，单独VEGF抑制剂的延长使用可能促进使用替代的新血管生成途径，从而随着存活率提高开启了药物抗性的可能性。
因此，双特异性分子将在单一药剂中结合HGF抗体的活性（抑制肿瘤生长、血管生成和转移）和VEGF阻断的抗血管生成作用，并且具有几种优于单独使用各种成分的优势。存在协同作用的可能，因为HGF和VEGF的同时中和可以抑制细胞对缺氧的转移反应，同时产生提高的血管生成控制。此外，这两种活性的组合可以限制随着存活率提高的对于单一药剂抗血管生成疗法药物抗性的可能性。
这样的拮抗剂可以是抗体或表位结合结构域，例如，免疫球蛋白单可变结构域。拮抗剂可以作为同时施用的独立分子的混合物来施用，即共同给药，或在彼此间隔24小时内，例如，彼此间隔20小时内，或15小时内，或12小时内，或10小时内，或8小时内，或6小时内，或4小时内，或2小时内，或1小时内，或30分钟内施用。
用于本发明中其他HGF拮抗剂包括抗-c-MET抗体，例如，WO2009/007427中所述的抗体。
在本发明的另一个方面中，提供了一种抗原结合蛋白，其包含选自SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:98的重链可变序列。在一个实施方案中，抗原结合蛋白是单克隆抗体。抗原结合蛋白可以包含选自SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:102的轻链可变序列，或SEQ ID NO:86或88的轻链。
在本文中所述的本发明的一个方面中，提供了一种抗原结合蛋白，其包含选自SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193或SEQ IDNO:194的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了根据本文中所述的本发明的一种抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白结合VEGF，例如，抗原结合蛋白包含结合VEGF的表位结合结构域，并且其中抗原结合蛋白包含与选自SEQ IDNO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:110、SEQ IDNO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193或SEQ ID NO:194的氨基酸序列具有至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。抗原结合蛋白可以进一步包含根据本发明上述方面的抗HGF抗体。抗HGF抗体可以通过接头连接VEGF特异性表位结合结构域。
在一个实施方案中，提供了根据本文中所述的本发明的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白结合HGF，例如，抗原结合蛋白包含结合HGF的表位结合结构域，并且其中抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:82的重链序列具有至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。
在本文中所述的本发明的进一步实施方案中，抗原结合蛋白可以进一步包含接头序列，例如选自SEQ ID NO:163-170、SEQ ID NO:187-190或SEQ ID NO:195或196的接头。
在进一步的实施方案中，拮抗剂作为能够结合两个或多个抗原的一个分子存在，例如，本发明提供了双重靶向分子，其能够结合HGF和VEGF或其能够结合HGF和VEGFR2，或其能够结合c-MET和VEGF。
本发明提供了包含配对的VH/VL结构域的抗原结合蛋白，所述配对的VH/VL结构域连接一个或多个表位结合结构域，其中抗原结合蛋白具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位结合结构域，并且其中至少一个抗原结合位点结合HGF。
本发明提供了包含配对的VH/VL结构域的抗原结合蛋白，所述配对的VH/VL结构域连接一个或多个表位结合结构域，其中抗原结合蛋白具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位结合结构域和至少一个来自配对的VH/VL结构域，并且其中至少一个抗原结合位点结合VEGF。
这样的抗原结合蛋白包含配对的VH/VL，例如，单克隆抗体，其连接一个或多个表位结合结构域，例如，域抗体，其中结合蛋白具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位结合结构域，并且其中至少一个抗原结合位点结合HGF，并且涉及所述抗原结合蛋白的生产方法和用途，特别是在治疗中的用途。
本发明的抗原结合蛋白也称为mAbdAb。
本发明的抗原结合蛋白具有至少两个抗原结合位点，例如，其具有两个结合位点，例如，其中第一结合位点对抗原上的第一表位具有特异性，而第二结合位点对相同抗原上的第二表位具有特异性。在进一步的实施方案中，存在4个抗原结合位点，或6个抗原结合位点，或8个抗原结合位点，或10个或更多个抗原结合位点。在一个实施方案中，抗原结合蛋白对超过一个的抗原具有特异性，例如，对两个抗原，或三个抗原，或四个抗原具有特异性。
在本发明的一个实施方案中，表位结合结构域是免疫球蛋白单可变结构域。
可以理解，本文中所述的任一抗原结合蛋白能够中和一种或多种抗原，例如，它们能够中和HGF，并且它们还能够中和VEGF。
在本发明说明书中关于本发明的抗原结合蛋白所用的术语“中和”及其语法变型意思是在本发明的抗原结合蛋白存在下，与该抗原结合蛋白不存在下的靶标活性相比，完全或部分地降低靶标的生物活性。中和也可能是由于但不限于阻断配体结合、阻止配体激活受体、下调受体或影响效应子功能中的一种或多种引起的。
可以以几种方式来测量中和的水平，例如，通过使用以下实施例中所列的任一种分析，例如，在测量配体与受体结合的抑制的分析方法，其可以例如按照实施例10中所述的来进行。在该分析中，通过测定中和抗原结合蛋白存在下MET磷酸化（Met磷酸化受到HGF的刺激）的降低来测量。适用于该分析的HGF蛋白包括包含NCBI参考序列：NM_000601.4（UniProt ID P14210）的HGF蛋白。可以通过例如实施例11中所述的分析来测量VEGF的中和水平。适用于该分析中的VEGF蛋白包括包含NCBI参考序列NP_001020539.2（UniProt ID:P15692）的VEGF165。
其他测定中和的方法，例如，通过测定中和抗原结合蛋白存在下配体与其受体之间结合的降低，是本领域已知的，并且包括，例如，BiacoreTM分析。
在一个实施方案中，因此提供了本文中所述的根据本发明的抗原结合蛋白，其中和HGF或中和VEGF。在进一步的实施方案中，提供了本文中所述的根据本发明的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白中和HGF和VEGF两者。
在本发明的可选方面中，提供了一种抗原结合蛋白，其具有与本文中举例说明的抗原结合蛋白至少基本上等同的中和活性。
本发明的抗原结合蛋白对HGF具有特异性，例如，它们包含能够结合HGF的表位结合结构域，和/或它们包含结合HGF的配对的VH/VL。抗原结合蛋白可以包含能够结合HGF的抗体。抗原结合蛋白可以包含能够结合HGF的免疫球蛋白单可变结构域。
本发明的抗原结合蛋白对VEGF具有特异性，例如，它们包含能够结合VEGF的表位结合结构域，和/或它们包含结合VEGF的配对的VH/VL。抗原结合蛋白可以包含能够结合VEGF的抗体。抗原结合蛋白可以包含能够结合VEGF的免疫球蛋白单可变结构域。
在一个实施方案中，提供了与本文中所述的抗原结合蛋白竞争的抗原结合蛋白。例如，与包含选自SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQID NO:193或SEQ ID NO:194的抗原结合蛋白竞争结合VEGF的抗原结合蛋白。
例如，与包含选自SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:98的可变重链序列的抗原结合蛋白竞争结合HGF的抗原结合蛋白。
在进一步的实施方案中，提供了竞争结合HGF和VEGF两者并包含选自SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193或SEQ ID NO:194的可变重链序列的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，提供了本文中所述的根据本发明的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白结合VEGF，例如，抗原结合蛋白包含结合VEGF的表位结合结构域并且其中抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193或SEQ ID NO:194的序列具有至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白对超过一个的抗原具有特异性，例如，其可能能够结合HGF和VEGF。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白能够同时结合HGF和VEGF。
在一个实施方案中，提供了本文中所述的根据本发明的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白结合HGF，例如，抗原结合蛋白包含结合HGF的表位结合结构域，并且其中抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:82的重链序列具有至少70%，或至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。
可以理解，本文中所述的任一抗原结合蛋白可能能够同时结合两个或更多个抗原，例如，如通过使用合适的分析方法，如实施例7中所述的，通过化学计量分析所测定的。
这样的抗原结合蛋白的实例包括抗VEGF抗体，其具有作为HGF拮抗剂的表位结合结构域，例如抗-HGF免疫球蛋白单可变结构域，连接到重链的C-末端或N-末端或轻链的C-末端或N-末端上。
这样的抗原结合蛋白的实例包括抗HGF抗体，其具有连接到重链的C-末端或N-末端或轻链的C-末端或N-末端上的作为VEGF拮抗剂的表位结合结构域。实例包括包含SEQ ID NO:76、78、80、82或84中所示重链序列和/或SEQ ID NO:86或88中所示轻链序列的抗原结合蛋白，其中重链和轻链的一个或两者进一步包含一个或多个能够拮抗VEGF的表位结合结构域，例如，通过结合VEGF或结合VEGF受体（例如，VEGFR2）来拮抗VEGF。这样的表位结合结构域可以选自SEQ ID NO:181、182和SEQ ID NO:104、106、108、110、191、192、193或194中所示的那些。
在特定的实施方案中，抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:78的重链序列和SEQ ID NO:86的轻链序列，其中重链和轻链（任选地重链）中的一个或两者进一步包含与其连接的能够拮抗VEGF或VEGF受体（任选地VEGF）的表位结合结构域。在特定的实施方案中，表位结合结构域具有SEQ ID NO:194中所示的序列。如本文中所述的，表位结合结构域可以通过1至20个氨基酸长的接头与抗原结合蛋白连接。
这样的抗原结合蛋白的实例包括具有表位结合结构域的HGF抗体，所述表位结合结构域包含与重链c-末端或n-末端或轻链c-末端或n-末端连接的VEGF免疫球蛋白单可变结构域，例如，具有SEQ ID NO:112-162中所示重链序列和SEQ ID NO:86或88所示轻链序列的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含与作为VEGF拮抗剂的表位结合结构域连接的抗HGF抗体，其中抗HGF抗体具有与以下抗体相同的CDR：具有SEQ ID NO:78、82或84的重链序列和SEQ ID NO:86的轻链序列的抗体，或具有SEQ ID NO:48的重链序列和SEQ ID NO:50的轻链序列的抗体，或具有SEQ DI NO:52的重链序列和SEQ ID NO:54的轻链序列的抗体，或具有SEQ ID NO:56的重链序列和SEQ ID NO:58的轻链序列的抗体。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含与作为VEGF拮抗剂的表位结合结构域连接的抗HGF抗体，其中重链序列包含SEQ ID NO:112、114、115、117、118、123、125、126、131、133或134和轻链序列包含SEQ ID NO:86或88。
WO2005/017107、WO2007/143098和WO2007/115049中给出了用于本发明中的HGF抗体的更多详细内容。这样的抗原结合蛋白的其他实例包括抗HGF抗体，其具有与重链c-末端或n-末端或轻链c-末端或n-末端连接的抗VEGF表位结合结构域，其中VEGF表位结合结构域是VEGF dAb，其选自SEQ ID NO:104、106、108、110、191、192、193或194中所示的任一个VEGF dAb序列。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包括抗HGF抗体，其具有与重链c-末端或n-末端或轻链c-末端或n-末端连接的抗VEGF表位结合结构域，其中VEGF表位结合结构域是VEGF dAb，其选自SEQ ID NO:104、106、108、110、191、192、193或194中所示的任一个VEGF dAb序列。
如本文中所用的术语“效应子功能”意思是指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性活性（CDC）介导的反应、Fc介导的吞噬作用和经由FcRn受体的抗体循环中的一种或多种。对于IgG抗体，包括ADCC和ADCP的效应子功能是通过重链恒定区与免疫细胞表面上存在的Fcγ受体家族的相互作用介导的。在人体中，这些包括FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。抗原结合蛋白与抗原结合以及Fc/Fcγ复合物的形成之间的相互作用诱导了各种效应，包括细胞毒性、免疫细胞激活、吞噬作用和炎性细胞因子的释放。
据信抗原结合蛋白的恒定区与各种Fc受体（FcR）之间的相互作用介导抗原结合蛋白的效应子功能。显著的生物学效应可以是效应子功能性的结果，特别是抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、补体的固定（补体依赖性细胞毒性或CDC）和抗原结合蛋白的半衰期/清除。通常，介导效应子功能的能力需要抗原结合蛋白与抗原的结合，并不是所有抗原结合蛋白介导每一种效应子功能。
可以以多种方式来测量效应子功能，包括例如通过FcγRIII与天然杀伤细胞的结合或通过FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合来测量ADCC效应子功能。例如，可以在天然杀伤细胞分析中测定本发明的抗原结合蛋白的ADCC效应子功能。这样的分析的实例可以在Shields等，2001The Journal of Biological Chemistry，Vol.276,P6591-6604；Chappel等，1993The Journal of Biological Chemistry，Vol268，p25124-25131；Lazar等，2006PNAS，103；4005-4010中找到。
测定CDC功能的分析的实例包括1995J Imm Meth184:29-38中所描述的。
人恒定区的一些同种型，特别是IgG4和IgG2同种型，基本上缺乏以下功能：a）通过经典途径的补体激活；和b）抗体依赖性细胞毒性。可以根据所需的效应子特性进行对抗原结合蛋白的重链恒定区的各种修饰。已经单独描述了含有特定突变的IgG1恒定区以降低与Fc受体的结合并且因此降低ADCC和CDC（Duncan等，Nature1988，332；563-564；Lund等，J.Immunol.1991，147；2657-2662；Chappel等，PNAS1991，88；9036-9040；Burton和Woof，Adv.Immunol.1992，51；1-84；Morgan等，Immunology1995，86：319-324；Hezareh等，J.Virol.2001，75（24）；12161-12168）。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种包含恒定区的抗原结合蛋白，以使得抗原结合蛋白具有降低的ADCC和/或补体激活或效应子功能性。在一个这样的实施方案中，重链恒定区可以包含IgG2或IgG4同种型的天然失能的恒定区或突变的IgG1恒定区。合适的修饰的实例描述于EP0307434中。一个实例包含位置235和237（EU指数编号）的丙氨酸残基的置换。
已经描述了在残基Asn297上含有特定突变或改变的糖基化的人IgG1恒定区增强与Fc受体的结合。在一些情况中，这些突变已经显示出增强ADCC和CDC（Lazar等，PNAS2006，103；4005-4010；Shields等，J Biol Chem2001，276；6591-6604；Nechansky等，Mol Immunol，2007，44；1815-1817）。
在本发明的一个实施方案中，这样的突变在选自239、332和330（IgG1）的一个或多个位置，或在其他IgG同种型的等价位置。合适突变的实例是S239D和I332E和A330L。在一个实施方案中，本文中所述的本发明的抗原结合蛋白在位置239和332处突变，例如，S239D和I332E，或在进一步的实施方案中，在选自239和332和330的三个或更多个位置突变，例如，S239D和I332E和A330L（EU指数编号）。
在本发明的一个实施方案中，抗原结合蛋白包含具有改变的糖基化特征的重链恒定区，以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能。例如，其中抗原结合蛋白具有增强的ADCC或增强的CDC，或其中具有同时增强的ADCC和CDC效应子功能。产生具有改变的糖基化特征的抗原结合蛋白的合适方法的实例描述于WO2003/011878、WO2006/014679和EP1229125中，其全部可适用于本发明的抗原结合蛋白。
本发明还提供了一种用于产生根据本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括步骤：
a）培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含本文中所述的分离核酸，其中在重组宿主细胞中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因灭活；和
b）回收抗原结合蛋白。
例如，可以使用从BioWa，Inc.（Princeton，NJ）获得的POTELLIGENTTM技术系统进行产生抗原结合蛋白的这些方法，其中缺乏FUT8基因的功能拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导细胞毒性（ADCC）活性的单克隆抗体，所述活性是相对于在具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体而增加。POTELLIGENTTM技术系统的特征描述于US7214775、US6946292、WO0061739和WO0231240中，将其全部引入本文中作为参考。本领域技术人员还将认识到其他合适的系统。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种包含嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，例如，包含具有至少一个来自IgG3的CH2结构域的嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如，其中其具有增强的ADCC或增强的CDC，或增强的ADCC和CDC功能。在一个这样的实施方案中，抗原结合蛋白可以包含一个来自IgG3的CH2结构域，或两个CH2结构域可以都来自IgG3。
还提供了一种用于产生根据本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括步骤：
a）培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含本文中所述的分离核酸，其中表达载体包含编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的Fc结构域的核酸序列；和
b）回收抗原结合蛋白。
例如，可以使用从BioWa，Inc.（Princeton，NJ）和Kyowa Hakko KogyoCo.，Ltd.（现为，Kyowa Hakko Kirin Co.，Ltd.）获得的COMPLEGENTTM技术系统进行产生抗原结合蛋白的这些方法，其中重组宿主细胞包含表达载体，其中编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的嵌合Fc结构域的核酸序列被表达以产生具有增强的补体依赖性细胞毒性（CDC）活性的抗原结合蛋白，所述活性是相对于缺乏这样的嵌合Fc结构域而其他方面相同抗原结合蛋白而增加。COMPLEGENTTM技术系统的特征描述于WO2007011041和US20070148165中，其各自引入本文中作为参考。在可选的实施方案中，可以通过将序列特异性的突变引入IgG链的Fc区中来增强CDC活性。本领域普通技术人员还将认识到其他合适的系统。
本领域技术人员很清楚，这样的修饰不仅可以单独使用，也可以相互结合使用以进一步增强效应子功能。
在本发明的一个这样的实施方案中，提供了包含重链恒定区的抗原结合蛋白，所述重链恒定区包含突变的和嵌合的重链恒定区，例如，其中抗原结合蛋白包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域，其中IgG1 CH2结构域在选自239和332和330的位置上具有一个或多个突变（例如，突变可以选自S239D和I332E和A330L），以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如其中其具有一个或多个以下的功能，增强的ADCC或增强的CDC，例如，其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。在一个实施方案中，IgG1 CH2结构域具有突变S239D和I332E。
在本发明的可选实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，并且其具有改变的糖基化特征。在一个这样的实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域，并且具有改变的糖基化特征，以使得海藻糖与甘露糖的比例为0.8:3或更低，例如，其中抗原结合蛋白是去岩藻糖化的，以使得与具有缺乏所述突变和改变的糖基化特征的免疫球蛋白重链恒定区的等同抗原结合蛋白相比，所述抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如其中其具有一个或多个以下的功能，增强的ADCC或增强的CDC，例如，其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。
在可选的实施方案中，抗原结合蛋白具有至少一个IgG3 CH2结构域和至少一个来自IgG1的重链恒定结构域，其中IgG CH2结构域根据本文中所述的限制进行突变。
在本发明的一个方面中，提供了产生本文中所述的根据本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括步骤：
a）培养含有表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体含有本文中所述的分离核酸，所述表达载体进一步包含编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的嵌合Fc结构域的Fc核酸序列，并且其中在重组宿主细胞中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因被灭活；和
b）回收抗原结合蛋白。
例如，可以使用可从BioWa，Inc.（Princeton，NJ）获得的ACCRETAMABTM技术系统（其结合了POTELLIGENTTM和COMPLEGENTTM技术系统）进行产生抗原结合蛋白的这些方法以产生具有增强的ADCC和CDC活性的抗原结合蛋白，所述活性是相对于缺乏嵌合Fc结构域并在寡糖上具有岩藻糖而其他方面相同的单克隆抗体而增强。
在本发明的再另一个实施方案中，存在包含突变的和嵌合的重链恒定区的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有改变的糖基化特征，以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如，其中其具有一个或多个以下的功能，增强的ADCC或增强的CDC。在一个实施方案中，突变选自位置239和332和330，例如，突变选自S239D和I332E和A330L。在进一步的实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的Ch2结构域。在一个实施方案中，重链恒定区具有改变的糖基化特征，以使得岩藻糖与甘露糖的比例为0.8:3或更低，例如，抗原结合蛋白是去岩藻糖化的，以使得与等同的非嵌合抗原结合蛋白或与缺乏所述突变和改变的糖基化特征的免疫球蛋白重链恒定区相比，所述抗原结合蛋白具有增强的效应子功能。
另一种修饰本发明的抗原结合蛋白的方式涉及通过修饰免疫球蛋白恒定结构域或FcRn（Fc受体，新生的）结合结构域来延长该蛋白的体内半衰期。
在成年哺乳动物中，FcRn，也称为新生Fc受体，通过作为结合IgG同种型的抗体并救助该抗体免于降解的保护性受体而在维持血清抗体水平中起着关键作用。IgG分子被内皮细胞内吞，并且如果结合FcRn，它们将再利用至循环中。相反，没有结合FcRn的IgG分子进入细胞中，并且被靶向于溶酶体途径，它们在其中被降解。
据信新生FcRn受体参与抗体清除和跨越组织的胞转作用（参见Junghans R.P（1997）Immunol.Res16.29-57和Ghetie等（2000）Annu.Rev.Immunol.18，739-766）。确定与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。该部分中描述的这些位置中任一个的转变可能能够提高本发明抗原结合蛋白的血清半衰期和/或改变其效应子性能。
本发明的抗原结合蛋白可以具有提高恒定结构域或其片段对FcRn的亲和性的氨基酸修饰。提高治疗性和诊断性IgG和其他生物活性分子的半衰期具有许多益处，包括降低这些分子给药的量和/或频率。在一个实施方案中，因此提供了根据本文中提供的本发明的抗原结合蛋白或包含具有一个或多个这些氨基酸修饰的IgG恒定结构域的全部或部分（FcRn结合部分）和与该修饰的IgG恒定结构域偶联的非IgG蛋白质或非-蛋白质分子的融合蛋白，其中修饰的IgG恒定结构域的存在提高了抗原结合蛋白的体内半衰期。
PCT公开No.WO00/42072公开了包含具有改变的FcRn结合亲和性的变异体Fc区，该多肽在Fc区的氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和447的任一个或多个处包含氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号是EU指数（Kabat等）的编号。
PCT公开No.WO02/060919A2公开了一种包含IgG恒定结构域的修饰IgG，所述恒定结构域相对于野生型IgG恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，修饰的IgG具有提高的半衰期，并且其中一个或多个氨基酸修饰在位置251、253、255、285-290、308-314、385-389和428-435的一个或多个位置处。
Shield等（2001，J Biol Chem；276:6591-604）使用了丙氨酸扫描诱变来改变人IgG1抗体的Fc区中的残基，然后测定与人FcRn的结合。当改变成丙氨酸时有效地消除与FcRn的结合的位置包括I253、S254、H435和Y436。其他位置显示出不太明显的结合降低，如下：E233-G236、R255、K288、L309、S415和H433。几个氨基酸位置在改变成丙氨酸时呈现出FcRn结合的提高；这些中值得注意的是P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424和N434。许多其他氨基酸位置表现出FcRn结合略有提高（D265、N286、V303、K360、Q362和A378）或无变化（S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444和K447）。
发现最明显的作用是对具有与FcRn的结合提高的组合变异体。在pH6.0，相对于天然IgG1，E380A/N434A变异体显示出与FcRn的结合高出8倍多，与E380A的2倍和N434A的3.5倍形成对比。将T307A添加到其中相对于天然IgG1实现了12倍的结合提高。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含E380A/N434A突变，并且具有提高的与FcRn的结合。
Dall’Acqua等（2002，J Immunol.；169:5171-80）描述了随机诱突和针对小鼠FcRn的人IgG1铰链-Fc片段噬菌体展示文库的筛选。他们公开了位置251、252、254-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、433和436的随机诱变。IgG1-人FcRn复合物稳定性的大幅提高发生在位于跨越Fc-FcRn界面的条带中的取代残基中（M252、S254、T256、H433、N434和Y436）并且位于外周的残基的取代具有较少程度的稳定性改善，如V308、L309、Q311、G385、Q386、P387和N389。通过组合M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F/Y436H突变获得了对人FcRn具有最高亲和性的变异体，并且相对于野生型IgG1呈现出57-倍的亲和性提高。与野生型IgG1相比，该突变的人IgG1在恒河猴中的体内行为呈现出接近4倍的血清半衰期提高。
因此，本发明提供了具有优化的FcRn结合的抗原结合蛋白的变异体。在优选的实施方案中，所述抗原结合蛋白的变异体在所述抗原结合蛋白的Fc区中包含至少一个氨基酸修饰，其中与所述亲本多肽相比，所述修饰选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446和447，其中Fc区中的氨基酸编号是Kabat.的EU指数的编号。
在本发明的进一步的方面中，修饰是M252Y/S254T/T256E。
此外，各种公开文献描述了获得生理上活性的分子的方法，所述分子通过将FcRn结合多肽引入分子中（WO97/43316；US.专利No.5,747,035；WO96/32478；WO91/14438）或通过将分子与保留FcRn结合亲和性但与其他Fc受体的亲和性已经得到很大程度降低的抗体融合（WO99/43713）或与抗体的FcRn结合结构域融合（WO00/09560；U.S.专利N°4,703,039）来改变其半衰期。
此外，还提供了产生具有降低的生物半衰期的抗原结合蛋白的方法。其中将His435突变成丙氨酸的变体IgG导致FcRn结合的选择性丧失和显著降低的血清半衰期（Firan等，2001，International immunology13:993）。U.S.专利No.6,165,745公开了通过将突变引入编码抗原结合蛋白的DNA片段中来产生具有降低的生物半衰期的抗原结合蛋白的方法。该突变包括Fc-铰链结构域的位置253、310、311、433或434的氨基酸置换。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含作为域抗体（dAb）的表位结合结构域，例如，表位结合结构域可以是人VH或人VL，或骆驼抗体VHH（纳米抗体）或鲨鱼dAb（NARV）。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含作为选自CTLA-4（Evibody）；脂质运载蛋白；蛋白A衍生分子如蛋白A的Z-结构域（亲和体，SpA）、A-结构域（亲和性多聚体/Maxibody）；热休克蛋白如GroEI和GroES；转铁蛋白（穿膜抗体）；锚蛋白重复蛋白（DARPin）；肽适体；C-型凝集素结构域（四连接素）；人γ-晶体蛋白和人泛素（affilins）；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白（adnectin）的骨架衍生物的表位结合结构域；其已经接受蛋白工程化以获得与其天然配体以外的配体的结合。
本发明的抗原结合蛋白可以包含连接作为adnectin的表位结合结构域的蛋白质骨架，例如，具有连接重链c-末端的adnectin的IgG骨架，或其可以包含连接adnectin的蛋白质骨架，例如，具有连接重链n-末端的adnectin的IgG骨架，或其可以包含连接adnectin的蛋白质骨架，例如，具有连接轻链c-末端的adnectin的IgG骨架，或其可以包含连接adnectin的蛋白质骨架，例如，具有连接轻链n-末端的adnectin的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为CTLA-4的表位结合结构域蛋白质骨架（例如，IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的CTLA-4的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的CTLA-4的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的CTLA-4的IgG骨架，或其可以包含具有连接轻链c-末端的CTLA-4的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为脂质运载蛋白的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的脂质运载蛋白的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的脂质运载蛋白的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的脂质运载蛋白的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的脂质运载蛋白的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为SpA的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的SpA的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的SpA的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的SpA的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的SpA的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为亲和体的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的亲和体的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的亲和体的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的亲和体的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的亲和体的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为affimer的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的affimer的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的affimer的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的affimer的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的affimer的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为GroEI的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的GroEI的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的GroEI的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的GroEI的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的GroEI的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为转铁蛋白的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的转铁蛋白的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的转铁蛋白的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的转铁蛋白的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的转铁蛋白的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为GroES的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的GroES的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的GroES的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的GroES的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的GroES的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为DARPin的表位结合结构域的蛋白质骨架（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的DARPin的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的DARPin的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的DARPin的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的DARPin的IgG骨架。
在其他实施方案中，其可以包含连接作为肽适体的表位结合结构域的蛋白质骨架，（例如IgG骨架），例如，具有连接重链n-末端的肽适体的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接重链c-末端的肽适体的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链n-末端的肽适体的IgG骨架，或其可以包含例如具有连接轻链c-末端的肽适体的IgG骨架。
在本发明的一个实施方案中，存在四个表位结合结构域，例如，四个域抗体，表位结合结构域中的两个可以对相同抗原具有特异性，或抗原结合蛋白中存在的所有表位结合结构域可以对相同抗原具有特异性。
本发明的配对的VH/VL结构域、抗体和蛋白质骨架可以通过使用接头来连接表位结合结构域。合适接头的实例包括可以是1个氨基酸至150个氨基酸长的氨基酸序列，或1个氨基酸至140个氨基酸，例如，1个氨基酸至130个氨基酸，或1至120个氨基酸，或1至80个氨基酸，或1至50个氨基酸，或1至20个氨基酸，或1至10个氨基酸，或5至18个氨基酸。这样的序列可以具有其自身的三级结构，例如，本发明的接头可以包含单可变结构域。在一个实施方案中，接头的大小等同于单可变结构域。合适的接头可以是1至20埃的大小，例如，小于15埃，或小于10埃，或小于5埃。
在本发明的一个实施方案中，至少一个表位结合结构域用包含1至150个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸的接头直接连接Ig骨架。这样的接头可以是接头“GS”或可以是选自SEQ ID NO:163-170、195或196中所示那些中的任一个的接头，或多个这样的接头。
用于本发明的抗原结合蛋白中的接头可以单独包含一组或多组GS残基或在其他接头之外包含一组或多组GS残基，例如，“GSTVAAPS”或“TVAAPSGS”或“GSTVAAPSGG”。在一个实施方案中，接头包含SEQID NO:163。
在一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“(PAS)n(GS)m”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“(GGGGS)n(GS)m”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“(TVAAPS)n(GS)m”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“(GS)m(TVAAPSGS)n”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“(PAVPPP)n(GS)m”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“(TVSDVP)n(GS)m”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“(TGLDSP)n(GS)m”连接Ig骨架。在所有这些实施方案中，n=1-10，m=0-4。
这样的接头的实例包括(PAS)n(GS)m，其中n=1和m=1、(PAS)n(GS)m，其中n=2和m=1、(PAS)n(GS)m，其中n=3和m=1、(PAS)n(GS)m，其中n=4和m=1、(PAS)n(GS)m，其中n=2和m=0、(PAS)n(GS)m，其中n=3和m=0、(PAS)n(GS)m，其中n=4和m=0。
这样的接头人实例包括(GGGGS)n(GS)m，其中n=1和m=1、(GGGGS)n(GS)m，其中n=2和m=1、(GGGGS)n(GS)m，其中n=3和m=1、(GGGGS)n(GS)m，其中n=4和m=1、(GGGGS)n(GS)m，其中n=2和m=0、(GGGGS)n(GS)m，其中n=3和m=0、(GGGGS)n(GS)m，其中n=4和m=0。
这样的接头实例包括(TVAAPS)n(GS)m，其中n=1和m=1（SEQ ID NO:163）、(TVAAPS)n(GS)m，其中n=2和m=1、(TVAAPS)n(GS)m，其中n=3和m=1、(TVAAPS)n(GS)m，其中n=4和m=1、(TVAAPS)n(GS)m，其中n=1和m=0（SEQ ID NO:164）、(TVAAPS)n(GS)m，其中n=2和m=0、(TVAAPS)n(GS)m，其中n=3和m=0（SEQ ID NO:166）、(TVAAPS)n(GS)m，其中n=4和m=0。
这样的接头的实例包括(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=1和m=1、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=2和m=1、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=3和m=1或(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=4和m=1、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=5和m=1、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=6和m=1、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=1和m=0、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=2和m=10、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=3和m=0、(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=3和m=1（SEQ ID NO:165）或(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=0。
这样的接头的实例包括(PAVPPP)n(GS)m，其中n=1和m=1、(PAVPPP)n(GS)m，其中n=2和m=1、(PAVPPP)n(GS)m，其中n=3和m=1、(PAVPPP)n(GS)m，其中n=4和m=1、(PAVPPP)n(GS)m，其中n=2和m=0、(PAVPPP)n(GS)m，其中n=3和m=0、(PAVPPP)n(GS)m，其中n=4和m=0。
这样的接头的实例包括(TVSDVP)n(GS)m，其中n=1和m=1、(TVSDVP)n(GS)m，其中n=2和m=1、(TVSDVP)n(GS)m，其中n=3和m=1、(TVSDVP)n(GS)m，其中n=4和m=1、(TVSDVP)n(GS)m，其中n=2和m=0、(TVSDVP)n(GS)m，其中n=3和m=0、(TVSDVP)n(GS)m，其中n=4和m=0。
这样的接头的实例包括(TGLDSP)n(GS)m，其中n=1和m=1（SEQ IDNO:57）、(TGLDSP)n(GS)m，其中n=2和m=1、(TGLDSP)n(GS)m，其中n=3和m=1、(TGLDSP)n(GS)m，其中n=4和m=1、(TGLDSP)n(GS)m，其中n=2和m=0、(TGLDSP)n(GS)m，其中n=3和m=0（SEQ ID NO:195）、(TGLDSP)n(GS)m，其中n=4和m=0（SEQ ID NO:196）。
在另一个实施方案中，在表位结合结构域和Ig骨架之间不存在接头。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“TVAAPS”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“TVAAPSGS”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“GS”连接Ig骨架。在另一个实施方案中，表位结合结构域通过接头“ASTKGPT”连接Ig骨架。
接头可以源自人血清白蛋白，例如，SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189或SEQ ID NO:190中所示的接头。接头可以进一步包含一些另外的残基，例如，它们可以包含另外的甘氨酸和丝氨酸残基。这些另外的残基可以在白蛋白衍生序列的开始或结尾处，或可以在白蛋白衍生序列内。这样的接头的实例包括SEQ ID NO:167和SEQ IDNO:169中所示的那些。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含至少一个抗原结合位点，例如，至少一个表位结合结构域，其能够结合人血清白蛋白。
在一个实施方案中，存在至少3个抗原结合位点，例如，存在4或5或6或8或10个抗原结合位点，并且抗原结合蛋白能够结合至少3或4或5或5或8或10个抗原，例如，其能够同时结合3或4或5或6或8或10个抗原。
本发明还提供了用于药物中的抗原结合蛋白，例如，用于制备治疗认为需要血管生成或与升高水平的HGF（HGF/Met信号传导）和/或VEGF相关的实体肿瘤的药物。这样的肿瘤包括结肠肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺（小细胞或非小细胞）肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤、头颈肿瘤、黑素瘤、肉瘤。还包括原发性和继发性（转移性）脑肿瘤，包括但不限于神经胶质瘤（包括室管膜瘤(epenymomas)）、脑膜瘤、少突神经胶质瘤(oligodendromas)、星形细胞瘤（低级的、退化发育的和多形性成胶质细胞瘤）、髓母细胞瘤、神经节瘤、神经鞘瘤和脊索瘤。适合用本发明的抗原结合蛋白治疗的与不合需要的血管生成相关的其他疾病包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、RA和牛皮癣。
本发明提供了治疗患有实体肿瘤（包括结肠肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺（小细胞或非小细胞）肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤、头颈肿瘤、黑素瘤、肉瘤）、原发性和继发性（转移性）脑肿瘤（包括但不限于神经胶质瘤（包括室管膜瘤）、脑膜瘤、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤（低级的、退化发育的和多形性成胶质细胞瘤）、髓母细胞瘤、神经节瘤、神经鞘瘤和脊索瘤）、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、RA或牛皮癣的病人的方法，包括施用治疗量的本发明的抗原结合蛋白。
本发明的抗原结合蛋白可以用于治疗实体肿瘤（包括结肠肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺（小细胞或非小细胞）肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤、头颈肿瘤、黑素瘤、肉瘤）、原发性和继发性（转移性）脑肿瘤（包括但不限于神经胶质瘤（包括室管膜瘤）、脑膜瘤、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤（低级的、退化发育的和多形性成胶质细胞瘤）、髓母细胞瘤、神经节瘤、神经鞘瘤和脊索瘤）、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、RA或牛皮癣，或与HGF和/或VEGF过度产生相关的任何其它疾病。
用于本发明中的蛋白质骨架包括含有抗体所有结构域的全单克隆抗体骨架，或本发明的蛋白质骨架可以包含非常规抗体结构，如单价抗体。这样的单价抗体可以包含配对的重链和轻链，其中将重链的铰链区进行修饰以使得重链没有同型二聚化，如WO2007/059782中所述的单价抗体。其他单价抗体可以包含配对的重链和轻链，其与缺乏功能性可变区和CH1区的第二重链二聚化，其中对第一和第二重链进行修饰以使得它们形成异二聚体而不是同型二聚体，从而形成具有两个重链和一个轻链的单价抗体，如WO2006/015371中所述的单价抗体。这样的单价抗体可以提供表位结合结构域能够连接的本发明的蛋白质骨架。
用于本发明中的表位结合结构域是与不同V区或结构域无关地特异性结合抗原或表位的结构域，其可以是域抗体或可以是作为选自CTLA-4（Evibody）；脂质运载蛋白；蛋白A衍生分子如蛋白A的Z-结构域（亲和体，SpA）；A-结构域（亲和性多聚体/Maxibody）；热休克蛋白如GroEI和GroES；转铁蛋白（穿膜抗体）；锚蛋白重复蛋白（DARPin）；肽适体；C-型凝集素结构域（四连接素）；人γ-晶体蛋白和人泛素（affilins）；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域和纤连蛋白（adnectin）的非免疫球蛋白骨架衍生物的结构域；其已经接受蛋白质工程化以获得与其天然配体以外的配体的结合。在一个实施方案中，其可以是域抗体或其他合适的结构域，如选自CTLA-4、脂质运载蛋白(lipocallin)、SpA、亲和体、亲和性多聚体、GroRI、转铁蛋白、GroES和纤连蛋白的结构域。在一个实施方案中，其可以选自免疫球蛋白单可变结构域、亲和体、锚蛋白重复蛋白（DARPin）和adnectin。在另一个实施方案中，其可以选自亲和体、锚蛋白重复蛋白（DARPin）和adnectin。在另一个实施方案中，其可以是域抗体，例如，选自人、骆驼抗体或鲨鱼（NARV）域抗体的域抗体。
表位结合结构域可以在一个或多个位置连接蛋白质骨架。这些位置包括蛋白质骨架的C-末端和N-末端，例如在IgG的重链C-末端和/或轻链C-末端，或例如在IgG重链N-末端和/或轻链N-末端。
在一个实施方案中，第一表位结合结构域连接包含配对的VH/VL的蛋白质骨架，而第二表位结合结构域连接第一表位结合结构域，例如，其中蛋白质骨架是IgG骨架，第一表位结合结构域可以连接IgG骨架的重链的C-末端，并且该表位结合结构域可以在其C-末端连接第二表位结合结构域，或例如第一表位结合结构域可以连接IgG骨架的轻链的C-末端，并且该第一表位结合结构域可以进一步在其C-末端连接第二表位结合结构域，或例如第一表位结合结构域可以连接IgG骨架的轻链的N-末端，并且该第一表位结合结构域可以进一步在其N-末端连接第二表位结合结构域，或例如第一个表位结合结构域可以连接IgG骨架的重链的N-末端，并且该第一表位结合可以进一步地在其N-末端连接第二表位结合结构域。
当表位结合结构域是域抗体时，一些域抗体可能适合于骨架内的特定位置。
用于本发明中的域抗体可以连接在常规IgG的重链和/或轻链的C-末端。此外，一些免疫球蛋白单可变结构域可以连接常规抗体的重链和轻链两者的C-末端。
在其中免疫球蛋白单可变结构域的N-末端与抗体恒定结构域（CH3或CL）融合的构建体中，肽接头可以帮助免疫球蛋白单可变结构域结合抗体。实际上，dAb的N-端末端位置紧靠参与抗原结合活性的补体决定区（CDR）。因此，短肽接头作为表位结合和蛋白质骨架的恒定结构域之间的间隔物，其可以使得dAb CDR更容易到达抗原，其因此可以以高亲和性结合。
其中免疫球蛋白单可变结构域连接IgG的环境将根据它们与哪条抗体链融合而不同：
当在IgG骨架的抗体轻链的C-端末端融合时，预期各个免疫球蛋白单可变结构域位于抗体铰链和Fc部分的附近。很可能这样的免疫球蛋白单可变结构域将彼此远离定位。在常规的抗体中，Fab片段之间的角度以及各Fab片段和Fc部分之间的角度可能变化非常显著。很可能-对于mAbdAb-Fab片段之间的角度差异不会很大，而对于各Fab片段和Fc部分之间的角度，观察到了一些角的限制。
当在IgG骨架的抗体重链的C-端末端融合时，预期各个免疫球蛋白单可变结构域位于Fc部分的CH3结构域附近。预期这对Fc与Fc受体（例如，FcγRI、II、III和FcRn）的结合特性没有影响，因为这些受体与CH2结构域（对于FcγRI、II、III类的受体）或与CH2和CH3结构域之间的铰链（例如，FcRn受体）接合。这样的抗原结合蛋白的另一个特征是预期两个免疫球蛋白单可变结构域彼此在空间上接近，且只要通过提供合适的接头来提供灵活性，这些免疫球蛋白单可变结构域甚至可以形成同型二聚物质，因此扩展了Fc部分的“拉链”四级结构，这可以增强构建体的稳定性。
这样的结构考虑可能有助于选择最合适的位置来将表位结合结构域（例如，dAb）连接至蛋白质骨架（例如，抗体）上。
抗原的大小、其定位（在血液中或在细胞表面上）、其四级结构（单体的或多聚的）可以发生改变。由于铰链区的存在，常规抗体是天然设计成作为转接器构建体发挥功能，其中在Fab片段顶端的两个抗原结合位点的定向可以大范围地变化，并且因此适应于抗原及其周围环境的分子特征。相反，连接抗体或其他蛋白质骨架（例如，包含无铰链区的抗体的蛋白质骨架）的免疫球蛋白单可变结构域可能直接或间接地具有较低的结构灵活性。
了解溶液状态和免疫球蛋白单可变结构域处的结合模式也是有帮助的。已经收集了dAb在体外可能主要以单体休、同型二聚的或多聚的形式存在于溶液中的证据（Reiter等(1999)J Mol Biol290p685-698；Ewert等(2003)J Mol Biol325，p531-553，Jespers等，(2004)J Mol Biol 337p893-903；Jespers等(2004)Nat Biotechnol 22 p1161-1165；Martin等(1997)Protein Eng.10 p607-614；Sepulvada等(2003)J Mol Biol 333 p355-365)。这使得清楚地联想到在体内观察到的Ig结构域的多聚化事件如Bence-Jones蛋白质（其可以是免疫球蛋白轻链的二聚体）（Epp等，(1975)Biochemistry 14 p4943-4952；Huan等，(1994)Biochemistry 33p14848-14857；Huang等，(1997)Mol immunol 34 p1291-1301)和淀粉样纤维（James等，(2007)J Mol Biol.367:603-8）。
例如，可能希望将倾向于在溶液中二聚化的dab连接到Fc部分的C-端末端，优选轻链的C-端末端，因为在本发明的抗原结合蛋白的情况中，连接Fc的C-端末端将允许那些dAb二聚化。
本发明的抗原结合蛋白可以包含对单个抗原特异性的抗原结合位点，或可以具有对两个或更多个抗原特异性的抗原结合位点，或对于单一抗原上的两个或更多个表位特异性的抗原结合位点，或可以存在各自对相同或不同抗原上的不同表位特异性的抗原结合位点。
特别地，本发明的抗原结合蛋白可以用于治疗与HGF和VEGF相关的疾病，例如，据认为需要血管生成或与升高的HGF（HGF/Met信号传导）和/或VEGF水平相关的实体肿瘤。这样的肿瘤包括结肠肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺（小细胞或非小细胞）肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤、头颈肿瘤、黑素瘤、肉瘤。还包括原发性和继发性（转移性）脑肿瘤，包括但不限于神经胶质瘤（包括室管膜瘤）、脑膜瘤、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤（低级的、退化发育的和多形性成胶质细胞瘤）、髓母细胞瘤、神经节瘤、神经鞘瘤和脊索瘤。适合于使用本发明的抗原结合蛋白治疗的与不合需要的血管生成相关的其他疾病包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、RA和牛皮癣。
可以通过用包含本发明抗原结合蛋白的编码序列的表达载体转染宿主细胞来产生本发明的抗原结合蛋白。通过将这些抗原结合蛋白的编码序列与能够控制在宿主细胞中的复制和表达和/或从宿主细胞分泌的常规调控序列可操作地相连来产生表达载体或重组质粒。调控序列包括启动子序列，例如，CMV启动子，和可源自于其他已知抗体的信号序列。相似地，可以产生具有编码互补抗原结合蛋白轻链或重链的DNA序列的第二表达载体。在特定的实施方案中，这种第二表达载体除所涉及的编码序列和选择标记之外与第一表达载体相同，以尽可能确保各个多肽链得到功能性表达。或者，抗原结合蛋白的重链和轻链编码序列可以位于单一载体上，例如，在相同载体中的两个表达盒中。
通过常规技术，将选定的宿主细胞用第一和第二载体共转染（或简单地通过单一载体转染），以形成本发明的包含重组的或合成的轻链和重链的转染宿主细胞。然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的工程化抗原结合蛋白。通过合适的分析试验，如ELISA或RIA，从培养物筛选包括重组重链和/或轻链的结合的抗原结合蛋白。可以使用相似的常规技术来构建其他抗原结合蛋白。
本领域技术人员可以选择用于本发明的方法和组合物构建中所用的克隆和亚克隆步骤中的合适载体。例如，可以使用常规pUC系列的克隆载体。一种载体，pUC19，可从供应机构，如Amersham（Buckinghamshire，英国）或Pharmacia（Uppsala，瑞典）购得，此外，能够容易地复制的、具有丰富的克隆位点和选择基因（例如，抗生素抗性）和易于操作的任何载体可以用于克隆。因此，在本发明中，克隆载体的选择不是限制因素。
还可以通过适用于扩增异源DNA序列的表达的基因，例如，哺乳动物二氢叶酸还原酶基因（DHFR），来表征表达载体。其他载体序列包括多聚A信号序列，如来自牛生长激素（BGH）和β球蛋白启动子序列（betaglopro）。可以通过本领域技术人员公知的技术来合成本发明中有用的表达载体。
这些载体的组成部分，例如，复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，可以获自商业或天然来源，或通过用于指导在选定宿主中表达和/或选择重组DNA产物的已知程序来合成。也可以选择本领域已知的多种类型的用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的其他合适的表达载体以用于该目的。
本发明还包括用含有本发明抗原结合蛋白编码序列的重组质粒转染的细胞系。可用于这些克隆载体的克隆和其他操作的宿主细胞也是常规的。然而，来自各种大肠杆菌菌株的细胞可用于克隆载体的复制和本发明抗原结合蛋白构建中的其他步骤。
用于本发明抗原结合蛋白表达的合适宿主细胞或细胞系包括哺乳动物细胞，如NS0、Sp2/0、CHO（例如，DG44）、COS、HEK、成纤维细胞（例如，3T3）和骨髓瘤细胞，例如，其可以在CHO或骨髓瘤细胞中表达。可以使用人细胞，因此使得该分子以人糖基化模式进行修饰。或者，可以使用其他真核生物细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择和用于转化、培养、扩增、筛选以及产物产生和纯化的方法是本领域已知的。参见，例如，以上引用的Sambrook等。
可以证明细菌细胞可用作适用于重组Fab表达或本发明其他实施方案的宿主细胞（参见，例如，Plückthun，A.，Immunol.Rev.，130:151-188（1992））。然而，由于在细菌细胞中表达的蛋白质倾向于为非折叠或不恰当折叠的形式或是非糖基化的形式，因此必须筛选细菌细胞中产生的任何重组Fab的抗原结合能力的保留。如果细菌细胞表达的分子以正确折叠的形式产生，那么该细菌细胞将是理想的宿主，或在可选的实施方案中，分子可以在细菌细胞中表达，随后将其再折叠。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株作为宿主细胞是生物技术领域中公知的。枯草芽孢杆菌、链霉菌、其他杆状菌等的各种菌株也可用于该方法中。
在需要的情况下，本领域技术人员已知的酵母细胞的菌株也可用作宿主细胞，以及昆虫细胞例如果蝇和鳞翅目以及病毒表达系统。参见，例如，Miller等，Genetic Engineering，8:277-298，Plenum Press（1986）和其中引用的参考文献。
可以构建载体的一般方法、生产本发明宿主细胞所需的转染方法以及从这样的宿主细胞产生本发明抗原结合蛋白所需的培养方法全都是常规技术。通常，本发明的培养方法是无血清培养方法，通常通过在悬浮液中无血清地培养细胞。同样，本发明的抗原结合蛋白一旦产生，可以根据本领域的标准程序，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、凝胶电泳等，从细胞培养物内容物中纯化本发明的抗原结合蛋白。这样的技术是在本领域技术人员能力范围内的并且对本发明没有限制。例如，改变的抗体的制备描述于WO99/58679和WO96/16990中。
抗原结合蛋白表达的再另一种方法可以利用在转基因动物中的表达，如U.S.专利No.4,873,316中所描述的。这涉及使用动物酪蛋白启动子的表达系统，将该启动子通过转基因方式整合至哺乳动物中时允许雌性动物在其乳汁中产生所需的重组蛋白。
在本发明进一步的方面中，提供了产生本发明抗体的方法，该方法包括培养用编码本发明抗体的轻链和/或重链的载体转化或转染的宿主细胞和回收由此产生的抗体的步骤。
根据本发明，提供了产生本发明抗原结合蛋白的方法，该方法包括步骤：
（a）提供编码抗原结合蛋白重链的第一载体；
（b）提供编码抗原结合蛋白轻链的第二载体；
（c）用所述第一和第二载体转化哺乳动物宿主细胞（例如，CHO）；
（d）在有益于抗原结合蛋白从所述宿主细胞分泌至所述培养基中的条件下培养步骤（c）的宿主细胞；
（e）回收步骤（d）的分泌的抗原结合蛋白。
一旦通过所需方法表达，随后通过使用合适的分析方法检验抗原结合蛋白的体外活性。目前常规的ELISA分析形式用于评定抗原结合蛋白与其靶标的定性和定量结合。此外，其他体外分析也可以用于验证中和效力，接着进行后续的人体临床研究来评价抗原结合蛋白在体内的持久性，尽管存在常见的清除机制。
治疗的剂量和持续时间与本发明的分子在人体循环中的相对持续时间相关，并且可以由本领域技术人员根据待治疗的病症和病人的一般健康来调节。设想了可能需要在延长的时间段内（例如，四至六个月）重复给药（例如，一周一次或每两周一次）以实现最大的治疗功效。
本发明治疗剂的给药方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适的途径。本发明的抗原结合蛋白和药物组合物特别可用于肠胃外给药，即，皮下（s.c.）、鞘内、腹膜内、肌内（i.m.）、静脉内（i.v.）或鼻内。
可以将本发明的治疗剂制备成在药物学上可接受的载体中含有本发明的抗原结合蛋白作为活性成分的药物组合物。在本发明的预防剂中，含有抗原结合蛋白的水性悬浮液或溶液可以以即注射的形式在生理pH下缓冲。用于肠胃外给药的组合物通常将包含本发明抗原结合蛋白的溶液或溶解于药物学上可接受的载体（例如，水性载体）中的其混合物。可以使用多种水性载体，例如，0.9%盐水、0.3%甘氨酸等。这些溶液可以制成无菌的，并且通常不含颗粒物质。可以通过常规的、公知的灭菌技术（例如，过滤）将这些溶液灭菌。组合物可以按照需要含有药物学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲剂等。本发明的抗原结合蛋白在这样的药物制剂中的浓度可以广泛变化，即从低于约0.5%，通常为或至少约1%，至高达15或20%重量，并且将主要根据选定的特定给药方式，基于流体体积、粘度等来选择。
因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可以制备成含有1mL无菌缓冲水和约1ng至约200mg，例如，约50ng至约30mg，或约5mg至约25mg本发明的抗原结合蛋白。相似地，本发明的用于静脉内输注的药物组合物可以制备成含有约250ml的林格氏溶液和约1至约30或约5mg至约25mg本发明的抗原结合蛋白/ml林格氏溶液。用于制备肠胃外给药组合物的实际方法是公知的或是本领域技术人员显而易见的，并且更详细地描述于例如Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，宾夕法尼亚州中。对于本发明的静脉内给药的抗原结合蛋白制剂的制备，参见Lasmar U和Paikins D“Theformulation of Biopharmaceutical products（生物药品的配制）”，Pharma.Sci.Tech.today，p.129-137，vol.3（2000年4月3日），Wang，W“Instability,stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals（液体蛋白质药物的不稳定性、稳定化和配制”，Int.J.Pharm185(1999)129-188，Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B（蛋白质药物的稳定性，部分A和B），编辑Ahern T.J.,Manning M.C.,New York,NY:Plenum Press(1992),Akers,M.J.“Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations（肠胃外制剂中的赋形剂-药物相互作用）”，J.Pharm Sci91(2002)2283-2300，Imamura，K等，“Effects of types of sugar on stabilization ofProtein in the dried state（糖的类型对于干燥状态蛋白质的稳定化的影响）”，J Pharm Sci92(2003)266-274，Izutsu,Kkojima，S.“Excipientcrystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying（冻干过程中赋形剂结晶及其蛋白质结构稳定作用），J Pharm.Pharmacol，54(2002)1033-1039，Johnson，R，“Mannitol-sucrosemixtures-versatile formulations for protein lyophilization（用于蛋白质冻干的甘露糖醇-蔗糖混合物-通用制剂”，J.Pharm.Sci,91(2002)914-922。
Ha，E Wang W，Wang Y.j.“Peroxide formation in polysorbate 80 andprotein stability（聚山梨酸酯80中的过氧化物形成和蛋白质稳定性）”，J.Pharm Sci，91，2252-2264，(2002)（将其全部内容引入本文中作为参考）以及读者特别指出的。
在一个实施方案中，本发明的治疗剂，当处于药物制剂中时，以单位剂型存在。本领域技术人员很容易确定合适的治疗有效剂量。可以根据体重计算病人的合适剂量，例如，合适的剂量可以在0.01至20mg/kg的范围内，例如，0.1至20mg/kg，例如，1至20mg/kg，例如，10至20mg/kg，或例如，1至15mg/kg，例如，10至15mg/kg。为了有效治疗人体中本发明所用的病症，合适的剂量可以在0.01至1000mg的范围内，例如，0.1至1000mg，例如，0.1至500mg，例如，500mg，例如0.1至100mg，或0.1至80mg，或0.1至60mg，或0.1至40mg，或例如1至100mg，或1至50mg本发明的抗原结合蛋白，其可以肠胃外给药，例如，皮下、静脉内或肌内。如果需要，可以由医师适当选择的合适时间间隔重复这样的剂量。
可以将本文中所述的抗原结合蛋白冻干用于存储，并且在使用前在合适的载体中重建。该技术已经显示出对于常规的免疫球蛋白是有效的，并且可以使用本领域已知的冻干和重建技术。
本领域中存在几种可以用于找到本发明中所用的表位结合结构域的方法。
术语“文库”指的是异源多肽或核酸的混合物。文库由各具有单个多肽或核酸序列的成员组成。在该方面，“文库”与“组（repertoire）”同义。文库成员之间的序列差异引起文库中存在的多样性。文库可以采取多肽或核酸的简单混合物的形式，或可以是用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如，细菌、病毒、动物或植物细胞等。在一个实例中，各单个生物体或细胞只含有一种或有限数目的文库成员。有利地，将核酸整合至表达载体中，以使得核酸编码的多肽能够表达。因此，在一个方面中，文库可以采取宿主生物体群体的形式，各生物体含有一个或多个表达载体的拷贝，所述表达载体含有核酸形式文库的单个成员，其可以表达以产生其相应的多肽成员。因此，宿主生物体群体具有编码大的多样的多肽组的能力。
“通用框架”是对应于如Kabat（“Sequences of Proteins ofImmunological Interest（具有免疫学意义的蛋白质的序列）”）限定的序列中保守的抗体区域或对应于如Chothia和Lesk（1987），J.Mol.Biol.196:910-917限定的人种系免疫球蛋白组或结构的单一抗体框架序列。可能存在单一框架，或一组这样的框架，已经发现其实质上允许通过超变区单独的变异来得到任何结合特异性。
在一个实施方案中，使用算法BLAST 2 Sequences以缺省参数（Tatusova.T.A.等，FEMS Microbiol Lett，174:187-188（1999））进行和测定了本发明中所限定的氨基酸和核苷酸序列比对及同源性、相似性或同一性。
当展示系统（例如，将核酸的编码功能与核酸编码的肽或多肽的功能性特征关联的展示系统）用于本文中所述的方法中时，例如，在dAb或其他表位结合结构域的选择中，扩增或增加编码所选定的肽或多肽的核酸的拷贝数常常是有利的。这提供了使用本文中所述的方法或其他合适的方法获得足量的核酸和/或肽或多肽用于其他轮的选择的有效方式，或用于制备其他组（例如，亲和性突变体组）。因此，在一些实施方案中，选择表位结合结构域的方法包括使用展示系统（例如，将核酸的编码功能与核酸编码的肽或多肽的功能性特征相关联的展示系统，如噬菌体展示），并且进一步包括扩增或增加编码所选定的肽或多肽的核酸的拷贝数。可以使用任何合适的方法来扩增核酸，如通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链式反应。
在一个实例中，该方法使用将核酸的编码功能与核酸编码的多肽的物理、化学和/或功能性特征关联的展示系统。这样的展示系统可以包含多个可复制遗传包，如噬菌体或细胞（细菌）。展示系统可以包含文库，如噬菌体展示文库。噬菌体展示是展示系统的一个实例。
多种合适的噬菌体展示系统（例如，单价展示和多价展示系统）已经得到了描述（参见，例如，Griffiths等，U.S专利号6,555,313B1（引入本文中作为参考）；Johnson等，U.S.专利号5,733,743（引入本文中作为参考）；McCafferty等，U.S.专利号5,969,108（引入本文中作为参考）；Mulligan-Kehoe,U.S.专利号5,702,892（引入本文中作为参考）；Winter,G.等，Annu.Rev.Immunol.12:433-455(1994)；Soumillion,P.等，Appl.Biochem.Biotechnol.47(2-3):175-189(1994)；Castagnoli,L.等，Comb.Chem.High Throughput Screen，4(2):121-133(2001)）。例如，噬菌体展示系统中展示的肽或多肽可以在任何合适的噬菌体上展示，如丝状噬菌体（例如，fd、M13、F1）、溶解性噬菌体（例如，T4、T7、λ）或RNA噬菌体（例如，MS2）。
通常，产生或提供展示一组肽或噬菌体多肽（phagepolypeptide）的噬菌体文库，如与合适的噬菌体外壳蛋白（例如，fd pIII蛋白）的融合蛋白。融合蛋白可以在噬菌体外壳蛋白的尖端展示肽或多肽，或如果需要的话，在内部位置展示。例如，展示的肽或多肽可以存在于作为pIII结构域1的氨基末端的位置。（pIII的结构域1也称为N1）。展示的多肽可以与pIII直接融合（例如，pIII结构域1的N-末端）或使用接头与pIII融合。如果需要，融合体可以进一步包含标签（例如，myc表位、His标签）。可以使用任何合适的方法来产生包含作为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白展示的一组肽或多肽的文库，所述方法如通过将编码展示的肽或多肽的噬菌体载体或噬菌粒的文库引入合适的宿主细菌中，并且培养所得到的细菌来产生噬菌体（例如，如果需要，使用合适的辅助噬菌体或互补质粒）。可以使用任何合适的方法，如沉淀和离心，从培养物中回收噬菌体文库。
展示系统可以包含一组含有任何所需多样性水平的肽或多肽。例如，组可以包含具有对应于生物体、生物体组、所需组织或所需细胞类型表达的天然产生多肽的氨基酸序列的肽或多肽，或可以包含具有随机或随机化氨基酸序列的肽或多肽。如果需要，多肽可以共有共同的核心或骨架。例如，组或文库中的所有多肽可以基于选自以下的骨架：蛋白A、蛋白L、蛋白G、纤连蛋白结构域、抗运载蛋白、CTLA4、所需的酶（例如，聚合酶、纤维素酶）或来自于免疫球蛋白超家族的多肽，如抗体或抗体片段（例如，抗体可变结构域）。这样的组或文库中的多肽可以包含随机或随机化氨基酸序列的限定区域和共同氨基酸序列的区域。在特定的实施方案中，组中的所有或基本上所有多肽是所需的类型，如所需的酶（例如，聚合酶）或所需的抗体的抗原结合片段（例如，人VH或人VL）。在一些实施方案中，多肽展示系统包含一组多肽，其中各个多肽包含抗体可变结构域。例如，组中的各个多肽可以包含VH、VL或Fv（例如，单链Fv）。
可以使用任何合适的方法，将氨基酸序列多样性引入肽或多肽或骨架的任何所需的区域中。例如，可以通过使用任何合适的诱变方法（例如，低保真PCR、寡核苷酸介导的或定点诱变、使用NNK密码子的多样化）或任何其他合适的方法来制备编码多样化多肽的核酸的文库而将氨基酸序列多样性引入目标区域中，如抗体可变结构域的互补决定区或疏水性结构域。如果需要，待多样化的多肽区域可以随机化。
构成所述组的多肽的大小主要是一个选择的问题，并且不需要均一的多肽大小。组中的多肽可以至少具有三级结构（形成至少一个结构域）。
选择/分离/回收
可以使用任何合适的方法从组或文库（例如，在展示系统中）选择、分离和/或回收表位结合结构域或结构域群。例如，基于可选择特征（例如，物理特征、化学特征、功能性特征）来选择或分离结构域。合适的可选择功能性特征包括组中肽或多肽的生物活性，例如，结合通用配体（例如，超抗原）、结合目标配体（例如，抗原、表位、底物）、结合抗体（例如，通过肽或多肽上表达的表位）和催化活性（参见，例如，Tomlinson等，WO99/20749；WO01/57065；WO99/58655）。
在一些实施方案中，从其中基本上所有结构域共有共同的可选择特征的肽或多肽文库或组选择和/或分离蛋白酶抗性的肽或多肽。例如，结构域可以选自其中基本上所有结构域结合共同通用配体、结合共同目标配体、结合共同抗体（或被共同抗体结合）或具有共同催化活性的文库或组。这种类型的选择对于制备基于具有所需生物活性的亲本肽或多肽的结构域组特别有用，例如，当进行免疫球蛋白单可变结构域的亲和性成熟时。
基于结合共同通用配体的选择可以产生含有全部或基本上全部作为原始文库或组的部分的结构域的结构域集合或群体。例如，可以通过淘选或使用合适的亲和性基质来选择、分离和/或回收结合目标配体或通用配体如蛋白A、蛋白L或抗体的结构域。可以通过将配体（例如，通用配体、目标配体）的溶液加入合适的容器（例如，试管、皮氏培养皿）中并使配体沉积或涂覆在容器壁上来实现淘选。可以将过量的配体洗掉，并且将结构域加入容器中，将容器维持在适于肽或多肽结合固定化配体的条件下。可以将未结合的结构域洗掉，并且使用任何合适的方法，例如，如刮削或降低pH，来回收结合的结构域。
合适的配体亲和性基质通常含有配体与其共价或非共价连接的固体支持物或珠（例如，琼脂糖）。可以在适于结构域与基质上的配体结合的条件下，使用分批方法、柱方法或任何其他合适的方法将亲和性基质与肽或多肽（例如，已经用蛋白酶温育的组）组合。可以将没有结合亲和性基质的结构域洗掉，并可以使用任何合适的方法，如用较低pH的缓冲液稀释、用温和的变性剂（例如，脲）或用与配体竞争结合的肽或结构域，来洗脱和回收结合的结构域。在一个实例中，将生物素化的目标配体在适于组中的结构域结合目标配体的条件下与组混合。使用固定化的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素（例如，珠上的）回收结合的结构域。
在一些实施方案中，通用或目标配体是抗体或其抗原结合片段。与文库或组的肽或多肽中基本上保守的肽或多肽结构特征结合的抗体或抗原结合片段特别可用作通用配体。适于用作用于分离、选择和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽的抗体和抗原结合片段可以是单克隆或多克隆的，并且可以使用任何合适的方法来制备。
文库/组
可以使用任何合适的方法来制备或获得编码和/或含有蛋白酶表位结合结构域的文库。可以设计文库来编码基于目标结构域或骨架的结构域（例如，从文库中选择的结构域）或文库可以使用本文中所述的方法从另一个文库中选择。例如，可以使用合适的多肽展示系统来制备富含结构域的文库。
可以使用任何合适的方法容易地产生编码一组所需类型的结构域的文库。例如，可以获得编码所需类型多肽（例如，免疫球蛋白可变结构域）的核酸序列，并且可以制备各自含有一个或多个突变的核酸的集合，例如，通过使用易错聚合酶链式反应（PCR）系统扩增核酸、通过化学诱变（Deng等，J.Biol.Chem.，269:9533（1994））或使用细菌增变株（Low等，J.Mol.Biol.，260:359（1996））。
在其他实施方案中，核酸的特定区域可以靶向用于多样化。用于突变选定的位置的方法也是本领域公知的，并且包括，例如，使用错配的寡核苷酸或简并寡核苷酸，使用或不用PCR。例如，已经通过将突变靶向于抗原结合环建立了合成抗体文库。随机或半随机抗体H3和L3区已经附加到种系免疫球蛋白V基因片段上以产生具有未突变框架区的大文库（Hoogenboom和Winter(1992)上文；Nissim等(1994)上文；Griffiths等(1994)上文；DeKruif等(1995)上文）。这样的多样化已经扩展到包括一些或全部其他抗原结合环（Crameri等(1996)Nature Med.,2:100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13:475；Morphosys，WO97/08320，上文）。在其他实施方案中，核酸的特定区域可以靶向用于多样化，例如，通过两步PCR策略，其使用第一个PCR的产物作为“大引物（mega-primer）”（参见，例如，Landt,O.等，Gene96:125-128(1990)）。例如，还可以通过SOE PCR来实现靶向多样化（参见，例如，R.M.等，Gene77:61-68(1989).）。
可以通过改变规定多肽序列的编码序列来实现选定位置的序列多样性，以使得在该位置可以整合多种可能的氨基酸（例如，所有20个或其子集）。使用IUPAC命名法，最通用的密码子是NNK，其编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。为了引入所需的多样性，可以使用NNK密码子。获得相同末端的其他密码子也可以使用，包括NNN密码子，其导致产生另外的终止密码子TGA和TAA。这样的靶向方法可以允许利用目标区域中的全序列空间。
一些文库包含作为免疫球蛋白超家族的成员（例如，抗体或其一部分）的结构域。例如，文库可以包含具有已知主链构象的结构域（参见，例如，Tomlinson等，WO99/20749）。可以在合适的质粒或载体中制备文库。如本文中所用的，载体指的是用于将异源DNA引入用于其表达和/或复制的细胞中的离散元件。可以使用任何合适的载体，包括质粒（例如，细菌质粒）、病毒或噬菌体载体、人工染色体和游离体载体。这样的载体可以用于简单的克隆和诱变，或表达载体可以用来驱动文库的表达。载体和质粒通常含有一个或多个克隆位点（例如，多接头）、复制起点和至少一个选择标记基因。表达载体可以进一步含有驱动多肽转录和翻译的元件，如增强子元件、启动子、转录终止信号、信号序列等。这些元件可以以可操作地连接编码多肽的克隆插入片段的方式来排列，以使得当这样的表达载体维持在适于表达的条件下（例如，在合适的宿主细胞中）时表达和产生多肽。
克隆和表达载体通常含有使载体能够在一种或多种选定宿主细胞中复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列是使载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列并且包括复制起点或自主复制序列。这样的序列对于多种细菌、酵母和病毒是公知的。来自质粒pBR332的复制起点适于大部分革兰氏阴性细菌，该2μ质粒起点适合于酵母，以及各种病毒起点（例如，SV40，腺病毒）可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，对于哺乳动物表达载体不需要复制起点，除非将它们用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞中，如COS细胞。
克隆或表达载体可以含有也称为选择标记的选择基因。这样的标记基因编码对于生长于选择培养基中的转化宿主细胞的存活或生长必要的蛋白质。因此未被含有选择基因的载体转化的宿主细胞在该培养基中将不能存活。典型的选择基因编码赋予抗生素和其他毒素（例如，氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素）抗性、补充营养缺陷或提供生长培养基中不可得的关键营养素的蛋白质。合适的表达载体可以含有多种成分，例如，复制起点、选择标记基因、一个或多个表达控制元件，如转录控制元件（例如，启动子、增强子、终止子）和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。如果存在，表达控制元件和信号或前导序列可以由载体或其他来源提供。例如，编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可以用于指导表达。
可以提供启动子用于在所需宿主细胞中表达。启动子可以是组成型的或诱导型的。例如，启动子可以可操作地连接编码抗体、抗体链或其部分的核酸，以使得其指导核酸的转录。可使用多种适用于原核生物宿主（例如，用于大肠杆菌的β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸（trp）启动子系统、lac、tac、T3、T7启动子）和真核生物宿主（例如，猿病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子、细胞巨化病毒启动子、腺病毒晚期启动子、EG-1a启动子）的启动子。
此外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记，并且在可复制表达载体的情况中，还包含复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常见的选择标记，并且可以用于原核细胞（例如，β-内酰胺酶基因（氨苄青霉素抗性）、用于四环素抗性的Tet基因）和真核细胞（例如，新霉素（G418或遗传霉素(geneticin)）、gpt（霉酚酸）、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因）中。二氢叶酸还原酶标记基因允许在各种宿主中使用氨甲喋呤来进行选择。编码宿主的营养缺陷标记的基因产物的基因（例如，LEU2、URA3、HIS3）常常用作酵母中的选择标记。还设想使用病毒（例如，杆状病毒）或噬菌体载体，以及能够整合至宿主细胞基因组中的载体，如逆转录病毒载体。
用于在原核细胞（例如，细菌细胞，如大肠杆菌）或哺乳动物细胞中表达的合适的表达载体包括，例如，pET载体（例如，pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40，Novagen等）、噬菌体载体（例如，pCANTAB5E，Pharmacia）、pRIT2T（蛋白A融合载体，Pharmacia）、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1（Invitrogen，Carlsbad，CA）、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXT1（Stratagene，La Jolla，CA）、pCDEF3（Goldman，L.A.等，Biotechniques，21:1013-1015(1996))、pSVSPORT（GibcoBRL，Rockville，MD）、pEF-Bos（Mizushima，S.等，Nucleic Acids Res.，18:5322(1990)）等。可以得到适用于各种表达宿主如原核细胞（大肠杆菌）、昆虫细胞（果蝇Schnieder S2细胞，Sf9）、酵母（甲醇毕赤酵母（P.methanolica）、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母（S.cerevisiae））和哺乳动物细胞（例如，CHO细胞）中的表达载体。
载体的一些实例是使对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达成为可能的表达载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单一克隆的独立增殖和表达来进行利用通用配体和/或目标配体的选择。如上所述，特定的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或嗜菌粒载体，例如，载体可以是具有大肠杆菌复制起点（用于双链复制）以及噬菌体复制起点（用于单链DNA的产生）的嗜菌粒载体。这样的载体的操作和表达是本领域公知的（Hoogenboom和Winter(1992)上文；Nissim等，(1994)上文）。简而言之，载体可以含有赋予嗜菌粒选择性的β-内酰胺酶基因和表达盒上游的lac启动子，所述表达盒可以含有合适的前导序列、多克隆位点、一个或多个肽标签、一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的各种抑制体和非抑制体菌株并添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）或辅助噬菌体如VCS M13，载体能够作为质粒复制而没有表达，只产生大量多肽文库成员或产物噬菌体，其中一些在其表面上含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。
抗体可变结构域可以包含目标配体结合位点和/或通用配体结合位点。在特定的实施方案中，通用配体结合位点是用于超抗原（如蛋白A、蛋白L或蛋白G）的结合位点。可变结构域可以是基于任何所需的可变结构域，例如，人VH（例如，VH1a、VH1b、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6）、人VL（例如，VLI、VLII、VLIII、VLIV、VLV、VLVI或VK1）或人VK（例如，VK2、VK3、VK4、VK5、VK6、VK7、VK8、VK9或VK10）。
再一个类别的技术涉及人造隔室中组的选择，这允许基因与其基因产物连接。例如，WO99/02671、WO00/40712和Tawfik&Griffiths（1998）Nature Biotechnol16(7)，652-6中描述了一种选择系统，其中可以在通过油包水型乳液形成的微胶囊中选择编码所需基因产物的核酸。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件分隔到微胶囊中，然后转录和/或翻译以在微胶囊内产生其相应的基因产物（RNA或蛋白）。随后将产生具有所需活性的基因产物的遗传元件分类。该方法通过各种方式检测所需活性而选择目标基因产物。
表位结合结构域的表征
可以通过本领域技术人员熟悉并且包括ELISA的方法测试结构域与其特异性抗原或表位的结合。在一个实施例中，使用单克隆噬菌体ELISA测试结合。
可以根据任何合适的程序来进行噬菌体ELISA：以下列出了示例性的实验方案。
可以通过ELISA筛选各轮选择产生的噬菌体群体与选定抗原或表位的结合以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可以通过ELISA筛选来自这些群体的单一感染细菌克隆的噬菌体以鉴定“单克隆”噬菌体抗体。还希望筛选用于结合抗原或表位的可溶性抗体片段，并且这也可以通过ELISA使用例如针对C-或N-末端标签的试剂来进行（参见，例如，Winter等，（1994），Ann.Rev.Immunology12,433-55，以及其中引用的参考文献）。
还可以通过PCR产物的凝胶电泳（Marks等，1991，上文；Nissim等，1994，上文）、探测（Tomlinson等，1992，J.Mol.Biol.227，776）或通过载体DNA的测序来确定选定的噬菌体单克隆抗体的多样性。
dAb的结构
在dAb选自例如，使用如本文中所述的噬菌体展示技术选择的V-基因组的情况中，这些可变结构域包含通用框架区，使得它们可以被如本文中限定的特定通用配体识别。WO99/20749中描述了通用框架、通用配体等的使用。
在使用V-基因组的情况中，多肽序列中的变异可以位于可变结构域的结构环内。可以通过DNA改组或通过突变来改变任一个可变结构域的多肽序列，以增强各可变结构域与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的，并且例如，由Stemmer，1994，Nature370:389-391和U.S.专利No.6,297,053所教导的，将两篇文献都结合至本文中作为参考。诱变的其他方法是本领域技术人员公知的。
用于构建dAb的骨架
i.主链构象的选择
免疫球蛋白超家族的成员对于其多肽链来说全部具有相似的折叠。例如，尽管就其一级序列而言抗体是高度多样化的，序列和晶相结构的比较已经揭示了，与预期相反，抗体的六个抗原结合环中的五个（H1、H2、L1、L2、L3）采取有限数目的主链构象或正则结构（Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196:901；Chothia等，(1989)Nature，342:877）。因此环长度和关键残基的分析使得能够预测大部分人抗体中发现的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象（Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227:799；Tomlinson等(1995)EMBO J.，14:4628;Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264:220）。尽管就序列、长度和结构而言（由于使用D片段），H3区更多样性，但对于短的环长度也形成了有限数目的主链构象，这取决于长度及环和抗体框架中关键位置的特定残基的存在或残基的类型（Martin等(1996)J.Mol.Biol.,263:800；Shirai等(1996)FEBS Letters，399:1）
有利地，dAb从结构域文库如VH结构域的文库和/或VL结构域的文库组装。在一个方面中，设计了结构域的文库，其中选择特定的环长度和关键残基以确保成员的主链构象是已知的。有利地，这些是自然界中发现的免疫球蛋白超家族分子的真实构象以最小化它们成为非功能性的机会，如上所讨论的。种系V基因片段用作用于构建抗体或T-细胞受体文库的一个合适的基础框架；其他序列也是可用的。变异可以以低频率产生，使得少数的功能性成员可以具有改变的主链构象而不影响其功能。
正则结构理论也可用于评定配体编码的不同主链构象的数目、基于配体序列预测主链构象和选择不影响正则结构的用于多样化的残基。已知在人VK结构域中，L1环可以采取四种正则结构中的一种，L2环具有单个正则结构，且90%的人VK结构域对于L3环采取四种或五种正则结构中的一种（Tomlinson等，上文）；因此，在单独的VK结构域中，不同的正则结构可以组合以形成多种不同的主链构象。既然V□结构域编码L1、L2和L3环的不同范围的正则结构且VK和V□结构域可以与可能编码H1和H2环的几种正则结构的任何VH结构域配对，对这五个环观察到的正则结构组合的数目是非常大的。这意味着主链构象多样性的产生可能对于广泛结合特异性的产生是必要的。然而，通过基于单个已知的主链构象来构建抗体文库，已经发现了预期相反，产生基本上靶向于所有抗原的足够多样性并不需要主链构象的多样性。更令人惊讶的是，单一主链构象不必是共有结构-单一天然存在构象可以用作整个文库的基础。因此，在一个特定的方面中，dAb具有单一已知主链构象。
选择的单一主链构象在所述的免疫球蛋白超家族类型的分子之间是常见的。当观察到显著数量的天然发生分子采取时，该构象是常见的。因此，在一个方面中，免疫球蛋白结构域各个结合环的不同主链构象的天然发生率单独考虑，然后选择对不同环具有所需主链构象组合的天然发生的可变结构域。如果没有一个可用，可以选择最接近的等同物。可以通过选择编码所需主链构象的种系基因片段来形成对不同环的主链构象的所需组合。在一个实例中，选择的种系基因片段通常自然地表达，并且特别地，它们可以是所有天然种系基因片段中最常表达的。
在设计文库中，可以单独考虑六个抗原结合环中的每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和L3，选择20%至100%天然发生分子的抗原结合环采取的已知构象。通常，观察到发生率高于35%（即，35%至100%），并且理想地，高于50%，或甚至高于65%。由于绝大部分H3环不具有正则结构，优选地选择显示出正则结构的那些环中常见的主链构象。对于各个环，因此选择在天然组中最常观察到的构象。在人抗体中，各个环最常见的正则结构（CS）如下：H1-CS1（79%的表达组）、H2-CS3（46%）、L1-VK的CS2（39%）、L2-CS1（100%）、L3-VK的CS1（36%）（计算假定□:□比例为70:30，Hood等（1967）ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.，48:133）。对于具有正则结构的H3环，具有从残基94至残基101的盐桥的七个残基的CDR3长度（Kabat等，(1991)Sequences of proteins of immunological interest（具有免疫学意义的蛋白质的序列），U.S.Department of Health and Human Services）似乎是最常见的。在EBML数据库中存在至少16个具有所需H3长度和关键残基以形成该构象的人抗体序列，并且在蛋白数据库中存在至少两个可以用作抗体建模基础的晶相结构（2cgr和1tet）。其中这种正则结构组合是VH片段3-23（DP-47）、JH片段JH4b、V□片段O2/O12（DPK9）和J□片段J□1的最常表达的种系基因片段也是合适的。因此这些片段可以组合使用以作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础。
或者，替代基于分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率选择单主链构象，将主链构象组合的天然发生率用作选择单个主链构象的基础。在抗体的情况中，例如，可以确定抗原结合环的任意两个、三个、四个、五个或全部六个的正则结构组合的天然发生率。因此，选定的构象可以是天然发生抗体中常见的，并且可以在天然组中最常观察到。因此，在人抗体中，例如，当考虑五个抗原结合环H1、H2、L1、L2和L3的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合，然后与H3环的最常见的构象结合作为选择单一主链构象的基础。
规范序列的多样化
既然已经选择了几种已知的主链构象或单一已知的主链构象，dAb可以通过改变分子的结合位点来构建以产生具有结构和/或功能多样性的组。这意味着产生变异体以使得它们在结构和/或功能中具有足够的多样性，从而它们能够提供广泛活性。
通常通过在一个或多个位置改变选择的分子来产生所需的多样性。可以随机选择待改变的位置，或它们可以是选定的。然后可以通过随机化（在该过程中常驻氨基酸被任一个天然或合成的氨基酸或其类似物替代，从而产生非常大量的变异体）或通过用一个或多个限定氨基酸子集替代常驻氨基酸来产生更有限数量的变异体而实现变化。
已经报道了各种方法用于引入这样的多样性。易错PCR（Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.,226:889）、化学诱变（Deng等(1994)J.Biol.Chem.,269:9533）或细菌增变株（Low等(1996)J.Mol.Biol.,260:359）可以用于将随机突变引入编码分子的基因中。用于突变所选定位置的方法也是本领域公知的，并且包括使用错配的寡核苷酸或简并寡核苷酸（使用或不用PCR）。例如，已经通过将突变靶向于抗原结合环建立了几个合成抗体文库。人破伤风类毒素结合Fab的H3区已经被随机化以形成了多种新的结合特异性（Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457）。已经将随机或半随机H3和L3区附接于种系V基因片段以产生具有未突变框架区的大文库（Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4457；Nissim等(1994)EMBO J.,13:692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13:3245;De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.,248:97）。已经将这样的多样化扩展到包括一些或全部其他抗原结合环（Crameri等(1996)Nature Med.，2:100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13:475；Morphosys，WO97/08320，上文）。
由于环随机化对于单独的H3具有形成大约超过1015个结构的可能，并且对于其他五个环具有相似大量的变异体，因此使用目前的转化技术或甚至通过使用无细胞系统来产生代表所有可能组合的文库是不可行的。例如，在迄今为止构建的最大文库之一中，产生了6×1010个不同的抗体，其只是该设计的文库潜在多样性的一部分（Griffiths等(1994)上文）。
在一个实施方案中，只有直接参与形成或改变所需分子功能的那些残基得到多样化。对于许多分子，功能是结合目标并因此多样性应当集中在目标结合位点，同时避免改变对分子整体包装或维持选定的主链构象关键的残基。
在一个方面中，使用了dAb文库，其中只改变了抗原结合位点中的那些残基。这些残基在人抗体组中极度多样化，并且已知在高分辨率抗体/抗原复合物中形成接触。例如，在L2中，已知位置50和53在天然发生的抗体中是多样化的，并且观察到与抗原形成接触。相反，常规方法将如Kabat等（1991，上文）限定的相应互补决定区（CDR1）中的所有残基多样化，与文库中多样化的两个残基相比，大约有七个残基。就形成多种抗原结合特异性需要的功能多样性而言，这代表了明显的改进。
实质上，抗体多样性是两个过程的结果：种系V、D和J基因片段的体细胞重组以形成天然的初级组（所谓的种系和连接区多样性）和所得到的重排V基因的体细胞超突变。人抗体序列的分析已经显示出初级组中的多样性集中于抗原结合位点的中心，而体细胞超突变将多样性扩散至初级组中高度保守的抗原结合位点外周的区域（参见，Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256:813）。这种互补性可能发展为有效的策略用于搜寻序列空间，并且虽然对于抗体明显是独特的，但可以容易地应用于其他多肽组。改变的残基是形成对于靶标的结合位点的那些残基的子集。如果需要，在选择过程中的不同阶段将靶标结合位点中的不同（包括重叠）残基子集多样化。
在抗体组的情况中，形成了初始的“天然”组，其中抗原结合位点中的一些但不是全部残基被多样化。如在该情况下本文中所用的，术语“天然”或“模拟”指的是不具有预定靶标的抗体分子。这些分子类似于由没有经历免疫多样化的个体的免疫球蛋白基因编码的那些分子，正如胎儿和新生儿个体的情况（其免疫系统尚未受到广泛多样抗原刺激物的激发）。然后该组相对于广泛的抗原或表位来选择。如果需要，然后可以在初始组中多样化区域以外引入进一步的多样性。可以对于改变的功能、特异性或亲和性来选择这种成熟的组谱系。
应理解，本文中所述的序列包括与本文中所述的序列基本上相同的序列，例如至少90%相同的序列，例如至少91%，或至少92%，或至少93%，或至少94%或至少95%，或至少96%，或至少97%，或至少98%，或至少99%相同。
对于核酸，术语“基本上相同”表示两个核酸，或其指定序列，在以合适的核苷酸插入或删除最佳排列和比较时，至少约80%的核苷酸是相同的，通常至少约90%至95%，或至少约98%至99.5%的核苷酸（具有）。或者，在选择性杂交条件下片段与链的互补序列杂交时，存在实质的同一性。对于核苷酸和氨基酸序列，术语“相同的”表示以合适的插入或删除最佳排列和比较时，两个核酸或氨基酸序列之间的同一性程度。或者，当在选择性杂交条件下DNA片段与链的互补序列杂交时，存在实质的同一性。
两个序列之间的百分同一性是序列共有的相同位置数目的函数（即，%同一性=相同位置的#/总的位置#乘以100），考虑需要引入以实现两个序列的最佳比对的空位的数目以及各个空位的长度。可以使用数学算法，如以下非限制性实施例中所述的，来完成序列的比较和两个序列之间的百分同一性的确定。
可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NMSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重（gap weight）和1、2、3、4、5或6的长度权重（length weight）来测定两个核苷酸序列之间的百分同一性。还可以使用已经整合至ALIGN程序（版本2.0）中的E.Meyers和W.Miller（Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988)）的算法使用PAM210权重残差表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分同一性。此外，可以使用已经整合至GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch（J.Mol.Biol.48:444-453(1970)）算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的百分同一性。
举例来说，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO:38编码的参照序列相同，即100%相同，或与参照序列相比可以包括多达特定整数数目的氨基酸改变，以使得%同一性低于100%。这样的改变选自至少一个氨基酸的删除、置换（包括保守性和非保守性置换）或插入，并且其中所述改变可以发生在参照多肽序列的氨基-或羧基-末端位置或那些末端位置之间的任何地方，单独地散布在参照序列的氨基酸之间或在参照序列内的一个或多个连续组中。通过将SEQ ID NO:38编码的多肽序列中的氨基酸总数乘以相应百分同一性的数字百分比（除以100），然后从SEQID NO:38编码的多肽序列中的所述氨基酸总数减去该乘积来确定给定%同一性的氨基酸改变的数目，或：
na≤xa-(xa·y)，
其中na是氨基酸改变的数目，xa是SEQ ID NO:38编码的多肽序列中的氨基酸总数，而y，例如，对于70%为0.70，对于80%为0.80，对于85%为0.85等，并且其中xa和y的任何非整数乘积在从xa减去之前四舍五入至最接近的整数。
本文所用的术语“治疗”及其语法变体意思是治疗性疗法。对于特定的病症，治疗意思是：（1）改善或防止病症的一个或多个生物表现的状况，（2）干扰（a）导致或造成病症的生物级联中的一个或多个点或（b）病症的一个或多个生物表现，（3）缓解与病症或其治疗相关的一个或多个症状、效应或副作用，或（4）减缓病症的进展或病症的一个或多个生物表现。由此还设想了预防性疗法。本领域技术人员将了解，“预防”不是绝对术语。在医学中，“预防”理解为指预防性施用药物以实质性地消除病症或其生物表现的可能性或严重性，或延迟该病症或其生物表现的发作。例如，当认为受试者处于发生癌症的高风险中时，如当受试者具有强烈的癌症家族史时或受试者已经暴露于致癌物质时，预防性疗法是合适的。
如本领域所理解的，术语“完全缓解”、“完全反应”和“完全复原”意思是癌症的所有可检测征兆和/或症状响应于治疗而消失。本领域还理解，可以基于所治疗癌症的类型和阶段来定义癌症的可检测征兆或症状。例如，患有肝细胞癌的受试者中对治疗的“完全反应”可以定义为用X-光或CT扫描观察没有可见的肝肿瘤。在一些情况中，可以通过如下所述的RECIST1.0标准（Therasse P，Arbuck SG，Eisenhauer EA，WandersJ，Kaplan RS，Rubinstein L等，New guidelines to evaluate the response totreatment in solid tumors（评价实体肿瘤治疗反应的新原则），EuropeanOrganization for Research and Treatment of Cancer（欧洲癌症研究治疗组织），National Cancer Institute of the United States（美国国家癌症研究所），National Cancer Institute of Canada（加拿大国家癌症研究所），J NatlCancer Inst.2000；92:205-16.）来定义临床反应。
合适地，本发明涉及用于治疗癌症或减轻其严重性的方法，所述癌症选自：脑癌（神经胶质瘤）、成胶质细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、Cowden病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、Wilm’s瘤、Ewing’s肉瘤、横纹肌肉瘤、室鼓膜瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌（包括肝细胞癌）、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨细胞肿瘤、甲状腺癌、淋巴母细胞性T细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性淋巴母细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、成免疫细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤原巨核细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、红白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴母细胞性T细胞淋巴瘤、Burkitt’s淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、尿道上皮癌、肺癌、外阴癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食道癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、口癌、GIST（胃肠基质肿瘤）和睾丸癌。
合适地，本发明涉及用于治疗癌症或减轻其严重性的方法，所述癌症选自：脑癌（神经胶质瘤）、成胶质细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、Cowden病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤和甲状腺癌。
“癌症”指的是细胞增殖性疾病状态，包括但不限于：心脏：肉瘤（血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤）、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管癌（鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌）、肺泡（细支气管）癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；胃肠：食道（鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤）、胃（癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤）、胰腺（导管腺癌、胰岛瘤、胰升糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤(vipoma)）、小肠（腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、Karposi’s肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤）、大肠（腺癌、小管腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤）；泌尿生殖道：肾（腺癌、Wilm’s肿瘤[肾胚细胞瘤]、淋巴瘤、白血病）、膀胱和尿道（鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌）、前列腺（腺癌、肉瘤）、睾丸（精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤）；肝：肝细胞瘤（肝细胞癌）、胆管癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：骨源性肉瘤（骨肉瘤）、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、软骨肉瘤、Ewing’s肉瘤、恶性淋巴瘤（网状细胞肉瘤）、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤（骨软骨外生骨疣(osteocartilaginous exostoses)）、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨肌瘤样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞肿瘤；神经系统：颅（骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎）、脑膜（脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病）、脑（星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、胚组织瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤）、脊髓纤维神经瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤）；妇科的：子宫（子宫内膜癌）、子宫颈（子宫颈癌，肿瘤前子宫颈发育异常）、卵巢（卵巢癌[浆液囊腺癌、粘液囊腺癌、未分类癌]、粒层-卵泡膜细胞瘤、SertoliLeydig细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤）、外阴（鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤）、阴道（透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄样肉瘤（胚胎横纹肌肉瘤）、输卵管（癌）；血液学：血液（骨髓性白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞白血病、慢性成淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良综合征）、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、Karposi’s肉瘤、胎块发育不良痣（moles dysplastic nevi）、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢瘤、牛皮癣；和肾上腺：成神经细胞瘤。
如本文中所用的，术语“癌症”、“瘤”和“肿瘤”可互换使用，并且无论是单数或复数形式，指的是已经发生使其对宿主生物体为病理性的恶性转化的细胞。原发性癌细胞（即，自恶性转化部位附近获得的细胞）可以通过良好确定的技术（特别是组织学检查）与非癌细胞容易地区分开来。如本文中所用的，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括源自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的体外培养物和细胞系。当涉及通常呈现为实体肿瘤的癌类型时，“临床上可检测的”肿瘤是基于肿瘤块可以检测的肿瘤；例如，通过如CAT扫描、MR成像、X-光、超声波或触诊这样的程序，和/或由于获自病人的样本中的一种或多种癌特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。肿瘤可以是实体肿瘤，如肝细胞癌（HCC）病灶。肿瘤可以是造血肿瘤，例如，血细胞的肿瘤等，意思是液体肿瘤。
如本文中所用的蛋白质或多肽的“过表达的”和“过表达”及其语法变型意思是给定的细胞相对正常细胞产生增加数量的特定蛋白质。例如，相对于非肿瘤细胞，c-Met蛋白可以由肿瘤细胞过表达。此外，与细胞中的野生型c-Met蛋白相比，突变体c-Met蛋白可以过表达。如本领域所理解的，可以将细胞中多肽的表达水平对于持家基因，如肌动蛋白标准化。在一些情况中，与非肿瘤细胞相比，特定的多肽可以在肿瘤细胞中是表达不足的。
如本文中所用的，术语“扩增”及其语法变型指的是染色体组中一个或多个额外基因拷贝的存在。在特定的实施方案中，可以在细胞中扩增编码c-Met蛋白的基因。HER2基因的扩增与特定的癌症类型相关。已经在人唾液腺和胃肿瘤衍生的细胞系、胃和结肠腺癌以及乳腺腺癌中发现了HER2基因的扩增。Semba等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:6497-6501(1985)；Yokota等，Oncogene，2:283-287(1988)；Zhou等，Cancer Res.，47:6123-6125(1987)；King等，Science，229:974-976(1985)；Kraus等，EMBO J.，6:605-610(1987)；van de Vijver等，Mol.Cell.Biol.，7:2019-2023(1987)；Yamamoto等，Nature,319:230-234(1986)。
通常，相对于待治疗的易感肿瘤具有活性的任何抗瘤剂可以与本发明的癌症治疗共同施用。这样的药剂的实例可以在V.T.Devita和S.Hellman（编辑）的Cancer Principles and Practice of Oncology（肿瘤学的癌原理和实践），第6版，（2001年2月15日），Lippincott Williams&Wilkins Publishers中找到。本领域普通技术人员基于药物的特定特征和所涉及的癌症能够确定哪种药剂组合是有用的。本发明中有用的典型抗瘤剂包括，但不限于，抗微管剂，如双萜类和长春花生物碱类；铂配位络合物；烷化剂，如氮芥、氧氮磷杂环己烷（oxazaphosphorine）、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯；抗生素剂，如蒽环类、放线菌素类和博来霉素类；拓扑异构酶II抑制剂，如表鬼臼毒素；抗代谢物，如嘌呤和嘧啶类似物，以及抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱类；激素和激素类似物；信号传导途径抑制剂；受体酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂；非受体酪氨酸激酶抑制剂；血管生成抑制剂、免疫治疗剂；促凋亡剂；和细胞周期信号传导抑制剂。
本发明还提供了用于治疗癌症的方法，包括施用至少一种本发明的抗原结合蛋白（本文中称为化合物A）或其药物学上可接受的盐，具有或没有另一种抗瘤剂（化合物B）。
如本文中所用的术语“规定期限”及其语法变型意思是化合物A2和化合物B2之一与化合物A2和化合物B2中另一种的施用之间的时间间隔。除非另外指出，规定期限可以包括同时施用。除非另外指出，规定期限指的是在单一天中化合物A2和化合物B2的施用。
如本文中所用的术语“持续时间”及其语法变型意思是本发明的化合物施用所示的连续天数。除非另外指出，连续天数不必定随治疗开始而开始或随着治疗结束而终止，只需要在治疗过程中的某个点存在连续天数的数目。
用于与化合物A或其药物学上可接受的盐组合或共同施用的另外的一种或多种活性成分（抗瘤剂）的实例是化疗剂。
抗微管或抗有丝分裂剂是对于抗细胞周期的M期或有丝分裂期中肿瘤细胞的微管活性的阶段特异性剂。抗微管剂的实例包括，但不限于，双萜类和长春花生物碱类。
双萜类，其源自天然来源，是在细胞周期的G2/M期起作用的阶段特异性抗癌剂。据信双萜类通过与这一蛋白结合稳定微管的β-微管蛋白亚基。然后蛋白的分解似乎被抑制，其中有丝分裂被抑止且接着细胞死亡。双萜类的实例包括，但不限于，紫杉醇及其类似物多西他赛。
紫杉醇，5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4,10-二醋酸2-苯甲酸13-酯与(2R,3S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸，是分离自短叶紫杉树短叶紫杉（Taxus brevifolia）的天然双萜产物并且可作为注射液
Figure GDA0000381902510000631
购得。其是萜烯类紫杉烷家族的成员。其在1971年首先被Wani等分离（J.Am.Chem，Soc.，93:2325，1971），他通过化学和X-射线晶体学方法表征了其结构。其活性的一个机理涉及紫杉醇结合微管蛋白的能力，由此抑制癌细胞生长。Schiff等，Proc.Natl,Acad,Sci.USA,77:1561-1565(1980)；Schiff等，Nature,277:665-667(1979)；Kumar,J.Biol,Chem,256:10435-10441(1981)。对于一些紫杉醇衍生物的合成和抗癌活性的综述，参见：D.G.I.Kingston等，Studies in Organic Chemistry vol.26，标题为“New trends in Natural Products Chemistry1986”，Attaur-Rahman，P.W.Le Quesne编辑，(Elsevier,Amsterdam,1986)pp219-235。
美国已经批准将紫杉醇临床用于难治性卵巢癌的治疗（Markman等，Yale Journal of Biology and Medicine,64:583,1991；McGuire等，Ann.Lntem，Med.,111:273，1989）和用于乳腺癌的治疗（Holmes等，J.Nat.Cancer Inst.,83:1797，1991）。其是用于皮肤瘤（Einzig等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，20:46）和头颈癌（Forastire等，Sem.Oncol.，20:56，1990）治疗的潜在候选物。该化合物还显示了用于治疗多囊性肾病（Woo等，Nature，368:750.1994）、肺癌和疟疾的潜能。用紫杉醇治疗病人导致与高于阈浓度（50nM）的给药持续时间相关的骨髓抑制（多细胞谱系，Ignoff,R.J.等，Cancer Chemotherapy Pocket Guide，1998）（Kearns,C.M.等，Seminars in Oncology，3(6)p.16-23，1995）。
多西他赛，(2R,3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸,N-叔-丁酯,13-酯与5β-20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4-醋酸2-苯甲酸酯，三水合物，是可作为
Figure GDA0000381902510000641
的注射液购得。多西他赛标明用于治疗乳腺癌。多西他赛是紫杉醇的半合成衍生物，参看，使用从欧洲紫杉树的针叶提取的天然前体10-脱乙酰基-浆果赤霉素III制得。多西他赛的剂量限制毒性是嗜中性白细胞减少症。
长春花生物碱是源自长春花属植物的阶段特异性抗瘤剂。长春花生物碱类通过特异性地结合微管蛋白在细胞周期的M期（有丝分裂）起作用。因此，结合的微管蛋白分子不能聚合成微管。据认为有丝分裂在中期抑止，接着细胞死亡。长春花生物碱的实例包括，但不限于，长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。
长春花碱，硫酸长春花碱，是可作为的注射液购得的。尽管其具有可作为各种实体肿瘤的二线治疗的指示，但其主要表明用于睾丸癌和各种淋巴瘤的治疗中，包括霍奇金病；以及淋巴细胞性和组织细胞性淋巴瘤。骨髓抑制是长春花碱的剂量限制副作用。长春新碱，长春花碱，22-氧代-，硫酸盐，是可作为
Figure GDA0000381902510000651
的注射液购得的。长春新碱表明用于治疗急性白血病，并且还发现用于霍奇金和非霍奇金恶性淋巴瘤的治疗方案中。脱发和神经效应是长春新碱最常见的副作用，并且发生较低程度的骨髓抑制和胃肠粘膜炎效应。
长春瑞滨，3’,4’-二脱氢-4’-脱氧-C’-去甲长春花碱[R-(R*,R*)-2,3-二羟基丁二酸酯（1:2）（盐）]，可作为酒石酸长春瑞滨的注射液
Figure GDA0000381902510000652
购得。长春瑞滨表明在各种实体肿瘤（特别是非小细胞肺癌、晚期乳腺癌和激素难治愈性前列腺癌）治疗中作为单药剂或结合其他化疗剂（如，顺铂）使用。骨髓抑制是长春瑞滨最常见的剂量限制副作用。
铂配位络合物是非阶段特异性抗癌剂，其是与DNA相互作用的。铂络合物进入肿瘤细胞，经历水合作用并与DNA形成链内和链间交联而对肿瘤产生不利的生物作用。铂配位络合物的实例包括，但不限于，顺铂和卡铂。
顺铂，顺式-二氯二氨合铂，可作为的注射液购得。顺铂主要表明用于转移性睾丸癌以及卵巢癌和晚期膀胱癌的治疗中。顺铂的主要剂量限制副作用是可以通过水合和利尿作用控制的肾损害，以及耳毒性。
卡铂，二氨合[1,1-环丁烷-二羧酸酯(2-)-O,O’]铂，可作为
Figure GDA0000381902510000654
的注射液购得。卡铂表明主要用于晚期卵巢癌的一线和二线治疗。骨髓抑制是卡铂的剂量限制毒性。
烷化剂是非阶段特异性的抗癌剂，并且是强亲电子试剂。通常，烷化剂通过烷基化，通过DNA分子的亲核部分与DNA形成共价连接，DNA分子的亲核部分例如为磷酸酯、氨基、巯基、羟基、羧基和咪唑基。这样的烷基化破坏了核酸功能，从而导致细胞死亡。烷化剂的实例包括，但不限于，氮芥如环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；烷基磺酸酯如白消安；亚硝基脲如亚硝脲氮芥；以及三氮烯如氮烯唑胺。
环磷酰胺，2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-氧氮磷杂环己烷2-氧化物单水合物，可作为
Figure GDA0000381902510000661
的注射液或片剂购得。环磷酰胺表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病的治疗中。脱发、恶心、呕吐和白细胞减少是环磷酰胺最常见的剂量限制副作用。
美法仑，4-[双(2-氯乙基)氨基]-L-苯丙氨酸，可作为
Figure GDA0000381902510000662
的注射液或片剂购得。美法仑表明用于多发性骨髓瘤和不可切除的卵巢上皮癌的缓解治疗。骨髓抑制是美法仑最常见的剂量限制副作用。
苯丁酸氮芥，4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸，可作为
Figure GDA0000381902510000663
片剂购得。苯丁酸氮芥表明用于慢性淋巴细胞性白血病和恶性淋巴瘤，如，淋巴肉瘤、巨滤泡性淋巴瘤和霍奇金病的缓解治疗。骨髓抑制是苯丁酸氮芥最常见的剂量限制副作用。
白消安，1,4-丁二醇二甲烷磺酸酯，可作为
Figure GDA0000381902510000664
片剂购得。白消安表明用于慢性骨髓性白血病的缓解治疗。骨髓抑制是白消安最常见的剂量限制副作用。
亚硝脲氮芥，1,3-[双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲，可作为
Figure GDA0000381902510000665
单瓶冻干材料购得。亚硝脲氮芥表明作为单药剂或结合其他药剂用于脑肿瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤的缓解治疗。延迟的骨髓抑制是亚硝脲氮芥最常见的剂量限制副作用。
氮烯唑胺，5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-羧酰胺，可作为
Figure GDA0000381902510000666
单瓶材料购得。氮烯唑胺表明用于治疗转移性恶性黑素瘤，以及结合其他制剂用于霍奇金病的二线治疗。恶心、呕吐和厌食是氮烯唑胺最常见的剂量限制副作用。
抗生素类抗瘤剂是非阶段特异性剂，其结合DNA或插嵌DNA。通常，这样的作用导致稳定的DNA复合物或链断裂，这破坏了核酸的通常功能，导致细胞死亡。抗生素类抗瘤剂的实例包括，但不限于，放线菌素类如更生霉素，蒽环类如柔红霉素和阿霉素，以及博来霉素类。
更生霉素，也称为放线菌素D，可作为
Figure GDA0000381902510000667
的注射形式购得。更生霉素表明用于Wilm’s肿瘤和横纹肌肉瘤的治疗。恶心、呕吐和厌食是更生霉素最常见的剂量限制副作用。
柔红霉素，(8S-顺式-)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-溶血-六吡喃糖苷)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-萘并萘二酮盐酸盐，可作为的脂质体注射形式或作为
Figure GDA0000381902510000672
的注射剂购得。柔红霉素表明用于急性非淋巴细胞性白血病和晚期HIV相关Kaposi’s肉瘤治疗的缓解诱导。骨髓抑制是柔红霉素最常见的剂量限制副作用。
阿霉素，(8S,10S)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-溶血-六吡喃糖苷)氧基]-8-乙醇酰基,7,8,910-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-萘并萘二酮盐酸盐，可作为
Figure GDA0000381902510000673
或ADRIAMYCIN
Figure GDA0000381902510000674
的注射形式购得。阿霉素表明主要用于治疗急性淋巴母细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病，但也可用作一些实体肿瘤和淋巴瘤治疗中的成分。骨髓抑制是阿霉素最常见的剂量限制副作用。
博来霉素，从轮枝链霉菌（Streptomyces verticillus）的菌株分离的细胞毒性糖肽抗生素的混合物，可作为购得。博来霉素表明作为鳞状细胞癌、淋巴瘤和睾丸癌的缓解治疗（作为单药剂或结合其他药剂）。肺和皮肤毒性是博来霉素最常见的剂量限制副作用。
拓扑异构酶II抑制剂包括，但不限于，表鬼臼毒素类。表鬼臼毒素是源自曼德拉草植物的阶段特异性抗瘤剂。表鬼臼毒素通常通过与拓扑异构酶II和DNA形成三重复合物而导致DNA链断裂，在细胞周期的S和G2期影响细胞。链断裂累聚，接着细胞死亡。表鬼臼毒素的实例包括，但不限于，依托泊甙（etoposide）和替尼泊甙（teniposide）。
依托泊甙，4’-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-0-(R)-亚乙基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷]，可作为
Figure GDA0000381902510000676
的注射液或胶囊购得，并且通常称为VP-16。依托泊甙表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于睾丸癌和非小细胞肺癌的治疗中。骨髓抑制是依托泊甙最常见的剂量限制副作用。白细胞减少的发生率趋向于比血小板减少更严重。
替尼泊甙，4’-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-0-(R)-噻吩亚甲基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷]，可作为
Figure GDA0000381902510000677
的注射液购得，并且通常称为VM-26。替尼泊甙表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于儿童的急性白血病的治疗中。骨髓抑制是替尼泊甙最常见的剂量限制副作用。替尼泊甙可以诱发白细胞减少和血小板减少。
抗代谢物抗瘤剂是在细胞周期的S期（DAN合成）通过抑制DNA合成或通过抑制嘌呤或嘧啶碱基合成并由此限制DNA合成而起作用的阶段特异性抗瘤剂。因此，S期无法继续，并且接着细胞死亡。抗代谢物抗瘤剂的实例包括，但不限于，氟尿嘧啶、氨甲喋呤、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤和吉西他滨。5-氟尿嘧啶，5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮，可作为氟尿嘧啶购得。5-氟尿嘧啶的施用导致胸苷酸合成的抑制，并且还掺入RNA和DNA中。结果通常是细胞死亡。5-氟尿嘧啶表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌和胰腺癌的治疗中。骨髓抑制和粘膜炎是5-氟尿嘧啶的剂量限制副作用。其他氟嘧啶类似物包括5-氟-脱氧尿嘧啶（氟尿苷）和5-氟脱氧尿苷单磷酸盐。
阿糖胞苷，4-氨基-1-β-D-阿拉伯糖呋喃糖苷-2(1H)-嘧啶酮，可作为购得，并且通常称为Ara-C。据认为阿糖胞苷通过将阿糖胞苷在末端掺入生长的DNA链中抑制DNA链延伸从而呈现出S-期的阶段特异性。阿糖胞苷表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于急性白血病的治疗中。其他胞苷类似物包括5-氮杂胞苷和2’,2’-二氟脱氧胞苷（吉西他滨）。阿糖胞苷诱导白细胞减少、血小板减少和粘膜炎。
巯基嘌呤，1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮单水合物，可作为
Figure GDA0000381902510000681
购得。巯基嘌呤通过尚未说明的机理抑制DNA合成而呈现出S期的阶段特异性。巯基嘌呤表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于急性白血病的治疗中。骨髓抑制和胃肠粘膜炎是高剂量巯基嘌呤的预期副作用。有用的巯基嘌呤类似物是咪唑硫嘌呤。
硫鸟嘌呤，2-氨基-1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮，可作为
Figure GDA0000381902510000683
购得。硫鸟嘌呤通过尚未说明的机理抑制DNA合成而呈现出S-期的阶段特异性。硫鸟嘌呤表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于急性白血病的治疗中。骨髓抑制包括白细胞减少、血小板减少和贫血是硫鸟嘌呤施用最常见的剂量限制副作用。然而，发生胃肠副作用，并且可能是剂量限制的。其他嘌呤类似物包括喷司他丁、赤羟基壬基腺嘌呤（erythrohydroxynonyladenine）、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨。
吉西他滨，2’-脱氧-2’,2’-二氟胞苷单盐酸盐（β-异构体），可作为
Figure GDA0000381902510000691
购得。吉西他滨通过阻断跨越G1/S边界的细胞进展而呈现出S-期的阶段特异性。吉西他滨表明与顺铂结合用于局部晚期肺小细胞肺癌的治疗中，以及单独用于局部晚期胰腺癌的治疗中。骨髓抑制，包括白细胞减少、血小板减少和贫血，是吉西他滨给药最常见的剂量限制副作用。
氨甲喋呤，N-[4[[(2,4-二氨基-6-喋啶)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，可作为氨甲喋呤钠购得。氨甲喋呤通过抑制脱氢叶酸还原酶来抑制DNA合成、修复和/或复制而呈现出特别是在S-期的细胞周期效应，脱氢叶酸还原酶是嘌呤核苷酸和胸苷酸合成所需要的。氨甲喋呤表明作为单药剂或结合其他化疗剂用于绒毛膜癌、脑膜白血病、非霍奇金淋巴瘤以及乳腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌和膀胱癌的治疗中。骨髓抑制（白细胞减少、血小板减少和贫血）和粘膜炎是氨甲喋呤给药的预期副作用。
喜树碱类，包括喜树碱和喜树碱衍生物，是作为拓扑异构酶I抑制剂可得的或正在研发中。据认为喜树碱类的细胞毒性活性与其拓扑异构酶I抑制活性相关。喜树碱类的实例包括，但不限于，伊立替康、拓扑替康和以下所述的7-(4-甲基哌嗪-亚甲基)-10,11-乙烯二氧-20-喜树碱的各种光学形式。
盐酸伊立替康，(4S)-4,11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶基哌啶基)羰氧基]-1H-吡喃并[3’,4’,6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮盐酸盐，可作为的注射液购得。
伊立替康是喜树碱的衍生物，其与其活性代谢物SN-38一起结合拓扑异构酶I-DNA复合物。据认为作为拓扑异构酶I:DNA:伊立替康或SN-38三重复合物与复制酶的相互作用引起的无法修复的双链断裂的结果而产生了细胞毒性。伊立替康表明用于结肠或直肠的转移癌的治疗。盐酸伊立替康的剂量限制副作用是骨髓抑制，包括中性白细胞减少，以及GI效应包括腹泻。
盐酸拓扑替康，(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3’,4’,6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮单盐酸盐，可作为
Figure GDA0000381902510000701
的注射液购得。拓扑替康是喜树碱的衍生物，其结合拓扑异构酶I-DNA复合物并且阻止由由拓扑异构酶I响应于DNA分子的扭转应变引起的单链断裂的重新接合。拓扑替康表明用于卵巢癌和小细胞肺癌的转移癌的二线治疗。盐酸拓扑替康的剂量限制副作用是骨髓抑制，主要是中性白细胞减少。
帕唑帕尼（pazopanib），可作为
Figure GDA0000381902510000702
购得，是酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。帕唑帕尼呈现为盐酸盐，具有化学名5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺单盐酸盐。帕唑帕尼批准用于治疗患有晚期肾细胞癌的病人。
利妥昔单抗是作为
Figure GDA0000381902510000703
和销售的嵌合单克隆抗体。利妥昔单抗结合B细胞上的CD20并引起细胞凋亡。利妥昔单抗静脉内施用，并且批准用于治疗类风湿性关节炎和B-细胞非霍奇金淋巴瘤。
奥法木单抗（ofatumumab）是作为
Figure GDA0000381902510000705
销售的全人单克隆抗体。奥法木单抗结合B细胞上的CD20，并且用于治疗用氟达拉滨（Fludara）和阿仑单抗（Campath）难以治疗的成人慢性淋巴细胞性白血病（CLL；一种白细胞癌症类型）。
mTOR抑制剂包括但不限于雷帕霉素（FK506）和rapalogs，RAD001或依维莫司（Afinitor）、CCI-779或替西罗莫司、AP23573、AZD8055、WYE-354、WYE-600、WYE-687和Pp121。
蓓萨罗丁（bexarotene）作为
Figure GDA0000381902510000706
销售，并且是选择性激活类维生素A X受体（RXR）的类维生素A亚类的成员。这些类维生素A受体具有不同于视黄酸受体（RAR）的生物活性。化学名称是4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸。蓓萨罗丁用于治疗其疾病用至少一种其他药物不能成功治疗的病人的皮肤T-细胞淋巴瘤（CTCL，一种皮肤癌类型）。
作为
Figure GDA0000381902510000707
销售的索拉非尼属于称为多激酶抑制剂的药物类别。其化学名称为4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨甲酰基氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺。索拉非尼用于治疗晚期肾细胞癌（一种在肾脏中开始的癌症类型）。索拉非尼还用于治疗不可切除的肝细胞癌（一种不能用外科手术治疗的肝癌类型）。
erbB抑制剂的实例包括拉帕替尼、厄洛替尼和吉非替尼。拉帕替尼，N-(3-氯-4-{[(3-氟苯基)甲基]氧基}苯基)-6-[5-({[2-(甲基磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺（如所示的，通过式II表示），是强效的、口服、小分子、erbB-1和erbB-2（EGFR和HER2）酪氨酸激酶的双重抑制剂，其批准结合卡培他滨用于治疗HER2-阳性转移乳腺癌。
可以根据1999年7月15日公布的WO99/35146和2002年1月10日公布的WO02/02552中公开的程序来制备式（II）化合物的游离碱、HCl盐和二甲苯磺酸盐。
厄洛替尼，N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双{[2-(甲氧基)乙基]氧基}-4-喹唑啉胺（以商品名Tarceva销售），由式III表示，如所示的：
Figure GDA0000381902510000712
例如，可以根据U.S.5,747,498，实施例20来制备厄洛替尼的游离碱和盐酸盐。
吉非替尼，4-喹唑啉胺,N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-4-吗啉)丙氧基]，由式IV来表示，如所示的：
Figure GDA0000381902510000721
吉非替尼，可以商品名（Astra-Zenenca）购得，是erbB-1抑制剂，其表明作为单一治疗用于治疗基于铂的化疗和多西他赛化疗都失败后的局部晚期或转移性非小细胞肺癌病人。可以根据1996年4月23日提交的国际专利申请No.PCT/GB96/00961并于1996年10月31日作为WO96/33980公开的程序来制备吉非替尼的游离碱、盐酸盐和二盐酸盐。
实施例
实施例1-人HGF的中和mAb的产生
在小鼠骨髓瘤NS0-衍生细胞中产生的重组人HGF蛋白获自R&DSystems，目录号294－HGN/CF。在第0、6和11天，用R&D重组人HGF免疫两只SJL/OlaHsd小鼠。在第14天分离脾细胞和淋巴结，并使用P3X63/Ag8.653衍生的融合伴体与小鼠骨髓瘤细胞融合。产生永生化的抗体产生细胞。将HAT选择用于淘汰未融合的骨髓瘤细胞。
对来自活性培养物的所得杂交瘤上清液筛选HGF-cMet的特异性结合和中和。鉴定、证实命中（hits）并通过在半固体培养基中的有限稀释或生长克隆至单克隆性（monoclonality）。将具有所需特征的单克隆抗体在液体培养物中放大，并通过标准色谱方法纯化。然后进一步鉴定所得到的纯化抗体的结合亲和性和功能性效力。
实施例2-抗体人源化-杂交瘤可变区的克隆
从S260116C12、S260105B02、S26115C11和S265109B10杂交瘤细胞提取总RNA。通过逆转录和聚合酶链式反应（RT-PCR）产生重链和轻链可变结构域cDNA序列。用于RT-PCR的正向引物是小鼠免疫球蛋白基因前导序列特异性的简并引物的混合物，而反向引物是抗体恒定区特异性的，在这种情况中，抗体恒定区对于S260116C12、S260105B02、S265109B10是同种型IgG1，而对于S260115C11是同种型IgG2b。基于Jones和Bending（Bio/Technology9:88，1991）所述的策略设计引物。对于两个V-区序列进行了RT-PCR，使得随后能够验证正确的V-区序列。对于通过RT-PCR产生的V-区产物，获得了DNA序列数据。
实施例3-抗体人源化-嵌合抗体的克隆
通过构建包括用于克隆至哺乳动物表达载体中的限制性位点以及人信号序列的重叠寡核苷酸，从头（de novo）制备编码嵌合抗体的DNA表达构建体。引入HindIII和SpeI限制性位点以构成含有信号序列（SEQID NO:1）的VH结构域，用于克隆至含有人γ1恒定区的哺乳动物表达载体中。引入HindIII和BsiWI限制性位点以构成含有信号序列（SEQ IDNO:1）的VL结构域，用于克隆至含有人κ恒定区的哺乳动物表达载体中。
实施例4-抗体人源化-人源化变异体的克隆
通过构建包括用于克隆至哺乳动物表达载体中的限制性位点以及人信号序列的重叠寡核苷酸从头（de novo）制备编码人源化抗体的DNA表达载体。引入HindIII和SpeI限制性位点以构成含有信号序列（SEQ IDNO:1）的VH结构域，用于克隆至含有人γ1恒定区的哺乳动物表达载体中。引入HindIII和BsiWI限制性位点以构成含有信号序列（SEQ ID NO:1）的VL结构域，用于克隆至含有人κ恒定区的哺乳动物表达载体中。
实施例5-重组抗体的表达
将编码相关重链和轻链（以下表1中所列的）的表达质粒瞬时共转染至HEK 293 6E细胞中，并且小规模表达以产生抗体。从上清液中通过蛋白A纯化抗体，并使用Nanodrop分光光度计定量。
表1:嵌合和人源化抗体变异体
Figure GDA0000381902510000741
Figure GDA0000381902510000751
实施例6-Biacore上抗体与HGF的结合
通过伯胺偶联将抗人IgG（Biacore BR-1008-39）固定于CM5芯片上，并且将该表面用于捕获抗体分子。将256nM、64nM、16nM、4nM和1nM的人HGFv1和人HGFδ5（GRITS38813）用作分析物。使用3M氯化镁进行了再生。所有结合曲线用缓冲液注射（即，0nM）进行双重参照，并使用1:1的模型将数据与A100评价软件配合。在37℃下运行，使用HBS-EP作为运行缓冲液用于VEGF运行，并使用HBS-N（其中进行以下添加：0.1M氯化锂，0.1M胍，0.1%（v/v）triton X705，0.1%（w/v）3-(N,N-二甲基肉豆蔻基-铵基)丙烷磺酸盐（Sigma T7763）。数据显示出所有分子能够结合HGF（全长和缩短形式）。对于大部分测试的构建体，对于HGF（全长和缩短形式），获得了通过Biacore可测量范围内的亲和性测量值，然而对于BPC1880结合，未能得到通过Biocare可测量的亲和性值，这是由于该试验中的解离速率（off-rate）超出了仪器的灵敏度，然而，这实际上表明了BPC1880与HGF的结合是非常紧密的。
表2显示了人源化mAb BPC1873、1880、1881、1884、1885和嵌合mAb BPC1856的HGF结合。
表2：抗体与HGF的结合
Figure GDA0000381902510000761
Figure GDA0000381902510000771
实施例7-Biacore上HGF-VEGF双特异性抗体与HGF和VEGF的结合
通过伯胺偶联将蛋白A固定于CM5芯片上，并且将该表面用于捕获抗体分子。使用64nM、16nM、4nM、1nM和0.25nM的人HGFv1（GRITS35238）和人HGFδ5（GRITS38813），并使用256nM、64nM、16nM、4nM和1nM的人VEGF。使用50mM NaOH进行再生。所有结合曲线用缓冲液注射（即，0nM）进行双重参照，并对于HGF分析使用1:1模型和对于VEGF分析使用1:1和双价分析物模型将数据与T100评价软件配合。在25℃下运行，使用HBS-EP作为用于VEGF运行的运行缓冲液，并使用其中添加了：0.1M氯化锂，0.1M胍，0.1%（v/v）triton X705，0.1%（w/v）3-(N,N-二甲基肉豆蔻基-铵基)丙烷磺酸盐（SigmaT7763）的HBS-N用于HGF运行。数据显示出双特异性分子能够结合HGF（全长和缩短形式）和VEGF两者。对于HGF（全长和缩短形式）结合的数据未能获得通过Biacore可测量的亲和性值，这是由于该试验中的解离速率超出了仪器的灵敏度，然而，这实际上表明了所测试的分子（BPC1923、BPC1924、BPC1925和BPC1926）与HGF紧密结合。
表3显示了Biacore运行的结果，并且证实了BPC1923、BPC1924、BPC1925和BPC1926能够结合VEGF。
表3：抗体与VEGF的结合
样品 配合 ka kd KD(nM)
BPC1923 1:1结合 4.90E+05 1.11E-05 0.023
BPC1924 1:1结合 4.67E+05 2.39E-05 0.051
BPC1925 1:1结合 4.69E+05 3.37E-05 0.072
BPC1926 1:1结合 4.68E+05 4.05E-05 0.087
DMS4000 1:1结合 3.07E+05 1.08E-04 0.352
BPC1923 二价分析物 1.35E+05 1.66E-04 1.225
BPC1924 二价分析物 1.51E+05 1.33E-04 0.880
BPC1925 二价分析物 1.48E+05 1.90E-04 1.285
BPC1926 二价分析物 1.54E+05 1.72E-04 1.115
DMS4000 二价分析物 1.64E+05 2.11E-04 1.289
综合在一起，数据表明16C12的人源化衍生物，特别是16C12Ha4La0（BPC1880），是抗HGF的非常高亲和性的抗体，并且是潜在的治疗抗体。重要地，在16C12Ha4La0的双特异性（mAb-dAb）形式中保留了这种对HGF的高亲和性，并且增加了对VEGF的高亲和性（如在BPC1923、BPC1924、BPC1925和BPC1926中举例说明的）。
实施例8-HGF和VEGF桥式ELISA
用PBS中的5μg/ml的重组人hVEGF-165（TB090219，Domantis，PBS中1.9mg/mL）涂覆96-孔高结合板，并且在4℃下储存过夜。用PBS将平板洗涤两次。将200μL封闭溶液（PBS缓冲液中的5%BSA）加入各个孔中，并且将板在室温下温育至少1小时。然后进行另一个洗涤步骤。在封闭溶液中，BPC1923、BPC1924、BPC1925、BPC1926、BPC1880在板上从51.4nM或60nM连续稀释。下表中已经列出了HGF-VEGF mAbdAb的详细信息。还包括了mAbdAb对照，其含有和对试验无关蛋白（称为DMS4000）特异性的mAb形式的抗VEGF dAb部分。1小时温育后，洗涤板。将生物素化的hHGF-v1（GRITS37567，1.62mg/mL，N13185-12）在封闭溶液中稀释至50μg/ml，并将50μL加入各个孔中。将板温育一小时，然后洗涤。将抗生物素蛋白链菌素-HRP（GEHealthcare，RPN4401V）于封闭溶液中以1:4000稀释，并将50μL加入各个孔中。在另一个洗涤步骤后，将50μl的OPD SigmaFast底物溶液加入各个孔中，并在加入50μL 2M硫酸后15分钟停止反应。使用VersaMax Tunable Microplate阅读器（Molecular Devices），采用基础终点方案在490nm处读取吸光度。
图1显示了HGF和VEGF桥式ELISA的结果，并且证实了BPC1923、BPC1924、BPC1925和BPC1926能够同时结合HGF和VEGF两者。BPC1880和DMS4000没有显示出与两个靶标的结合。
实施例9-Mv1Lu增殖试验
Mv1Lu细胞增殖试验可以用于测定推定的HGF拮抗剂的效力。TGF-β抑制Mv1Lu细胞增殖，并且这通过加入HGF被克服（J.ImmunolMethods1996，Jan16，Vol189(1)；59-64）。因此，HGF-处理的和未处理的细胞之间的细胞增殖差异反映了HGF-介导的细胞增殖。推定的HGF拮抗剂抑制这种作用的能力可以得到量化。
为了测试S260116C12及其人源化变异体的HGF中和能力，将Mv1Lu细胞（ATCC）在补充40ng/ml人HGF、1ng/ml TGF-β（R&DSystems）和测试抗体的无血清培养基中培养。如所需的，从对照孔省略HGF。所有试验在TGF-β存在下进行。所有试验在HGF存在下进行，除了称为“-HGF”的阴性对照条件。加入终浓度为1.3x10-08、6.7x10-09、3.3x10-09、1.7x10-09、8.3x10-10、4.2x10-10、2.1x10-10、1.0x10-10M的抗体。在使用无关同种型对照（称为杂交对照抗体）的情况中，其以1.3x10-08M的终浓度来使用。在48h后使用其中生物发光信号与活细胞数成比例的发光ATP-依赖性试验（CellTiterGloTM，Promega）测定总细胞数。所有条件重复三次测试。所示数据呈现为平均值+/-SD，并且代表至少两个独立的试验。
人源化抗-HGF单克隆抗体BPC1880、BPC1881、BPC1884和BPC1885各自以剂量依赖性的方式消除了HGF介导的Mv1Lu细胞增殖，具有与来自鼠抗体S260116C12的不可区分的特征。杂交对照抗体对HGF-介导的细胞增殖没有影响（图2a-d）。
为了证实这种HGF中和能力在mAbdAb形式中仍然保留，在鼠抗-HGF mAb S260116C12与代表性的人源化抗-HGF mAbdAb构建体BPC1923和BPC1924（分别对应于人源化mAb变异体BPC1880和BPC1881）之间进行了直接比较。这些mAbdAb含有抗VEGF-dAb部分形式的（in-format）抗HGF单克隆抗体成分。加入终浓度为3.3x10-08、1.7x10-08、8.3x10-09、4.2x10-09、2.1x10-09、1.0x10-09、5.2x10-10M的抗体。使用了杂交对照抗体和无关mAbdAb对照（称为DMS4000），并且各自以3.3x10-08M的终浓度来使用。所示数据呈现为平均值+/-SD，并且代表至少两个独立的试验。
mAbdAb构建体的处理导致了HGF-介导的Mv1Lu细胞增殖的剂量依赖性消除，其与相应的mAb稿应特征不可区分（图2e-f）。无关杂交对照抗体或包含靶向于试验无关蛋白的单克隆抗体部分和抗VEGF-dAb部分的同种型对照mAb（DMS4000）的处理对HGF-介导的细胞增殖没有作用，证实了所观察到的测试抗体的作用是由于HGF的特异性中和引起的。
综合在一起，这些数据表明了鼠抗-HGF mAb S260116C12及其人源化变异体（称为BPC1880、BPC1881、BPC1884和BPC1885）以剂量依赖性方式消除了HGF-依赖性细胞增殖，并且这种活性在mAbdAb形式中保留，如通过BPC1923和BPC1924举例说明的。
实施例10-人脐带内皮细胞（HUVEC）c-MET磷酸化试验
用重组HGF处理血清饥饿的HUVEC单层导致了HGF受体cMET的磷酸化，这在细胞裂解物中是可检测的。因此，可以通过定量用HGF处理的细胞（其已经与推定的HGF拮抗剂预温育）的磷酸化-cMET来测定HGF的中和。
将汇合的供体HUVEC（Lonza）在Bulletkit培养基（Lonza）中以5,000细胞/孔接种于明胶涂覆的96孔板（Becton Dickenson）上，并在37℃/5%CO2下培养过夜。培养基用无添加剂的基础培养基（例如，EGM-2，Lonza）替代，并将细胞培养大约四小时。用重组HGF将测试抗体的浓度滴定预温育15分钟，接着加入细胞中以获得25ng/ml HGF的终浓度和2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.06μg/ml的测试抗体终浓度。将细胞在37℃下培养20-25分钟，接着洗涤，并制备总细胞裂解物用于根据制造商的说明（Mesoscale Discovery）使用MSD ELISA方法来进行p-cMET分析。所有条件至少重复进行三次。所示数据呈现为平均值+/-SD，并且代表至少两个独立的试验。
HGF与鼠抗-HGF抗体S260116C12预温育导致HGF-介导的c-MET磷酸化的剂量依赖性的中和。用称为BPC1873、BPC1880、BPC1881、BPC1884和BPC1885的S260116C12的各种人源化变异体预温育获得了相似的数据，证实了S260116C12的HGF-中和能力及其在人源化后保留。用杂交对照抗体预温育对c-MET磷酸化没有影响。数据呈现为原始MSD值（图3a-c）。
为了证实这种HGF-中和能力在mAbdAb形式中保留，在人源化抗-HGF mAb BPC1880和BPC1881与相应的抗-HGF/抗-VEGF mAbdAb构建体BPC1923和BPC1924之间进行了直接比较。这些mAbdAb含有具有抗-VEGF dAb部分的形式的抗-HGF单克隆抗体成分。以一定的浓度范围添加抗体，例如，1.3x10-08、6.7x10-09、3.3x10-09、1.7x10-09、8.3x10-10、4.2x10-10M。使用了无关杂交对照抗体，并且以1.3x10-08M的终浓度来使用。所示数据呈现为三个重复样本的平均值+/-SD，并且代表至少两个独立的实验。
用mAbdAb构建体的处理导致了HGF-介导的cMET磷酸化的剂量依赖性消除，这与相应的mAb响应特征非常相似（图3d-e）。无关杂交对照抗体的处理对HGF-介导的c-MET磷酸化没有影响。
数据表明在mAbdAb形式中仍然保留了鼠抗-HGF mAb S260116C12及称为BPC1880、BPC1881的其人源化变异体中和HUVEC中的HGF-介导的c-Met磷酸化的能力，如通过BPC1923和BPC1924举例说明的。
实施例11-HUVEC中通过mAbdAb同时抑制HGF-介导的cMET磷酸化和VEGF-介导的VEGF2磷酸化
用重组血管内皮生长因子（VEGF）处理血清饥饿的HUVEC单层导致了VEGF受体VEGF2的磷酸化，这在细胞裂解物中是可检测的。因此，可以通过定量用VEGF处理的细胞（其已经与推定的VEGF拮抗剂预温育）的磷酸化-VEGF2来测定VEGF的中和。此外，可以通过用预温育的VEGF、HGF和推定的双特异性VEGF/HGF拮抗剂（例如，mAbdAb）的组合处理细胞来相似地测定抗-HGF、抗-VEGF mAbdAb同时抑制VEGF-介导的VEGFR2磷酸化和HGF-介导的cMET磷酸化的能力。
将汇合的供体HUVEC（Lonza）在Bulletkit培养基（Lonza）中以5,000细胞/孔接种于明胶涂覆的96孔板（Becton Dickenson）上，并在37℃/5%CO2下培养过夜。培养基用无添加剂的基础培养基（例如，EGM-2，Lonza）替代，并将细胞培养大约四小时。测试抗体的浓度滴定液与重组HGF预温育15分钟，接着加入细胞中以获得25ng/ml HGF、10ng/ml VEGF165的终浓度和1.3x10-08、6.7x10-09、3.3x10-09、1.7x10-09、8.3x10-10、4.2x10-10M测试抗体的终浓度。将细胞在37℃下培养20-25分钟，接着洗涤，并制备总细胞裂解物用于根据制造商的说明（MesoscaleDiscovery）使用MSD ELISA方法进行的p-cMET和p-VEGFR2分析。所有条件至少重复进行三次。所示数据呈现为平均值+/-SD，并且代表至少两个独立的试验。
HGF或者HGF与VEGF的组合的处理与未处理的细胞或只用VEGF处理的那些相比细胞，导致了p-cMET可检测的增加。HGF和VEGF的组合与人源化抗-HGF抗体BPC1884或相应的mAbdAb BPC1925预温育导致了HGF-介导的c-MET磷酸化的剂量依赖性中和，这与实施例10的发现相一致，表明HGF-中和能力在mAbdAb形式中仍然保留（图4a）。
在相同的细胞裂解物样品中定量p-VEGFR2的水平。用VEGF或VEGFHE HGF的组合处理细胞与未处理的细胞或只用HGF处理的那些细胞相比，导致了p-VEGFR2可检测的增加。HGF和VEGF的组合与抗-HGF、抗-VEGF mAbdAb BPC1925预温育导致了可检测的VEGFR2的降低，反映出图4a中所描述的与HGF中和同时的VEGF中和。相反，相应的人源化抗-HGF mAb BPC1884的处理没有影响p-VEGFR2水平，证实了VEGF中和通过mAbdAb的VEGF-靶向部分特异性地获得。
数据表明通过抗-HGF/抗-VEGF mAbdAb可以同时中和VEGF和HGF，如通过BPC1925举例说明的和在HUVEC中通过HGF-介导的p-cMET和VEGF-介导的p-VEGFR2的测量测定的。
实施例12-血管生成试验
该实施例是预言性的。其提供了进行其中可以测试了本发明的抗原结合蛋白的附加试验的指引。该试验测定了体外细胞分析中抗-HGF/抗-VEGF mAbdAb或其他抗原结合蛋白抑制血管生成的能力。
AngiokitTM是可购得的内皮细胞和成纤维细胞的共培养物分析，并可以用于测试推定的抗血管生成剂在体外抑制一个或多个与内皮网络形成相关的参数的能力。使用图象分析将这些参数定量，并且这些参数包括例如总内皮细胞面积（场面积）、血管支点数量、平均小管长度等。
在典型的分析中，如制造商（TCS Cellworks）指导的进行血管生成共培养分析（AngiokitTM）。简言之，从24孔形式的AngiokitTM共培养板中吸出培养基，并用补充或未补充人HGF和/或VEGF的全生长培养基替代。测试化合物可以以合适的浓度加入。通常在第4、7和9天替换培养基和测试化合物。通常在第11天，将细胞固定，并如制造商所指导的通过抗-CD31免疫细胞化学可视化内皮细胞网络。通过光学显微镜记录图象，并使用合适的软件（例如，AngioSys，TCS Cellworks）进行图象分析以获得各种血管生成参数的定量。由此可以测定由测试抗原结合蛋白的HGF-拮抗作用、VEGF-拮抗作用或同时的HGF-和VEGF-拮抗作用对各种血管生成过程的影响，并与合适的阳性和阴性对照相比较。
实施例13-动物模型中肿瘤生长的抑制
该实施例是预言性的。其提供了进行其中可以测试本发明的抗原结合蛋白的附加分析的指引。该分析测定了动物模型中抗-HGF/抗-VEGFmAbdAb或其他抗原结合蛋白抑制实验性肿瘤生长的能力。在典型的实验中，动物（例如，小鼠）接种肿瘤细胞的悬浮液或切割的肿瘤碎片以启动肿瘤生长。这样的接种或植入可以例如：皮下；肌内进行而通过静脉进入特定的组织中以产生原位肿瘤（取决于肿瘤细胞类型，例如，颅内或进入乳房脂肪垫中）。免疫受损的动物可以用于允许肿瘤异种移植物的生长，例如，来自人肿瘤细胞系。
可以在肿瘤细胞接种之前、同时或之后开始通过合适的途径（例如，静脉内、腹膜内）施用mAbdAb或其他抗原结合蛋白。测试化合物的进一步的给药通常在实验的过程中周期性地进行。可以通过各种方式，包括可触知肿瘤维度的物理测量、肿瘤生存力的生物发光成象（在其中使用了合适的表达荧光素酶的肿瘤细胞系的情况中）以及通过原发性和继发性肿瘤的验尸检查（包括免疫组织化学和组织学检查），来测定mAbdAb或其他抗原结合蛋白在抑制肿瘤生长中的治疗作用。后者可以提供一种用于测定推定的治疗剂对各种抗原结合蛋白的靶标特异性的肿瘤特征的效应的方法，例如血管生成/微脉管密度、坏死、磷酸化VEGF受体或HGF受体的检测。还可以进行附加生物标志物的定量，例如，HGF、VRGF或其他肿瘤衍生因子的循环水平的检测，其可以反映出肿瘤负荷或肿瘤生长特征。
可以将用mAbdAb处理的动物组中的这些肿瘤生长参数与用对照物质或抗原结合蛋白的组合处理的动物组中的相比较。
实施例14-Bx-PC3细胞cMET磷酸化试验
用重组HGF处理血清饥饿的Bx-PC3细胞导致HGF受体cMET的磷酸化，这在细胞裂解物中是可检测的。因此，可以通过定量与推定的HGF拮抗剂预温育后HGF处理的细胞的磷酸化-cMET来确定HGF的中和。
将Bx-PC3细胞于补充有胍和10%FCS的RPMI中以10,000细胞/孔接种于96孔板中，并在37℃/5%CO2下培养16小时。细胞用100μl PBS洗涤和添加100μl RPMI无血清培养基，并在37℃/5%CO2下再培养16小时。将一定浓度范围（6.67x10-07、1.67x10-07、4.2x10-08、1.0x10-08、2.6x10-09、6.5x10-10、1.6x10-10、4.1x10-11、1.0x10-11M）的测试抗体加入细胞中，一式两份。15分钟后，加入终浓度为200ng/ml的重组HGF。在37℃/5%CO2下培养后，除去培养基，并用100μl冰冷PBS洗涤细胞，并制备细胞裂解物用于根据制造商的说明（Mesoscale Discovery）通过MSD ELISA方法检测cMET/磷酸-cMET。数据呈现为细胞裂解物中总的可检测cMET的p-cMET百分比，+/-重复值的SE，并且代表至少两个独立的实验。
鼠抗-HGF mAb S260116C12的添加导致HGF-介导的cMET磷酸化的剂量依赖性中和。通过用称为BPC1880、BPC1881、BPC1884和BPC1885的S260116C12的人源化变异体处理获得了相似的数据，证实人源化后仍然保留了HGF中和能力。用杂交抗体对照处理对cMET磷酸化没有实质性影响。为了证实这种HGF-中和能力在mAbdAb形式中仍然保留，用抗HGF/抗-VEGF mAbdAb构建体BPC1923、BPC1924、BPC1925、BPC1926（分别对应于mAb BPC1880、BPC1881、BPC1884、BPC1885）处理细胞。这些mAbdAb含有具有抗-VEGF dAb部分形式的抗-HGF单克隆抗体成分。mAbdAb构建体的处理导致了HGF-介导的cMET磷酸化的剂量依赖性消除，其与相应的mAb响应特征不可区分。用无关mAbdAb同种型对照（DMS4000）处理对HGF介导的c-Met磷酸化没有作用（图5）。
这些数据描述了鼠抗-HGF mAb S260116C12在Bx-PC3细胞中抑制HGF-介导的cMET磷酸化的能力并且证实了人源化和构造成抗-HGF/抗VEGF mAbdAb后仍然保留这种活性。
实施例15-Bx-PC3细胞迁移试验
Oris细胞迁移试验（AmsbioTM）由在各个孔中含有预插入的硅酮接种塞的无菌96孔组织培养板组成。加入细胞，并使其生长至汇合。将塞子移除而留下圆形的无细胞区域。在加入迁移抑制剂或促进剂后，监测随着时间进入该区域的细胞迁移。因此，该试验提供了一种用于测定能够调节细胞迁移的因子（包括HGF）的推定抑制剂的方法。
将Bx-PC3胰腺细胞于RPMI完全培养基中以100,000细胞/孔接种于Oris细胞迁移96孔板中，并培养72小时直至汇合。移除细胞塞以获得无细胞区域。在具有各种不同浓度（6.67x10-07、1.67x10-07、4.2x10-08、1.0x10-08、2.6x10-09、6.5x10-10、1.6x10-10、4.1x10-11、1.0x10-11M）的测试抗体与终浓度25ng/ml的重组HGF组合的RPMI无血清培养基中培养细胞24小时。通过用CellTracker（CellTrackerTM Green CMFDA，Invitrogen#C2925）荧光标记细胞和使用平板阅读器（Envision）测量荧光来定量进入无细胞区域的细胞迁移。根据制造商的说明（Amsbio）通过使用板掩模来实现原始无细胞区域外的细胞所产生荧光的排除。数据呈现为最大迁移的百分比并且代表至少两个独立的实验。
与HGF未处理的对照相比，HGF处理细胞导致了进入无细胞区域的细胞迁移的实质性增加。这种HGF-介导的细胞迁移受到鼠抗-HGFmAb S260116C12以剂量依赖性方式的抑制。人源化S260116C12变异体BPC1873、BPC1880、BPC1881、BPC1884和BPC1885的处理导致了非常相似的抑制特征，证实了人源化后保留了HGF-中和能力（图6）。
实施例16-Vk抗-VEGF dAb的产生
按照USSN61/512,143中所述的产生Vk dAb。简言之，为了产生具有结合人VEGF能力的域抗体（dAb），使用展示Vk dAb的噬菌体展示文库进行选择。对生物素化的rhVEGF15（“可溶性选择”）和固定在塑料表面上的rhVEGF165（“被动选择”）进行选择。使用常规噬菌体淘选技术和三轮针对递减浓度的抗原的选择鉴定出一组结合dAb的VEGF。序列分析确认76个独特的Vk序列。
为了鉴定合适结构的dAb，将dAb序列克隆至哺乳动物表达载体中的人IgG1同种型（Pascolizumab；抗-IL4）的遗传mAb的重链C末端上。用两个接头中的一个将dAb连接到mAb上；较短的接头由序列GSTVAAPST组成，而长接头由序列GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS组成。
分析dAb以确定它们结合rhVEGF和阻断VEGF结合重组VEGFR1（flt-1）或VEGFR2（KDR）的能力。受体结合试验（RBA）数据证明了DT02-K-044dAb（SEQ ID NO:191）不仅能够紧密结合VEGF，而且在基于平板的试验中能够阻止VEGF结合其天然受体。
在改善DT02-K-044的解离常数（Kd）的尝试中，进行了亲和性成熟，并且在HEK细胞中与帕考珠单抗(padcolizumab)共表达的帕考珠单抗-(GSTVAAPS)3-T mAb重链表达载体的情况中评价了候选前导物。使用SPR技术（Proteon）分析了转染上清液中表达的mAb-dAb与VEGF的结合。样品没有定量，但与一起表达的亲本mAb-dAb进行了比较。在Proteon分析中，将突变的克隆与各个板上以相同方式表达的亲本克隆相比较。所有改善簇集在13个多样化的CDR残基中的3个（S34、G51、H96（编号是基于Vk dAb的第一个残基（Asp）作为残基1））。在这三个位置中，位置S34和H96的置换是最显著的（就改善KD而言，通过Proteon分析以及在HUVEc增殖试验中）。以下的表4强调了特定位置的KD（以nM计）的Proten评价，其中亲和性相对于DT02-K-044亲本dAb显著增强（表4）。
表4：DT02-K-044（SEQ ID NO:191）的亲和性成熟的变异体
突变体ID 氨基酸置换 KD nM
DT02-K-044wt N/A 0.1
DT02-K-044-077 S34A 0.04
DT02-K-044-082 S34G 0.07
DT02-K-044-083 S34H 0.049
DT02-K-044-084 S34I 7.27E-27*
DT02-K-044-085 S34K 1.12E-18*
DT02-K-044-086 S34L 0.032
DT02-K-044-087 S34M 0.005*
DT02-K-044-088 S34N 0.052
DT02-K-044-090 S34Q 0.02
DT02-K-044-092 S34T 0.003*
DT02-K-044-093 S34V 0.034
DT02-K-044-095 S34Y 0.006*
DT02-K-044-229 H96A 0.002
DT02-K-044-230 H96C 0.023
DT02-K-044-232 H96E 0.004*
DT02-K-044-234 H96G 0.022
DT02-K-044-235 H96I 0.004
DT02-K-044-236 H96K 9.82E-18*
DT02-K-044-237 H96L 0.031
DT02-K-044-238 H96M 0.044
DT02-K-044-239 H96N 0.013
DT02-K-044-240 H96P 0.043
DT02-K-044-247 H96Y 0.018
为了确定这些单独有益的突变是否可以累加，构建了结合这些变化的组合突变体，其导致特别是确定为DT02-K-044-251（S34K加H96E，SEQ ID NO:192）和DT02-K-044-255（S34K加H96K，SEQ ID NO:193）的双重突变体的鉴定。
使用各种接头，包括源自人血清白蛋白的21个氨基酸的接头序列，将这两个dAb与优选的单突变体DT02-K-044-085（S34K，SEQ ID NO:194）一起作为与帕考珠单抗的融合体表达。在受体结合试验、HUVEc增殖试验中测试这三个构建体的效力，并通过Biacore SPR测试动力学亲和性。所有这三个分子在低pM范围中都显示出与亲本分子相比显著增强的亲和性。
序列标识符
表5：氨基酸和DNA序列的序列识别号
Figure GDA0000381902510000881
Figure GDA0000381902510000891
Figure GDA0000381902510000901
Figure GDA0000381902510000921
Figure GDA0000381902510000931
Figure GDA0000381902510000941
Figure GDA0000381902510000951
序列
SEQ.ID NO.1信号肽序列（DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGC
SEQ.ID NO.2信号肽序列（氨基酸序列）
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ.ID NO.3 S260116C12小鼠可变重链（DNA序列）
CAGATTCAGCTGCGGCAGTCTGGAGCTGGACTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCACTGGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGACCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTACTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACAACTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGGGGGGGtTATTACTACGGTAGTAGCTACGACTCCTGGGGCCAAGGCA
SEQ.ID NO.4 S260116C12小鼠可变重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAGLMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHDLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSSYDSWGQG
SEQ.ID NO.5 S260116C12小鼠可变轻链（氨基酸序列）
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTCAGTATTCATGGTACTCATTTAATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCTAGAATCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGAGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTTCTGTCAGCAAAGTATTGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
SEQ.ID NO.6 S260116C12小鼠可变轻链（氨基酸序列）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPYTFGGGTKLEIKR
SEQ.ID NO.7 S260105B02小鼠可变重链（DNA序列）
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCACTGGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACAACTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGGGGGGTATGGTTACCACGACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGAC
SEQ.ID NO.8 S260105B02小鼠可变重链（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYGYHDAWFAYWGQG
SEQ.ID NO.9 S260105B02小鼠可变轻链（DNA序列）
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTACACGTTCGGA
SEQ.ID NO.10 S260105B02小鼠可变轻链（氨基酸序列）
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFG
SEQ.ID NO.11 S260115C11小鼠可变重链（DNA序列）
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCACTGGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACAACTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGGGGGGGTTATTACTACGGTAGTAGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGC
SEQ.ID NO.12 S260115C11小鼠可变重链（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSSFDYWGQG
SEQ.ID NO.13 S260115C11小鼠可变轻链（DNA序列）
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
SEQ.ID NO.14 S260115C11小鼠可变轻链（氨基酸序列）
QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLELKR
SEQ.ID NO.15 S265109B10小鼠可变重链（DNA序列）
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCACTGGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTTCTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACAACTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGGGGGATATTACTACGGTAGTCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ.ID NO.16 S265109B10小鼠可变重链（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSSSTNYNEKFKDKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSPMDYWGQGTSVTVSS
SEQ.ID NO.17 S265109B10小鼠可变轻链（DNA序列）
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGGTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
SEQ.ID NO.18 S265109B10小鼠可变轻链（DNA序列）
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSARSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK
SEQ.ID.No.19 S260116C12 CDR H1（氨基酸序列）
GYWIE
SEQ.ID.No.20 S260116C12 CDR H2（氨基酸序列）
EILPGSGTTNYNEKFKG
SEQ.ID.No.21 S260116C12 CDR H3（氨基酸序列）
GGYYYGSSYDS
SEQ.ID.No.22 S260116C12 CDR L1（氨基酸序列）
RASESVSIHGTHLMH
SEQ.ID.No.23 S260116C12 CDR L2（氨基酸序列）
AASNLES
SEQ.ID.No.24 S260116C12 CDR L3（氨基酸序列）
QQSIEDPYT
SEQ.ID.No.25 S260105B02 CDR H1（氨基酸序列）
GYWIE
SEQ.ID.No.26 S260105B02 CDR H2（氨基酸序列）
EILPGSGSTNYNEKFKG
SEQ.ID.No.27 S260105B02 CDR H3（氨基酸序列）
GGYGYHDAWFAY
SEQ.ID.No.28 S260105B02 CDR L1（氨基酸序列）
KSSQSLLYSSNQKNYLA
SEQ.ID.No.29 S260105B02 CDR L2（氨基酸序列）
WASTRES
SEQ.ID.No.30 S260105B02 CDR L3（氨基酸序列）
QQYYSYPYT
SEQ.ID.No.31 S260115C11 CDR H1（氨基酸序列）
GYWIE
SEQ.ID.No.32 S260115C11 CDR H2（氨基酸序列）
EILPGSGSTNYNEKFKG
SEQ.ID.No.33 S260115C11 CDR H3（氨基酸序列）
GGYYYGSSFDY
SEQ.ID.No.34 S260115C11 CDR L1（氨基酸序列）
TASSSVSSSYLH
SEQ.ID.No.35 S260115C11 CDR L2（氨基酸序列）
STSNLAS
SEQ.ID.No.36 S260115C11 CDR L3（氨基酸序列）
HQYHRSPLT
SEQ.ID.No.37 S265109B10 CDR H1（氨基酸序列）
GYWIE
SEQ.ID.No.38 S265109B10 CDR H2（氨基酸序列）
EILPGSSSTNYNEKFKD
SEQ.ID.No.39 S265109B10 CDR H3（氨基酸序列）
GGYYYGSPMDY
SEQ.ID.No.40 S265109B10 CDR L1（氨基酸序列）
SARSSVSYMH
SEQ.ID.No.41 S265109B10 CDR L2（氨基酸序列）
DTSKLAS
SEQ.ID.No.42 S265109B10 CDR L3（氨基酸序列）
QQWSSNPPT
SEQ.ID NO.43 S260116C12嵌合体重链（DNA序列）
CAGATCCAGCTGCGCCAGTCCGGCGCCGGCCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCACGACCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACCGCCGACACCTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCACCGAGGACTCCGCCATCTACTACTGCGCCCGCGGCGGCTACTACTACGGCTCCTCCTACGACTCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.44 S260116C12嵌合体重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAGLMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHDLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.45 S260116C12嵌合体轻链（DNA序列）
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCTCCTGCCGCGCCTCCGAGTCCGTGTCCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCTGGAGTCCGGCGTGCCCGCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGAGACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTCCATCGAGGACCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.46 S260116C12嵌合体轻链（氨基酸序列）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO.47 S260105B02嵌合体重链（DNA序列）
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCGGCTCCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACCGCCGACACCTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCACCGAGGACTCCGCCATCTACTACTGCGCCCGCGGCGGCTACGGCTACCACGACGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.48 S260105B02嵌合体重链（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYGYHDAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.49 S260105B02嵌合体轻链（DNA序列）
GACATCGTGATGTCCCAGTCCCCCTCCTCCCTGGCCGTGTCCGTGGGCGAGAAGGTGACCATGTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCCGCGAGTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCACCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCGTGAAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACTCCTACCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.50 S260105B02嵌合体轻链（氨基酸序列）
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO.51 S260115C11嵌合体重链（DNA序列）
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCGGCTCCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACCGCCGACACCTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCACCGAGGACTCCGCCATCTACTACTGCGCCCGCGGCGGCTACTACTACGGCTCCTCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.52 S260115C11嵌合体重链（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.53 S260115C11嵌合体轻链（DNA序列）
CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCATCATGTCCGCCTCCCTGGGCGAGCGCGTGACCATGACCTGCACCGCCTCCTCCTCCGTGTCCTCCTCCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCCAAGCTGTGGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCTCCTACTCCCTGACCATCTCCTCCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCACCAGTACCACCGCTCCCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.54 S260115C11嵌合体轻链（氨基酸序列）
QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO.55 S265109B10嵌合体重链（DNA序列）
CAGGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGATGAAACCCGGGGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATCGGCGAAATCCTGCCCGGCAGCAGCAGCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCTTCACCGCCGACACTAGCAGCAACACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACAACCGAGGACTCCGCAATCTACTACTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCCCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.56 S265109B10嵌合体重链（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSSSTNYNEKFKDKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSPMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.57 S265109B10嵌合体轻链（DNA序列）
CAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCATTATGAGCGCTAGCCCCGGGGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGGAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCAGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCTCCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCTCCCACTTTCGGCGGCGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.58 S265109B10嵌合体轻链（氨基酸序列）
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSARSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO.59 S260116C12嵌合体重链可变区（DNA序列）
CAGATCCAGCTGCGCCAGTCCGGCGCCGGCCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCACGACCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACCGCCGACACCTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCACCGAGGACTCCGCCATCTACTACTGCGCCCGCGGCGGCTACTACTACGGCTCCTCCTACGACTCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.60 S260116C12嵌合体重链可变区（氨基酸序列）
QIQLRQSGAGLMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHDLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.61 S260116C12嵌合体轻链可变区（DNA序列）
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCCAGCGCGCCACCATCTCCTGCCGCGCCTCCGAGTCCGTGTCCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCTGGAGTCCGGCGTGCCCGCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGAGACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTCCATCGAGGACCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGT
SEQ.ID NO.62 S260116C12嵌合体轻链可变区（氨基酸序列）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPYTFGGGTKLEIKR
SEQ.ID NO.63 S260105B02嵌合体重链可变区（DNA序列）
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCGGCTCCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACCGCCGACACCTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCACCGAGGACTCCGCCATCTACTACTGCGCCCGCGGCGGCTACGGCTACCACGACGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.64 S260105B02嵌合体重链可变区（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYGYHDAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.65 S260105B02嵌合体轻链可变区（DNA序列）
GACATCGTGATGTCCCAGTCCCCCTCCTCCCTGGCCGTGTCCGTGGGCGAGAAGGTGACCATGTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCCGCGAGTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCACCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCGTGAAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACTCCTACCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGT
SEQ.ID NO.66 S260105B02嵌合体轻链可变区（氨基酸序列）
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIKR
SEQ.ID NO.67 S260115C11嵌合体重链可变区（DNA序列）
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCGGCTCCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACCGCCGACACCTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCACCGAGGACTCCGCCATCTACTACTGCGCCCGCGGCGGCTACTACTACGGCTCCTCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.68 S260115C11嵌合体重链可变区（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSSFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.69 S260115C11嵌合体轻链可变区（DNA序列）
CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCATCATGTCCGCCTCCCTGGGCGAGCGCGTGACCATGACCTGCACCGCCTCCTCCTCCGTGTCCTCCTCCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCCAAGCTGTGGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCTCCTACTCCCTGACCATCTCCTCCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCACCAGTACCACCGCTCCCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGT
SEQ.ID NO.70 S260115C11嵌合体轻链可变区（氨基酸序列）
QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLEIKR
SEQ.ID NO.71 S265109B10嵌合体重链可变区（DNA序列）
CAGGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGATGAAACCCGGGGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATCGGCGAAATCCTGCCCGGCAGCAGCAGCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCTTCACCGCCGACACTAGCAGCAACACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACAACCGAGGACTCCGCAATCTACTACTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCCCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.72 S265109B10嵌合体重链可变区（氨基酸序列）
QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSSSTNYNEKFKDKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARGGYYYGSPMDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.73 S265109B10嵌合体轻链可变区（DNA序列）
CAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCATTATGAGCGCTAGCCCCGGGGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGGAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCAGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCTCCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCTCCCACTTTCGGCGGCGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGT
SEQ.ID NO.74 S265109B10嵌合体轻链可变区（氨基酸序列）
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSARSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKR
SEQ.ID NO.75 S260116C12人源化Ha2重链（DNA序列）
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGTGACCATCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.76 S260116C12人源化Ha2重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGTTNYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.77 S260116C12人源化Ha4重链（DNA序列）
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.78 S260116C12人源化Ha4重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.79 S260116C12人源化Ha5重链（DNA序列）
CAGATCCAGCTGAGGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.80 S260116C12人源化Ha5重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.81 S260116C12人源化Ha6重链（DNA序列）
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCTTCACTGCCGACAAGTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.82 S260116C12人源化Ha6重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.83 S260116C12人源化Ha7重链（DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.84 S260116C12人源化Ha7重链（氨基酸序列）
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.85 S260116C12人源化La0轻链（DNA序列）
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGATAGCCTGGCTGTGTCACTGGGGGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGGGCCAGCGAGTCCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAAAGCGGCGTCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACTATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGAGCATCGAGGACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.86 S260116C12人源化La0轻链（氨基酸序列）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSIEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO.87 S260116C12人源化La1轻链（DNA序列）
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGATAGCCTGGCTGTGTCACTGGGGGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGGGCCAGCGAGTCCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAAAGCGGCGTCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGAGACCGACTTCACCCTGACTATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGAGCATCGAGGACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.88 S260116C12人源化La1轻链（氨基酸序列）
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSETDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSIEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO.89 S260116C12人源化Ha2重链可变区（DNA序列）
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGTGACCATCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.90 S260116C12人源化Ha2重链可变区（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGTTNYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.91 S260116C12人源化Ha4重链可变区（DNA序列）
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.92 S260116C12人源化Ha4重链可变区（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.93 S260116C12人源化Ha5重链可变区（DNA序列）
CAGATCCAGCTGAGGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.94 S260116C12人源化Ha5重链可变区（氨基酸序列）
QIQLRQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.95 S260116C12人源化Ha6重链可变区（DNA序列）
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCTTCACTGCCGACAAGTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.96 S260116C12人源化Ha6重链可变区（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.97 S260116C12人源化Ha7重链可变区（DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ.ID NO.98 S260116C12人源化Ha7重链可变区（氨基酸序列）
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.99 S260116C12人源化La0轻链可变区（DNA序列）
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGATAGCCTGGCTGTGTCACTGGGGGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGGGCCAGCGAGTCCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAAAGCGGCGTCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACTATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGAGCATCGAGGACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGT
SEQ.ID NO.100 S260116C12人源化La0轻链可变区（氨基酸序列）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSIEDPYTFGQGTKLEIKR
SEQ.ID NO.101 S260116C12人源化La1轻链可变区（DNA序列）
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGATAGCCTGGCTGTGTCACTGGGGGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGGGCCAGCGAGTCCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAAAGCGGCGTCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGAGACCGACTTCACCCTGACTATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGAGCATCGAGGACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGT
SEQ.ID NO.102 S260116C12人源化La1轻链可变区（氨基酸序列）
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSETDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSIEDPYTFGQGTKLEIKR
SEQ.ID NO.103抗-VEGF 098 dAb（DNA序列）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGATTATGATATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTTCTGTGGAGGGTGTTCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAATATTCGTTATGTGGGGAATCGGTCGTGGTGGACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
SEQ.ID NO.104抗-VEGF 098 dAb（氨基酸序列）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.105抗-VEGF 098AAA dAb（DNA序列）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGATTATGATATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTTCTGTGGAGGGTGTTCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAATATTCGTTATGTGGGGAATCGGTCGTGGTGGACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCC
SEQ.ID NO.106抗-VEGF 098AAA dAb（氨基酸序列）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSSAAA
SEQ.ID NO.107抗-VEGF 044 dAb（DNA序列）
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGTCCTGAGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCATGGTTCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTATATGTATTATCCTCATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
SEQ.ID NO.108抗-VEGF 044 dAb（氨基酸序列）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.109抗-VEGF 593 dAb（DNA序列）
GAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ.ID NO.110抗-VEGF 593 dAb（氨基酸序列）
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.111抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPSGS-593重链（DNA序列）
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGCGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ.ID NO.112抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPSGS-593重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.113抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPSGS-593重链（DNA序列）
CAGATCCAGCTGAGGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGGTCTGGCACCACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACTGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGGCGGCTACTACTACGGCAGCAGCTACGACAGCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ.ID NO.114抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPSGS-593重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.115抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPSGS-098重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.116抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPSGS-098重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.117抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-TVAAPSGS-098重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.118抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-TVAAPSGS-098重链（氨基酸序列）
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.119抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPS-098重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.120抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPS-098重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.121抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-TVAAPS-098重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYDMWWVRQAPGKGLEWVSSISVEGVQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNIRYVGNRSWWTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.122抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-TVAAPS-098重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.123抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPSGS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.124抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPSGS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.125抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-TVAAPSGS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.126抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-TVAAPSGS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.127抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.128抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.129抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-TVAAPS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.130抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-TVAAPS-098AAA重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.131抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPSGS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.132抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPSGS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.133抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-TVAAPSGS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.134抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-TVAAPSGS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.135抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-TVAAPS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.136抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-TVAAPS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.137抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-TVAAPS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.138抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-TVAAPS-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.139抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-GS(TVAAPSGS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.140抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-GS(TVAAPSGS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.141抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-GS(TVAAPSGS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.142抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-GS(TVAAPSGS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.143抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-(TVAAPS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.144抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-(TVAAPS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.145抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-(TVAAPS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.146抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-(TVAAPS)3-044重链（氨基酸序列）
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SEQ.ID NO.153抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-DETYVPKEFNAETF-044重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDETYVPKEFNAETFDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.154抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-DETYVPKEFNAETF-044重链（氨基酸序列）
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDETYVPKEFNAETFDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.155抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS-044重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.156抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS-044重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.157抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS-044重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.158抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS-044重链（氨基酸序列）
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.159抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha4-EVDETYVPKEFNAETFTFHAD-044重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.160抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha5-EVDETYVPKEFNAETFTFHAD-044重链（氨基酸序列）
QIQLRQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGKATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.161抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha6-EVDETYVPKEFNAETFTFHAD-044重链（氨基酸序列）
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.162抗-HGF-VEGF S260116C12人源化Ha7-EVDETYVPKEFNAETFTFHAD-044重链（氨基酸序列）
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGTTNYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYYGSSYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVDETYVPKEFNAETFTFHADDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ.ID NO.163 TVAAPSGS接头（氨基酸序列）
TVAAPSGS
SEQ.ID NO.164 TVAAPS接头（氨基酸序列）
TVAAPS
SEQ.ID NO.165 GS(TVAAPSGS)3（氨基酸序列）
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS
SEQ.ID NO.166(TVAAPS)3（氨基酸序列）
TVAAPSTVAAPSTVAAPS
SEQ.ID NO.167 DETYVPKEFNAETFGS接头（氨基酸序列）
DETYVPKEFNAETFGS
SEQ.ID NO.168 DETYVPKEFNAETF接头（氨基酸序列）
DETYVPKEFNAETF
SEQ.ID NO.169 EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS接头（氨基酸序列）
EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS
SEQ.ID NO.170 EVDETYVPKEFNAETFTFHAD接头（氨基酸序列）EVDETYVPKEFNAETFTFHAD
SEQ.ID NO.171 DMS4000重链（DNA序列）
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGCGCCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ.ID NO.172 DMS4000重链（氨基酸序列）
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.173 DMS4000轻链（DNA序列）
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCACCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCGGTACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.174 DMS4000轻链（氨基酸序列）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO.175杂交抗体对照重链（DNA序列）
CAGGTCCAATTAGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACCTTCACTAACTATGGAATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATGGATAAACACCAGAAATGGAAAGTCAACATATGTTGATGACTTCAAGGGGCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTACAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGACGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGGGAATATGGATGGTTACTTCCCTTTTACTTACTGGGGCCAGGGTACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ.ID NO.176杂交抗体对照重链（氨基酸序列）
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTRNGKSTYVDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYYCAREGNMDGYFPFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.ID NO.177杂交抗体对照轻链（DNA序列）
GATATTGTCATGACTCAGTCTCCATCATCCCTGTCCGCATCAGTAGGAGACAGGGTCACCATCACCTGCAAGGCTTCTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTATCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCTCAGGCAGTGGATCCGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGACTTCGCAACGTATTACTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTCACGTTCGGTGGTGGTACCAAGGTGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ.ID NO.178杂交抗体对照轻链（氨基酸序列）
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.ID NO179抗-VEGF Y0317人源化抗体片段VH区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL
SEQ.ID NO180抗-VEGF Y0317人源化抗体片段VL区
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV
SEQ ID NO:181(抗-VEGF抗运载蛋白)
DGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
SEQ ID NO:182(抗-VEGFR2adnectin)
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
SEQ ID NO:183(抗-HGF纳米抗体HGF13)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:184(人源化抗-HGF纳米抗体HGF13hum5)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:185(阿瓦斯汀可变轻链)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO:186(阿瓦斯汀可变重链)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:187
DDNPNLPRLVRPE
SEQ ID NO:188
DEMPADLPSLAADF
SEQ ID NO:189
HKDDNPNLPRLVRPEVDVM
SEQ ID NO:190
ENDEMPADLPSLAADFVESKD
SEQ ID NO:191(抗-VEGF Vk dAb DT02-K-044)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO:192(抗-VEGF Vk dAb DT02-K-044-251)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELKWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPETFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO:193(抗-VEGF Vk dAb DT02-K-044-255)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELKWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPKTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO:194:DT02-K-044-085
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELKWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPHTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO:195(TGLDSP)3接头（氨基酸序列）
TGLDSPTGLDSPTGLDSP
SEQ ID NO:196(TGLDSP)4接头（氨基酸序列）
TGLDSPTGLDSPTGLDSPTGLDSP
Figure ISB00001124615600021
Figure ISB00001124615600031
Figure ISB00001124615600041
Figure ISB00001124615600061
Figure ISB00001124615600071
Figure ISB00001124615600081
Figure ISB00001124615600091
Figure ISB00001124615600101
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Claims (16)

1.一种包含与一个或多个表位结合结构域连接的至少一个配对的VH/VL结构域的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白包含至少两个抗原结合位点，所述抗原结合位点的至少一个由该至少一个表位结合结构域提供，且所述抗原结合位点的至少一个由该至少一个配对的VH/VL结构域提供，其中该配对的VH/VL结构域或各个配对的VH/VL结构域特异性地结合HGF并且包含SEQ ID NO：92、94、96或98的VH氨基酸序列。
2.根据权利要求1的抗原结合蛋白，其中该配对的VH/VL结构域或各个配对的VH/VL结构域包含SEQ ID NO：100或102的VL氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2的抗原结合蛋白，其包含与所述表位结合结构域连接的两个配对的VH/VL结构域。
4.根据权利要求3的抗原结合蛋白，其包含IgG骨架，该IgG骨架包含两个重链和两个轻链，各个重链包含所述配对的VH/VL结构域的一个VH，各个轻链包含所述配对的VH/VL结构域的一个VL。
5.根据权利要求3的抗原结合蛋白，其包含含有两个重链和两个轻链的抗体，该重链包含SEQ ID NO：78、80、82或84的氨基酸序列，和该轻链包含SEQ ID NO：86或88的氨基酸序列。
6.根据权利要求4或5的抗原结合蛋白，其中所述表位结合结构域中的一个连接各个重链的N-末端或C-末端。
7.根据权利要求6的抗原结合蛋白，其中所述表位结合结构域中的一个连接各个重链的C-末端。
8.根据权利要求1至7任一项的抗原结合蛋白，其中所述表位结合结构域通过1至20个氨基酸的接头与所述抗原结合结构域连接。
9.根据前述任一项权利要求的抗原结合蛋白，其中所述结合蛋白对超过一种的抗原具有特异性，任选地其中所述抗原结合蛋白能够结合HGF和VEGF。
10.根据前述任一项权利要求的抗原结合蛋白，其中所述表位结合结构域中至少一个具有对VEGF的特异性。
11.根据前述任一项权利要求的抗原结合蛋白，其包含四个表位结合结构域，任选地其中所述表位结合结构域中的两个具有对相同抗原的特异性。
12.根据前述任一项权利要求的抗原结合蛋白，其具有4个抗原结合位点。
13.根据权利要求8的抗原结合蛋白，其中所述表位结合结构域中的至少一个进一步包含接头，所述接头选自SEQ ID NO：163-170或187-190、195或196中所示的任一个，或任意多个或其组合。
14.根据前述任一项权利要求的抗原结合蛋白，其中所述表位结合结构域中的至少一个结合人血清白蛋白。
15.一种抗原结合蛋白，其包含抗-HGF抗体和通过包含1至20个氨基酸的接头与所述抗体连接的至少一个表位结合结构域，所述抗体包含具有SEQ ID NO：90、92、94、96或98的VH氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：100或102的VL序列的轻链，和所述表位结合结构域特异性地结合VEGF。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1至14中任一项的抗原结合蛋白和药物学上可接受的载体。
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