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CN103443284A - 从草本植物酶促分离木质素及其他生物制品的方法和系统 - Google Patents

从草本植物酶促分离木质素及其他生物制品的方法和系统 Download PDF

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CN103443284A CN2012800148864A CN201280014886A CN103443284A CN 103443284 A CN103443284 A CN 103443284A CN 2012800148864 A CN2012800148864 A CN 2012800148864A CN 201280014886 A CN201280014886 A CN 201280014886A CN 103443284 A CN103443284 A CN 103443284A
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Abstract

描述了从草本植物材料酶促分离木质素以及诸如可发酵糖的其他生物制品的方法。该方法可提供改善，例如增加的产品纯度以及减少的加工能量需求以及对产品的改性和污染。还提供了实践该方法的系统。

Description

从草本植物酶促分离木质素及其他生物制品的方法和系统
发明背景
在35U.S.C.§119(e)下，本发明要求于2011年1月24日申请的美国临时专利申请第61/435,492号的优先权，通过参照将其整体并入本文。
本发明涉及从草本植物酶促分离(enzymatic isolation)木质素和其它生物制品，且具体涉及从木质纤维素材料酶促分离木质素和糖的方法，以及执行这些方法的系统。
用于生产生物制品的生物质的潜在丰富来源是草本木质纤维素植物纤维。诸如植物纤维中发现的一些纤维素多糖可与木质素分离并降解为可发酵糖。例如，可发酵这些糖以制造醇类(例如，乙醇、丁醇)、有机酸(例如，醋酸、柠檬酸)及其它产物(例如，其它碳氢化合物、蛋白质)。木质素已被用于各种应用中，包括当燃烧时作为能量来源、以及作为各种化学品和组合物的原材料或添加剂。如通常理解的，然而，木质纤维素材料的天然结构使得该材料在不采取严苛和/或能量消耗大的手段的情况下非常耐分开(分馏)(fractionation)。
木质纤维素生物质可包含，例如约35-50wt%纤维素，约15-35wt%半纤维素，以及约5-30wt%木质素，或其它比例，取决于其来源。虽然纤维素、半纤维素和木质素经常可为木质纤维素生物质的主要组分，但也可存在各种量的以结合和非结合形式二者存在的其他材料。这些次要组分可包括，例如蛋白质、糖醛酸、醋酸、灰分、诸如蔗糖的游离糖、土壤及外来杂物。纤维素通常是葡萄糖的聚合物。葡萄糖分子可通过β-1,4-糖苷键相连接。半纤维素是通常主要包含5-碳糖，例如木糖和阿拉伯糖的聚合物，其可具有一些葡萄糖和甘露糖遍布分散。半纤维素倾向于形成在植物壁中与纤维素和木质素作用以强化其的聚合物。木质素倾向于帮助结合纤维素-半纤维素基质同时增加弹性。木质素聚合物的分子结构典型可为，例如随机和紊乱的并可主要由通过多糖相互连接的碳环结构(例如，具有甲氧基、羟基和丙基的苯环)组成。木质素-半纤维素基质通常包住纤维素，使得该材料抗消化。
处理木质纤维素材料以从生物质中的生物聚合物分离木质素已为活跃的研究领域且已研究和报道了很多热、机械和化学预处理方法(及其组合)。过去已使用了严苛处理(harsh treatment)，例如涉及强化学物质和/或高温处理，以从木质纤维素材料的其他成分中分离木质素。在一些之前方法中，纤维素多糖的分离，例如与草本木质纤维素植物纤维材料中的保护性木质素分离，已出现需要高能源成本、或导致改性的或受污染的产物、或影响其下游处理、或具有其他弊端。
硫酸盐(kraft)或亚硫酸盐制浆过程，例如已被用于造纸厂中，从软木、硬木或二者的纤维素纤维中移除木质素，通过用浓酸(例如硫酸)、硫化钠或硫酸盐预处理纸浆，作为造纸的预备操作。用浓酸或浓碱/碱性剂处理木质纤维素材料可导致生成木素磺化盐，其为硫污染的木质素材料。严苛酸处理木质纤维素材料还可导致存在抑制剂，其可复杂化生物制品的下游处理并因为需要解毒步骤而增加制造成本。移除木质素并暴露纤维素的另一先前技术包括，例如使用高压蒸汽，其意味着需要增加能源成本。从棉籽壳释放木质素和糖的先前处理实践，例如包括采用高温(例如，>180℃)和高蒸汽压处理材料，其需要大量能源。也已报道了在木质纤维素材料上组合使用浓酸/碱和蒸汽处理，其可放大所述弊端。另一先前方法使用辐射装置以离子化木质纤维素生物质原料。辐射可改变木质素组分及其木质素衍生物的结构。其它先前技术使用重组多肽以增加其它水解酶的释放。重组多肽的使用可涉及更高的材料成本且未使用天然试剂。先前实践还使用了采用生物反应器膜的连续生物反应器处理以用于连续处理。生物反应器膜的使用可需要延长处理时间，并具有不一致的组分收率。其它先前方法使用生物体活体厌氧培养以执行所需的释放任务。厌氧活体培养的使用可增加处理复杂性和成本。
本发明人已认识到就木质纤维素材料(例如，棉籽壳)组分的特定组分及衍生物，诸如木质素和糖而言，如果它们可以以更纯的形式分离而不降解所提取的木质素和糖并具有更少的废副产品，则可更为有用的作为工业原料。本研究者进一步已认识到仅使用天然、更环境友好及可循环活性剂，伴随更少能量需要从诸如棉籽壳的草本植物材料分离木质素和糖的需求。
发明概述
本发明的一个特征是提供使用全酶法(total enzymatic process)从草本木质纤维素植物分离木质素和其它生物制品的方法。
本发明的一附加特征是提供使用全酶法从棉籽壳(cotton seed hull)分离木质素和糖的方法。
本发明的另一特征是提供使用全酶法而无需利用高温处理、电离辐射处理、强酸、强碱性试剂、螯合剂、重组DNA和/或活体厌氧微生物培养来从棉籽壳分离木质素和糖的方法。
本发明的附加特征和优势将部分在下列说明书中陈述，且部分根据说明书将是显而易见的，或通过本发明实践可知晓。通过在说明书和所附权利要求中特别指出的元素及组合将了解并获得本发明的目标和其它优势。
为实现这些和其它优势，以及依照本发明的目的，如在本发明中具体和广泛描述的，本发明部分涉及分离木质纤维素材料组分的方法，该方法包括：粉碎木质纤维素材料至具有增大表面积的更小粒径。然后在不存在在先木质纤维素材料的非酶分离木质素处理(non-enzymatic lignin separation treatment)的情况下，酶消化(enzymatically digested)包含经粉碎的木质纤维素材料、至少一种酶混合物以及水溶液的混合物，从而酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖。然后从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的水溶液用于任一或两种生物制品的回收。
本发明进一步涉及分离木质纤维素材料组分的方法，该方法包括：粉碎木质纤维素材料至具有第一增大表面积的更小粒径，然后在不存在任何在先木质纤维素材料的非酶分离木质素处理的情况下，酶消化包含经粉碎的木质纤维素材料、第一酶混合物以及第一水溶液的第一混合物，从而第一酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的第一不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖。然后从该第一不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的第一水溶液，其中接着将该经分离的第一不溶性部分粉碎至具有第二增大表面积的更小粒径。然后酶消化包含经粉碎的第一不溶性部分、第二酶混合物以及第二水溶液的第二混合物，从而第二酶致水解从包含木质素的第二不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖，然后从第二水溶液分离包含木质素的第二不溶性部分。
将理解前述一般说明和下列详细说明二者仅为示例性和解释性的且仅意图提供如权利要求所要求的本发明的进一步的说明。
如本文所使用的，“木质纤维素材料”或“木质纤维素”是指在基质中包含木质素和纤维素，以及任选还包含半纤维素的植物细胞壁材料。包含这些组分的木质纤维素材料可为但不限于：草本材料、农业废弃物(agriculturalresidues)、林业废弃物(forestry residues)、生活固体垃圾、回收纸和废纸(例如，本色纸)以及纸浆和造纸厂废弃物(例如，未漂白纸浆和造纸机废弃物(millresidues))。
“木质素”是指为植物和一些藻类次生细胞壁的主要部分的复合生物聚合物。木质素填充细胞壁内和纤维素、半纤维素以及果胶组分(如果存在)间的空间。木质素可通过，例如CAS号9005-53-2确认。
“C6和/或C5糖”是指单糖，包括例如：己糖(“C6”)糖(例如，己醛糖例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、己醛糖、阿洛糖、阿卓糖；和己酮糖例如阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖；或其它，单独或其任意组合)、和/或戊糖(“C5”)糖(例如，戊醛糖例如木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖；戊酮糖例如核酮糖、木酮糖；以及其它，单独或其任意组合)。己糖是具有6个碳原子的单糖，具有化学式C6H12O6。己糖的分类可通过，例如功能基，在1位具有醛功能基的己醛糖，以及在2位具有酮功能基的己酮糖。如已知的，6-碳醛糖可形成环状半缩醛，其可包括吡喃糖结构。在溶液中，6-碳醛糖的开链形式和环状形式可平衡存在，或彼此以其他相对分率存在。包含于本发明图示中的图显示了D-葡萄糖和D-甘露糖的开链和环状形式，该图表仅用于示例目的而非必要限制(图4)。如所述图中显示的，己糖碳编号相对于其开链形式来表示(戊糖使用相似的碳编号体系)。为了简化说明，未示例就此所提供的图表中所示环状环中的任何折叠结构(例如，椅式构象)，且这些结构应当被本领域技术人员所理解。戊糖是具有5个碳原子的单糖，具有化学式C5H10O5。戊糖可被分为例如2组，在1位具有醛功能基的戊醛糖，以及在2位具有酮功能基的戊酮糖。如已知的，5-碳醛糖也可具有环状半缩醛形式，其可包括呋喃糖结构。5-碳醛糖的半缩醛环状形式可自然开合，其中可发生旋转。
“葡聚糖”是指通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖。葡聚糖可涉及β-葡聚糖(例如，纤维素、凝胶多糖(curdlan)、海带多糖、金藻昆布多糖(chrysolaminarin)、香菇多糖、地衣多糖、平菇-D-葡聚糖(pleuran)、酵母多糖)、α-葡聚糖(例如，右旋糖酐、糖原、支链淀粉、淀粉)、任一单独或其任意组合。
除非另外指明，“酶活性”是指酶水解活性。
“非酶分离木质素处理”是指任意高温/高压处理、电离辐射处理、强酸处理、强碱性试剂处理、螯合剂处理、重组DNA处理、或活体厌氧微生物培养处理，或不是基于酶水解处理的任意其他处理，其可引起或诱导木质纤维素材料的水解且对于以可发觉的量从木质纤维素材料的C6和/或C5糖中分离木质素而言是足够严苛的。
并入本申请并构成本申请一部分的附图阐释了本发明的方面并与说明书一起用于解释本发明的原理。
附图简述
图1阐明了根据本发明一实例从木质纤维素材料分离木质素和其他生物制品的方法的流程框图。
图2阐明了根据本发明一实例从木质纤维素材料(以棉籽壳说明)分离木质素和糖的方法的流程框图。
图3阐明了根据本发明一实例从木质纤维素材料分离木质素和糖的方法的工艺流程图。
图4显示了D-葡萄糖和D-甘露糖开链和环状形式的非限制性图解。
发明详述
本发明提供了伴随释放可回收糖和/或其它生物制品的从草本植物酶促纯化木质素的方法。本方法可为完全基于酶处理，不需任何严苛的木质纤维素材料的非酶预处理或共处理，该预处理或共处理可降低生物制品的品质和/或另外使生产复杂或增加生产开支。在本方法中，可通过物理减小原料颗粒的物理尺寸以增加其表面积来预处理木质纤维素原料和/或另外使得该材料更易进行随后的纤维素分子酶致水解处理。在本发明方法中，随后在经预处理(调整大小)的木质纤维素材料上进行的酶致水解中，纤维素分子可被分解以释放可发酵糖和其它更小分子，并从木质素中分离，从而使得与未经粉碎预处理所可能的情况相比，它们各自的回收为更高纯度的形式。例如，通过单独使用酶，作为本发明方法中的中间材料的经粉碎(调整大小)的木质纤维素材料中的纤维素链可被更轻易地分解为C6和/或C5糖分子并从木质素中分离。本方法中所使用的粉碎可以优选的方式进行，其不导致或引起木质纤维素原料的水解，且除了调整材料大小以外，使得原始组分(例如，木质素、纤维素)对于随后的分离处理而言是实质上或基本上完全完整的。本方法提供在经粉碎的原料上的酶致水解反应，其中在一或多个消化阶段中使用酶混合物(enzyme blend)。本发明可行的总体策略是除去(消化)尽可能多的存在于经粉碎的木质纤维素原料中的多糖(例如，纤维素、木聚糖、己糖和/或戊糖聚合物)并以基本上完整的形式获得分离的木质素，以及C6和/或C5糖(例如，可发酵C6和/或C5糖)。此外，在本发明方法中可以在相对温和条件下酶致水解木质纤维素材料(例如，约50℃、约5的pH、以及在接近大气压下，或其他温和条件)。这可允许伴随减少与更严苛水解条件相关的不希望的副产物(例如，产品污染物和反应抑制剂)的生成而有效地分解纤维素。此外，如通过本发明实施例中所述实验研究结果所示的，已发现即便不包含严苛的木质纤维素原料的非酶预处理(例如，强酸处理或采用相对温和的酸在高温高压下处理)，本发明方法也可实现木质纤维素材料的实质酶致水解以提供高度纯化的木质素、可发酵糖、或二者。
草本植物可为木质纤维素材料的来源，其可使用本发明方法处理。木质纤维素材料可为，例如木材料、草材料和/或源自这些材料的废弃产物，其包含木质素(例如至少1wt%，或至少3wt%，或至少5wt%，或至少10wt%，或至少15wt%，或至少25wt%的木质素，基于干固体)。木质纤维素材料可被分类为，例如农业废弃物和废物(例如棉籽壳、谷物外壳(grain hull)、甘蔗渣、玉米杆、玉米芯、稻草、柳枝稷(switchgrass)、树叶、茎秆、壳等)、林业产品(例如软木、硬木等)、木头碎片(例如锯屑、木片、树皮等)、造纸厂纸浆、以及废纸或回收纸(例如本色纸、新闻用纸)、以及其它木质纤维素材料或其任意组合。在木质纤维素材料中，碳水化合物聚合物(例如，纤维素和半纤维素)紧密与木质素结合，其中可发酵糖或其前体陷入木质素和半纤维素所形成的基质中。本发明方法可针对克服此木质素分离和纯化的障碍，并以经济方式由木质纤维素材料生产其它有用的生物制品，而不降解或污染想要的生物制品且无需严苛的木质纤维素材料非酶处理。
在本发明方法中，可以颗粒形式处理木质纤维素材料，且粒径可为重要的，因为其可直接影响可用于与用来处理该颗粒的酶相互作用的表面积。在本发明方法中，在酶致水解处理之前进行粒径减小(即，粉碎)以提供更高纯度产物。在不希望受限于理论的情况下，酶消化前的粉碎可通过增加该材料的总表面积以增加酶对于木质纤维素材料的可达性(accessibility)。这被认为使得酶水解活性更易于出现在木质纤维素材料的暴露表面上，其中可更易于该纤维素从木质素中分离。经释放的纤维素可被进一步酶促水解以将其分解为简单单糖或其他可发酵糖。此外，酶致水解可在经粉碎的木质纤维素颗粒上进行，例如，在温和酸性、有机酸缓冲水溶液中，在大气压下温和加热条件下，减少或避免对严苛化学品或能源密集型操作的需求。
关于一般机理，酶混合物可被用于本发明方法中的木质纤维素材料单一阶段或多阶段消化中。六碳(C6)和/或五碳(C5)糖从草本材料(例如，棉籽壳(cotton seed hulls，CSH))的生物聚合物基质释放。木质素留作未水解的固体部分中的残留生物聚合物。消化后停止搅拌，木质素在其本身内聚集并作为沉淀轻易地从溶液中析出，其可被进一步处理和/或作为最终产物被回收。当在未通过化学处理磺化的天然草本材料上进行水解时，如在本发明酶致水解方法中，所得的聚集木质素未以磺酸盐的形式被硫磺污染。经释放的C6和/或C5糖(例如，葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖等)溶解或混悬在水解溶液中并可从经消化混合物的液体部分回收，且当需要时可用于进一步使用。除去木质素后，通过引入选定的适当转换生物体(包括将在生物乙醇发酵工业中认可的那些)可将移除糖部分中的经回收C6和/或C5糖或部分例如直接转换成乙醇或其他生化基产物。木质素可被用作燃料源、作为原料或添加剂和/或用于其它应用。
参考图1，本发明的方法10可包括，例如，粉碎步骤1，其中将木质纤维素材料(lignocellulosic material，LCM)磨碎为具有增加表面积的更小粒径。可将木质纤维素材料粉碎至粒径，例如小于约10mm，或小于约7mm，或小于约5mm，或小于约3mm，或小于约2mm，或小于约1mm，或小于约0.5mm，或粉碎至粒径约0.001mm至约10mm，或约0.01mm至约7mm，或约0.1mm至约5mm，或约1mm至约3mm，或这些范围值的任意其他组合。粒径的测定可通过，例如网筛系列或使用对于非常细微颗粒具有测微计尺的显微镜。所述粒径可为绝对值或均值。至少75%(以体积计)，或至少90%，或至少95%，或至少98%，或至少99%，或例如100%的经粉碎的颗粒可落入任意所述范围内。最佳范围可依据待处理木质纤维素材料的类型而不同。木质纤维素材料的优选尺寸应当未减少至木质素或纤维素组分开始损坏的尺寸。在不希望受限于理论的情况下，认为在随后酶消化中在经粉碎的木质纤维素材料上可实现的酶促水解活性的程度和/或速率可随着逐步增加的尺寸减小(progressively increasing size reduction)(增加的表面积)而逐步增加，直至达到木质纤维素材料中目标组分或其前体发生损坏的临界值。
然后，如图1中所示，可酶消化经粉碎的木质纤维素材料并且所得生物制品根据例如三种不同处理途径A、B或C而分馏。所有三种处理途径包括通常认定为处理步骤(一个或多个)2的酶消化方案。对于三种不同情形，消化通常包括在不存在任何在先木质纤维素材料的非酶分离木质素处理的情况下，包含经粉碎的木质纤维素材料、至少一种酶混合物以及水溶液的混合物接触，以酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖。如图1所示，消化方案2可在单一阶段或多阶段中进行。
在处理途径A的步骤2a中，采用至少一种对于纤维素具有纤维素水解活性的酶、任选至少一种对于半纤维素具有水解活性的酶以及至少一种对于葡聚糖具有水解活性的其它酶同时酶消化所述混合物。然后，在步骤3a中，从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有糖的水溶液以提供含木质素产物31以及含糖水流32。各木质素和糖产物流可分别被进一步处理。例如，木质素产物在进一步处理及使用或其它处理前可被干燥。例如，可在生物发酵设备中处理糖产物流以制备其它产物(例如乙醇)。
在处理途径B的步骤2b中，可在多阶段2b-1和2b-2中连续酶消化该混合物。包含至少一种对于纤维素具有纤维素水解活性的酶以及任选至少一种对于半纤维素具有水解活性的酶的第一酶混合物可被用于第一消化2b-1中。对于葡聚糖具有水解活性的第二酶混合物可被用于第二消化2b-2中。在各消化阶段2b-1和2b-2之后进行液/固分离3b-1和3b-2以分别回收含糖水流33和残留糖/洗涤水流34，其如同所示也可被进一步处理。从第二液/固分离步骤3b-2产生的含木质素产物35，其如同所示也可被进一步处理。
在处理途径C的步骤2c中，在第一消化中采用至少一种具有纤维素分解活性的酶和至少一种具有半纤维素分解活性的酶在单一阶段中酶消化该混合物。在单一消化阶段2c之后进行液/固分离3c以回收含糖和葡聚糖水流36，并隔离含木质素产物37，其处理流如同所示也可被进一步处理。因为省略第二消化，存在于此处理途径的水流36中的诸如果胶的非水解葡聚糖生物聚合物，发酵酵母对其可能不起作用。
在步骤2a、2b-1或2c中，第一酶混合物可包含如本发明也适用的更细节内容中描述的酶的组合。取决于待处理的木质纤维素材料的类型，半纤维素的降解可简化剩余处理并消除对于潜在的半纤维素和纤维素衍生糖复杂下游分离的可能需求。因此，第一酶混合物可联合不同的酶，其中至少一种对于纤维素具有水解活性且至少另一种对半纤维素具有水解活性。此外，在2a、2b-1和2c这些步骤中使用的第一酶混合物可包含如下的酶例如，可含有至少一种内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶或二者，与纤维二糖酶、或β-或α-葡萄糖苷酶或其组合的结合。在不希望受限于理论的情况下，据信纤维二糖酶(或β-或α-葡萄糖苷酶)的存在，例如，可抑制反馈(feedback)。反馈是指如下现象，其中内切葡聚糖酶(或外切葡聚糖酶)，例如倾向于从木质纤维素基质裂解C2-C5单体，该单体可积聚至其可抑制酶致水解反应进行的水平。纤维二糖酶、或β-或α-葡萄糖苷酶，例如，可降解C2-C5单体(例如，C2-C5短链糖)，且因而抑制或阻止与内切葡聚糖酶和/或外切葡聚糖酶有关的酶促反应的相关反馈。作为一个选项，在这方面可使用纤维二糖酶以抑制反馈。在处理途径B中第一消化步骤2b-1之后，可从木质素释放大量的C6和C5糖(例如，至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少99%(重量百分数)，基于木质纤维素原料中的原始理论存在量)。
与处理途径A步骤2a中第一消化有效联合的在处理途径B中的第二消化阶段2b-2可使用第二酶混合物，例如葡聚糖酶和果胶酶的组合等，或用于此酶混合物的本发明所述的其它酶，该酶混合物进行木质素的二次清除。此二次清除可涉及破坏葡聚糖(例如，果胶)的二级部分(secondary strand)，并将它们作为释放糖(例如，半乳糖，甘露糖)从木质素中移除。
虽然未作要求，但处理途径A的同时消化的表现可与处理途径B的多阶段消化表现相当，例如在木质素纯度以及所达到的C5和C6糖释放量方面。例如，通过处理途径A和B获得的木质素的纯度彼此可在，例如约±25%之内，或约±20%之内，或约±15%之内，或约±10%之内，或约±5%之内，或约±2%之内。通过处理途径A和B获得的木质素和/或C6和C5糖的收率可落入，例如任意相同耐受值(tolerance value)内。A和B两种处理途径结果中的差异可为通过第二酶混合物从木质纤维素基质释放的糖和任意更小分子合并入通过第一酶混合物释放的具有糖和其它生物制品的途径A产物流，而在处理途径B中这些生物制品可在各消化阶段及相关的液/固分离步骤之后从木质素固体回收的单独产物流中被回收。在处理途径C中不包括采用第二酶混合物二次清除木质素。处理途径C的木质素产品依旧可提供高纯度木质素产品，虽然如果应用于相同的材料(取决于经处理的特定木质纤维素材料)，其可倾向于小于处理途径A和B可实现的纯度。重要的是，在处理途径A、B和C中，所使用的酶优选对于木质素是非酶活性的且优选当释放C6和C5糖时保留木质素的完整。虽然未绝对排除，但优选不使用对于木质素具有酶作用的酶(诸如漆酶)。
本发明方法可分批或连续进行。在任一策略中，且不考虑诸如本发明所述的单一或多阶段酶消化顺序是否用于分离木质纤维素材料组分，在至少起始酶消化阶段之前将木质纤维素材料经粉碎至具有增加表面积的更小粒径。优选地，在应用起始或单一酶消化阶段之前原始木质纤维素原料和经粉碎的木质纤维素材料均未接受任何非酶分离木质素处理。若使用多阶段，则优选在各连续消化阶段之前将木质纤维素材料粉碎至逐渐更小的尺寸并具有增加的表面积。另外，在本发明方法中，如所述，第一和第二酶混合物可在单一消化阶段同时使用，或在分开消化阶段中单独使用。如所述，第一酶混合物优选可包含，例如至少对于纤维素具有纤维素水解活性的酶，以及任选至少一种至少对于半纤维素具有水解活性的酶，或二者。第二酶混合物优选可包含，例如至少对于葡聚糖聚合物具有水解活性的酶，以提供诸如含木质素固体颗粒的二次清除或“抛光(polishing)”，以除去残留糖或其它非木质素材料。
第一酶混合物可包含，例如，选自以下酶组1)至5)中的两组或多组中的至少一种酶：
1)内切葡聚糖酶(endoglucanase)(1,4-β-D葡聚糖水解酶)、羧甲基纤维素酶(carboxymethylcellulase)(CMC酶)，其例如，可沿着生物聚合物链体提供攻击，并可生产纤维素链的随机剪刀(scisson)，获得葡萄糖和纤维寡糖(cell-oligosaccharides)；
2)外切葡聚糖酶(exoglucanase)(1,4-β-D葡聚糖纤维二糖水解酶)、微晶纤维素酶(avicelase)(C1)，其可在具有纤维二糖作为一级结构的纤维素酶的非还原末端上提供外部(末端)攻击；
3)纤维二糖酶(cellobiase)、β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)、α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase)，其如所述可抑制或阻止与内切葡聚糖酶和/或外切葡聚糖酶有关的酶促反应的相关反馈，并可将纤维二糖水解为葡萄糖；
4)内1,4-β-木聚糖酶(endo1,4-beta-xylanase)、内-(1,4)-β木聚糖水解酶(endo-(1,4)-beta xylanohydrolase)，其中木聚糖酶例如可分解半纤维素；
5)β-1,3-木聚糖酶(beta-1,3-xylanase)、1,3-β-D-木糖苷酶(1,3-beta-D-xylosidase)和外-1,3-β-木糖苷酶(exo-1,3-beta-xylosidase)。
在第一酶混合物中可使用选自组1)至5)间多组的酶的任意组合。这些组合可包括来自组1)至5)的至少两组中的至少一种酶，或来自组1)至5)的至少三组中的至少一种酶，或来自组1)至5)的至少四组中的至少一种酶，或来自组1)至5)的所有五组中的至少一种酶。如所述，一优选的混合物是组1)和/或2)的酶与组3)的酶。另一组合可为组1)、2)、3)的酶，以及组4)和/或5)的至少一种酶或二者。
第二酶混合物可包含，例如来自以下酶组1a)至20a)中的两组或多组中的至少一种酶：
1a)内-1,3(4)-β-葡聚糖酶(endo-1,3(4)-beta-glucanase)；
2a)昆布糖酶(laminarinase)(内-1,3-β-葡聚糖酶)；
3a)外-1,2-1,6-α-甘露糖苷酶(exo-1,2-1,6-alpha-mannosidase)；
4a)β-D-吡喃木糖基-(1,4)-β-D-吡喃木糖酶
(beta-D-xylopyranosyl-(1,4)-beta-D-xylopyranose)；
5a)α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶(alpha-N-arabinofuranosidase)；
6a)阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)；
7a)内-1,5-α-阿拉伯聚糖酶(endo-1,5-alpha-arabinanase)；
8a)果胶酶(pectinase)；
9a)多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)；
10a)果胶酯酶(pectin esterase)；
11a)天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease)；
12a)金属蛋白酶(metallo protease)；
13a)内-(1,4)-甘露聚糖酶(endo-(1,4)-mannanase)；
14a)植酸酶(phytase)；
15a)α-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖醛酸酶(alpha-glucuronidase andbeta-glucuronidase)；
16a)hexenuronidase；
17a)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)和酸性磷酸酶(acid phosphatase)；
18a)α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase)和β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)；
19a)β-甘露糖苷酶(beta-mannosidase)；
20a)α-岩藻糖苷酶(alpha-fucosidase)。
在第二酶混合物中可使用酶组1a)至20a)这些组的任意组合。这些组合可包括，例如来自组1a)至20a)的至少两组中的至少一种酶，或来自组1a)至20a)的至少三组中的至少一种酶，或来自组1a)至20a)的至少四组中的至少一种酶，或来自组1a)至20a)的至少五组中的至少一种酶，且类似地直至来自组1a)至20a)的各组中的至少一种酶的组合。在一个方法中，例如，来自组1a)、2a)和8a)的至少一种酶包含于第二酶混合物中。在另一方法中，来自组1a)至20a)中大多数的至少一种酶用于第二酶混合物中。在另一方法中，来自组1a)至20a)的2组，或3组，或4组，或5组，或6组，或7组，或8组，或9组，或10组，或11组，或12组，或13组，或14组，或15组，或16组，或17组，或18组，或19组，或所有20组中的至少一种酶用于第二酶混合物中。
第一酶混合物的添加总量可为，例如，基于木质纤维素材料(以固体重量计)约0.001%至约3%(以总酶重量计)，或约0.01%至约1%(以总酶重量计)，或约0.015%至约0.8%(以总酶重量计)，或约0.05%至约0.6%(以总酶重量计)，或约0.1%重量至约1%(以总酶重量计)，或约0.2至约0.8%(以总酶重量计)，或约0.25%至约0.75%(以总酶重量计)，或约0.4%至约0.6%(以总酶重量计)，或约0.5%(以总酶重量计)，也可使用其它量。使用来自不同组1)至5)的酶的比例可相同或不同。来自第一酶混合物的酶的比例可为，例如，10-90wt%的组1)和2)总酶，10-90wt%的组3)总酶，以及0-90wt%的组4)和5)总酶；或10-90wt%的组1)和2)总酶，10-90wt%的组3)总酶，以及10-90wt%的组4)和5)总酶；或20-40wt%的组1)和2)总酶，20-40wt%的组3)总酶，以及20-40wt%的组4)和5)总酶；或其它比例。所使用的第二酶混合物的总量可为，例如类似于对于第一酶混合物所述的，或其它有效量。在第二酶混合物中的酶的比例可为，例如，至少0.5wt%，或0.5%至50%，或约2%至约10%的源自组1a)至20a)大多数中的至少一种酶，或这些组的其它所述量的酶，基于待处理的木质纤维素材料或其固体部分衍生物的固体重量。本发明所述的任意酶的任意量可基于活性的酶。
酶混合物可以溶液或使用基质以干的形式引入。可预混合各混合物的各个酶(例如，在通常溶液中)，或各自单独引入，或以其它较少被包含的组合引入至消化器以原位形成酶混合物。也可以干的形式将酶引入消化器，其中该酶伴随基质使用，例如滑石、高岭土、树枝石(dendrite)等。用于干酶的基质可提高额外的处理需求(例如，回收归因于基质的固体)，且如果使用的话，需要进行监控以确保该基质不干扰消化。
参考图2，本发明可涉及一更具体的应用，例如涉及伴随释放可发酵糖从诸如棉籽壳的草本植物中酶纯化木质素的方法200。在步骤201中，棉籽壳(CSH)被磨碎至尺寸小于2mm。在步骤202中，经磨碎棉籽壳接受第一酶消化。在步骤203中，可沉降较沉固体并倒出该沉降固体上的水相中的糖。在步骤204中，重悬该沉降固体、洗涤并回收用于进一步的处理。在步骤205中，干燥沉淀物。在步骤206中，将经干燥沉淀物磨碎至尺寸小于50μm。在步骤207中，经磨碎的沉淀物接受第二酶消化。在步骤208中，可沉降较沉固体并倒出该沉降固体上的水相中的残留糖。在步骤209中，重悬该沉降固体、洗涤并回收用于进一步的处理。在步骤210中，干燥沉淀物。在步骤211中，回收具有一些杂质的木质素。考虑到本申请的教导可轻易执行可能的调整或修饰，该工艺流程也可应用于其它木质纤维素材料。
参考图3，本发明方法30可包括，例如，向第一粉碎机300进料木质纤维素原料301，例如棉籽壳或木质纤维素材料。该原料可为已碎裂、斩碎、切碎和/或磨碎至一定程度的植物纤维材料。可在第一粉碎机300处将木质纤维素原料磨碎至具有增加表面积的更小粒径，足以以更可行的方式且无需任何其它颗粒预处理以在该经磨碎颗粒上进行酶致水解。在此方面所提供的经粉碎原料的粒径，例如，可随木质纤维素原料材料的类型而不同。棉籽壳的经粉碎粒径可为，例如小于约5mm，或小于约3mm，或小于约2mm，或小于约1.5mm，或小于约1mm，或小于约1mm，或小于0.5mm，或约0.001至约5mm，或约0.01mm至约3mm，或约0.1mm至约2.5mm，或约0.2mm至约2mm，或约0.5mm至约1.5mm，或其它值。棉籽壳的粒径可以绝对或平均值表示。例如，至少75%(以体积计)，或至少90%，或至少95%，或至少98%，或至少99%，或100%的经粉碎颗粒可落入任意所述范围内。这些尺寸也可应用于其它木质纤维素材料，或者可使用本申请的教导主要以经验确定用于随后酶处理的适当粉碎尺寸。粉碎装置可为，例如，干磨机(例如，锤式粉碎机、旋转锤磨机等)、湿磨机、或用于减少原料粒径的其它已知装置和布置。可任选筛选经粉碎的原料，例如，采用网筛筛系列以选择尺寸分数或另外地在第一酶消化器中进一步处理颗粒前另外控制该粒径分布。该消化器可为具有适当容量以保持所有混合组分的任意容器，且其可配有温和的温度控制工具(means)(例如，传统的容器加热工具)。该消化器还可优选配有搅拌装置，其可以为传统的搅拌装置(例如，叶轮、磁力搅拌等)，以及可配有适用的输入口和排放口的消化器。如同可被理解的，更适宜的保持容器、搅拌装置、加热工具等的类型可取决于处理的规模。例如本发明方法的实施可以以任何规模，包括工业、中试、实验室或其它规模。
在第一消化器310中准备包含经粉碎的木质纤维素材料、第一酶混合物311和包含酸性缓冲水溶液302的第一水溶液的混合物。如所述，可选择第一酶混合物，例如以至少对于纤维素、任选半纤维素或二者具有纤维素分解活性。如所述，当希望木质素产物纯度时，可改变木质素的酶(诸如漆酶)是较不优选的。酶和缓冲液的引入可在消化器处或者在其引入消化器中之前与经粉碎的木质纤维素原料相合并。第一水溶液可包含，例如诸如柠檬酸缓冲液的酸性有机缓冲水溶液。酸性缓冲溶液可具有诸如约4.5至约6.9，或约4.7至约5.5，或约4.8至约5.2的pH。该酸性缓冲溶液的酸性不足以引起木质纤维素材料水解或损害酶致水解机制。搅拌原料、酶、缓冲液和溶液的混合物以在消化期间提供并维持更均质的组合。例如可在温和加热下搅拌该混合物充足的持续时间以用于从包含木质素的木质纤维素材料的第一不溶性部分释放C6和/或C5糖。可在例如至少约30℃的温度下消化该混合物至少约1小时。消化温度需不超过例如约60℃且实际可使用更低的温度。消化也可在接近大气压力下进行，无需增压消化器内容物以在木质纤维素颗粒上实现期望的酶活性。可在至少约35℃，或至少约40℃或至少约45℃，或至少约50℃，或约30℃至约50℃，或其它温度下消化混合物例如，至少约3小时，或至少约6小时，或至少约9小时，或至少约12小时，或至少约15小时或至少约18小时，或至少约21小时，或至少24小时。从第一不溶性部分倒出一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的第一水溶液312。该C6和/或C5糖可包含溶解的C6和/或C5糖、混悬的C6和/或C5糖颗粒中的至少一种或二者。通过倒出或虹吸抽出经酶消化混合物的水相可将容器中的沉淀的含木质素材料与包含该C6和/或C5糖的水相分离。可使用过滤(例如，筛滤)、离心以及从水相分离固体的其它已知手段。倒出或虹吸，或回收液相而同时保留沉降固相相对不受干扰的其它分离方法，是分离经消化的混合物的含木质素固体部分的优选分离方法。其它方法(例如离心)可导致固体部分中增加的非木质素杂质。可将经倒出的糖转移至发酵处理系统315。可用于发酵这些糖的技术是已知的，其通常可包括如下步骤：微生物发酵该糖溶液，蒸馏以制造大致95%纯乙醇，以及通过分子筛脱水以带来超过99.5%的乙醇浓度，或其它已知发酵方法。完成从糖生成乙醇的发酵可通过例如，例如描述于美国专利第2,802,774号中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，以及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。其它有用的微生物是描述于例如美国专利第4,094,742号中的乙醇制造芽孢杆菌，它们通过参照整体并入本发明。
可将第一消化器中的不溶性部分重悬并洗涤至少一次。初次洗涤可使用温和酸，且任意随后洗涤液可为单独的水。可在进行消化的相同容器中洗涤该沉降的固体，或者替代地可使用单独容器洗涤该沉降的固体。可通过任何常规固/液分离工艺(例如倒出、虹吸、离心、筛滤等)收回或移除该洗涤液313。可在烘干机320中干燥经洗涤的沉淀物314。可在粉碎机330处将经干燥的不溶性部分粉碎至具有第二增加表面积的更小粒径。此粉碎机可与之前单元相同或不同。在粉碎机330处可将经干燥的颗粒粉碎至相比于提供给之前消化器的甚至更小尺寸以获得可用于随后消化中的酶作用的额外的表面积。在第二粉碎机单元330处产生的棉籽壳的粉碎粒径可为，例如，小于约50μm，或小于约40μm，或小于约30μm，或小于约20μm，或小于10μm，或约1μm至约50μm，或约5μm至约40μm，或约7.5μm至约30μm，或其他值。这些粒径可代表绝对或平均值。例如，至少75%(以体积计)，或至少90%，或至少95%，或至少98%，或至少99%，或100%的经粉碎的棉籽壳颗粒可落入任意所述范围内。这些粒径也可应用于其它木质纤维素材料，或者可使用本申请的教导主要以经验确定用于随后酶处理的适当的粉碎尺寸。
将包含经粉碎的第一不溶性部分、第二酶混合物341和包含可类似于在第一消化器中所使用的酸性缓冲水溶液331的第二水溶液的混合物进料至第二消化器340。第二酶混合物可以溶液或干的形式引入。如所述，例如，可选择第二酶混合物以至少对于葡聚糖具有纤维素水解活性。可在温和加热下搅拌该第二混合物充足的持续时间用于从包含木质素的第二不溶性部分释放残留的C6和/或C5糖。所述例如用于第一消化器310的温度和压力条件可被用于第二消化器340中。如第一消化器，消化温度需不超过例如约60℃且实际可使用更低的温度和大气压力。可从第二消化器倒出包含残留糖的水相342，并任选将其传输至发酵处理系统315或其它处理系统。可重悬并洗涤包含木质素的该第二不溶性部分。可将残留沉淀物344进料至烘干机350并收集木质素产物351。虽然阐释了两阶段粉碎和消化处理，但将理解可使用单一阶段处理，或者还可使用三阶段处理、或四阶段处理或甚至更多阶段处理。
图3中阐明的所有处理容器和装置可配有适当的用于引入所有可应用进料的入口以及用于除去如所述材料的排放出口，例如使用用于此类目的的常规装置和设备。可从处理容器至容器重力排泄或泵送流体材料。没有必要限制可使用此安排处理的木质纤维素材料，且其包括本发明前述材料。本领域技术人员将认识到其它含木质纤维素原料存在并可通过实践本发明方法而分开。此外，虽然未在图3中示出，可在糖水流316、或水流345，或它们的合并流317上实施酶回收。可通过适当的分离方法，例如使用反渗透、微滤或其它方法从这些水流中分离酶内容物，并当可应用时回收再用于上述系统中的消化器中。在本发明方法中可仅使用新鲜酶，或可仅使用经回收的酶，或在本发明方法中可以任意比例使用新鲜酶和经回收的酶的组合。
通过实践本发明方法，木质纤维素材料可被分成至少为木质素以及C6和/或C5糖(例如，可发酵糖)。其它材料也可存在于该方法所述一个或多个产物流中。通过本发明方法获得的产物收率高。为了本发明目的，″收率″是经回收特定产物的质量除以基于原始木质纤维素材料中存在量的理论最大量(计算酶致水解反应的水加成(accounting for water addition for the enzymatichydrolysis reaction))。木质素的收率可为，例如，至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约80%，或至少约90%，或至少约91%，或至少约92%，或至少约93%，或至少约94%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%，或至少约99%，或更高。C6和C5糖的收率可为，例如，至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%，或至少约99%，或更高。
所获木质素可为不含硫的高品质、相对纯净、低分子量木质素。本发明方法的木质素产物具有许多可能的应用。木质素可被燃烧用于能源生产。木质素的一些其它潜在应用包括碳纤维生产、沥青生产、以及作为生物聚合物中的组分。这些用途包括，例如石油钻井添加剂、混凝土添加剂、染料分散剂、农业化学品、动物饲料、工业粘合剂、造纸工业专用聚合物、贵金属回收助剂、木材防腐、无硫木质素产品、汽车制动器、木板产品、生物分散剂、聚氨酯泡沫体、环氧树脂、印刷电路板、乳化剂、螯合剂、水处理制剂、墙板增强剂、粘附剂、香草醛和木糖醇原料，以及作为香豆醇(paracoumarylalcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)的来源。
可将本发明方法的C6和C5糖产物发酵为例如乙醇、正丁醇、丙酮、有机酸、面包酵母、或所选发酵用微生物的任意其它细胞代谢产物。可由糖制造的其它商业产品包括，例如动物饲料添加剂、木糖醇甜味剂(xylitolsweetener)、糠醛及其它有用产品。
本发明方法可避免实践使用浓酸或碱以释放木质纤维素材料组分的一些在先方法。本发明方法的酶处理不依赖于这些用于木质素组分释放的严苛化学处理并可消除产生与已被用于造纸的常规纸浆处理相关的木素磺化盐。本发明的酶处理相比于使用高压蒸汽的常规热化学处理是显著更小能源密集的，该热化学处理还可减损纯净木质素组分的价值。此外，用于本发明方法中的酶处理不同于诸如EDTA的一些螯合剂的使用，不会影响或至少不会显著影响下游处理。因此，使用本发明方法减少或完全避免了辅助用于木质素的最终纯化步骤的后处理子系统的需求。不同于辐射处理，用于本发明方法中的酶方法不改变该木质素组分，而是逐步释放完整的它们，且因为不需要辐射装置而具有减少的开支。不纯顽固材料被消化。本发明方法中可使用天然酶用于组分释放，不需要重组多肽以促进任何木质素组分的最终纯化。当不存在有机体而仅使用酶溶液时，活体厌氧活有机体不是必需的。不需要使用非常手段以减少原料溶液顽固性杂质，因为通过协助转换经释放的天然木质素组分和木质素衍生物的温和酶致水解自然移除了这些杂质。此外，本发明方法是得其本身回收酶组分，这可能降低有价值离散材料的回收成本。从运转成本和社会的角度，本发明方法可为环境友好以及可持续的。
本发明包括任意次序和/或任意组合的下列方面/实施方式/特征：
1.本发明涉及分离木质纤维素材料组分的方法，包括：
粉碎木质纤维素材料以形成经粉碎的木质纤维素材料；
在不存在任何在先从该木质纤维素材料的非酶分离木质素(non-enzymatic lignin separation)的情况下，酶消化包含经粉碎的木质纤维素材料、至少一种酶混合物以及水溶液的混合物，以酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的水溶液。
2.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该水溶液包含酸性有机缓冲水溶液。
3.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中在该水溶液中的至少一种C6和/或C5糖包括溶解的C6和/或C5糖、或混悬的C6和/或C5糖颗粒、或其任意组合。
4.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中
在水溶液中采用酶混合物酶消化经粉碎的木质纤维素材料包括在约30℃至约60℃的温度下搅拌混合物至少约1小时，以及
该分离包括停止搅拌并从包含沉降固体的不溶性部分倒出(decanting)至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的水溶液。
5.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该木质纤维素材料是棉籽壳、谷物外壳、甘蔗渣、玉米杆、玉米芯、稻草、柳枝稷、树叶、茎秆、植物壳、软木块、硬木块、锯屑、造纸厂纸浆、废纸、回收纸、或其任意组合。
6.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该木质纤维素材料包括棉籽壳。
7.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该至少一种酶混合物包含含至少一种酶的第一酶混合物，该至少一种酶来自组1)至5)中的至少两组：
1)内切葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶；
2)外切葡聚糖酶、微晶纤维素酶；
3)纤维二糖酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶；
4)内1,4-β-木聚糖酶、内-(1,4)-β木聚糖水解酶；
5)β-1,3-木聚糖酶、1,3-β-D-木糖苷酶和外-1,3-β-木糖苷酶。
8.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中第一酶混合物包含：
来自组1)和/或2)的至少一种酶，
组3)的至少一种酶，以及
组4)和/或5)的至少一种酶。
9.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该至少一种酶混合物还包含含至少一种酶的第二酶混合物，该至少一种酶来自组1a)至20a)中的至少两组：
1a)内-1,3(4)-β-葡聚糖酶；
2a)昆布糖酶(内-1,3-β-葡聚糖酶)；
3a)外-1,2-1,6-α-甘露糖苷酶；
4a)β-D-吡喃木糖基-(1,4)-β-D-吡喃木糖酶；
5a)α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶；
6a)阿魏酸酯酶；
7a)内-1,5-α-阿拉伯聚糖酶；
8a)果胶酶；
9a)多聚半乳糖醛酸酶；
10a)果胶酯酶；
11a)天冬氨酸蛋白酶；
12a)金属蛋白酶；
13a)内-(1,4)-甘露聚糖酶；
14a)植酸酶；
15a)α-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖醛酸酶；
16a)hexenuronidase；
17a)碱性磷酸酶和酸性磷酸酶；
18a)α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶；
19a)β-甘露糖苷酶；
20a)α-岩藻糖苷酶。
10.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中木质素的收率为至少约90%。
11.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中C6和/或C5糖的收率为至少约90%。
12.分离木质纤维素材料组分的方法，包括：
a)将木质纤维素材料粉碎为经粉碎的木质纤维素材料；
b)在不存在任何在先木质纤维素材料的非酶分离木质素处理的情况下，酶消化包含经粉碎的木质纤维素材料、第一酶混合物以及第一水溶液的第一混合物，以第一酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的第一不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；
c)从该第一不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的第一水溶液；
d)将该第一不溶性部分粉碎为经粉碎的第一不溶性部分；
e)酶消化包含经粉碎的第一不溶性部分、第二酶混合物以及第二水溶液的第二混合物，以第二酶致水解从包含木质素的第二不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
f)从含有该至少一种C6和/或C5糖的第二水溶液分离包含木质素的第二不溶性部分。
13.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中木质纤维素材料的粉碎包括碾磨该木质纤维素材料至小于约2mm的尺寸。
14.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中第一不溶性部分的粉碎包括碾磨或研磨该第一不溶性部分至小于约50微米的尺寸。
15.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，还包括：在分离后，在粉碎第一不溶性部分之前洗涤该第一不溶性部分至少一次并干燥经洗涤的第一不溶性部分。
16.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该第一水溶液包含酸性有机缓冲水溶液。
17.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中在该第一水溶液中的至少一种C6和/或C5糖包括溶解的C6和/或C5糖、或混悬的C6和/或C5糖颗粒、或其任意组合。
18.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中
在第一水溶液中采用第一酶混合物酶消化经粉碎的木质纤维素材料包括在约30℃至约60℃的温度下搅拌第一混合物至少约1小时，以及
该分离包括停止搅拌并从包含沉降固体的第一不溶性部分倒出至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的第一水溶液。
19.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该木质纤维素材料是棉籽壳、谷物外壳、甘蔗渣、玉米杆、玉米芯、稻草、柳枝稷、树叶、茎秆、植物壳、软木块、硬木块、锯屑、造纸厂纸浆、废纸、回收纸、或其任意组合。
20.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该木质纤维素材料包括棉籽壳。
21.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该第一酶混合物包含至少一种酶，该至少一种酶来自组1)至5)中的至少两组：
1)内切葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶；
2)外切葡聚糖酶、微晶纤维素酶；
3)纤维二糖酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶；
4)内1,4-β-木聚糖酶、内-(1,4)-β木聚糖水解酶；
5)β-1,3-木聚糖酶、1,3-β-D-木糖苷酶和外-1,3-β-木糖苷酶。
22.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中该第二酶混合物包含至少一种酶，该至少一种酶来自组1a)至20a)中的至少两组：
1a)内-1,3(4)-β-葡聚糖酶；
2a)昆布糖酶(内-1,3-β-葡聚糖酶)；
3a)外-1,2-1,6-α-甘露糖苷酶；
4a)β-D-吡喃木糖基-(1,4)-β-D-吡喃木糖酶；
5a)α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶；
6a)阿魏酸酯酶；
7a)内-1,5-α-阿拉伯聚糖酶；
8a)果胶酶；
9a)多聚半乳糖醛酸酶；
10a)果胶酯酶；
11a)天冬氨酸蛋白酶；
12a)金属蛋白酶；
13a)内-(1,4)-甘露聚糖酶；
14a)植酸酶；
15a)α-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖醛酸酶；
16a)hexenuronidase；
17a)碱性磷酸酶和酸性磷酸酶；
18a)α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶；
19a)β-甘露糖苷酶；
20a)α-岩藻糖苷酶。
23.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中木质素的收率为至少约90%。
24.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，其中至少一种C6和/或C5糖的收率为至少约50%，基于木质纤维素材料中存在的原始量。
25.任何前述或下列实施方式/特征/方面的方法，还包括生物发酵处理该至少一种C6和/或C5糖。
26.用于分离木质纤维素材料组分的系统，包含：
用于粉碎木质纤维素材料的至少一个粉碎机；
至少一个包含配有内部搅拌器的容器的消化器，其中该容器可操作用于在不存在任何在先木质纤维素材料的非酶分离木质素处理的情况下保持经粉碎的木质纤维素材料、至少一种酶混合物以及水溶液的混合物，并可操作用于伴随搅拌酶消化该混合物以酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
用于从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种糖的水溶液的分离器。
27.任何前述或下列实施方式/特征/方面的系统，还包含：
用于干燥包含木质素的不溶性部分的烘干机；
用于粉碎第一不溶性材料的粉碎机；
包含配有内部搅拌器的容器的消化器，其中该容器可操作用于保持经粉碎的第一不溶性材料、至少一种酶以及水溶液的混合物，以及搅拌使该混合物接触以酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
用于从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种糖的水溶液的分离器。
28.任何前述或下列实施方式/特征/方面的系统，还包含适于从消化器接收经释放的C6和/或C5糖并将该C6和/或C5糖发酵为乙醇的生物发酵处理系统。
本发明可包括上述和/或下列如在句子和/或段落中陈述的这些各种特征或实施方式的任意组合。本发明所公开特征的任意组合被认为是本发明的一部分且对于可组合特征无意进行限制。
下列实施例意图示例而非限制本发明。在下列实施例中，所有部分的比例为重量比，除非另外指明。
实施例
实施例1
进行实验以评价酶在作为木质纤维素材料的棉籽壳上的木质素纯化和糖分离的效果。
实验步骤
纯化方法
棉籽壳获自Buckeye Technologies(Memphis，Tennessee)。将该棉籽壳干磨至小于2mm的尺寸。通过锤磨或相当的碾磨进行碾磨。通过目筛测定经磨的外壳的尺寸。将约220克的经磨的棉籽壳制为50mM pH 5.0柠檬酸盐缓冲液中的10%固体溶液。该棉籽壳的10%固体溶液包含约2200ml溶液中的220克棉籽壳。
该50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)通过下列方式制备。pH 5.0柠檬酸盐缓冲储备液的制备通过在900克水中混合210克柠檬酸一水合物，然后伴随搅拌逐渐加入100ml 50%NaOH，其获得1升pH 5.0柠檬酸盐缓冲储备液。该pH 5.0，50mM(0.05M)柠檬酸盐缓冲液的制备是使用缓冲储备液，通过稀释50-55ml的pH 5.0柠檬酸盐缓冲储备溶液至1升水中以获得50mM柠檬酸盐缓冲液，用作用于棉籽壳固体的缓冲溶液。使用pH计监控柠檬酸盐缓冲液的pH，通过按需滴加50%NaOH或浓HCl，按照所需对其进行调节以提供并维持5.0的pH。
将10%棉籽壳溶液的温度升高至约50℃并维持在该温度。在作为消化器的4升发酵烧杯中采用0.5%第一酶溶液修正该经加热溶液。该第一酶溶液包含酶混合物，该酶混合物含有：1/3重量份的CellicTM CTEC，其为包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶的酶制剂，获自NovozymesNorth America(Franklinton，North Carolina)，1/3重量份的获自Sigma-Aldrich(St.Louis，Missouri)的葡萄糖苷酶，以及1/3重量份的获自Novozymes North America的H-TEC木聚糖酶。使用磁力搅拌器在约200rpm下搅拌所得混合物24小时。24小时后，停止搅拌并沉降固体。从消化器倒出沉降固体上的水相。该倒出的水相包含糖和混悬的细微糖颗粒。仅更大更重的固体作为沉降沉淀物保留在消化器中。通过加水在消化器中重悬该沉降固体并用HCl酸化至pH2.5，然后搅拌以提供温和酸洗步骤。洗涤该固体后停止搅拌并可再次沉降固体。从消化器倒出洗涤液水相而仅留下固体。将固体仅重悬于水中(无需酸化)，搅拌，并在停止搅拌后再收集固体。可重复此洗涤步骤直至水相澄清或几乎澄清。然后在约50℃的温度下在干烤箱中干燥固体过夜。将经干燥的沉淀物(固体)磨碎至尺寸小于50微米。使用研钵和研杵将固体研磨至非常细微粉末。使用具有测微计尺的显微镜测量经研固体的尺寸。中断固体研磨周期以检测研磨固体的尺寸直至获得所述粒径并继而停止研磨。此粉末不是特别吸湿的。如同上述，将磨碎的粉末再次加入pH 5.0，0.05mM柠檬酸盐缓冲液中至10%的固体溶液。采用磁力搅拌器在约200rpm下搅拌该溶液并采用第二酶溶液修正。该第二酶溶液是溶液中的酶混合物，其包含1/3重量份的获自Specialty Enzymes and Biotechnologies(Chino，California)的CELLUSUB，以及2/3重量份的青霉发酵物(penicillin sp.ferment)，其为现场制作的制剂，包含所述第二酶混合物的所有或基本上所有的酶。在约45℃的温度下消化所得混合物6小时。停止搅拌且如同上，沉降固体(沉淀物)。倒出沉降固体上的水相，尽可能地移除混悬于水相中的细微的颗粒，在消化器中留下更重的沉降固体。可用非酸化水洗涤沉降固体以除去细粒，直至水相澄清或几乎澄清。如所述第一干燥步骤在相似条件下在干烤箱中干燥沉淀物。最终的经干燥材料为具有一些小杂质的木质素。
木质素分析：
使用乙酰溴分析溶液确认和量化棉籽壳以及最终木质素产物中的木质素。木质素的乙酰溴分析遵循IIyama，K.等，“Determination of Lignin inHerbaceous Plants by an Improved Acetyl Bromide Procedure”，J Sci Food Agric1990；以及Hatfield，R.D.等，“Using the Acetyl Bromide Assay To DetermineLignin Concentrations in Herbaceous Plants:Some Cautionary Notes”，J AgricFood Chem 1999所公开的步骤。分析方法通常包括下列步骤。
(1)往各测试试管加入10-15mg干燥研磨样品。将样品粉碎至粉末，但可通过最大20目筛(work up to a maximum of a 20mesh screen)。并且，样品重量范围可为2-40mg并仍然得到好的结果，但使用至少10mg以确保更准确的质量，以及使用不超过15mg以确保完全消化。通常使用试管作为程序空白以及至少两试管用于“标准”。
(2)往各试管加入10ml DI H2O。将试管置于65℃(设为85)的干燥模块中并加热一小时，每10分钟进行搅拌。
(3)将样品滤过GF/A玻璃纤维滤器并冲洗三次，采用以此顺序的各下列溶液：水>乙醇>丙酮>乙醚。各次冲洗可几分钟。
(4)将滤片置于20ml玻璃闪烁管(无盖)中并在70℃下加热过夜。
(5)往各管中加入2.5ml醋酸中的25%AcBr。
(6)将管带盖置于50℃烘箱中2小时，并偶尔涡旋。
(7)在冰箱中冷却样品。准备具有10ml2N氢氧化钠以及12ml醋酸的容量瓶。将各样品从闪烁管转移至容量瓶。采用醋酸良好冲洗滤纸孔进入容量瓶并用醋酸加至体积。
(8)沉降样品至少一小时，并优选过夜，然后在280nm处测定其吸光率。
分析结果：
分析结果显示220克棉籽壳检测出约20%的纯木质素含量。最终木质素产物检测为约95%纯木质素含量。
试验研究结果表明大量糖在第一次酶消化后被移除。在第二次消化后，伴随一些杂质保留了大部分木质素。分数存放(fraction inventory)证实220克原料的约60克作为固体在第一次消化后残留。因此，大量糖首先在第一次消化中被移除。第二次精制消化仅进行木质素的二次清洁。在不希望受限于理论的情况下，在酶处理前的固体细微碾磨(成粉)被认为增加表面并在用于精制固体的第二次酶消化(浓缩的糖酶)中极大促进残留糖的移除。因此，草案或方法的进行可优选采用可生成最大表面积的最小粒径，其可让酶接触可获得的糖。其可进行20%-30%固体(基于待消化混合物的总重量)的初级消化。在第一次消化后还可收集固体量一段时间并接着在进行第二次消化阶段之前将其磨细致精制尺寸(例如，小于约50微米)。
申请人特别并入在本发明公开中所有引用参考文献的全部内容。此外，当给出数量、浓度或其它值或参数作为范围、优选范围、或向上优选值和向下优选值列时，其被理解为特别公开形成自任意向上范围界限或优选值和任意向下范围界限或优选值的任意配对的所有范围，无论范围是否单独公开。当本发明述及数值范围时，除非另作说明，该范围意图包括其端点和在该范围内的所有整数和分数。当定义范围时，无意于将本发明的范围限制为述及的特定值。
通过考虑本发明公开的说明书和实践，本发明的其它实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明说明书和实施例意图被考虑为仅为对通过下列权利要求及其等价物所指示的本发明真实范围和精神的示例。

Claims (28)

1.分离木质纤维素材料组分的方法，包括：
粉碎木质纤维素材料以形成经粉碎的木质纤维素材料；
在不存在任何在先从该木质纤维素材料的非酶分离木质素的情况下，酶消化包含经粉碎的木质纤维素材料、至少一种酶混合物以及水溶液的混合物，以酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的水溶液。
2.权利要求1的方法，其中该水溶液包含酸性有机缓冲水溶液。
3.权利要求1的方法，其中在该水溶液中的至少一种C6和/或C5糖包括溶解的C6和/或C5糖、或混悬的C6和/或C5糖颗粒、或其任意组合。
4.权利要求1的方法，其中，
在水溶液中采用酶混合物酶消化经粉碎的木质纤维素材料包括在约30℃至约60℃的温度下搅拌混合物至少约1小时，以及
该分离包括停止搅拌并从包含沉降固体的不溶性部分倒出至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的水溶液。
5.权利要求1的方法，其中该木质纤维素材料是棉籽壳、谷物外壳、甘蔗渣、玉米杆、玉米芯、稻草、柳枝稷、树叶、茎秆、植物壳、软木块、硬木块、锯屑、造纸厂纸浆、废纸、回收纸、或其任意组合。
6.权利要求1的方法，其中该木质纤维素材料包括棉籽壳。
7.权利要求1的方法，其中该至少一种酶混合物包含含至少一种酶的第一酶混合物，该至少一种酶来自组1)至5)中的至少两组：
1)内切葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶；
2)外切葡聚糖酶、微晶纤维素酶；
3)纤维二糖酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶；
4)内1,4-β-木聚糖酶、内-(1,4)-β木聚糖水解酶；
5)β-1,3-木聚糖酶、1,3-β-D-木糖苷酶和外-1,3-β-木糖苷酶。
8.权利要求7的方法，其中第一酶混合物包含：
来自组1)和/或2)的至少一种酶，
组3)的至少一种酶，以及
组4)和/或5)的至少一种酶。
9.权利要求1的方法，其中该至少一种酶混合物还包含含至少一种酶的第二酶混合物，该至少一种酶来自组1a)至20a)中的至少两组：
1a)内-1,3(4)-β-葡聚糖酶；
2a)昆布糖酶(内-1,3-β-葡聚糖酶)；
3a)外-1,2-1,6-α-甘露糖苷酶；
4a)β-D-吡喃木糖基-(1,4)-β-D-吡喃木糖酶；
5a)α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶；
6a)阿魏酸酯酶；
7a)内-1,5-α-阿拉伯聚糖酶；
8a)果胶酶；
9a)多聚半乳糖醛酸酶；
10a)果胶酯酶；
11a)天冬氨酸蛋白酶；
12a)金属蛋白酶；
13a)内-(1,4)-甘露聚糖酶；
14a)植酸酶；
15a)α-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖醛酸酶；
16a)hexenuronidase；
17a)碱性磷酸酶和酸性磷酸酶；
18a)α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶；
19a)β-甘露糖苷酶；
20a)α-岩藻糖苷酶。
10.权利要求1的方法，其中木质素的收率为至少约90%。
11.权利要求1的方法，其中C6和/或C5糖的收率为至少约90%。
12.分离木质纤维素材料组分的方法，包括：
a)将木质纤维素材料粉碎为经粉碎的木质纤维素材料；
b)在不存在任何在先木质纤维素材料的非酶分离木质素处理的情况下，酶消化包含经粉碎的木质纤维素材料、第一酶混合物以及第一水溶液的第一混合物，以第一酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的第一不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；
c)从该第一不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的第一水溶液；
d)将该第一不溶性部分粉碎为经粉碎的第一不溶性部分；
e)酶消化包含经粉碎的第一不溶性部分、第二酶混合物以及第二水溶液的第二混合物，以第二酶致水解从包含木质素的第二不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
f)从含有该至少一种C6和/或C5糖的第二水溶液分离包含木质素的第二不溶性部分。
13.权利要求12的方法，其中木质纤维素材料的粉碎包括碾磨该木质纤维素材料至小于约2mm的尺寸。
14.权利要求12的方法，其中第一不溶性部分的粉碎包括碾磨或研磨该第一不溶性部分至小于约50微米的尺寸。
15.权利要求12的方法，还包括：在分离后，在粉碎第一不溶性部分之前洗涤该第一不溶性部分至少一次并干燥经洗涤的第一不溶性部分。
16.权利要求12的方法，其中该第一水溶液包含酸性有机缓冲水溶液。
17.权利要求12的方法，其中在该第一水溶液中的至少一种C6和/或C5糖包括溶解的C6和/或C5糖、或混悬的C6和/或C5糖颗粒、或其任意组合。
18.权利要求12的方法，其中
在第一水溶液中采用第一酶混合物酶消化经粉碎的木质纤维素材料包括在约30℃至约60℃的温度下搅拌第一混合物至少约1小时，以及
该分离包括停止搅拌并从包含沉降固体的第一不溶性部分倒出至少一部分含有该至少一种C6和/或C5糖的第一水溶液。
19.权利要求12的方法，其中该木质纤维素材料是棉籽壳、谷物外壳、甘蔗渣、玉米杆、玉米芯、稻草、柳枝稷、树叶、茎秆、植物壳、软木块、硬木块、锯屑、造纸厂纸浆、废纸、回收纸、或其任意组合。
20.权利要求12的方法，其中该木质纤维素材料包括棉籽壳。
21.权利要求12的方法，其中该第一酶混合物包含至少一种酶，该至少一种酶来自组1)至5)中的至少两组：
1)内切葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶；
2)外切葡聚糖酶、微晶纤维素酶；
3)纤维二糖酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶；
4)内1,4-β-木聚糖酶、内-(1,4)-β木聚糖水解酶；
5)β-1,3-木聚糖酶、1,3-β-D-木糖苷酶、和外-1,3-β-木糖苷酶。
22.权利要求12的方法，其中该第二酶混合物包含至少一种酶，该至少一种酶来自组1a)至20a)中的至少两组：
1a)内-1,3(4)-β-葡聚糖酶；
2a)昆布糖酶(内-1,3-β-葡聚糖酶)；
3a)外-1,2-1,6-α-甘露糖苷酶；
4a)β-D-吡喃木糖基-(1,4)-β-D-吡喃木糖酶；
5a)α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶；
6a)阿魏酸酯酶；
7a)内-1,5-α-阿拉伯聚糖酶；
8a)果胶酶；
9a)多聚半乳糖醛酸酶；
10a)果胶酯酶；
11a)天冬氨酸蛋白酶；
12a)金属蛋白酶；
13a)内-(1,4)-甘露聚糖酶；
14a)植酸酶；
15a)α-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖醛酸酶；
16a)hexenuronidase；
17a)碱性磷酸酶合酸性磷酸酶；
18a)α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶；
19a)β-甘露糖苷酶；
20a)α-岩藻糖苷酶。
23.权利要求12的方法，其中木质素的收率为至少约90%。
24.权利要求12的方法，其中至少一种C6和/或C5糖的收率为至少约50%，基于木质纤维素材料中存在的原始量。
25.权利要求12的方法，还包括生物发酵处理该至少一种C6和/或C5糖。
26.用于分离木质纤维素材料组分的系统，包含：
用于粉碎木质纤维素材料的至少一个粉碎机；
至少一个包含配有内部搅拌器的容器的消化器，其中该容器可操作用于在不存在任何在先木质纤维素材料的非酶分离木质素处理的情况下保持经粉碎的木质纤维素材料、至少一种酶混合物以及水溶液的混合物，并可操作用于伴随搅拌酶消化该混合物以酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
用于从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种糖的水溶液的分离器。
27.权利要求26的系统，还包含：
用于干燥包含木质素的不溶性部分的烘干机；
用于粉碎第一不溶性材料的粉碎机；
包含配有内部搅拌器的容器的消化器，其中该容器可操作用于保持经粉碎的第一不溶性材料、至少一种酶以及水溶液的混合物，以及搅拌使该混合物接触以酶致水解从包含木质素的木质纤维素材料的不溶性部分释放至少一种C6和/或C5糖；以及
用于从包含木质素的不溶性部分分离至少一部分含有该至少一种糖的水溶液的分离器。
28.权利要求26的系统，还包含适于从消化器接收经释放的C6和/或C5糖并将该C6和/或C5糖发酵为乙醇的生物发酵处理系统。
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