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CN103339151A - 多价嵌合OspC疫苗原和诊断抗原 - Google Patents

多价嵌合OspC疫苗原和诊断抗原 Download PDF

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CN103339151A
CN103339151A CN2011800611724A CN201180061172A CN103339151A CN 103339151 A CN103339151 A CN 103339151A CN 2011800611724 A CN2011800611724 A CN 2011800611724A CN 201180061172 A CN201180061172 A CN 201180061172A CN 103339151 A CN103339151 A CN 103339151A
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chimeric
protein
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CN2011800611724A
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R·T·马尔科尼
C·厄恩哈特
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Original Assignee
Virginia Commonwealth University
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Abstract

本发明提供了一种用作用于莱姆病的疫苗和诊断的嵌合多价重组体蛋白质。该嵌合蛋白质包含外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区和/或α螺旋5区的表位。该OspC类型可以与哺乳动物感染疏螺旋体有关。

Description

多价嵌合OspC疫苗原和诊断抗原
技术领域
本发明一般涉及一种用于莱姆病（Lyme's disease）的疫苗和诊断。具体地讲，本发明提供了一种嵌合的多价重组体蛋白质，其包括与哺乳动物感染有关的外表面蛋白质C（OspC）类型的环5（loop 5）和/或α螺旋5（alpha helix5，α helix5或α5）区/结构域的免疫显性表位。
背景技术
莱姆病是在北美洲和欧洲最常见的节肢动物媒介传染病。其由螺旋体伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi，即B.burgdorferi）、伽氏疏螺旋体（B.garinii）、和嘎氏疏螺旋体（B.afzelii）引起。通过被感染的蜱（Ixodes ticks）的叮咬发生对哺乳动物的传染[Burgdorfer etal.,1982；Benach et al.,1983]。可考虑的病态与莱姆病有关，并且在美国和欧洲存在每年高达3%的人群被感染的区域[Fahrer et al.,1991]。感染可导致多系统的炎性疾病，早期症状可以包括红斑迁移、微热、关节痛、肌肉痛、以及头痛[Steere et al.,1977a]。后期临床表现可能很严重，并且可以部分地包括关节炎[Steere et al.,1977a；Eiffert et al.,1998；Steere etal.,2004]、心脏炎[Asch et al.,1994；Nagi et al.,1996；Barthold et al.,1991]和神经学上的并发症[Nachman and Pontrelli，2003；Coyle and Schutzer，2002]。另外，莱姆病具有显著的社会经济成本，由于与曝露于蜱有关，所以表现出户外娱乐和社会活动减少。
药物经济学研究表明，明显存在对莱姆病疫苗的需要，特别是在每年疾病风险超过1%的人群中[Meltzer et al.,1999；Shadick et al.,2001]。然而，目前在市场上买不到疫苗。第一个人类莱姆病疫苗是基于OspA的LYMErix（葛兰素史克）；然而，其使用期限较短，并且据说由于销售下降，在2002年GSK主动地将其撤出市场。销售下降可能溯及有关的、实际的或者被感觉的可能副作用，包括慢性炎症性关节炎，该关节炎理论上可以在HLA-DR4-阳性受体中扩大[Kalish et al.,1993]。虽然正在开发新的基于OspA的疫苗原来减轻该潜在的并发症[Koide et al.,2005；Willett et al.,2004]，但问题依然是基于OspA的疫苗的成活力。人们关心的是要求保持长期预防性的加强频率。OspA在蜱中央管里被表达，一旦蜱叮咬（tick feeding），OspA就会被快速地下调，并且在哺乳动物中不表达[Gilmore et al.,2001；Schwan et al.,1995]。基于OspA的疫苗的作用机理是，靶向在蜱内部的螺旋体并且防止它们的传染[de Silva et al.,1999]。因为传染发生在蜱叮咬的48小时内，故有效防护取决于较高的抗OspA抗体的循环滴度，需要频繁加强。这些与基于OspA的疫苗有关的固有问题可以通过利用抗原而被避免，所述抗原在感染早期期间以高水平被表达、并且可激发出杀菌的抗体。
OspC在莱姆病疫苗开发中已经引起了相当大的注意。它是一个在26kb环形质粒上被编码的22kDa的、表面暴露的脂蛋白[Fuchs et al.,1992]，所述环形质粒在被分离出的伯氏疏螺旋体广义复合物当中是通用的[Marconi et al.,1993；Sadziene et al.,1993]。一旦蜱叮咬，OspC的表达就被诱导，并且在哺乳动物感染早期期间被保持[Schwan，2004]，并且在感染期间它的基因是稳定的[Hodzic et al.,2000；Stevenson et al.,1994]。抗OspC抗体已经显示出可防止感染，但是仅能对抗表达在序列上与疫苗原紧密相关的OspC的菌株[Gilmore etal.,1996；Bockenstedt et al.,1997；Gilmore and Mbow，1999；Mathiesen et al.,1998；Scheiblhofer et al.,2003；Jobe et al.,2003；Rousselle et al.,1998；Wallich et al.,2001；Mbowet al.,1999；Probert et al.,1997；Brown et al.,2005；Probert and LeFebvre，1994]。OspC序列的分析已经描绘出大约21个按字母名称（A至U）来区分的OspC种类的簇或者类型[Seinost et al.,1999；Wang et al.,1999]。虽然在一个簇内部的序列变化通常是小于2%，但在OspC类型之间的序列变化却可以高达22%[Wang et al.,1999；Theisen et al.,1995；Brisson and Dykhuizen，2004]。这样的表位内部类型变化很可能解释了由具有单一OspC类型的接种疫苗提供的有限预防范围。
Dunn和Luft的美国专利No.6,248,562（2001年6月19日）描述了嵌合体疏螺旋体蛋白质，其由至少两个来自与疏螺旋体相同和/或不同种类对应的和/或非对应的蛋白质的多肽组成。该被并入嵌合蛋白质的嵌合多肽源自于来自任何疏螺旋体菌株的任何疏螺旋体蛋白质，并且包括OspA、OspB、OspC、OspD、p12、p39、p41、p66、以及p93。嵌合蛋白质可以被用作免疫诊断试剂，并且用作对抗疏螺旋体感染的疫苗免疫原。然而，没有提及存在于OspC蛋白质上的环5和α5表位。
Livey的美国专利No.6,872,550和6,486,130（申请日分别是2005年3月29日和2002年11月26日）描述了构建体，其用于对抗莱姆病的疫苗，含有OspC抗原。然而，在这两个专利中没有提及环5和α5表位的表征。
Dattwyler等人的美国专利No.7,008,625（2006年3月7日）公开了多种疏螺旋体菌株的抗原性多肽和/或在单一蛋白质内部的蛋白质。该嵌合体疏螺旋体蛋白质由外表面蛋白质OspA和外表面蛋白质OspC的多肽片段组成。这些蛋白质对抗莱姆病疏螺旋体可能是有效的，并且可用于免疫诊断试剂。然而，没有提及环5和α5表位的表征。
出版物“用于莱姆病诊断的重组嵌合体疏螺旋体蛋白质”（MariaJ.C.Gomes et al.，2000。J.Clin.Microbiol.，38：2530-2535）涉及到上述两个专利。作者述及了工程化的重组嵌合体，每个嵌合体都含有伯氏疏螺旋体关键抗原性蛋白质、OspA、OspB、OspC、鞭毛蛋白（Fla或者p41）、以及蛋白质p93的部分。该论文在于提供诊断，但是在结束段落中描述了用于疫苗原的应用。该作者提到，通过重要表位的基因变异性的进一步研究，可以产生较好的嵌合体，但是未述及OspC的环5和α5表位。
因此现有技术迄今尚未能提供了这样一种疫苗：其可提供针对多个OspC类型的广谱预防，用于抑制和/或治疗莱姆病。
发明内容
本发明提供了一种用于用作莱姆病的疫苗和诊断的嵌合多价重组体蛋白质。本发明是部分地基于新颖的来自数种不同OspC种类组（类型）的保护性表位的发现和表征，每个种类组都与哺乳动物（例如人类）莱姆病感染有关。这些表位的鉴别有可能构建包括多个来自不同OspC传染性类型的表位的嵌合蛋白质。因此，当用作疫苗时，嵌合重组体蛋白质可引起对抗多种可表达这些OspC类型、并且与哺乳动物莱姆病有关的疏螺旋体菌株的广谱的防护。另外，该嵌合蛋白质可用作诊断工具来鉴别具有对抗所述表位的抗体的个体，并且因此来确定是否个体已经暴露于或者感染莱姆病的病原体。在本发明的一些实施方式中，所述表位是B细胞表位和/或免疫显性表位。
本发明的目的在于提供一种嵌合重组体蛋白质，其包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位。在一种实施方式中，OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。在一些实施方式中，嵌合蛋白质具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：250、SEQID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：264、SEQ IDNO：265、SEQ ID NO：266、以及SEQ ID NO：267。在一些实施方式中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。
本发明进一步提供了一种用于在需要其的个体中引起针对疏螺旋体免疫反应的方法。该方法包括将嵌合重组体蛋白质给药于个体的步骤，该蛋白质包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位。在本发明的一种实施方式中，OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。在一些实施方式中，嵌合蛋白质具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：250、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：263、SEQ IDNO：264、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：266、以及SEQ ID NO：267。在一些实施方式中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。
本发明还提供了一种用于确定是否个体已经暴露于或者感染疏螺旋体的方法。该方法包括下述步骤：1）从个体中获得生物样品；2）将生物样品暴露于至少一种重组体嵌合蛋白质，其中，至少一种嵌合蛋白质包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位；以及3）测定所述生物样品中的抗体是否结合于至少一种嵌合蛋白质，其中，抗体结合的检出是先前暴露于或者感染了疏螺旋体的指示。在本发明的一种实施方式中，OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。在一些实施方式中，嵌合蛋白质具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262、SEQ IDNO：263、SEQ ID NO：264、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：266、以及SEQ ID NO：267。在本发明的一些实施方式中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。
本发明还提供了针对嵌合重组体蛋白质的抗体，该蛋白质包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位。在本发明的一种实施方式中，OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。在一些实施方式中，嵌合蛋白质具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：250、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：263、SEQ IDNO：264、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：266、以及SEQ ID NO：267。在一些实施方式中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。所述抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。在一种实施方式中，抗体对于疏螺旋体螺旋体具有杀菌性。
本发明还提供了一种嵌合重组体蛋白质的免疫原性混合物（cocktail）。在混合物（cocktail）中的每个嵌合重组体蛋白质都包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位。
附图说明
图1.来源于马里兰州病人的OspC序列的进化关系：OspC类型鉴别。OspC基因被PCR扩增、测序，并且构建系统发生图。代表22个OspC类型的数据库序列被包含在分析中（登录号被显示）。每个种类组都被分配有类型名称（大写字母），类型名称通过每个分支上的大写字母被显示。在每个对于组区分而言关键的节点处展示了自展值（bootstrapvalue）（1000个试验）。
图2.表明在感染期间对于OspC的抗体反应显著地是OspC类型特异性的。数种OspC类型（如图中所示）的重组OspC蛋白质被生成、通过SDS-PAGE分离、免疫印迹、并且用被HRP共轭的S蛋白质或者收集自小鼠的血清筛选，所述小鼠已用所显示的已知OspC类型的克隆分离株感染。
图3A-C.OspC类型A的免疫显性表位的定位。产生OspC类型A的平截（truncation）作为S-Tag融合蛋白，并且在大肠杆菌中表达。图面A代表OspC平截的概要。编号反映了伯氏疏螺旋体B31MIOspC的残基编号。在图面A中，每个被截断的蛋白质结合感染抗体的能力被通过（+）或（-）向右显示。向左的数目显示包含每个平截的氨基酸残基。在图面B和C中，用被HRP共轭的S蛋白质、或者用小鼠血清筛选重组体蛋白质的免疫印迹，以便验证表达和加载，所述小鼠感染了OspC类型A产生菌株--伯氏疏螺旋体B31MI（该血清为α-B31MI感染血清）。为了进行参照，在图面B和C中的箭头显示了重组体的迁移位置，显示该重组体对于α-B31MI感染血清没有免疫活性。分子质量标志物被显示在每个免疫印迹右边。
图4A和4B.环5和α螺旋5表位的片段在类型间（intertype）和类型内（intratype）水平上的比较分析，以表格形式显示。
图5.显示了在多个感染了不同的OspC类型A生产菌株的动物中的环5抗体反应。用感染血清筛选1）全长OspC类型A或（2）含有氨基酸第130-150位（其包括环5）的片段的免疫印迹。用于产生感染血清和用于收集血清的特定小鼠（m）的菌株被显示在上述每个图面。当收集血清时在感染期间的时间点也被显示。用于每个类型，等份的蛋白质被做免疫印迹，所有的免疫印迹被暴露于膜相同时间量。
图6.ELISA：包埋有OspC类型A靶向抗体的血清样品的鉴别。r-全长OspC类型A、r-类型A环5，并且、牛血清白蛋白被用于涂覆ELISA平板的孔。这些孔用来自莱姆病病人的血清掩蔽。所有测定进行一式三份，并且平均值与标准偏差一起被显示出来。所有方法在正文中有描述。对于伯氏疏螺旋体B31MI的抗体，来自病人15的血清被测定为IgG阴性，被用作阴性对照。
图7A和7B.通过PepSpot分析鉴别包含OspC类型A环5表位的特定残基。产生跨越环5结构域的重叠的肽，并且印斑移到硝化纤维素上。被固定化的肽然后用来自小鼠的血清、或者用来自莱姆病病人（如同被显示的那些）的血清掩蔽，所述小鼠感染了OspC类型A产生菌株（B31MI）的克隆种群。图A，环5结构域的免疫印迹结果；图B，肽序列。
图8.显示了环5是被暴露的表面，并且环5的抗体是杀菌性的。用针对类型A环5产生的抗血清，进行IFAs和杀菌试验。（A）结果显示了抗环5抗血清的特异性。伯氏疏螺旋体B31MI、帕氏疏螺旋体（B.parkeri）、以及r-类型A环5片段的全细胞裂解液通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳被分离，进行免疫印迹，并且用抗类型A环5抗血清（1:1,000）掩蔽。蛋白质标志物的分子质量在图右侧。
图9A和9B.四价嵌合OspC测试构建体的产生。图A，在图面A中显示了用于产生四价ABKD嵌合疫苗原构建体的流程图。在ABKD嵌合疫苗原中使用的类型特异性的OspC表位被表示为不同的柱描影。OspC类型A的环5表位和类型B、K和D的α螺旋5表位在第1轮PCR中被扩增，并且进行凝胶纯化。这些初始的扩增子然后被加入随后的一轮PCR，以生产完全的嵌合构建体。因为扩增子的末端（连接物序列）是互补的，所以在变性后它们可以退火以允许重叠延伸，接着进行PCR扩增。最终的扩增子被退火成pET46Ek/LIC载体。图B，在图面B中，最终的ABKD嵌合疫苗原构建体的蛋白质序列被显示由含有表位的区域和被标注的连接物序列组成。
图10.用ABKD嵌合疫苗原和全长OspC显示抗ABKD抗血清的免疫反应性的Westernblot。通过ABKD嵌合疫苗原--全长r-OspC蛋白质类型A、B、K和D（如同显示的那些）、以及rBBN39（阴性对照）的免疫印迹评估免疫原性。印迹用抗His tag mAb、或者用代表性抗ABKD抗血清（显示于下文）掩蔽，以显示大约等于加载量。分子质量标志物被显示在右边。观察到强的对A、B和K（但是不包括D）的IgG响应。
图11A和图11B.来自用ABKD嵌合疫苗原免疫的小鼠的血清的反应性的ELISA滴定。图A，来自用ABKD嵌合疫苗原（n=12）接种疫苗、或者用PBS/佐剂（n=3）假装免疫的小鼠的血清被滴定，用于与ABKD嵌合疫苗原或者rOspC蛋白质类型A、B、K、以及D的反应性。图面A显示了所有血清对ABKD嵌合疫苗原构建体（具有对于每个小鼠的不同标记的实线）的免疫反应性的滴定。在假装接种疫苗的小鼠（虚线）中没有观察到Ab响应。图B，也完成了对每个OspC类型的特异性响应的滴定（未显示曲线），并且在1/2最大OD405处测定的滴度被显示在图面B中（每个小鼠一个点，水平线在平均值滴度处）。对照小鼠没有滴度，并且未被绘出。
图12.抗ABKD抗血清的免疫球蛋白同种型分布。ELISA孔用ABKD嵌合疫苗原构建体涂覆（100ng/孔），并且用抗ABKD抗血清一式二份探测（1：10000；n=12）。用生物素化同种型特异性的第二Ab（小鼠同种型试剂盒；Zymed实验室）和被HRP共轭的链霉抗生物素蛋白检测被结合的Ig。通过测量显色产物，反应性被量化，所述显色产物是通过ABTS底物的受HRP调节的转化而产生的。
图13A-E.ABKD疫苗变体的构建示意图。使用具有5'悬垂来增加C端氨基酸的反向引物，通过扩增原始构建体，构建ABKDppa（图面A）。以相同的方式，但使用OCDH5ggLIC引物，制得ABKDgg（未显示）。ABKDD（图面B）、ADBK（图面C）、以及ADBKD（图面D）全部使用可增加尾部编码连接物序列的引物通过PCR扩增组成序列而制得的。得到的PCR产物进行凝胶纯化，并且通过重叠退火和延伸进行连接。最终产品被克隆入pET-46Ek/LIC载体。含有OspC类型特异性表位的区域用字母表示，并且连接物序列用数字表示（参见用于被编码氨基酸序列的插入物）。箭头表示引物，并且5'悬垂的LIC尾部或者连接物序列被标注在每个引物箭头的尾部上。
图14.考马斯亮蓝染色的嵌合疫苗原测试构建体的SDS-PAGE凝胶。疫苗原r-蛋白质在大肠杆菌中被表达，亲合性通过镍色谱法被纯化，并且通过BCA方法被量化。2μg的纯化蛋白质在15%SDS-PAGE凝胶（标准；Biorad）上走电泳，并且用考马斯亮蓝G-250染色。没有污染性蛋白被标注，并且存在极小量的或者没有重组体蛋白降解。
图15A和B.全长r-OspC的小鼠疫苗血清识别的评估。在图面A中，r-OspC类型A、B、K、以及D被电泳，并且被转印至PVDF（类型显示在顶端；500ng/泳道），并且用1:2500稀释度的来自小鼠的代表性血清进行探测，其中小鼠已用每一个变体构建体（显示在左侧）接种。通过被过氧化物酶共轭的山羊抗小鼠IgG（1:40000）和化学发光进行二次检测。分子质量被显示在右边。在图面B中显示的是小鼠疫苗血清与全长r-OspC反应性的定量ELISA滴定结果。针对每个疫苗构建体（标注在底部）产生的血清被进行对抗经固定化的、全长的、r-OspC类型A、B、K、以及D的滴定。还包括来自用PBS（ABKD*）[17]透析的ABKD构建体的滴度。柱子指示了对抗OspC类型A（黑色）、B（灰色）、K（空心）、以及D（阴影线）的平均滴度。来自个体小鼠的滴度用空心三角形表示。下面列出的是平均数值滴度、以及对应于用PBS透析（ABKD*）或者用精氨酸/谷氨酸缓冲液透析（ABKD）的ABKD构建体的滴度的指数化滴度。
图16A-C.表位特异性的同种型对三种疫苗构建体的反应。OspC类型A、B、K、以及D被固定化在ELISA平板上，并且一式两份地用来自被ABKD、ABKDD、或ADBKD构建体接种的小鼠的免疫血清进行探测。用生物素化的同种型特异性第二抗体和被过氧化物酶共轭的链霉抗生物素蛋白检测被结合的Ig同种型。
图17.来自免疫小鼠的脾细胞对体外用免疫性抗原再刺激的IFN-γ响应。收集来自三个用六种疫苗构建体中每一个免疫的小鼠的无红细胞的脾细胞，汇集，并且一式三份地用原始免疫性抗原（在24孔板中107个细胞mL-1，抗原为10或5μg mL-1）再刺激。一式三份的对照孔被给药10mgmL-1BSA或者不含蛋白质。在温育（37°C、5%CO2）96小时后，收集无细胞的上清液，并且通过ELISA确定IFN-γ浓度。在所有情形中，IFN-γ在BSA中和不含蛋白质的孔中的浓度低于测定检测极限。
图18A和18B.对在弗氏佐剂（Freund's adjuvant）或者明矾中给药的ABKD疫苗原的抗体反应的评估。在图面A中显示的是小鼠血清中IgG的定量ELISA滴定结果，该血清是通过对抗在弗氏佐剂（实心柱）中乳化或者被吸附于明矾（阴影柱）的ABKD疫苗而产生的。滴定该血清以对抗固定化ABKD疫苗原或者全长的r-OspC类型A、B、K、以及D。在图面B中显示的是被结合于固定化ABKD疫苗原的血清的同种型分布。用生物素化的同种型特异性第二抗体和被过氧化物酶共轭的链霉抗生物素蛋白检测被结合的Ig同种型。
图19.OspC蛋白质序列一致性的成对比较的分布。使用PAM40记分矩阵，对来自280个疏螺旋体分离株的OspC蛋白质序列进行Clustal排列，计算出成对百分率一致性。柱状图间隔是1%，并且没有百分率一致性<50%。
图20A-C.被指定OspC类型的种类、地理学和生物学分离数据。
图21A-C.代表性OspC蛋白质序列的共有序列系统发生树。包括氨基酸20-200位（A）、20-130位（B）、以及131-200位（C）在内的OspC序列被自展（bootstrapped）（n=1000），计算距离，并且产生相邻连接树并使这些树符合共有序列树。赫姆斯疏螺旋体（B.hermsii）的Vmp33序列被用作外围组。标志显示了种类伯氏疏螺旋体（Bb）、伽氏疏螺旋体（Bg）、或者嘎氏疏螺旋体（Ba）、分离株菌株名称、指定的OspC类型（粗体）、以及来自被表示为该单一序列（在括号中）其他菌株的相同OspC序列的数量。自展支撑（bootstrap support）被显示在所有把OspC类型区分开来的节点处。
图22.OspC类型PLj7（嘎氏疏螺旋体）OspC序列与OspC类型PKi（伽氏疏螺旋体比较；实心黑线）、F（伯氏疏螺旋体；实心灰线）、以及M（伯氏疏螺旋体；黑虚线）相比较的Bootscan分析。Bootscan窗口是40个碱基（base），具有10个碱基步骤。与严谨的共有序列进行对比，100次自展重复。曲线图已经被简化，仅显示其中改变顺序的树的百分比超过50%的那些峰值，并且显示70%水平被认为代表可能的重组。
图23.来自在该研究中限定的所有OspC类型的OspC蛋白质序列中含有表位的区域的排列。在OspC类型内相差一个以上氨基酸的所有序列都被显示为代表性序列。描影的一致性阈值是80%。二级结构的α螺旋和环（对应于B31结构）被显示在排列下面（Kumaranet al.,2001）。
图24.在构建ABKD嵌合疫苗原中使用的亲本OspC序列的ClustalX排列和在疫苗原中含有表位的区域的物理定位。OspC类型A中含有表位的区域（环5区域、淡灰色盒）和类型B、K、以及D（α螺旋5区，暗灰色盒）的定位被突出显示在母体序列的Clustal X排列内部。
图25A-J.本发明的示例性嵌合疫苗原。构建体标题显示了被并入构建体中的OspC类型特异性的环5和螺旋5表位、以及它们的顺序。粗体X代表任选的连接物序列的位置。
图26.来自数种疏螺旋体菌株的OspC的蛋白质和DNA登录号。
图27.使用嵌合A8.1蛋白质以ELISA形式评估在蜱攻击的狗中莱姆病血清转化。ELISA板用100ng/孔碳酸盐缓冲液中A8.1蛋白质涂覆。收集在攻击后3周、4周、以及5周来自非攻击（对照）和蜱攻击的狗的血清，稀释（1:250），并且一式两份地施加到ELISA板上。在温育后，用IgG特异性的、被过氧化物酶共轭的第二抗体（1:20000）检测被结合的狗Ig。使用基于TMB的色原，来量化反应性。每一个柱子都代表个体动物的平均数据。
图28A-D.图A，在来自伯氏疏螺旋体的OspC的代表性序列内部的一般表位定位；图B，在A9.1构建体中的表位模式；图C，在B9.1构建体中的表位模式；图D，在C9.1构建体中的表位模式。
图29A-C.图A，在A9.2构建体中的表位模式；图B，在B9.2构建体中的表位模式；图C，在C9.2构建体中的表位模式。
图30A-C.图A，在A9.3构建体中的表位模式；图B，在B9.3构建体中的表位模式；图C，在C9.3构建体中的表位模式。“环”显示包括螺旋3的环5区域。
具体实施方式
本发明是基于与人类莱姆病感染有关的OspC类型的新颖的防护性的、类型特异性的表位的鉴别和表征。该新颖的表位位于OspC羧基末端一半的两个结构域（区域）内部。此前没有结构域被鉴别为高度免疫原性。第一结构域（在本文中称作“α螺旋5区/结构域”或者“α5区域/结构域”或者“螺旋5区域/结构域”）是位于残基160和200之间，并且含有包括一部分环6、α螺旋5、以及非结构化的C末端结构域在内的二级结构元件（Kumaran et al.,2001）。第二结构域（在本文中称作“环5区域/结构域”）位于残基131和159之间，并且含有包括一部分α螺旋3、环5和α螺旋4在内的二级结构元件（Kumaranet al.,2001）。这些区域中的每一个都含有至少一个可以在本发明的实施方式中使用的表位。来自这两个结构域的表位、或者来自这两个区域内部的抗原性肽或多肽可以在本发明的实施方式中使用，或者单独使用，或者优选与嵌合免疫原中的其他表位结合使用。在本发明的一些实施方式中，所述表位是免疫显性表位。典型地，所述表位是B细胞表位，虽然不排除T细胞表位。
新颖的表位的发现、以及将表位绘图成不同的OspC类型，有可能构建出的多价嵌合蛋白质，含有多个来自多个OspC类型的线性的、类型特异性的免疫显性表位。当用作疫苗时，多价的（多价）重组体嵌合蛋白质可引起对抗疏螺旋体螺旋体感染的广谱防护，所述疏螺旋体螺旋体可表达对应于嵌合蛋白质中OspC类型的OspC类型，即，所述疏螺旋体是高度传染性的。另外，该嵌合蛋白质可用作诊断工具来鉴别具有对抗嵌合蛋白质中所含表位的抗体的个体，并且因此来确定是否个体已经暴露于和/或感染莱姆病的病原体。
为了便于理解本发明，提供如下定义：
抗原：使用的术语在历史上用于表示可被抗体结合的实体，并且还表示可诱导抗体产生的实体。更多的现有用途将抗原的意义限定为被抗体结合的实体，虽然用语“免疫原”被用于可诱导抗体产生的实体。在这里讨论的实体同时是免疫原性的和抗原性的，是指其或者作为免疫原、或者作为抗原，典型地根据其预定的应用来指代。术语“抗原”、“免疫原”和“表位”在此可以互换地使用。
B细胞表位：在被B细胞受体识别的抗原上的特异性的化合物结构域，并且其可以被分泌的抗体结合。该术语与“抗原决定簇”是可互换的。
免疫显性表位：在诱导显性的、或者最强烈的免疫反应的分子上的表位。
线性表位：一种包含单一的、非中断的、连续的氨基酸链的表位，所述氨基酸通过肽键结合一起从而形成肽或者多肽。这样的表位可以通过其一级结构，即链上氨基酸的线性序列，进行描述。
构象表位：一种由至少一些如下氨基酸组成的表位：它们不是不中断的、氨基酸线性序列的一部分，但是它们通过蛋白质的二级、三级和/或四级相互作用而被接近表位中的其他残基。这些残基可以位于远离就一级序列而言在表位中其他残基处，但是由于蛋白质折叠而可以在空间上位于构象表位中其他残基的附近。
环5区域/结构域：OspC中的区域，OspC包括与图23中所示OspC类型A序列中残基131至159进行比对的残基。被包括在该区域中的菌株B31的OspC二级结构元件是一部分α螺旋3、环5、以及α螺旋4，正如Kumaran et al.（2001）所定义。
α螺旋5区/结构域：OspC中的区域、以及图23中未显示的C端部分蛋白质（菌株B31序列中氨基酸第201-210位），OspC包括与图23中所示菌株B31（OspC类型A）序列中氨基酸第160至200位进行比对的残基。包括在该区域内的菌株B31 OspC二级结构元件是一部分环6、α螺旋5、以及非结构化的C末端结构域，正如Kumaran et al.（2001）所定义。
蛋白质：有大约100个以上通过肽键进行共价连接的氨基酸的线性序列。
多肽：有大约20至大约100个通过肽键进行共价连接的氨基酸的线性序列。
肽：有大约20个以下通过肽键进行共价连接的氨基酸的线性序列。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在此可以互换地使用。
嵌合蛋白质：一种重组体蛋白，其一级序列包含多个在性质上不会在单一分子中一起产生的肽、多肽、和/或蛋白质序列。
嵌合蛋白质的价（例如“多价”或者“多价的”）指的是在嵌合疫苗原中包括的携带有OspC类型特异性表位的多肽的数目。例如，二价嵌合体可以由类型A的α螺旋5和类型B的α螺旋5组成，或者由类型A的α螺旋5和类型A的环5组成。在每个携带有多肽表位的区域中可以有多个不同的表位。
原始序列或者天然序列或者野生型序列：在自然界中发现的肽、多肽、蛋白质或者核酸的序列。
重组体肽、多肽、蛋白质或者核酸：已经通过使用分子生物学技术比如克隆、聚合酶链反应（PCR）等产生和/或操控的肽、多肽、蛋白质或者核酸。
类型特异性：主要与单一种类组相关。
侵袭性感染：如果在人类感染期间，从除围绕初始蜱叮咬而被接种的皮肤之外的位置处（例如从血浆、脑脊髓液等）已经分离出携带OspC类型的疏螺旋体，OspC蛋白质被说是“与侵袭性感染有关”。
因此本发明提供了重组体嵌合蛋白质，其包含多个来自环5和/或α螺旋5区的线性表位，环5和/或α螺旋5区中的至少两个是来自不同的与侵袭性感染有关的OspC类型。优选地，抗原性表位表示大约2至大约20个、优选大约5至大约13个不同的OspC类型被包含于单一的嵌合蛋白质中。在一些实施方式中，嵌合重组体蛋白质包含来自5个OspC类型、或者来自6个OspC类型、或者来自7个OspC类型、或者来自8个OspC类型、或者来自9个OspC类型、或者来自13个OspC类型的表位。虽然，典型地，至少两个表位的一级序列彼此不同，并且来源于不同的OspC类型，但也可以在嵌合体中包括多拷贝的单一类型表位，或者包括数种基于或者衍生于相同OspC类型原始序列的序列。虽然在嵌合体中线性表位的总数可以稍微改变，但一般来讲，线性表位的数目范围将是大约10到30个，在本发明的一个具体实施方式中，免疫显性表位选自下述两个以上OspC类型：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。在一种实施方式中，嵌合蛋白质是四价的，并且含有来自类型A、B、K和D的表位。在另一种实施方式中，嵌合蛋白质是八价的，并且含有来自OspC类型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。然而，本领域的技术人员将认识到，也可以使用来自其他OspC类型组合的表位，只要得到的嵌合体产生合适的免疫反应并且/或者可有效作为疫苗用于防止莱姆病即可。其他合适的组合的例子，如同许多在此公开的实施例显示的那样，包括但不限于：1）A、B、K、D、E、N、C；2）I、C、A、B、K、D；以及3）C、A、B、K、D。
在一些实施方式中，嵌合蛋白质具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：250、SEQID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：264、SEQ IDNO：265、SEQ ID NO：266、以及SEQ ID NO：267；或者是与SEQ ID No.：250-267中任何一个所述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%以上一致性的氨基酸序列。
在另一种实施方式中，在嵌合重组体蛋白质中至少一种OspC类型与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
本发明还包括一种通过使用这些嵌合重组体蛋白质而在需要其的个体中引起针对疏螺旋体的免疫反应的方法。
在另一种实施方式，本发明提供了一种用于确定是否个体已经暴露于或者感染疏螺旋体的诊断方法。该方法包括下述步骤：1）从所述个体中获得生物样品；2）按照在此所描述的，将生物样品暴露于至少一种重组体嵌合蛋白质；以及3）测定所述生物样品中的抗体是否结合于至少一种嵌合蛋白质。抗体结合的检出是先前暴露于或者感染了疏螺旋体的指示。
在其他的实施方式中，本发明提供了对于在此描述的嵌合重组体蛋白质的抗体；以及包含在此描述的嵌合重组体蛋白质的免疫原性混合物（cocktail）。
在一些实施方式中，环5和α螺旋5区将同时被包含。例如，“E、N、I、C、A、B、K、D”构建体可以同时含有OspC类型E、N、I、C、A、B、K、以及D中每一个的环5和螺旋5区域。然而，并不需要如此。例如，可以包括类型A的环5区域和类型E、N、I、C、B、K、以及D的α螺旋5区；或者可以仅包括每个OspC类型的环5区域；或者仅包括α螺旋5区；或者可以包括其他的组合（例如类型E、N、I、以及C的环5区和类型A、B、K、以及D的α螺旋5区）。许多这样的组合对于本领域的技术人员而言显而易见，并且所有这些变化应被包括在本发明中。
另外，在嵌合体内部的表位的线性序列可以改变。一般来讲，从氨基到羧基末端的次序将是“环5区、α螺旋5区、环5区、α螺旋5区”等。例如，在E、N、I、C、A、B、K、D构建体的情况中，沿着嵌合体长度的优先次序是“E类型环5区、E类型α螺旋5区；N类型环5区、N类型α螺旋5区；I类型环5区、I类型α螺旋5区......”，其中不同的OspC类型和/或不同的结构域任选地被中性连接物序列分开。然而，例如，取决于为嵌合体中内含物选择的元件，该次序可以改变。可以使用任何OspC类型和结构域的次序，只要得到的嵌合体产生合适的免疫反应并且/或者可有效作为疫苗用于防止莱姆病、或者可以有效地用于诊断即可。图25A-J中提供了示例性的嵌合体序列的例子。用于来自数种疏螺旋体菌株的OspC的蛋白质和DNA登录号的关键以表格形式显示在图26中。
被包含于嵌合蛋白质中的氨基酸序列可以包含α螺旋5和/或环5区、或者其抗原片段。术语“抗原片段”是指含有至少一个在感染期间被识别的线性表位的一级OspC序列的片段。这样的表位，当在OspC的重组体蛋白亚基中表达时，可保留结合被感染所诱导的抗体的能力，该结合方式类似于结合在细胞表面处表达的野生型蛋白质。在个体抗原片段中可以含有一个以上不同的表位。本领域的技术人员将认识到，对于表位的抗体亲合性或者抗体亲抗原性的测量法多少不很精确，并且亲合性/抗体亲抗原性在免疫反应期间可以显著地改变，比如通过亲合力成熟/体细胞高变（hypermutataiton）。然而，一般来讲，与天然的、完整的α螺旋5或者环5所显示出的亲合性相比，抗体结合嵌合蛋白质的亲合性/抗体亲抗原性是在至少大约50%、优选大约60%、更优选大约70%、进一步优选大约80%、最优选大约90-100%或者甚至更大的范围内。一般来讲，被包含于嵌合蛋白质中的抗原性序列将含有大约20至大约100个氨基酸、优选大约30至大约70个氨基酸。并且嵌合蛋白质本身将含有总共大约160至大约800个氨基酸、优选大约240至大约560个氨基酸。另外，抗原性序列在此可以是指“表位”，无论它们是否包括全部“天然的”表位，只要它们具有在此描述的抗体结合特征即可。
可选地，当被包括在嵌合蛋白质中时，合适的抗原片段或者抗原性序列或者表位可以通过它们的能力被鉴别，所述能力是在被给予嵌合蛋白质的寄主中引起合适的针对表位的抗体产量。本领域的技术人员将认识到，抗体滴度的定义可以改变。在此，“滴度”是指抗血清的反转稀释度，所述抗血清会结合被100ng测试蛋白质涂覆的ELISA孔上可利用的结合位点的一半。一般来讲，合适的抗体产量的特征在于抗体滴度在大约100至大约100,000的范围内，优选在大约10,000至大约10,000,000的范围内。可选地，特别是在诊断测定中，所述“滴度”应该是结合背景水平的大约三倍。例如，若被认为是“阳性”，在测试中的反应性应该是比在来自未受感染个体的血清中检测的反应性大至少三倍。优选地，抗体反应是防护性的，即，与未被接种的寄主相比，可防止或者减轻在后来暴露于疏螺旋体的被接种的寄主中病症的发展。
根据本发明的一个示例性嵌合蛋白质的氨基酸序列被显示于图9B中。在该示例性实施方式中，嵌合体含有来自OspC类型A的环5区氨基酸序列、以及来自OspC类型B、K和D的α螺旋5区序列。该情况下，OspC类型A序列是来自菌株LDP56，核苷酸登录号为EF053513并且蛋白质登录号为ABK41054；OspC类型B是来自菌株LDP73，核苷酸登录号为EF053525并且蛋白质登录号为ABK41066；OspC类型K是来自菌株LDP89，核苷酸登录号为EF053523并且蛋白质登录号为ABK41064；OspC类型D是来自菌株LDP116，核苷酸登录号为EF053527并且蛋白质登录号为ABK41068。本领域的技术人员将认识到，来自许多种疏螺旋体菌株的OspC已知、或者可以被发现，并且可以在本发明的实施方式中使用。示例性嵌合构建体的序列在本文中有描述，或者表示为SEQ ID NO：。
本领域的技术人员将认识到，虽然在本发明的一些实施方式中，被选择用于本发明嵌合蛋白质内含物的氨基酸序列直接地对应于OspC蛋白质的原始或者天然序列的一级氨基酸序列，这并不是必要条件。被包含于本发明的嵌合蛋白质中的表位的氨基酸序列多少可以改变，并且仍然适合于在本发明中使用。例如，在不对表位引起免疫反应的能力产生有害效应的情况下，可以进行某些保守性氨基酸取代。本领域的技术人员将认识到这样的保守性取代的属性，例如一种带正电荷的氨基酸取代另一种带正电荷的氨基酸；一种带负电荷的氨基酸取代另一种带负电荷的氨基酸；一种疏水性的氨基酸取代另一种疏水性的氨基酸；等等。在本发明的嵌合蛋白质中包含的表位序列的所有这样的取代或者改变应被理解为包括在本发明的范围内，只要最终的表位仍然具有引起合适的免疫反应的作用即可。另外，被包含于本发明的嵌合蛋白质中的氨基酸序列不需要包括全长的含有天然表位或表位的结构域。本领域的技术人员将认识到，出于多种原因，已知为表位、或者包含表位的截断型氨基酸序列可以优选被用于本发明，只要这些序列满足表位标准即可。如此被取代或者改变的氨基酸序列在此可以是指“基于”或者“衍生于”原始野生型或者天然序列。一般来讲，线性表位“衍生于”其、或者线性表位“基于”其的OspC蛋白质是OspC蛋白质，因为它们自然地产生。这些天然的OspC蛋白质可以可选地被称为天然的蛋白质或者野生型蛋白质。
初级序列的这些改变可以出于多种原因中的任何一个而被引入，例如：删除或者引入蛋白酶裂解位点；增强或减弱溶解度；促进或者阻碍分子内或者分子间相互作用例如折叠、离子相互作用、盐桥等，所述相互作用或许会另外干扰单个表位的呈递（presentation）和沿着嵌合体长度的可接近性。所有这样的改变应被理解为包括在本发明的范围内，只要得到的氨基酸序列具有针对表位来源的OspC类型引起保护性抗体反应的作用即可。一般来讲，这些被取代的序列与天然蛋白质中对应的序列有至少大约50%相同，优选与野生型序列有大约60-70%、优选70-80%、或80-90%、优选大约95-约100%相同。
在本发明的一些实施方式中，在嵌合疫苗原中的单个线性表位通过间插序列被彼此分离，所述间插序列在性质上或多或少是中性的，即它们不会自动地引起对疏螺旋体的免疫反应。这样的序列可以存在或者可以不存在于嵌合体的表位之间。如果存在，它们例如可以具有分开表位的作用，并且有助于表位彼此立体分离。作为另一种选择，这样的序列可以是通过重组加工工艺、例如克隆工艺而进行简单地人工构造。这样的序列典型地被称为连接物（linker）或者间隔肽，其许多实例已为本领域的技术人员所熟知。参见，例如Crasto,C.J.and J.A.Feng.2000.连接物：产生用于融合蛋白的连接物序列的程序.ProteinEngineering,13（5）：309-312，其是一篇描述非结构化连接物的参考文献。也可以通过使用例如已知具有二级结构的现有序列、或者通过使用基本的已知用于设计连接物的生物化学原理来设计结构化（例如螺旋状）序列连接物。另外，其他的元件可以存在于嵌合蛋白质中，例如前导序列或者可“标记（tag）”蛋白质以便于蛋白质提纯或者检测的序列，其实例包括但不限于：组氨酸标记，检测标记（例如S-Tag、或者Flag-tag），其他的抗原性氨基酸序列比如已知的含有T细胞表位的序列和蛋白质固定化基序等。另外，嵌合蛋白质可以被化学改性，例如通过酰胺化、磺酰化、脂质化、或者其他已为本领域的技术人员所熟知的技术来改性。
本发明进一步提供编码本发明的嵌合蛋白质的核酸序列。这些核酸包括DNA、RNA、以及它们的杂交物等。另外，本发明包括载体含有或者藏有这些编码序列。合适的载体的例子包括但不限于质粒、黏粒、基于病毒的载体、表达载体等。在一种优选实施方式中，载体将是质粒表达载体。
可以通过任何合适的方法生产本发明的嵌合蛋白质，其许多已为本领域的技术人员所熟知。例如，蛋白质可以被化学合成、或者通过使用DNA重组技术（例如在细菌细胞中、在细胞（哺乳动物、酵母或者昆虫细胞）培养物中、在植物或者植物细胞中、或者通过无细胞的基于原核或真核的表达系统、或者通过其他的体外体系等）生产。
本发明还提供用于引起免疫反应的组合物，其可以被用作疫苗来预防或者治疗疏螺旋体感染，特别当表现为莱姆病（疏螺旋体莱姆病）时。至于“引起免疫反应”，我们是指抗原给药，当例如通过并入3H胸腺嘧啶脱氧核苷测量时，会引起特异性抗体合成（以如上所述的滴度）和/或细胞增殖。至于“疫苗”，我们是指可引起免疫反应的嵌合蛋白质，免疫反应导致对抗疏螺旋体攻击的防护，与未接种的（例如单独为佐剂）对照生物体相比，或者全部地预防、或者部分地预防或阻止与疏螺旋体感染（即莱姆病症状）有关的症状的发展。该组合物包括一个种以上在此描述的被基本纯化的重组体嵌合蛋白质、以及药理学上合适的载体。在组合物中的多个嵌合蛋白质可以相同也可以不同，即组合物可以是不同嵌合体的“混合物（cocktail）”，或者组合物仅含有单一类型的嵌合体。这样的用作疫苗的组合物的制备为本领域技术人员所熟知。典型地，这样的组合物或者作为液体溶液制备或者作为悬浮液制备，然而，也期待固体形式比如药片、丸剂、粉末等。还可以制备在给药之前呈适合于溶于或悬浮在液体中的固体形式。该制品还可以被乳化。可以将活性成分与药学可接受的、并且与活性成分兼容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、或它们的组合。另外，组合物可以含有较小含量的辅助物质比如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。本发明的疫苗制品可以进一步包含佐剂，其合适的例子包括但不限于Seppic、Quil A、Alhydrogel等。如果希望口服形式给药该组合物，则可以加入不同的增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或者粘合剂等。本发明的组合物可以含有任何这些附加的成分，以便以适合给药的形式提供该组合物。在配方中嵌合蛋白质的最终含量可以变化。然而，一般来讲，在配方中的含量是约0.01-99%w/v。
该方法涉及将在药理学可接受的载体中包含嵌合重组体蛋白质的组合物给药于哺乳动物。本发明的疫苗制品可以通过本领域技术人员所熟知的许多合适方法中的任何一种被给药，包括但不限于通过注射、吸入、口服、鼻饲、通过摄取含有嵌合蛋白质的食品等。在优选的实施方式中，给药方式是皮下注射或者肌内注射。另外，组合物可以与其他的治疗形态比如可加强免疫系统的物质、化学治疗剂等一起被给药。
本发明提供的方法可在哺乳动物中引起对疏螺旋体的免疫反应、以及接种疫苗对抗疏螺旋体感染。在一种实施方式中，哺乳动物是人类。然而，本领域的技术人员将认识到，还期望其他的哺乳动物进行这样的疫苗接种，例如所述制品也可以用于兽医目的。其例子包括但不限于伙伴性“宠物”比如狗、猫等；食品来源动物、劳动动物和娱乐性动物比如牛、马、牛、绵羊、猪、山羊等；甚至用作疏螺旋体蓄积库的野兽（例如小鼠、鹿）。本发明还提供了一种诊断和方法，用于通过使用该诊断来鉴别个体，所述个体具有针对在本发明的嵌合蛋白质内部所含表位的抗体。使来自怀疑已暴露于疏螺旋体、或者处于暴露于疏螺旋体危险之中的个体（例如人类、鹿、或其他对疏螺旋体螺旋体感染敏感的哺乳动物）的生物样品接触本发明的嵌合蛋白质。通过使用已知的方法，可检测生物样品中在嵌合蛋白质和抗体之间结合反应的存在或者不存在。阳性结果（结合发生，因此存在抗体）表明个体已经暴露于和/或感染疏螺旋体。在该关系中，取决于分析的目标，对任何所关注的OspC类型子集特异的嵌合体可以被构建，即所有可能的OspC类型可以或者可以不被包含于诊断性嵌合体中。
另外，本发明的诊断方面不限制在临床使用或者家庭使用，但是也可以作为研究工具对实验室中使用有价值，例如用来鉴别来自蜱的疏螺旋体螺旋体分离株，研究OspC类型的地理分布等。
本发明还包括针对在此公开的表位和/或嵌合蛋白质的抗体。这些抗体可以是多克隆的、单克隆或者嵌合的，并且可以以本领域的技术人员已知的任何方式产生。在本发明的一种优选实施方式中，抗体是杀菌性的（杀疏螺旋体的），即疏螺旋体螺旋体暴露于抗体会引起螺旋体死亡。这些抗体可以以多种方式使用，例如作为检测试剂来诊断在前已暴露于疏螺旋体；作为试剂盒中的试剂用于研究疏螺旋体、用于治疗疏螺旋体感染等。
提供下述实施例以显示本发明的不同具体实施方式，但是不应被认为以任何方式进行限制。
实施例
实施例1.在侵袭性的人类莱姆病分离株中OspC类型多样性的显示和此前未被表征的限定OspC抗体反应特异性的表位的鉴别
引言
莱姆病是通过感染了伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体或者嘎氏疏螺旋体的蜱（Ixodesticks）叮咬而被传递给人类的。外表面蛋白C（OspC）被认为是重要的与传递过程有关的、并且可能与哺乳动物中早期感染建立有关的毒性因子（Grimm et al.,2004；Pari et al.,2004；Schwan et al.,1995）。OspC是可变的、大约22kDa、表面暴露的、被质粒编码的脂蛋白（Fuchset al.,1992；Marconi et al.,1993；Sadziene et al.,1993）。已经测定了三种OspC蛋白质的晶体结构（Eicken et al.,2001；Kumaran et al.,2001）。该蛋白质是大螺旋状，具有5个通过可变的环连接的5α螺旋。已经假定这些环形成配体结合结构域（Eicken et al.,2001；Kumaranet al.,2001）。证据建议OspC可能通过用作可结合于唾液腺中未鉴别受体的黏附素而有助于来自蜱中央管的螺旋体转位（Pal et al.,2004）。已经在数个复发性发烧组的种类中鉴别出OspC的直向同源物，所述复发发烧组引起OspC关联蛋白在其他疏螺旋体种类中进行类似作用的可能性（Marconi et al.,1993；Margolis et al.,1994）。OspC表达受环境调控、受蜱叮咬诱导，并且OspC在哺乳动物早期感染期间是主要的抗原（Alverson et al.,2003；Schwanet al.,1998；Stevenson et al.,1995）。转录至少部分地受RpoN/S调节网络调控（Hubner et al.,2001）。应该注意，关于在传染期间和在早期感染期间OspC表达的暂时性质的精确细节的报告存在矛盾（Ohnishi et al.,2001；Schwan et al.,1995）。
OspC显示出显著的基因和抗原性的多样性（Theisen et al.,1995；Theisen et al.,1993）。已经描绘了21个OspC种类组（此后称作OspC类型）（Seinost et al.,1999；Wang et al.,1999）。OspC类型按字母名称（A至U）来区分。在数据库中的数百种OspC氨基酸序列的分析表明，在OspC类型之间的差异可以高达30%，虽然在一个类型内部的差异通常小于6%。Seinost et al.已经假设在OspC类型A、B、I和K与人身上侵袭性感染之间的相关性（Seinostet al.,1999）。Lagal et al.也报道说，特异性的OspC变体，正如单链构型多形性分析所定义的那样，与侵袭性的人类感染相关联（Lagal et al.,2003）。然而，Alghaferi和同事的最近研究已经怀疑该相关性的强度（Alghaferi et al.,2005）。OspC类型或序列对功能和寄主-病原体相互作用的影响代表了重要的且广阔的研究领域。已经研究OspC用于莱姆病疫苗的开发（Bockenstedt et al.1997；Gilmore et al.,2003；Gilmore et al.,1999a；Probert et al.,1994；Theisen et al.,1993；Wilske et al.,1996）。然而，OspC变化和对于OspC抗原结构的有限的认识使这些努力复杂化了。OspC具有保护能力，但是仅对抗相同的菌株（Bockenstedt et al.1997；Gilmore et al.,1999；Gilmore et al.,1999b；Probert and LeFebvre,1994；Wilske et al.,1996）。这建议防护性表位存在于序列高度可变的蛋白质区域内部。
本研究的目标是数种交迭。首先，通过测定侵袭性和非侵袭性分离株的OspC类型，来寻求在OspC类型与侵袭性感染之间的假定相关性的进一步评估，所述分离株由马里兰州限定的病人群体中回收。其次，通过测定响应值是否是类型特异性的，寻求更好地理解对于OspC的抗体反应。最后，通过鉴别在小鼠感染期间可引起抗体反应的表位，寻求OspC抗原结构的定义。在本文中出现的数据表明，与侵袭性感染有关的OspC类型的数目大于此前假定的数目（Seinost et al.,1999）。另外，我们已经鉴别了两个此前未被表征的表位，并且显示对于OspC的抗体反应呈现为类型特异性。这些分析提供了如下重要信息：增强我们对于OspC在莱姆病发病机理中的作用的理解，并且便于构建基于OspC的疫苗。
实验工序
细菌分离株、培养和感染血清的产生。从马里兰州病人身上回收的莱姆病分离株被用于这些分析（表1）。在研究之前病人提供的通知同意经约翰霍普金斯药物研究审查委员会（John Hopkins Medicine Institutional Review Board）批准。螺旋体在BSK-H完全培养基（Sigma）中于33°C下进行培养，通过暗视野镜检进行监控，并且通过离心来收获。对于一些分离株，按照此前的描述通过表面下平板法（sub-surface plating）（Sung et al.,2000）产生克隆株群。为了测定单个菌落的OspC类型，对OspC基因进行PCR扩增、测序和比较性序列分析（如下所述）。为了产生对抗一系列表达已知类型OspC蛋白质的克隆株群的抗血清，将103个螺旋体在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并且用接种针接种入C3H-HeJ小鼠（皮下，在肩胛间；Jackson Labs）。在接种后2周或4周，按照此前描述的方法（Zhanget al.,2005），使用靶向flaB基因的引物，通过耳朵冲孔活检样本的实时PCR，证实小鼠感染。通过尾部剪断，从第0、2、4和8周的每个小鼠上收集血液，并且收获感染血清。已经在此前描述过在这些分析中使用的附加抗血清和感染血清（McDowell et al.,2002）。
表1.细菌的分离株、来源信息和OspC类型。
伯氏疏螺旋体分离株 来源 OspC类型
B31MI 蜱 A
5A4 来源于B31MI的克隆 A
LDP56 人血 A
LDP61 人血 A
LDP60 人血 A
LDP80 人血 A
LDP76 人血 A
LDS106 人类皮肤 A
LDP73 人血 B
LDS79 人类皮肤 H
LDS101 人类皮肤 H
LDP84 人血 C
LDP63 人血 N
LDC83 人类CSF N
LDP120 人血 N
LDP74 人血 K
LDS81 人类皮肤 K
LDS88 人类皮肤 K
LDP89 人血 K
LDP116 人血 D
DNA分离、OspC类型和计算机辅助的结构分析。为了测定OspC类型，按照此前所描述的（Marconi et al.,2003）从每个菌株分离总的DNA，并且用作模板用于PCR，使用OspC20（+）LIC和OspC210（-）LIC引物（表2）。使用扩展高保真聚合酶（Expand HighFidelity polymerase）（罗氏），采用下述循环条件，进行PCR：初始变性，94°C下2分钟；94°C下15s、50°C下30s、68°C下60s，10个循环；94°C下15s、50°C下30s、68°C下60s（最后20个循环中的每一个增加附加的5s）；最后的延伸，68°C下7分钟。使用QiaQuick PCR提纯试剂盒（Qiagen）回收扩增子，用T4DNA聚合酶处理以便产生单链的悬垂，退火进入PET-32Ek/LIC载体（Novagen），并且转化进入大肠杆菌NovaBlue（DE3）细胞（Novagen）。制造商描述了用于这些工序的方法。选择菌落的氨苄青霉素抗性（50μgmL-1），通过PCR筛选用于OspC插入物。将选出的菌落转移进入LB肉汤（Fisher），于37°C下摇动（300rpm）培养，并且使用QiaFilter Midi质粒分离试剂盒（Qiagen）分离质粒。在服务付费基础（MWG Biotech）上，对OspC插入物测序。翻译测定的序列，并且使用具有缺省参数的ClustalX(35)进行排列。为了测定OspC类型，产生相邻的连接树，并且计算自展值（1000次试验）。用N-J绘图仪目测得到的系统发生图。在分析中包含数据库中可利用的附加的OspC序列。使用在网址ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3dshtml下可利用的NCBI分子模型数据库文件1GGQ,1F1M、以及1G5Z（4,15）和CN3D软件，产生OspC的结构模型。
表2.在该研究中使用的聚合酶链反应引物。
Figure BDA00003370568800231
a加有下划线的LIC尾部序列
重组体蛋白质的产生。为了产生全长和平截的OspC，以为伯氏疏螺旋体B31MI的OspC类型A序列（Fraser et al.,1997）基础设计引物。该引物具有允许退火进入PET-32 Ek/LIC载体（Novagen）的尾部序列、不依赖连接酶的克隆（LIC）和表达载体。所有LIC工艺此前已有描述（Hovis et al.,2004）。为了验证所有构建体的序列，使用QiaFilter Midi质粒提纯试剂盒（Qiagen）从大肠杆菌NovaBlue（DE3）细胞中提纯重组体质粒，并且对插入物测序（MWG Biotech）。
SDS-PAGE和免疫印迹分析。按照此前描述的方法（Roberts et al.,2002），通过SDS-PAGE，在12.5%标准预制凝胶（Criterion Precast Gels）（Biorad）中分离蛋白质，并且免疫印迹到PVDF膜（Millipore公司）上。使用S蛋白质辣根过氧化物酶（HRP）共轭物（Novagen），证实重组体蛋白质的表达。该共轭物可检测被所有在该研究中使用的重组体蛋白质所携带的N末端S-Tag融合。该HRP共轭的S蛋白质在1:10,000的稀释度下使用。对于免疫印迹分析，从感染小鼠中收集的血清在1:1000的稀释度下使用。HRP共轭的山羊抗小鼠IgG用作第二抗体（Pierce），并且在1:10,000的稀释度下使用。一般的免疫印迹方法此前已有描述（Metts et al.,2003）。
结果
从马里兰州莱姆病病人中回收的分离株的OspC类型分析。由每一个被分析的分离株成功地扩增OspC，所述分离株是从马里兰州莱姆莱姆病病人中回收的。测定每个扩增子的序列，并且进行比较序列分析来确定OspC类型（图1）。包括A（n=6）、B（n=1）、C（n=1）、D（n=1）、H（n=2）、K（n=4）和N（n=3）的有代表性的数种不同的OspC类型被鉴别。此前已经报道说仅OspC类型A、B、I和K与在人类身上侵袭性感染有关（Seinost et al.,1999）。在该研究中，侵袭性的分离株被限定为从血液、器官或者脑脊髓液中回收的分离株；反之非侵袭性的分离株是从皮肤中回收、但在其他的身体位置未发现的分离株（Seinost et al.,1999）。然而，在这里显示，一些表达OspC类型C、D、以及N的分离株是从血液（LDP84、LDP63、LDP 116、以及LDP 120）或者脑脊髓液（LDC83）中回收的，因而是侵袭性的。这一现象建议，特定OspC类型与侵袭性感染的相关性可能不是严谨的关系，并且相关性的强度需要再评估。
在小鼠感染期间对于OspC的抗体反应的类型特异性分析。为了确定在感染期间引起的对于OspC的抗体反应是否是类型特异性的，产生类型A、B、C、D、H、K和N重组体OspC蛋白质来用作测试抗原。重组体蛋白质进行免疫印迹，并且用收集自感染了OspC类型A、B、或D（按上述方法测定）的伯氏疏螺旋体分离株的小鼠的血清进行筛选（图2）。通过使用HRP共轭的S蛋白质的免疫印迹筛选，证实了重组体蛋白质在大肠杆菌中的表达和蛋白质的相等加载量，所述S蛋白质可在N末端融合中识别S-Tag。当用在感染2周收集的抗伯氏疏螺旋体B31MI抗血清（OspC类型A）筛选时，检测到仅与类型A蛋白质的强的反应性。该强的并且早期的对于OspC的IgG反应与较早的报告（Theisen et al.,1995；Wilske et al.,1993）一致。在感染8周收集的血清也会与OspC类型A显著地反应，但是观察到很弱的与其他OspC类型的交叉免疫反应性。在感染了LDP 116和LDP 73（分别为OspC类型D和B分离株）的小鼠体内Ab（抗体）对于OspC的反应也是类型特异性的。可以得出如下结论：在对于OspC的抗体反应中存在显著程度的类型特异性，该特异性暗示体内免疫显性表位是位于蛋白质类型特异性结构域的内部。
在小鼠感染期间可引起抗体反应的OspC线性表位的定位。为了鉴别可在感染期间引起抗体反应的OspC类型A的线性表位，产生数种重组体OspC片段，并且用伯氏疏螺旋体B31MI感染血清（8周）筛选（图3）。B31MI是OspC类型A生产菌株。通过用HRP共轭的S蛋白质进行免疫印迹，证实了重组体蛋白质的表达。为了定位OspC的线性表位，用感染血清筛选OspC片段的免疫印迹。含有一个以上表位的两个结构域被定位，一个结构域在α螺旋5残基第168和203位之间的蛋白质C末端一半内部，另一个结构域在螺旋3和环5的残基第136和150位之间（此后，分别称作α5表位和环5表位）。这些表位此前在文献中未被表征。
OspC序列分析和OspC结构的计算机模拟。为了测定环5和α5表位在OspC蛋白质上的空间存在位置，对于单体或二聚形式的OspC类型A（数据未显示），进入通过X射线结晶学分析确定的坐标（Eicken et al.,2001；Kumaran et al.,2001），并且产生带状结构和空间填充模型。单体形式的OspC类型I和E蛋白质也建立模型。这些分析显示，环5表位是被暴露在单体和二聚形式的OspC类型A、E和I蛋白质上的表面。在原始X射线结晶学分析中，N末端和C末端的部分或者不是重组体蛋白质的部分、或者不能被建模。在任何情形中，测定的结构表明N末端和C末端同时存在于彼此紧密接近的位置，并且接近细胞膜。
为了在类型内水平上评估在环5和α5表位内部的序列变化，227个OspC序列被排列。这些分析显示，环5表位和α5表位两者在类型间水平上都是高度可变的，但是在类型内部明显地高度保守。图4提供（以表格形式）了对于每个OspC类型的环5和α5结构域序列，并且显示了频率，利用该频率在被分析的OspC序列中检测了每个特异性序列。作为环5在类型内水平上保守性的证据，57个环5类型A表位序列的比较显示，有53个和边远（outlying）序列相同，所述边远序列仅在一个或两个残基处有差别。对于α5表位，注意到有类似的观察现象。在43个OspC类型A序列中，有42个在残基168和203之间是相同的。注意，分析了少数几个α5表位序列，因为多数情况下数据库中可利用的序列是部分的和缺少改变量的C末端。
实验证明对于环5表位的抗体反应不是只有单个小鼠才有的。考虑到环5的类型内保守性及其相对短的长度，环5表位或许是出色的用于开发嵌合OspC环5基疫苗原的候选对象。为了验证对于环5表位的抗体反应通常发生在感染期间、并且不只是单个小鼠才有，用来自附加的感染了OspC类型A产生菌株B31MI、LDP56和5A4的小鼠的血清筛选含有第130-150位片段的环5的免疫印迹。在所有的情形中，检测到抗体识别该表位（图5）。虽然在来自感染了LDP56的小鼠2的感染血清中对环5的反应较弱，但较长的暴露清楚地显示在该动物中，环5是抗原性的。这表明，匹配这些表位的免疫反应不只是单个动物才有，并且进一步为其用于疫苗开发的可能性提供了支持。
讨论
OspC被清楚地确立为对莱姆病发病机理的重要贡献者（Grimm et al.,2004；Pal et al.,2004；Schwan et al.,1995）。有强有力的证据表明其在莱姆病的螺旋体从中央管转运到唾液腺期间起重要作用（Pal et al.,2004）。另外，其在早期感染期间被选择性地表达，是免疫显性抗原（Fingerle et al.,1995；Schwan et al.,1998；Wilske et al.,1993），并且已经被其他人假设为在莱姆病分离株传播能力中的关键决定因数（Seinost et al.,1999）。该研究的目标是测试在OspC类型和侵袭性感染之间的可能相关性，测定对于OspC的抗体反应是否是类型特异性的，并且进一步通过定位在感染期间出现的线性表位来限定OspC的抗原结构。
OspC的序列分析已经描绘了21个不同的OspC类型（Seinost et al.,1999），并且已经假定这些OspC类型中仅四个（类型A、B、I和K）是与人类身上侵袭性感染有关（Seinostet al.,1999）。然而，最近的研究已经怀疑该假定的相关性（Alghaferi et al.,2005）。为了进一步阐明这一点，测定了从马里兰州病人中回收的侵袭性莱姆病分离株和非侵袭性莱姆病分离株的OspC类型。为了完成该研究，对全长OspC基因进行PCR扩增、测序并且进行比较序列分析。这些分析显示，在该病人群体中，与侵袭性人类感染有关的OspC类型还包括类型C、D、以及N。虽然已经有人建议产生OspC类型I的菌株是与侵袭性人类感染有关的主要类型（Seinost et al.,1999），在马里兰州病人群体中鉴别的侵袭性分离株没有一个携带OspC类型I。类似地，Alghaferi et al.也没有检测出产生OspC类型I的菌株（Alghaferiet al.,2005）。概括地讲，这两个研究已经在大巴尔的摩地区中鉴别出18个侵袭性分离株，它们具有下述分项数字：A，n=5；B，n=2；C，n=1；D，n=1；H，n=1；K，n=3；N，n=7。因此，在该地理区域，似乎是产生OspC类型A和N的侵袭性分离株占优势。这些数据反对了在人类身上仅4个OspC类型与侵袭性感染有关的假设。从来自不同地理区域的更大病人群体中回收的分离株的附加分析将被要求进一步评估OspC类型-侵袭性感染相关性的有效性，并且要求测定在限定的地理区域中在特定OspC类型的发病率方面是否存在差异。
通过用OspC疫苗接种所提供的可变防护性和描绘的不同OspC类型（Seinost et al.,1999），带来了抗体反应可以是类型特异性的可能。该假设得到了下述事实的支持：已经发现OspC疫苗接种可提供仅对抗相同菌株的防护（Bockenstadt et al.,1997；Gilmore et al.,1999a；Probert and LeFebvre,1994）。直至该报告前，在感染期间抗体对于OspC的反应的类型特异性没有被直接地评估。为了阐明这一点，用小鼠体内产生的感染血清筛选一系列全长重组体OspC蛋白质类型A、B、C、D、H、K和N，克隆株群表达已知的OspC类型。感染血清的使用是重要的，因为其允许进行集中评估对于在体内被细菌特异性地提呈的表位的抗体反应。这些分析显示，尽管在OspC的N末端和C末端结构域的内部有强的序列保守性，对于被分析的OspC类型的抗体反应是类型特异性的。例如，来自感染了类型A或者D菌株的小鼠的血清以类型特异性方式是免疫活性的，很少有或者没有与其他OspC类型的交叉免疫反应性。尽管对于21个OspC类型的抗体反应并没有全部进行分析，但上述的数据建议，保守结构域不是免疫显性的，并且在感染期间被细菌提呈的OspC的线性表位是被包含在蛋白质的可变域（类型特异性的结构域）内部。
迄今为止仅几个研究被发表设法定位或者鉴别OspC的表位。已经鉴别线性的和构象的表位。Gilmore和Mbow的研究表明，短至6个残基的前导肽外独立的N末端缺失和13个残基的C端平截消除了单克隆抗体B5的结合（Gilmore et al,1999a；Gilmore,1998）。从这一点可以得出如下结论：B5单克隆抗体可识别构象上限定的表位（Gilmore et al.,1999b）。在该构象上被限定的表位内部包含抗体识别部位的精确的残基未被识别。与用单克隆抗体B5观察到的现象相反，多克隆抗体对于与细胞相关的天然OspC的反应的该分析显示，OspC的末尾10个C末端残基的缺失、或者N-末端延伸区域的缺失没有消除在感染期间诱导的IgG对OspC的识别。该结果差异据推测是集中在多克隆抗体与单克隆抗体比较的反映。该数据当然没有杜绝构象表位的存在，其清楚地表明在OspC中同样存在线性表位。在较早的研究中，Mathieson et al.也报告了在OspC中的线性表位（Mathieson et al.,1998）。他们发现，OspC的C端7个残基构成了可被血清中IgM识别的线性表位，所述血清收集自欧洲的神经螺旋体病（neuroborreliosis）病人。虽然在该报告里没有评估IgM结合，但OspC的C端10个残基的缺失没有消除IgG结合。被感染诱导的IgG识别的表位显示出被定位在蛋白质中数个位点处。然而，这并不建议C末端表位不存在或者不被感染期间诱导的抗体所识别，而是建议在OspC中有附加的表位位于别处。
越短的OspC片段的免疫印迹分析允许越精确的OspC表位定位。OspC的抗原性的区域被定位在两个区域。一个区域跨越残基第136-150位，而另一个区域跨越残基第168-210位。使用来自X射线衍射分析的坐标而产生的结构模型将残基136-150主要置于表面被暴露的环（被称为环5）的内部（Kumaran et al.,2001）。在OspC的单体模型和二聚模型中，环5都被表面暴露，并且位于突出弯曲（prominent bend）的内部。虽然已经表明重组体OspC实际上的确可形成二聚体，但还没有测定天然的OspC是否在体内形成二聚体或者更大的低聚物。OspC的二聚体模型显示出包含大于>30%蛋白质的显著被埋的界面。这种程度的被埋的界面建议在单体之间有紧密的相互作用，并且被认为显示了蛋白质的二聚型是其生物学活性形式[Kumaran et al.,2001；Eicken et al.,2001；Zuckert et al.,2001]。在OspC二聚体中，在环5内部的残基据预测是假定的构象限定的配体结合性袋（binding pocket）的一部分，可能具有生物学意义。这一荷电的口袋排列有含有羰基的氨基酸比如谷氨酸和天冬氨酸残基。已经测定了三种OspC蛋白质类型A、I（Kumaran et al.,2001）和（Eickenet al.,2001）的晶体结构。在所有这些蛋白质中，该假定的结合袋的溶剂结构明显地很保守。在感染血清中环5接近抗体支持了如下假定：该结构域可以是暴露的表面，并且潜在地可用于配体结合。尽管环5和假定的配体结合袋有强的类型间结构保守性，但该结构域的序列在类型间水平上是高度可变的。跨越残基第168至210位的α5结构域的序列在类型间水平上也是可变的，除了末尾20个残基高度保守之外。为了测定在类型内水平上是否存在足够的保守性以便允许构建由一系列类型特异性表位组成的嵌合OspC疫苗，OspC序列被排列，并且构建树形图。通过这些分析，对OspC类型测定了227个序列（数据未显示）。环5和α5表位两个都被发现在类型内水平上是很保守的。例如，OspC类型A蛋白质的环5表位在57个序列中的54个序列中是相同的，而α5表位在43个类型A序列中的42个序列是保守的。在其他的OspC类型中同样记录到这些结构域的显著保守性，包括类型C-I、M、N和O都显示出在环5和α5表位内部绝对的类型内保守性。
该研究表明，与此前识别的分离株相比，在侵袭性分离株当中有更大的OspC多样性。该研究还表明，在小鼠体内对于OspC的抗体反应主要是类型特异性的，并且受此前未被表征的环5和α5表位限定。早期的研究和本发明提供的数据清楚地表明，单一的OspC蛋白质不会输送对抗不同菌株的防护性（Bockenstedt et al.,1997）。一个可能的疫苗接种方法是利用在这报告中被识别的表位，用于开发重组体嵌合OspC疫苗原。环5表位或者环5表位与α5表位的组合可能最有前途，如果它们还被证明是在人类身上一致具有抗原性的话。这些表位长度相对较短、线性、并且在类型内水平上高度保守。就这些特征而言，应该证明构建环5-α5嵌合疫苗原在技术上是可行的，该嵌合疫苗原可以传送对抗高度多样性的莱姆病分离株的防护性。
实施例2.分析人身上对于OspC类型A环5结构域的抗体反应，并且评估环5表位在莱姆病疫苗开发中的可能应用
莱姆病螺旋体的外表面蛋白质C（OspC）是22kDa的免疫显性（Fuchs et al.,1992）抗原，一旦蜱叮咬以及在早期感染期间，该抗原就被表达（Schwan et al.,1995）。尽管强的对于OspC的抗体反应在自然感染期间被发动，但该反应不会导致细菌的清除，因为在感染建立之后不久OspC生产就被关闭（Schwan et al.,1995）。OspC已经呈现为重要的毒性因子，并且作为可能的莱姆病疫苗开发候选对象。然而，发展基于OspC的疫苗的努力受到了菌株异质性的阻碍（Theisen et al.,1993；Wilske et al.,1996；Wilske et al.,1993）。尽管用OspC进行疫苗接种可引起高度防护性的反应，但大量的研究仅报告菌株特异性的防护（Bockenstedt et al.,1997；Gilmore et al.,1996；Mbow et al.,1999；Probert et al.,1997；Rousselle et al.,1998；Scheiblhofer et al.,2003）。最近的分析已经显著加深了我们对于OspC抗原结构的和菌株特异性防护基础的理解。已经限定了21个表示为类型A-U的OspC（Lagalet al.,2003；Seinost et al.,1999；Wang et al.,1999）。通过用可产生特异性OspC类型的伯氏疏螺旋体的克隆株群感染小鼠，已经表明在早期感染期间的抗体反应主要是OspC类型特异性的（参见实施例1）。这就建议在早期感染期间提呈的主要的表位很可能存在于OspC的类型特异性结构域的内部。虽然较早的研究建议21个OspC类型中的仅4个与侵袭性感染有关（Seinost et al.,1999），但最近的研究已经表明，产生附加OspC类型的分离株也可以建立侵袭性感染（Alghaferi et al.,2005；实施例1）。然而，OspC类型A显示出在人类身上引起侵袭性感染的菌株中是主要的。OspC类型A的表位图谱分析显示，可在小鼠中引起反应的主要的线性表位之一存在于环5结构域内部（参见实施例1）。环5结构域在类型间水平上是高度可变的，但是在给定类型的序列内部是保守的（参见实施例1）。在本发明的研究中，我们细化了表位的定位，表明其表面暴露在完整的细菌上，并且表明其可诱导出杀菌性抗体。
设法限定OspC的免疫显性表位的大量研究一直用小鼠来进行（Bockenstedt et al.,1997；Gilmore et al.,1996；Mbow et al.,1999；Probert et al.,1994）。然而，已经表明，对一些表位的抗体反应在用于人类时相对于小鼠及其他哺乳动物有差别（Lovrich et al.,2005）。本发明研究的第一目的是测定OspC的环5结构域是否可被在人类感染期间引起的抗体所识别。理想的是，用收集自感染了类型A产生菌株克隆株群的个体的血清进行这些分析。因为人们不能绝对必然地确定个体是否感染了异质的或者同质的群体，我们设法识别可显示出对类型A特异性序列的反应的病人血清。为了完成该研究，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选收集自红斑迁移（早期莱姆病）病人的血清样品组。含有环5残基第130至150位的重组类型（r-类型）OspC类型A和r-OspC类型A亚片段被用于涂覆96孔板（250ng的r-蛋白质/孔；0.1M Na2HPO4；4°C过夜）。该孔板被封闭（磷酸盐缓冲盐水中10%脱脂奶粉、0.5%吐温20；37°C，2h）并洗涤，将莱姆病病人血清（稀释1:400）加至每个孔中（37°C；1h）。加入被辣根过氧化物酶共轭的山羊抗人免疫球蛋白G（IgG；Sigma）（50μL的1:40,000稀释度）（1h；37°C），接着按照供应商（Sigma）指示加入TMB底物（3,3,5,5-四甲基联苯胺）。使用孔板阅读器测定在450nm处的光密度数值。另外的孔用牛血清白蛋白涂覆，用作阴性对照。所有测定一式三份进行。平均A450值被显示，具有标准偏差。如图6所示，数种血清样品被发现具有强的对于全长OspC类型A和环5片段的IgG反应。血清样品8和44展示出与环5片段的最强的免疫反应性，由此选择用于进一步分析。
为了更精确地限定可被感染诱导的抗体识别的环5结构域内部的残基，用来自病人8和44的血清、并且用来自感染了OspC类型A产生菌株B31MI（参见实施例1）的克隆株群的小鼠的血清筛选PepSpot矩阵。PepSpot矩阵由具有12至13个的残基的跨越OspC类型A的环5结构域的重叠的肽（两个氨基酸的节距）组成，所述肽已被转印到Whatman50纤维素膜（150nmol/cm2；JPT肽技术有限公司，柏林，德国）上。该PepSpot膜被封闭（Tris-0.5%吐温20缓冲液盐水中5%脱脂奶粉），洗涤，用小鼠和人类血清样品（分别在封闭溶液中稀释1:1,000和1:400）筛选，并且用种类特异性抗IgG抗血清检测抗体结合性。尽管组成免疫活性的结构域的特定的残基在小鼠中和人类中略微有差别，但主要的表位被定位在残基130至146内部（图7）。在OspC类型A序列中，该区域包括α螺旋3的C末端区域和环5的N末端部分。
OspC的晶体结构在空间上将环5设置在蛋白质的突出弯曲上（Eicken et al.,2005；Kumaran et al.,2001；图24）。已经假定该环为配体结合袋的一部分（Kumaran et al.,2001）。为了确定环5是否被展示在细胞表面，并且是否能够接近在体外生长的螺旋体中的抗体，使用抗环5抗血清进行免疫荧光测定（IFA）。用伯氏疏螺旋体B31MI（OspC类型A）、帕氏疏螺旋体（B.parkeri）、以及S-Tagr-环5类型A的完整细胞裂解液进行的免疫印迹分析表明，环5抗血清是特异性的，建立了该抗血清对于IFA的适用性。IFA中被分析的菌株由伯氏疏螺旋体B31MI（OspC类型A）和LDP74（OspC类型K）组成。螺旋体在33°C下培养，并被转移至37°C培养3天，以便刺激OspC表达。用可被透化的细胞（丙酮固定）、不可被透化的细胞（空气干燥）、以及此前描述的标准方法（Roberts et al.,2002）进行IFA。用1:1,000稀释度的小鼠环5抗血清、小鼠预免疫血清、或兔鞭毛蛋白抗血清掩蔽载玻片。通过使用被Alexa Fluor 568共轭的山羊抗小鼠IgG或者被Alexa Fluor 488共轭的山羊抗兔IgG（封闭缓冲液中10μg mL-1）完成了检测。视情况而定，在使用若丹明或者荧光素滤光器装置的Olympus BX51荧光范围上目测载玻片，或者通过暗视野镜检，并且使用Olympus MagnaFIRE照相机拍照。通过IFA观察到的标记是高度特异性的，并且与免疫印迹分析一致；产类型A的分离株被表面标记，而伯氏疏螺旋体LDP74 OspC类型K未被标记（数据未显示）。另外，与在升高的温度下OspC的上调一致，IFA显示出与细胞在33°C下生长相比，在37°C下生长的螺旋体具有显著更大表面标记。可识别被内侧膜锚定的外周胞质蛋白质的抗FlaB抗血清，没有标记不可被透化的细胞，但是容易地标记被用丙酮透化的细胞（数据未显示）。该对照表明，环5表位实际上是被暴露的表面，并且在IFA中采用的实验条件没有破坏细胞完整性，因此可人工地暴露不是天然存在于细菌表面上的表位。
环5抗血清在细胞表面处有效地结合于OspC的能力带来了可以是杀菌性相互作用的可能性，如同已经表明的抗体对全长OspC的相互作用那样（Bockenstedt et al.,1997；Ikushima et al.,2000；Jobe et al.,2003；Lovrich et al.,2005；Rousselle et al.,1998）。为了确定靶向环5的抗体是否也显示出杀菌性活性，用在33°C或者变化至37°C的温度下培养的伯氏疏螺旋体分离株B31MI和LDP74进行杀灭测定。通过离心收获螺旋体，洗涤，调节至5x105个细胞每500L（在BSK-H培养基中），并且将12.5μL转入无菌的0.65mL微型离心管中。然后，在有或者没有豚鼠补体（7.5μL；Sigma Chemical公司，圣路易斯市，密苏里州）的情况下，加入10μL加热灭活（56°C；30分钟）的环5血清，将这些组分混合物，并且在33或37°C下孵育8h。加入总共70μL的H2O，并且螺旋体根据制造商的说明书用Live/Dead BacLight染色剂（分子探针，Eugene市，美国俄勒冈州）染色。简言之，将两个染色剂SYTO 9和碘化丙啶加至细胞。这些染料可以将活细菌（即，具有完整的细胞膜）与具有破损细胞膜（compromised membranes）的细菌区分开来。活细菌由于用SYTO 9染色而发绿色荧光；反之死的或者损伤的细菌由于用碘化丙啶而发红色荧光。一旦用预免疫热失活的血清（在有或者没有补体的情况下）处理，观察到具有破坏的细胞膜的细胞的基线水平为25%。相反，暴露于抗环5抗血清的大约70%的细胞展示出细胞膜破裂。杀菌性活性被测定出是补体依赖性的。一旦用抗环5抗体处理，在这里看到的发泡效果与用其他的抗OspC抗体报告的发泡效果一致（Bockenstedt et al.,1997；Escudero et al.,1997）。同样重要的是注意到，与在升高的温度下OspC的上调一致，在37°C下培育的螺旋体中死细胞的百分比相比在33°C下培养的细菌（数据未显示）一致较高。从本发明的数据中清楚可见，抗环5抗体是杀菌性的。
数个报告已经大致勾勒出莱姆病疫苗开发的清楚而强力的合理性（在Hanson andEdelman，2004中有评述）。然而，目前在市场上买不到疫苗。在开发广谱防护性的莱姆病疫苗的努力中，巴克斯特公司寻求了一种产生含有14个不同全长的r-OspC蛋白质的疫苗混合物的策略（Hanson and Edelman,2004）。然而，混合物被认为是不可接受地反应原性的（reactigenic）。反应原性可能由大量被要求引起对于混合物中每个OspC类型蛋白质的独特防护表位的足够反应的蛋白质所导致。使用多个全长蛋白质的混合物疫苗的潜在问题是可能错误指导抗体对于保守的、不相干的、无防护性的表位的反应。或许可以通过开发嵌合的、r-疫苗原来克服该问题，所述r-疫苗原由天然存在的每一个主要OspC类型的免疫显性的线性表位组成。这一普通思想源于通过使用来自在不同感染阶段被表达的蛋白质的表位来开发疟疾疫苗的努力中（Hanson and Edelman,2004）。相同的思想已经被应用于对抗A组链球菌的六价M蛋白质疫苗的开发、以及对抗数种其他病原体的疫苗开发，具有出色的成功（Apta et al.,2006；Caro-Aguilar et al.,2005；Fan et al.,2005；Horvath et al.,2005；Kotloff et al.,2005；McNeil et al.,2005；Wang et al.,2005）。随着对OspC的物理和抗原结构的新的洞察，现在或许有可能开发有效的、r-多价的、嵌合的OspC疫苗。该新近被识别的环5结构域理想地适合用于这样一种疫苗的内含物中。
实施例3.基于OspC的四价的、重组的、嵌合的疫苗原的开发
莱姆病是在北美洲和欧洲最常见的节肢动物媒介传染病。目前，在市场上买不到用于人类的疫苗。外表面蛋白质C（OspC）具有抗原性和表达特征，这使得OspC成为有吸引力的疫苗候选对象。然而，序列异质性阻碍着其用作疫苗原。序列分析已经鉴别了21个明确限定的OspC种类组或者“类型”（表示为类型A至U）。本研究报告了被表示为在人类和鼠科感染期间OspC类型B、K和D的线性表位的图谱、以及这些表位（连同此前已鉴别的OspC类型A线性表位一起）在重组的、四价的、嵌合体疫苗原开发中的利用。发现该构建体在小鼠体内是高度免疫原性的，并且被诱导的抗体表面可在体外标记被培养的螺旋体。重要的是，疫苗接种诱导出补体依赖性的杀菌性抗体，该抗体可对抗表达每个被并入构建体的OspC类型的菌株。这些结果建议了能够制备出一种作为重组体嵌合蛋白质的有效且广谱防护性的多价的基于OspC的莱姆病疫苗。
材料和方法
伯氏疏螺旋体分离株和培养。
通过按照此前描述的表面下平板法[Sung et al.,2000]获得伯氏疏螺旋体分离株B31MI（OspC类型A）、LDP73（类型B）、LDP116（类型D）和LDP74（类型K）的克隆株群[参见实施例1]。通过PCR扩增（Taq聚合酶，Promega）和OspC的DNA测序，利用系统发生分析[参见实施例1]对类型赋值，测定单个克隆的OspC类型。如同显示的那样，在完全BSK-H培养基（Sigma）中在33或37°C下培养螺旋体。不依赖于连接酶的克隆和重组体（r-）OspC蛋白质的生产。
通过PCR扩增来自每个分离株的对应基因，产生全长OspC类型B、K和D和一系列截断和片段。引物被设计成具有5'悬垂，以便允许在PET-32 Ek/LIC载体中不依赖连接酶的克隆（LIC）（表3）[实施例1]。基本上按照制造商（Novagen）的指导进行所有LIC方法。简言之，在扩增和单链尾部更新以后，扩增子与PET-32 Ek/LIC载体一起退火，该载体被转化进入NovaBlue（DE3）大肠杆菌细胞中并且增殖。回收质粒，并且通过DNA测序证实插入序列。对于蛋白质纯化，纯化的质粒被用于转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞，并且在对数生长期期间通过向培养液中添加IPTG（1mM）、接着温育三个小时来诱导蛋白质表达。通过由PET-32Ek/LIC载体表达而增加的N末端融合含有Trx标志（Trx-tag）、S标志（S-tag）、以及六组氨酸（hexahistidine）（His标志（His-tag））基序。该His-tag被利用以便允许通过镍亲和层析法纯化r-蛋白质。简言之，细胞被裂解，并且核酸和细胞壁肽聚糖分别被Benzonase核酸酶和r-溶菌酶降解。按制造商的方案（Novagen），通过离心（16000xg，15分钟）澄清可溶性蛋白质，经过固定化镍柱，洗涤，洗脱。洗脱的蛋白质在磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.4）中用10kDa分子量截止膜（Slid-a-lyzer，Pierce）充分透析，最后的蛋白质浓度通过BCA测定（Pierce）被量化，并且通过SDS-PAGE评估制品的纯度。
表3.在各种OspC类型片段产生中使用的PCR引物。LIC尾部是粗体。
Figure BDA00003370568800331
Figure BDA00003370568800351
Figure BDA00003370568800371
Figure BDA00003370568800381
免疫印迹分析：OspC类型B、D、以及K的表位图谱。
为了允许用于在感染期间相关表位的绘图，用104个表达OspC类型B、K、或D的螺旋体克隆株群感染C3H/HeJ小鼠，并且在第2、4、6、8和12周通过尾部出血收集血液。这些血清被用于筛选如在实施例1中描述的纯化的OspC蛋白质和截断。对r-蛋白质进行SDS-PAGE，转印至PVDF，并且用1:1000稀释度的类型特异性的鼠感染血清掩蔽（在第6周收集）。类似地，用来自已知感染了表达OspC类型B、K、或D的伯氏疏螺旋体菌株（Allen Steere博士友情提供）的病人的血清（1:400）筛选r-蛋白质。使用合适的IgG特异性的、被辣根过氧化物酶（HRP）共轭的第二抗体，并且通过化学发光来目测结果。
四价嵌合疫苗原的构建和表达。
选择类型A的环5区（氨基酸第131至149位，即aa131-149）和类型B的α螺旋5区（氨基酸第160-201位，即aa160-201）、类型K的α螺旋5区（氨基酸第161-201位，即aa 161-201）、以及类型D的α螺旋5区（氨基酸第161-201位，即aa 161-201）用于四价测试疫苗原中的内含物。由如上所述r-质粒和列于表4中的引物对每一个含有表位的区域进行PCR扩增。PCR条件是标准条件：初始2min94°C变性步骤，接着35个循环的94°C下15秒变性，在50°C下30秒引物退火，以及在72°C下60秒延伸，最后的72°C下延伸7分钟。引物被设计成具有载体特异性的LIC尾部、或者具有非结构化的、蛋白酶抗性的连接物序列作为5'悬垂（图9A）[Crasto and Feng,2000]。通过使用TAE缓冲液，用琼脂糖凝胶电泳分析了所有扩增子，并且进行凝胶纯化（QiaQuick凝胶萃取法，Qiagen）。纯化的产物然后被用作在随后轮次PCR中的模板。在第二轮，将类型A的环5的扩增子和类型B的α螺旋5的扩增子合并作为模板。在变性后，扩增子经由它们的互补连接物序列退火，所述连接物序列允许用于通过使用正向类型A环5引物和反向类型B的α螺旋5引物进行重叠延伸和随后的扩增。按类似方式将类型K和D的α螺旋5序列加至构建体中，不同的是，在第一个10循环之后将退火温度提高到60°C以便提高退火特异性。最终产品被退火至pET-46Ek/LIC表达载体，该载体编码N末端六组氨酸标志融合（Novagen），并且转化NovaBlue（DE3）大肠杆菌细胞。通过对纯化的质粒进行DNA测序，确认疫苗原序列。按如上所述方法完成蛋白质表达和纯化。
表4.在ABKD嵌合疫苗原产生中使用的PCR引物。LIC尾部是粗体，连接物序列加有下划线。
Figure BDA00003370568800411
用四价ABKD嵌合疫苗原免疫小鼠。
12个六周大的雄性C3H/HeJ菌株小鼠被用50μg的嵌合疫苗原免疫，所述嵌合疫苗原已以1:1的比率与完全弗氏佐剂（CFA）乳化。该疫苗原以200μL的总体积被给药，分为腹内注射和皮下注射剂型。三个对照小鼠被给药CFA中的PBS假装接种。在第2和4周，小鼠被用50μg在弗氏不完全佐剂中的蛋白质加强。假装免疫的小鼠接受佐剂中PBS。在第一次注射之前、、以及在第6周，所有小鼠通过尾部切口被放血。
ABKD嵌合疫苗原的免疫原性评估。
通过免疫印迹分析和ELISA评估疫苗原的免疫原性。按如上所述方法产生免疫印迹并且掩蔽。通过免疫印迹分析了1μg的每个纯化的r-蛋白质（OspC类型A、B、K、D、以及嵌合疫苗原）。r-BBN39这种无关的His标记的蛋白质来源于伯氏疏螺旋体（种内类似蛋白质（paralogous protein）家族163），用作阴性对照。为了验证相等的蛋白质加载量，一个印迹被用抗His标志单克隆抗体（mAb）（1:2000；Novagen）掩蔽。为了评估对疫苗接种的反应，相同的印迹被用1:500稀释度的小鼠抗ABKD抗血清掩蔽。被HRP共轭的山羊-抗小鼠IgG（1:40000稀释度）用作第二抗体，并且通过化学发光来目测结合情况。使用涂覆了100ng每孔在碳酸盐缓冲液（pH9.6；在4°C下16hr）中的疫苗构建体或者r-OspC（类型A、B、K、或D）的96孔板（Costar 3590；Corning），进行ELISA分析。孔板被封闭（PBS中1%BSA，具有0.2%吐温-20（PBS-T）；2hr），用PBS-T洗涤3次，并且将逐级稀释的抗ABKD抗血清（100μL；1:50至1：109350）加至双份孔板的孔中（1hr）。被HRP共轭的山羊-抗小鼠IgG（1:20000）用作第二抗体，并且ABTS用作显色底物。在ELISA孔板阅读器（ELx 808；Biotek）中在405nm处读取吸光度，同时反应速率是线性的。通过用四参数逻辑斯谛方程（SigmaPlot）将S形曲线拟合成吸光度曲线、并且计算对应于50%最大吸光度曲线的平稳段的反向的稀释度，计算出滴度。
抗ABKD抗体反应的免疫球蛋白同种型分布。
通过用100ng每孔的嵌合构建体涂覆一式两份ELISA平板，评估抗ABKD抗体反应的同种型分布型。按如上所述方法洗涤并且封闭孔板。一式两份分析了从12个接种小鼠收集的抗ABKD抗血清（100μL；1:10000；1hr）。通过与同种型特异性的生物素化第二抗体一起温育（1hr；小鼠同种型试剂盒；Zymed），检测被结合的疫苗原特异性的Ig。通过被HRP共轭的链霉抗生物素蛋白（30分钟）和显色底物ABTS，检测被结合的生物素化抗体。所有的温育是在室温下完成。
间接免疫荧光测定（IFA）。
为了测定包含在ABKD嵌合疫苗原中的表位是否存在于在体外培养的伯氏疏螺旋体的表面上，进行IFA分析。为了最大化OspC生产，产生OspC类型A、B、K、或D的克隆株群的培养温度从33°C变化到37°C。通过离心（7000xg，15分钟）收集来自5mL浓稠培养液的螺旋体（大约107-108个细胞mL-1），用PBS洗涤3次，再悬浮于5mL的PBS中，并且取100μL在充电载玻片（Superfrost Plus,Fisher Scientific）上扩散至2cm2面积。一组载玻片进行空气干燥，第二组载玻片用丙酮固定。载玻片被封闭（1hr；在PBS-T中3%BSA），然后用1：100稀释度的抗ABKD抗血清、预免疫血清、或者1：1000稀释度的兔抗鞭毛蛋白抗血清掩蔽（1hr）。用被Alexafluor 568共轭的山羊抗小鼠IgG或者被Alexafluor 488共轭的山羊抗兔IgG（10μg mL-1封闭缓冲液）检测被结合的抗体。在各个步骤之间，载玻片在PBS-T中洗涤3次，并且所有的温育是在室温下在黑暗的、湿润的腔室中1小时。载玻片安装Fluoromount-G（Electron Microscopy Sciences公司），视情况而定，在使用若丹明或者荧光素滤光器装置的Olympus BX51荧光范围上目测检验，或者通过暗视野镜检，或者通过使用Olympus MagnaFire数码相机照相。
杀菌活性的评估。
在体外评估抗ABKD抗血清杀灭伯氏疏螺旋体的能力。温度按如上所述方法已经从33°C变化至37°C的螺旋体被用BSK-H培养基洗涤3次，并且将细胞密度调节到大约106个细胞mL-1。将8μL的细胞与8种豚鼠补体（Sigma）和4μL的每个测试血清（在56°C下热失活；30分钟）合并。对照包括：热失活的不含补体的抗ABKD抗血清；仅补体；以及汇集的具有补体的加热灭活的预免疫血清。如需要，通过添加BSK-H培养基，使总反应体积达到20μL，并且样品在37°C下孵育18hr。使用BacLight LIVE/DEAD测定法（Molecular Probes）评估杀灭情况，使用具有荧光素和若丹明滤光器装置的Olympus BX51荧光显微镜在5个高倍视野（high power field）中手工计数活的、和死的/损伤的细胞。
结果
鉴别在小鼠和人类感染期间出现的OspC类型B、D、以及K的表位。
迄今为止，已经从确定被侵袭性感染的病人中回收OspC类型A、B、C、D、H、I、K和N[Seinost et al.,1999；实施例1；Alghaferi et al.,2005]。这些OspC类型中的4个（A、B、K、以及D）被选出，以便建立多价嵌合OspC疫苗的应用原则证据。因为在感染期间出现的表位仅鉴别了OspC类型A，在该研究中的第一步是鉴别与感染相关的OspC类型B、K和D的表位。为了完成该鉴别，用来自感染了伯氏疏螺旋体（OspC类型B、K或D）克隆株群的小鼠的血清、或者来自人类莱姆病病人的血清掩蔽每个类型的截断和片段的免疫印迹，所述莱姆病病人经确定已经至少部分感染了生产OspC类型B、K、或D的伯氏疏螺旋体菌株（Allen Steere博士和Kathryn Jones友情提供）。在小鼠体内第6周的抗体反应是类型特异性的；然而，一些人类血清展示出在类型之间的交叉免疫反应性（数据未显示），这建议这些病人可能被混合的螺旋体种群感染。至于OspC类型B，对于小鼠感染血清，表位定位在α螺旋5（在aa175和200之间）。人感染血清与被类似定位的片段（氨基酸第164-185位，即aa164-185）发生反应，表明类型B的α螺旋5区是抗原性的。在OspC类型K中，在小鼠中表位被绘制在aa148和160之间，并且在人类中表位被绘制在α螺旋5区（在aa160和175之间）。OspC类型D表位在小鼠和人类中被绘制在α螺旋5区（在aa167和180之间），尽管有多个额外的表位被人类血清识别。这些数据表明，对于四价ABKD疫苗原构建体中的内含物，OspC类型B、K、以及D的α螺旋5区是合适的选择。
四价嵌合OspC疫苗原的构建、表达和纯化。
使用上述对于类型B、K和D限定的α螺旋5表位和在较早研究[实施例1]中限定的环5类型A表位，制备出多价的嵌合r-疫苗原，其由四个含有表位的区域组成。这些表位被短的、非结构化的、蛋白酶抗性的连接物序列连接起来（图9B）。该重组疫苗原长度是169个氨基酸（aa），分子量为18.0kDa，等电点为6.49。其结构被预测是显著的螺旋状[Gasteiger et al.,2005；Kneller et al.,1990]并且具有高稳定性指数[Guruprasad et al.,1990]。在用PBS透析后，有一些重组体疫苗原沉淀；然而，大约500μg mL-1保持可溶性，并且该可溶性蛋白质被用于所有的实验。通过SDS-PAGE对纯化疫苗原蛋白质进行的分析显示出单一条带的18kDa分子量，并且没有污染性蛋白质。
ABKD嵌合疫苗原在小鼠体内的免疫原性。
为了评估对于ABKD嵌合疫苗原的抗体反应及其单一组分表位，C3H/HeJ小鼠被给予弗氏佐剂中疫苗原。从接种疫苗（n=12）和假装免疫（PBS+佐剂）的小鼠（n=3）中收集血清，并且评估与ABKD嵌合疫苗原和全长r-OspC蛋白质类型A、B、K、以及D的反应性。Western blot分析表明，抗ABKD抗血清与疫苗原蛋白质、并且与r-OspC类型A、B和K会强烈地反应。相反，与嵌合构建体的C末端OspC类型D表位的反应性显著较弱（图10）。血清中的任何一种与阴性对照蛋白质（r-BBN39）没有反应性，并且来自假装接种疫苗的小鼠的血清不会与任何一种蛋白质发生反应。定量的基于ELISA的血清反应性的滴定显示出高滴度的对抗ABKD嵌合疫苗原蛋白质的IgG反应，平均滴度为27,800（图11A）。通过评估与固定化全长r-OspC蛋白质的结合情况，完成了对抗类型特异性表位的反应性的滴定。观察到在对于单个表位的抗体滴度中的显著差异（图11B）。值得注意的是，表位特异性的滴度会随着其近似于疫苗原的C末端而降低。
抗ABKD抗血清的免疫球蛋白同种型分布。
免疫球蛋白同种型分布型对于评估疫苗特异性抗体的潜在的效应因子功能很关健。为了评估被ABKD嵌合疫苗原诱导的免疫球蛋白重链类别转换，通过ELISA确定同种型分布。主要的同种型是IgG1，或多或少地具有低水平的IgG2a和IgG2b。六周的血清仅显示出有限水平的IgM、IgG3、或IgA（图12）。
间接免疫荧光测定。
通过间接免疫荧光显微术，评估被ABKD嵌合疫苗原中每个表位诱导的抗体在疏螺旋体细胞表面上结合OspC的能力。用产生OspC类型A、B、K、以及D的细胞观察到特异性的表面标记（数据未显示）。荧光信号的强度与类型特异性的滴度一致，用携带有OspC类型A或B的细胞看见最强的荧光。携带有类型K或D的细胞的荧光强度较低，并且染色不匀，细胞呈点刻的外观。在被探测的细胞中没有记录与相匹配的预免疫血清的反应性。针对空气固定的细胞的抗鞭毛蛋白抗体缺少表面标记可用于验证细胞的外部细胞膜是完整的，并且被检测的表位天然存在于细胞表面。如预测的那样，用丙酮透化的细胞被抗鞭毛蛋白抗体标记（数据未显示）。
证明用ABKD嵌合疫苗原进行疫苗接种可诱导杀菌性抗体。
使用LIVE/DEAD BacLight测定法[Tily et al.,2001；Ledin et al.,2005；Elias et al.,2000；Montgomaeiy et al.,2006；Elias et al.,2002；Shin et al.,2004]，评估抗ABKD抗血清的杀菌活性。检测对抗携带有包括在嵌合疫苗构建体中的所有类型OspC的菌株的杀细菌活性。与抗ABKD抗血清一起温育，诱导出显著的细胞聚集。在聚集体内部同时存在活细胞和死细胞。由于在聚集体内部细胞计数的固有难度，通过仅计数非聚集性的、游离的细胞，确定活细胞和死细胞的百分比。对于所有四个OspC类型，在用于杀菌试验的培养液中死细胞的背景水平是大约20-30%。在我们的实验室中已经不断地观察到该死细胞背景水平，接着将培养液温度从33°C转至37°C，以便上调OspC表达。在杀菌试验中，杀灭以补体依赖性方式发生，死细胞的百分比显著地增加超过背景直至56-90%。死细胞的数量在所有情形中是任何一种对照中观察到的死细胞数量的至少两倍。单独的补体不会引起杀灭。没有由汇集的预免疫血清所引起的杀菌活性，表明针对疫苗原的特异性免疫应答对于杀菌活性是必需的。
讨论
数个研究已经探究了莱姆病螺旋体的OspC作为潜在疫苗原的潜在应用。尽管用OspC进行疫苗接种可引起保护性抗体反应，但保护性被报告为具有很大的菌株特异性[Gilmoreet al.,1996；Scheiblhofer et al.,2003；Wallich et al.,2001；Brown et al.,2005；Probert andLeFebvre,1994；Gilmore et al.,2003]。通过使用多个OspC蛋白质的混合物引起广谱防护的尝试尚未证明成功。巴克斯特公司测试了由14种不同的全长OspC变体组成的OspC混合物；然而，它们不能针对每个变体（这是广谱防护的一个要求）的独特结构域引起足够的抗体滴度。另外，不可接受的反应原性被报道了[Hanson etal.,2004]。混合物疫苗的一般方面是对于表位的抗体反应的可能的错误指导，所述表位在感染期间不是天然出现的、并且不会诱导出保护性抗体。嵌合疫苗的产生提供了能够绕过使用r-蛋白质简单的混合物所遇到的问题的可选方法。嵌合疫苗由一系列免疫显性表位组成，这些表位已经在对抗疟疾[Hanson et al.,2004；Caro Aguilar et al.,2005]、A组链球菌[McNeil et al.,2005；Dale et al.,2005；Hu et al.,2002；Dale,1999；Kotloff et al.,2005；Horvath et al.,2005]、以及数种病毒[Apt et al.,2006；Fan and Mei,2005；Wang et al.,2005；Bouche et al.,2005]的疫苗开发中被研究。如果要使多价OspC疫苗具有广谱防护性，有必要在疫苗原中并入足够矩阵的表位以引起对抗多种菌株的防护反应。利用这样一种疫苗原的构建来向前发展的能力已经通过系统发生分析被大大地促进，所述系统发生分析已经描绘了21种不同的表示为A-U的OspC类型[Seinost et al.,1999]，其中仅一个子集与人类身上侵袭性感染有相互关系[Seinost et al.,1999；实施例1；Alghaferi et al.,2005]。
对于OspC的表位结构的详细理解是开发嵌合疫苗原所要求的。已经有数个在前的文献描述了OspC表位定位[Gilmore et al.,1996；Jobe et al.,2003；Lovrich et al.,2005]。两篇研究报道说，可引起杀菌性抗体的表位存在于OspC的C末端结构域内部[Jobe et al.,2003；Lovrich et al.,2005]；然而，因为该结构域相对保守，不清楚为什么对抗C末端的抗体不是广谱防护性的。Matheisen et al.也建议C末端是抗体反应的主要标靶，注意到来自具有全长OspC的欧洲人神经螺旋体病病人的血清的反应性比具有10个氨基酸的C末端截断的形式的病人血清的反应性更大[Mathiesen et al.,1998]。由此他们得出必须具有C末端表位的结论；然而，因为测试抗原由单一的未知类型的OspC变体组成，C末端更广谱的识别可归因于该结构域的更大保守性，并非必须表明C末端是免疫显性的。Gilmore et al.表明，用未变性的r-OspC（但不是与用已变性的r-OspC）免疫小鼠赋予了使用同源分离株的攻击以防护性[Gilmore et al.,1996；Gilmore and Mbow,1999]，表明防护性的表位可以在构象上被限定。在单独的分析中，Gilmore et al.利用具有可赋予被动免疫性的抗OspC单克隆抗体分析了有限数量的OspC平截的免疫反应性，所述OspC平截来源于单一的OspC类型（类型A）[Gilmore and Mbow,1999]。N末端或C末端的缺失消除了通过mAb对r-蛋白质的检测，进一步建议构象的或者不连续的表位的存在。不清楚被mAb识别的表位是否是免疫显性的、在自然感染期间是相关的、或者在不同的OspC类型当中是保守的。最近已经绘制了OspC类型A的线性免疫显性表位，并且发现这些表位存在于环5区和α螺旋5区内部[实施例1]。含有环5类型A表位的r-蛋白质在小鼠体内引起杀菌性抗体，带来了单个的类型特异性表位可以被用于疫苗开发的可能性[参见实施例2]。在该报告中，在早期感染期间出现的OspC类型B、K、以及D的表位被绘制，并且已经构建了基于这些表位的四价嵌合疫苗原。该ABKD嵌合疫苗原在小鼠体内是高度免疫原性的，并且诱导出的抗体可在细胞表面处结合OspC、并且可有效地以补体依赖性方式杀灭产生OspC类型A、B、K、以及D的菌株。
在我们努力开发四价嵌合测试疫苗原的第一步，是鉴别在小鼠和人类感染期间出现的OspC类型B、K和D的线性表位。这些分析基本上是按照在实施例1中描述的鉴别OspC类型A的环5表位和α螺旋5表位的方法进行的。简言之，用血清筛选大量的OspC类型B、K和D平截和片段组，所述血清来自于用感染克隆分离株小鼠和至少部分地感染了表达相应OspC类型的菌株的人类。通过使用来自于用实验方法感染的小鼠的血清，精确的表位绘制是有可能的。然而，在自然地感染的人类中，抗体反应是针对宽广的表位矩阵。这并不令人惊奇，据推测可反映对于OspC表位的抗体反应的扩展，所述表位在早期感染期间在细菌细胞表面处通常不存在。新的表位，其中一些可以来自OspC的保守结构域（例如α螺旋1），可以变得一旦细菌细胞死亡、并且从细胞膜释放OspC就可到达。这显示了伴随着人类血清样品在表位绘制中的应用的警告（caveats）；即感染的精确持续时间典型地是不可知的，并且感染种群的克隆性（clonality）是可疑的[Wang et al.,1999；Ruzic-Sabljicet al.,2006；Hofmeister et al.,1999；Guttman et al.,1996；Rijpkema et al.,1997]。在任何事件中，由人类血清样品的分析清楚可见，在产生OspC类型A、B、K或D的菌株感染期间，在α螺旋5区内部的表位可被识别。另外，在数种不同的OspC类型生产菌株当中对于α螺旋5的反应的一致性可以是该OspC结构域功能相关的指示。
虽然α螺旋5区和环5区序列在OspC类型之间是可变的，但是这些区域在每个类型内部是高度保守的[参见实施例1]。这建议，在嵌合疫苗的意义上，仅有限数量的OspC表位会被要求具有广谱防护的效果。作为第一步，在广谱防护性疫苗原的开发中，来自OspC类型B、K和D的环5类型A表位和α螺旋5表位在测试疫苗原开发中被使用。使用被设计成可编码连接物序列的引物，对含有这些表位的区域进行PCR扩增。这允许在嵌合构建体产生中使用PCR重叠延伸，并且提供了一种用于分离具有短的、非结构化的、蛋白酶抗性的氨基酸序列的表位的手段[Crasto and Feng,2000]。在该研究中开发的实验性的基于OspC的、四价的、ABKD嵌合疫苗原在所有测试的小鼠（n=12）中引起一致的、高滴度的IgG抗体反应。另外，疫苗原诱导出针对每个被并入的表位的抗体。有趣的是，表位特异性的滴度呈现为受构建体内部表位位置的影响。从N末端表位（类型A的环5）至C末端表位（类型D的α螺旋5）的滴度有累进的下降。滴度向C末端表位下降的现象在早期的基于链状球菌M-蛋白质的嵌合疫苗研究中也有报告[Dale et al.,1993；Dale et al.,1996]。对滴度的位置特异性影响的基础尚不清楚，但是可以归因于C末端结构的体内降解或改变[Dale et al.,1999]。
虽然对于抗疏螺旋体感染的防护性所必需的Th细胞因子反应和相关的免疫球蛋白同种型模式一直没有完全解析[Kraiczy et al.,2000；Widhe et al.,2004；Keane-Myers et al.,1995；Keane-Myers et al.,1996；Keane-Myers and Nickell,1995]，但该模式的确定在疫苗原开发中是重要的步骤，并且可能提供关于不同疫苗原构建的潜在保护能力的重要信息。通过ELISA确定该反应的同种型分布，并且观察到与混合Thl和Th2细胞因子反应有关的重链Ig同种型。在该研究中记录的类别转换暗示了足够的T细胞帮助，甚至在缺少被并入疫苗原中的限定T细胞表位的情况下。通过使用用于鼠科子集（H2Ak/H2Ek）和人类（HLA-DRB1）II型MHC的预报的肽结合算法进行疫苗原序列分析，显示了在被预测可结合所有可利用的等位基因的疫苗原中可能的T细胞表位[Rammensee et al.,1999；Zhang etal.,2005]。作为被预测的结合性的肽中的一种，LANSVKELT在构建体内部被重复三次，并且该重复在引起Th反应中可能是重要的[Jiang et al.,1999；Ahlborg et al.,1998；Kjerrulfet al.,1997；Theisen et al.,2000]。虽然可能的T细胞表位的分析不是详尽的，但该预测支持我们的数据，显示嵌合疫苗原可以诱导出有助于小鼠的T-淋巴细胞。另外，其暗示该构建体或许可能在人类身上也会如此，无需合并混杂的T细胞表位序列。弗氏佐剂在产生该同种型分布中的重要性尚不可知，但在明矾或者其他适合于人类中使用的佐剂的意义上的反应和同种型分布有待评估[ten Hagen et al.,1993；Lindblad,2004；Petrovsky and Aguilar,2004；Brewer et al.,1999；McNeela and Mills,2001]。另外，嵌合疫苗原中表位次序或者结构的改变可以提供一种机制，借助该机制，免疫反应可以被制作得最大化体内防护性[Tongren et al.,2005；Cai et al.,2004]。
对于就疫苗开发而言为多产的疫苗原的反应，被诱导出的抗体必须能够结合完整的伯氏疏螺旋体细胞的表面并且和引起细菌杀灭。IFA分析显示了产生OspC类型A、B、K和D的菌株细胞表面的较强标记性。尽管与针对更多N末端表位被诱导的抗体相比，针对类型D表位的抗体滴度显著更低，但产生类型D的菌株的表面标记容易显现。观察发现在每一个OspC类型培养物中的细胞子集没有被抗ABKD抗血清用标记，这暗示那些细胞不表达OspC。然而，在体内，已经显示，在由蜱传染到哺乳动物期间、以及在早期哺乳动物感染期间，如果不是全部至少大多数细胞表达OspC[Gilmore et al.,2001；Zhong et al.,1997]。也评估了抗ABKD抗体有效杀灭细胞的能力。来自被接种疫苗的小鼠的血清以补体依赖性方式有效地杀灭了表达OspC类型A、B、K和D蛋白质的螺旋体。虽然对于所有的OspC类型杀灭率小于100%，但这可能是在种群细胞中体外OspC表达的异质性功能，一种在体内已经被纪录较多的现象[Schwan et al.,1995；Schwan and Piesman,2000；Hu et al.,1996]。
该实施例描述了一种新颖的r-嵌合的多价的基于OspC的莱姆病疫苗原的原则性的构建和证据。基于表位的r-嵌合蛋白质的使用允许在相同的构建体中覆盖多个OspC类型，并且绕过误导针对不相干的蛋白质结构域的免疫反应的潜在问题。在主动侵染期间被识别的线性表位的绘制是嵌合疫苗开发的关键部分，并且已经成功地完成了对于与人类身上侵袭性感染有关的四个OspC类型的这种绘制。包括在疫苗原中的表位已经诱导出类型特异性的IgG抗体，该抗体能够在疏螺旋体细胞表面处结合OspC，并且可有效进行受补体调节的细菌杀灭。
实施例4.对于希望提高免疫原性的嵌合多价的莱姆病疫苗的变体的免疫反应
在该研究中，我们设法提高构建体的溶解度，并且评估表位设置、表位重复性、以及假定的C末端固定化标记的内含物对于免疫反应的潜在影响。一般来讲，这些分析提供了对于广谱防护性OspC疫苗、以及构建嵌合疫苗的设计策略的洞察力。
材料和方法
重组OspC的表达和纯化
按照此前描述的方法[参见实施例1和实施例2]，产生重组体全长OspC蛋白质类型A、B、K和D。简言之，通过使用具有5'悬垂以允许在PET-32 Ek/LIC载体（Novagen）中不依赖连接酶的克隆的引物，扩增来自伯氏疏螺旋体分离株B31MI（OspC类型A）、LDP73（类型B）、LDP74（类型K）、以及LDP116（类型D）克隆株群的OspC基因[实施例1]。在扩增和单链尾部再生后，扩增子被与PET-32 Ek/LIC载体一起退火，所述载体被转化入NovaBlue（DE3）大肠杆菌细胞中并且增殖。在通过DNA测序（MWG-Biotech）确认插入序列后，用IPTG（1mM）诱导蛋白质表达。使用被PET-32 Ek LIC表达标志编码的六组氨酸基序（Novagen），通过镍亲和层析法纯化蛋白质。用咪唑洗脱的蛋白质在磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.4）中使用10kDa分子量截止膜（Slid-a-lyzer,Pierce）进行充分透析，通过BCA测定法（Pierce）定量蛋白质浓度，并且通过SDS-PAGE评估制品的纯度。
ABKD疫苗变体的构建、表达、以及纯化
为了研究降低针对跨越疫苗构建体的特异性表位的IgG滴度的可能机制、以及技术方案，构建多个原始疫苗的变体。所有疫苗变体是以此前描述[实施例3]的ABKD疫苗原序列为基础的，并且含有相同的包含表位的序列。这些变体包括类型A的环5区（氨基酸（aa）第131至149位）和类型B的α螺旋5区（aa160-201）、类型K的α螺旋5区（aa161-201）、以及类型D的α螺旋5区（aa161-201）（图13插入物）。ABKDppa和ABKDgg分别将Pro-Pro-Ala或者Gly-Gly基序加至原始ABKD构建体的C末端。这两个该构建体都是通过使用反向引物（表5）来扩增原始ABKD构建体而产生的。所述反向引物经由编码5'悬垂的合适氨基酸而增加了基序（图13A）。其他的疫苗变体是通过重叠退火和延伸技术而产生的，所述技术类似于在构建原始ABKD疫苗原中使用的技术[实施例3]。通过使用反向引物再扩增ABKD构建体，产生ABKDD构建体，所述反向引物携带有编码非结构化的、蛋白酶抗性的连接物的3'尾部序列。这允许PCR产物退火成含有OspC类型D表位的序列，所述序列已经用在5'端编码互补性连接物的序列扩增、随后重叠延伸、并且扩增退火后的构建体（图13B）。通过退火彼此独立地扩增的含有类型A和D表位的区域，随后与从原始ABKD构建体扩增的类型B和K的螺旋5表位区域退火，产生ADBK构建体（图13C）。通过退火来自ABKD和ADBK序列的扩增子，产生ADBKD构建体（图13D）。在所有的情形中，用GoTaq Green（Promega）完成PCR扩增，采用的条件是：初始2min94°C变性步骤；接着35个循环的在94°C下变性15sec；在50°C下引物退火30sec；72°C下延伸60sec；最后的72°C下延伸7分钟。在构建这些疫苗原中使用的所有引物被列于表5中。所有的PCR产物在用作随后的PCR反应模板之前进行凝胶纯化。最后的扩增子通过不依赖连接酶的克隆被退火至pET-46Ek/LIC载体，并且被转化入NovaBlue（DE3）大肠杆菌细胞。使用T7引物，筛选菌落用于插入物，回收质粒（Qiafilter Midi Qiagen）用于通过DNA测序确认插入物。按如上所述方法表达并纯化重组蛋白质。在纯化后，使用10kDa分子量截止膜（Slide-a-Lyzer,Pierce），在3种变化的PBS（pH7.4）或含有100mM磷酸酯、100mM NaCl、50mM精氨酸和50mM谷氨酸的pH8缓冲液（Arg/Glu缓冲液）[Golovanov et al.,2004]中透析疫苗蛋白质。通过SDS-PAGE评估构建体的纯度。
表5.在构建嵌合疫苗原中使用的引物。LIC尾部是粗体，连接物序列加有下划线。
Figure BDA00003370568800511
Figure BDA00003370568800521
用疫苗变体免疫小鼠
用6个疫苗原变体中的每一个免疫六周大的雄性C3H/HeJ小鼠（每个构建体用3个小鼠）。因为需要彼此比较变体的免疫原性，优选基于摩尔量给药蛋白质，以便补偿每单位疫苗原质量的表位数量差异。每次免疫中，每个小鼠接受大约2.8纳摩尔的蛋白质，即50μg的构建体ABKD、ABKDppa、ABKDgg、以及ADBK，或者62.5μg的构建体ABKDD和ADBKD。用完全弗氏佐剂中的疫苗免疫小鼠，然后在第2和4周用弗氏不完全佐剂加强。在第一次免疫之前和在第6周，通过尾部缺口从所有的小鼠中收集血清。为了测定佐剂对总的抗体滴度和表位特异性的抗体滴度的影响、以及对同种型分布的影响，用如上所述在弗氏佐剂中乳化的、或者被吸附到明矾（Imject Alum,Pierce）上的ABKD疫苗原免疫小鼠（每佐剂6个），并且在第6周由通过尾部缺口收集血清。
评估被疫苗变体诱导的表位特异性的IgG滴度
通过Western blot和ELISA评估每个疫苗原的免疫原性。对于Western blot，以每泳道在下降的样品缓冲液中500ng的量加载r-OspC类型A、B、K、D，在12.5%SDS-PAGE凝胶（Criterion,Biorad）中进行电泳，并且电转印至PVDF（Immobilon-P,Millipore）。印迹用具有0.2%吐温-20（PBS-T）的磷酸盐缓冲盐水中1%BSA封闭。用PBS-T中1:2500稀释度的每个抗血清探测印迹1小时，然后洗涤三次。为了验证相等的蛋白质加载量，一个印迹被用抗His标志单克隆抗体（1:2000；Novagen）掩蔽。通过1:40000稀释度的被过氧化物酶共轭的山羊抗小鼠IgG和化学发光（Super Signal Pico,Pierce）进行二次检测。为了进行定量分析，通过ELISA分析确定OspC类型特异性的IgG滴度。以100ng每孔的量将r-OspC类型A、B、K或D涂覆到96孔板（Costar 3590;Corning）上，在碳酸盐缓冲液（pH9.6）中在4°C下孵育16hr。封闭孔板（具有0.2%吐温-20（PBS-T）的PBS中1%BSA，2hr），用PBS-T洗涤3次，将逐级稀释的抗疫苗原抗血清（100μL）加至双份孔板的孔（1hr）。被HRP共轭的山羊抗小鼠IgG（1:20000）用作第二抗体，并且ABTS用作显色底物。在ELISA孔板阅读器（ELx 808;Biotek）中在405nm处读取吸光度，同时反应速率是线性的，并且通过用四参数逻辑斯谛方程（SigmaPlot）将S形曲线拟合成吸光度曲线，计算出滴度。滴度被报道为对应于50%最大吸光度曲线平稳段的反向稀释度。
表位特异性的免疫球蛋白同种型分布的测定
通过ELISA评估抗体对于ABKD、ABKDD、以及ADBKD疫苗变体构建体的反应的同种型分布。用100ng每孔的r-OspC类型A、B、K、以及D涂覆96孔板。按如上所述方法封闭并且洗涤孔板。将抗疫苗原抗血清加至孔板，并且一式两份分析（100μL；1:10000；1hr）。通过与同种型特异性的生物素化第二抗体一起温育（1hr；小鼠同种型试剂盒；Zymed），检测被结合的表位特异性的Ig。通过被过氧化物酶共轭的链霉抗生物素蛋白（30分钟）和显色底物ABTS，检测第二抗体。所有的温育是在室温下完成。
通过疫苗特异性的T-淋巴细胞测定IFN-γ和IL-4生产
使用Abuodeh et al.[1999]方法的变型，通过用疫苗原进行体外再刺激，评估了来自被免疫小鼠的脾细胞的细胞因子反应。被疫苗接种的小鼠通过CO2麻醉实施安乐死，无菌地除去脾，并且将脾放入RPMI培养基（Sigma）中。来自3个用每种疫苗构建体免疫的小鼠的脾被汇集，并且通过用22量规针将RPMI重复注射入脾被膜来收获细胞。将细胞悬液转移至50mL离心管，收获的细胞在200xg下离心5分钟。通过暴露于3mL的8.3mg/mL氯化铵（R-7757,Sigma)1分钟，红细胞被裂解。然后用20mL的RPMI（Sigma）稀释氯化铵，细胞被离心并且洗涤三次。细胞被再悬浮于10mL含有10%FCS、100μg mL-1链霉素、100UmL-1青霉素、2.5μg mL-1两性霉素B的RPMI中。细胞用台盼蓝染色以便评估成活力，用血球计数器计数，并且将所有的细胞悬液调节至107个细胞mL-1。以每孔107个细胞（每个疫苗原类型12个孔）的量将细胞等分加入24孔板（Costar 3526）。以5或10μg mL-1的量用免疫性疫苗原刺激一式三份的孔。对照包括用不相干的蛋白质即10μgmL-1的牛血清白蛋白刺激的一式三份的孔、以及未受刺激的孔（没有蛋白质）。所有的孔板在37°C、5%CO2下孵育96小时，然后收获上清液，并且在-80°C下冷冻，用于细胞因子的ELISA定量。
为了定量Th1/Th2细胞因子IFN-γ和IL-4的水平，根据制造商的说明书使用基于ELISA的测定（ELISA-Max；Biolegend）。简言之，捕获抗体被涂覆到96孔ELISA平板上，孔板被封闭，并且在孔板中100μL每个培养液上清一式两份孵育2hr。对于IL-4检测，使用未稀释的培养液上清；反之对于IFN-γ，测试未稀释的上清液和在PBS中稀释1:20的上清液。使用含有已知浓度的每一种细胞因子的样品来产生标准曲线。通过用生物素化第二抗体、接着用被HRP共轭的链霉抗生物素蛋白、并且使用TMB底物进行比色检测，来检测被结合的细胞因子。
结果
变体疫苗构建体的构建、表达、以及纯化
使用具有5'悬垂的引物和重叠退火及延伸PCR技术，生产出5种原始ABKD疫苗的变体（图13）。所有构建体的DNA序列都被证实。选择疫苗原的物理化学特性，显示在表6中[Gasteiger et al.,2005]。在通过镍色谱法纯化重组体疫苗原后，注意到在用PBS进行透析期间有显著比例的r-蛋白质发生沉淀。该现象也被记录在ABKD疫苗原的初始报告中[实施例3]。虽然较高分子量的构建体ABKDD和ADBKD在PBS中具有较高的溶解度，但r-蛋白质沉淀仍然显著。出于该原因，改进的透析缓冲液（Arg/Glu缓冲液）以Golovanov etal.[2004]为基础被开发出来。缓冲液的pH从PBS的pH（pH7.4）增加到pH8.0，以便增加在缓冲液pH和r-蛋白质的pI（pI 6.49或6.85）之间的差值。另外，盐浓度从150mM下降到100mM，并且加入50mM精氨酸和50mM谷氨酸。通过使用该缓冲液，没有记录到任何一种r-蛋白质沉淀，并且可溶性蛋白质浓度有显著的增加。当通过SDS-PAGE目测检验时，r-蛋白质是纯的，并且不含降解产物（图14）。
表6.疫苗原的物理化学特性。
Figure BDA00003370568800551
疫苗变体的免疫原性
为了评估ABKD疫苗变体的相对免疫原性，用每个在弗氏佐剂中的变体免疫小鼠。通过Western blot评估血清的表位特异性反应性，其中血清被用于探测被PVDF固定化的r-OspC四个类型中的每一个。当利用与标志特异性的小鼠抗His标志单克隆抗体的反应性进行评估时，蛋白质被证实等量加载在印迹上。来自被免疫小鼠的血清显示了在与每一种r-OspC蛋白质的反应性水平上的疫苗原依赖性差异（图1A）。值得注意的是，在接种了ABKDppa变体和ABKDgg变体的小鼠体内有减弱的与类型D螺旋5表位的反应性，并且与ADBK变体的反应性减弱最显著。为了以定量的方式评估这些变化，再次使用四个全长r-OspC类型中每一个作为固定化抗原，通过ELISA完成与每一个被包括在构建体中的OspC类型特异性的表位的IgG反应性的滴定。这些滴度大大地模拟了定性的Western blot发现物，表明了在免疫血清对单个表位的反应性中的疫苗特异性差异（图15B）。可看到在与类型D表位的反应性中最显著的差异，对于ABKDppa、ABKDgg和ADBK变体观察到特别低的滴度。
疫苗变体特异性的免疫球蛋白的同种型分布
为了更详细地理解被变体疫苗原诱导的免疫反应，当通过表位特异性的滴度测定时，对于具有最好的疫苗潜力（ABKD、ABKDD、ADBKD）的三个变体，完成了表位特异性的免疫球蛋白同种型分布。一般来讲，IgG1在抗原特异性的免疫球蛋白、较小含量的IgG2a和IgG2b、以及极少的IgG3或者IgM中有优势，此前已经记录了一种模式[实施例3]（图16）。对于所有的表位和所有的疫苗变体，Ig同种型的模式是类似的，一个例外。在用ABKDD免疫的小鼠体内类型K和D表位特异性的IgG2a和IgG2b的反应性比在用ABKD或ADBKD变体免疫的小鼠体内的反应性更大。
通过疫苗特异性的T-淋巴细胞生产Th1/Th2细胞因子
为了评估细胞因子环境和被ABKD疫苗原变化诱导的Th1/Th2平衡的潜在影响，用疫苗原在体外再刺激小鼠脾细胞，所述小鼠已经用疫苗原免疫。记录到在不同免疫的小鼠之间IFN-γ诱导水平的显著差异。使所有疫苗变体与培养液上清中的IFN-γ增加水平相关联，尽管ADBK和ADBKD的水平比被其他疫苗原诱导的水平高两倍至三倍（图17）。在所有的情形中，5μg mL-1和10μg mL-1浓度的抗原诱导出IFN-γ，具有0.5-8.6ng/mL的水平范围。来自未受刺激的脾细胞或者来自用牛血清白蛋白刺激的脾细胞的细胞培养液上清都具有低于测定检测极限15.6pg/mL的IFN-γ水平。在受疫苗刺激的培养液上清和对照培养液上清中都没有检测到IL-4，表明浓度低于测定检测极限2.0pg/mL。
佐剂类型对抗体滴度和同种型分布的影响
为了测定佐剂类型对于针对疫苗原的反应的影响，用在弗氏佐剂中被乳化的或者被吸附于明矾的ABKD蛋白质免疫小鼠。对抗整个疫苗原、以及对抗各组分表位的IgG滴度在用明矾佐剂免疫的小鼠体内略微地降低，尽管反应的一般模式在两个佐剂之间是类似的（图18A）。尽管IgG1水平类似，但用明矾免疫的小鼠具有降低的疫苗原特异性的IgG3、IgG2a、以及IgG2b（图18B）。表位特异性的同种型分布非常类似于使用整个疫苗原所看到的分布（数据未显示）。
讨论
在疫苗开发中，含有多个B细胞表位的嵌合蛋白质的应用与完整蛋白质多价疫苗原和肽共轭物相比具有潜在的优点。仅有防护性的表位序列的内含物降低了对抗不相干表位反应的错误指导的可能性，所述表位或者在母体分子中或者在肽载体上。如果如同OspC一样具有很大的保守结构域的话，这一点是重要的，所述结构域在重组体疫苗原中是免疫显性的，但是在感染期间细菌不提呈[实施例1；Kumaran et al.,2001；Eicken et al.,2001]。这样的表位与防护性免疫反应的产生不相关。然而，新颖的蛋白质的产生要求考虑分子间和分子内的相互作用，该相互作用可能阻塞表位或者影响蛋白质稳定性和溶解度。在该实施例中，我们已经以OspC为基础扩大了重组的、多价的嵌合的莱姆病疫苗原的研究。原始ABKD疫苗在小鼠体内是高度免疫原性的，并且诱导出在细菌细胞表面处结合天然OspC的IgG，并且引起补体依赖性杀灭[实施例3]。尽管有该成绩，但ABKD构建体具有两个要求改善的因子，其在PBS中的溶解度较差，这会干扰r-蛋白质的生产，并且可以影响储存稳定性、以及对抗蛋白质中单个表位的IgG滴度的差异。具体地讲，就表位接近疫苗C末端而论，滴度降低了。该研究的目标是提高疫苗原溶解度，并且使用改进的在表位设置、表位重复、以及固定化基序的内含物方面有差异的疫苗原，以便提高总的和表位特异性的免疫反应。
在较早的研究中，注意到重组体疫苗原在PBS中透析后有显著的沉淀[实施例3]。这种较差的溶解度不仅限制了疫苗原生产，而且还可能影响到疫苗免疫原性。在PBS中透析后得到的ABKD构建体的最大浓度是0.5mg/mL，并且经常是非常小。OspC晶体结构建议螺旋5表位区域参与了在天然OspC蛋白质中的内部单体的（intramonomeric）4-螺旋束[Kumaran et al.,2001；Eicken et al.,2001]。这可以导致在疫苗原蛋白质内部和之疫苗原蛋白质间的在被暴露的疏水性螺旋表面之间的相互作用，依次导致沉淀。将精氨酸和谷氨酸加至透析缓冲液中时发现可以使所有重组体疫苗原蛋白质的溶解度增加4至100倍（表7）。溶解度增加的基础可能是精氨酸和谷氨酸与被暴露的具有相反电荷的残基的相互作用、与疏水性残基的相互作用（即，疏水性残基与精氨酸和谷氨酸侧链脂肪族部分的相互作用）[Golovanov et al.,2004]。与用在PBS中透析后的ABKD疫苗原免疫的小鼠相比，用在Arg/Glu缓冲液中透析后的ABKD构建体免疫的小鼠具有显著更高的滴度[实施例3]。Arg/Glu缓冲液可以引起更有利的折叠模式或者较少的分子间的或者分子内的相互作用，借此提供更好的使表位接近B细胞受体的通道。精氨酸或者谷氨酸吸附于r-蛋白质显然不会干扰表位识别。已经报告Arg/Glu缓冲液可以保护蛋白酶的体外活性[Golovanov et al.,2004]。虽然在PBS透析样品或Arg/Glu透析样品中没有显而易见的蛋白水解降解，但不能排除在体内防止蛋白水解裂解。在含有精氨酸和谷氨酸的缓冲液中透析可能是有用的工具，可以被应用于其他的新颖的具有显著的分子间相互作用的嵌合蛋白质。
表7.在PBS或者Arg/Glu缓冲液中透析的疫苗原的可溶性蛋白质浓度。
Figure BDA00003370568800581
较差的免疫反应与C末端表位位置的相互关系此前已经在嵌合链状球菌M-蛋白质疫苗原中有报道，可能是由于与C末端、或羧肽酶催化的蛋白水解降解有关的结构论点[Daleet al.,1993；Dale et al.,1996；Dale et al.,1999]。已经建议了许多方法来保护肽和重组体蛋白免受蛋白酶活性，包括C末端的酰胺化或者PEG化、氨基（N）-末端的乙酰化、以及添加保护性氨基酸基序[Brickerhoff et al.,1999；Powell et al.,1992；Lee et al.,2005；Alvarezet al.,2004；Kawarasaki et al.,2003；Walker et al.,2003]。还报道了氨基酸基序可以通过抑制羧肽酶的作用而固定化蛋白质的C末端；然而，仅用几个蛋白质评估了它们的保护能力。评估了两个固定化基序增强抗体对ABKD疫苗原的反应的能力。两个中性的、亲水性的甘氨酸残基的添加可以降低羧肽酶C和D的活性，其对于疏水性的并且碱性的C末端氨基酸分别具有特异性[Alvarez et al.,2004；Kawarasaki et al.,2003；Remington and bredam,1994]。Pro-Pro-Ala基序的添加通过并列的、大体积脯氨酸残基可以在空间上阻碍羧肽酶进展[Walker et al.,2003]。
为了评估添加这些该基序对于针对ABKD嵌合疫苗原的抗体反应的影响，用ABKDgg或ABKDppa构建体免疫小鼠。在两种情况下，与用未修饰的ABKD构建体免疫相比，血清具有更低的对抗多个表位之一的平均IgG滴度。ABKDppa构建体的类型D特异性的IgG滴度降低，尽管这主要是由于单一的外露层（outlier）。ABKDgg构建体具有降低的对抗类型K和D表位的滴度。基于IgG滴度，使用这些基序的中任何一个没有优点。针对C末端表位的滴度下降并不呈现为受羧肽酶的作用介导，对于羧肽酶，这些基序应该赋予抗性，尽管有可能由蛋白酶防护带来的任何优点可能已经被Arg/Glu缓冲液提供的类似防护所掩蔽[Golovanov et al.,2004]。
为了研究可能的与较差的对C末端表位的免疫反应有关的结构因素，生成了数个额外的构建体。在嵌合链状球菌疫苗中，重复在C末端处的N末端表位通过未知的机制“保护”前者C末端表位[Dale et al.,1999；Dale et al.,2005；Hu et al.,2002；McNeil et al.,2005]。基于该成绩，开发了ABKD疫苗原的类似变体。产生ABKDD构建体来评估对于类型D表位的反应是否可能被第二个C末端类型D表位保护。为了评估降低的滴度是否是主要由于C末端表位位置，将类型D表位移动至第二个最N末端的位置（ADBK）。最后，ADBKD构建体被用于评估重复的C末端表位的防护性，并且利用ABKDD评估重复表位对特异性免疫应答的影响。在ABKDD疫苗原中的表位重复使得类型D特异性的IgG滴度加倍，但同时引起了对抗相邻接的类型K表位的滴度降低。当在ADBK构建体中类型D表位被置于更N末端位置时，类型D特异性的IgG滴度显著降低。另外，对抗ADBK构建体中C末端类型K表位的反应性相对于ABKD中的反应性得到改善。添加C末端类型D表位（ADBKD）不会提高类型K特异性的滴度；然而，其产生了显著提高的（尽管不是加倍）对抗类型D表位的滴度。这些结果表明，类型D表位的C末端位置优选是内部位置，并且没有显而易见的受到额外的“保护性”C末端表位的C末端表位保护。在该疫苗原中表位特异性的滴度的主要决定因数不是其靠近C末端，而更可能是嵌合蛋白质的三级结构。
疫苗原诱导的Ig同种型可能与体内防护效力具有因果关系。通过改变表位或者表位的次序，有可能改变同种型分布[Tongren et al.,2005]、以及因此带来的抗体效应因子功能。为了测量表位特异性的同种型分布，对抗最有前途的疫苗原（ABKD、ABKDD、ADBKD）的抗血清被结合于固定化的rOspC类型A、B、K或D，并且用同种型特异性的抗血清检测被结合的抗体。如同此前关于ABKD疫苗原的报告[实施例3]，主要的同种型是IgG1、水平多少有点低的IgG2a和IgG2b（取决于构建体）、以及低水平的IgM和IgG3。表位特异性的Ig同种型分布在ABKD抗血清和ADBKD抗血清之间是类似的，从N末端到C末端表位IgG2a和IgG2b水平下降，类似总的IgG滴度。对于所有的表位，ABKDD具有一致水平的IgG2a和IgG2b，尽管类型K特异性的总的IgG滴度较低。
ABKD疫苗原诱导出补体依赖性的杀菌性抗体[实施例3]。在小鼠中，IgG1不活化补体[Dangl et al.,1988；Miletic and Frank,1995]，表明主要的被诱导的同种型可能不是防护性的。虽然已经报道说，OspA特异性的IgG1借助于补体依赖性的机制[Munson et al.,2000]可能是杀疏螺旋体，但通过ABKD疫苗原诱导的抗体杀灭细菌是补体依赖性的[实施例3]。被诱导出的同种型分布可能受C3H/HeJ小鼠的应用的影响，所述C3H/HeJ小鼠是用于莱姆病研究的标准动物模型。在伯氏疏螺旋体感染期间已经记录了在C3H/HeJ菌株小鼠和BALB/c菌株小鼠之间体液免疫的差异，尤其在总IgG水平上、尤其在IgG2a水平上的差异，在C3H/HeJ小鼠中IgG水平和IgG2a水平都较高[Yang et al.,1992；Keane-Myers andNickell,1995]。另外，C3H/HeJ小鼠细胞系的TLR-4不足，尽管不能预测通过疫苗接种或者在感染期间TLR-4是对抗莱姆病的保护性的关健，因为疏螺旋体不产生脂多糖[Takayamaet al.,1987；Barthold et al.,1990]。
因为一般认为体液的杀疏螺旋体活性是补体依赖性的，所以Th1细胞因子反应的诱出可以是有利的，因为其存在于许多细菌疾病中（在[Spellberg and Edwards,2001]中有评述）。在主动侵染期间，Th细胞因子已经在莱姆病及其后遗症的发展和消散中被暗示。已经有几个研究发现IL-4对于杀疏螺旋体抗体反应的发展不是关键的细胞因子[Munson et al.,2000；Potter et al.,2000；Christie et al.,2000；Satoskar et al.,2000-64]，暗示Th1型反应可能与防护性有关。另外，分泌rFN-γ的Thl细胞可促进与莱姆病有关的心脏炎的消散[Bockenstedtet al.,2001；Kelleher et al.,1998]。相反地，关节炎严重程度和皮肤螺旋体载荷通过给药r-IL-4而被降低，并且在感染期间给药抗IL-4抗体而被增加[Keane-Myers and Nickell 1995;Keane-Myers et al.,1996]。在自然感染期间，IFN-γ的产生已经与慢性莱姆病的发展相关联的[Widhe et al.,2004]，以及与莱姆病关节炎中关节肿胀程度相关联[Gross et al.,1998]。IFN-γ还与抑制由体外淋巴结培养液诱导的杀疏螺旋体抗OspA抗体产生相关联[Munson etal.,2002]。为了研究通过疫苗接种诱导的Th细胞因子环境，用疫苗原在体外再刺激小鼠脾细胞，并且通过ELISA定量Th1（IFN-γ）和Th2（IL-4）细胞因子。在用疫苗原再刺激的细胞的上清液中检测IFN-γ，尽管取决于构建体，浓度有差别。相反，在任何一种脾细胞上清液中未检出IL-4。ABKD、、ABKDppa、以及ABKDD构建体都具有类似浓度的IFN-γ。ADBKD具有大约加倍浓度的IFN-γ，并且ADBK具有甚至更高的水平。在再刺激细胞上清液中的IFN-γ和总的表位特异性的血清IgG滴度或者同种型分布之间没有显而易见的相关性。
通过选择免疫佐剂，可能改变细胞因子和相关的Ig同种型分布。弗氏完全佐剂已经与Th1细胞因子反应相关联[Cribbs et al.,2003；Shibakiand Katz,2002]，其可以提高IgG2a的水平。当前仅有的被批准用于人类的佐剂是明矾，已知其可提高Th2细胞因子的分泌[Cribbset al.,2003；Brewer et al.,1999；Lindblad,2004；Petrovsky and Aguilar,2004]。在用明矾免疫的小鼠中，用与弗氏佐剂免疫相比，记录到预期的对于疫苗原及其部分表位的IgG滴度的适度降低。另外，与IgG1相比，IgG3、IgG2a、以及IgG2b同种型有相应地更大的降低。这符合使用该佐剂预期的Th1细胞因子反应降低。然而疫苗原的确会继续诱导出能够补体固定的抗体，表明佐剂对于构建体或者其变型的显著改变对于有效反应而言可能并非是必需的。
在该实施例中，我们研究了潜在的嵌合多价莱姆病疫苗原的变种，意欲优化被诱导的体液免疫反应。通过在Arg/Glu缓冲液中透析增强构建体的溶解度，构建体的免疫原性取得了显著的改善。这可能具有降低的蛋白质相互作用，允许在体内更大的表位暴露[Theisenet al.,2000]。蛋白酶防护性C末端基序的添加和“保护性的”C末端表位的添加都没有提高对疫苗原的免疫反应。表位的重新排序引起对于被移动的表位的免疫反应的实质下降。在该疫苗中针对组分表位的免疫反应中的差异表现为主要取决于蛋白质的结构、而非取决于蛋白质对蛋白酶消化的耐受性。另外，有证据表明，由疫苗原诱导出的Th细胞因子和IgG同种型可能通过嵌合构建体的结构和佐剂配方而被改变。该研究提供了关于次最佳的对于嵌合疫苗原的免疫反应基础的重要信息、以及可能改善这些反应的方法。
实施例5.可利用的OspC序列的分析表明了广谱防护性多价嵌合莱姆病疫苗的可行性
为了便于进一步开发广谱防护性嵌合构建体，我们已经进行了在数据库中可利用的OspC序列的系统发生分析。被分析的OspC片段跨越残基20至200（对于B31MI序列，使用（残基位置）数字表示法）。数据库中较短的序列被排斥在这些分析之外，剩下的序列来自280个可用于分析的疏螺旋体菌株。通过排列（PAM40记分矩阵）和成对恒等矩阵分析确定每个序列的OspC类型名称。与较早的研究一致，显示出95%以上序列一致性的序列被认为属于相同的OspC类型（Attie et al.,2006；Wang et al.,1999）（图19）。观察到清楚的序列比较双峰分布，在有差别的OspC类型序列之间具有65%的平均序列一致性，并且在类型内部>97%的一致性。除了21个Wang et al.（1999）描述的类型之外，限定了17个额外的群集。我们没有对包含小于3个序列的群集指定OspC类型名称。在命名新的OspC类型中，我们选择保持现有的OspC类型名称A-U（Wang et al.,1999），同时有在每个群集内部包含的其他的基于主型菌株命名的类型。
在280个被分析的序列当中，有202个被指定了OspC类型，所有的OspC类型是来自引起莱姆病的种类。78个未指定OspC类型的序列包括引起莱姆病的螺旋体（51个分离株）及其他疏螺旋体种类（27个分离株）。分离株（每个OspC序列由该分离株得到）的地理学和生物学来源以表格形式被显示于图20中。主要的伯氏疏螺旋体分离株来自北美洲（80%），较小数量的分离株来自欧洲（16%）和亚洲（4%）。53%的伯氏疏螺旋体、48%的嘎氏疏螺旋体和79%的伽氏疏螺旋体OspC序列来源于从人类中收集的分离株。值得注意的是，来自人类分离株的伽氏疏螺旋体OspC序列主要来自脑脊髓液（CSF）来源（68%），反之嘎氏疏螺旋体分离株主要来自皮肤（83%）。相反，伯氏疏螺旋体衍生的OspC序列来自从人类皮肤（51%）、血浆（30%）、以及CSF（19%）回收的分离株。这些发现与已知的由这些生物体引起的疾病模式一致，并且表明在该报告中评估的OspC序列样品代表了莱姆病螺旋体的真正种群。
为了便于进一步的系统发生分析，通过删除相同的序列，被分析的序列组被减少到74个。这些序列然后被排列，并且通过使用具有自展（n=1000）的Phylip(v3.66)谱系发生软件包进行分析。通过使用Dayhoff PAM矩阵，对于跨越20至200、20至130和131至200的区域计算出距离，并且通过相邻连接产生树。赫姆斯疏螺旋体OspC直向同源物（ortholog）（Vmp33）序列用作外围组（Margolis et al.,1994）。产生共有序列树通过多数决定原则（对于组内含物，50%截断）。在Dayhoff PAM模型下通过极大似然法，对于共有序列树，重新计算距离（图21）。
用OspC的20-200aa（氨基酸）片段产生的共有序列树在终端节点处被充分支持，所有被测定的OspC类型群集如预期的那样。虽然有几个较深的分支很少得到自展分析的支持（图21A），这不是预料不到的，因为扩大的在序列之间的区域一致性使得这些区域的系统发生分化变得精细。极大地基于种类一致性，通过使用OspC的20-200和20-130氨基酸片段产生的共有序列树显示出类似的系统发生群集（图21A、21B）。然而，通过使用氨基酸131-200（图21C）产生的共有序列树产生了显著不同的群集模式，该模式不被自展分析强烈地支持。这一发现符合如下假设：在有差别的OspC类型的菌株之间已经发生OspC基因的短片段之间的重组。在OspC类型之间OspC短片段的重组的证据能够在特定的序列中看到。例如，嘎氏疏螺旋体OspC类型的序列PLj7在氨基酸20-130结构域内部具有区域，所述区域与在形成PKi群集的伽氏疏螺旋体OspC序列中看到的区域相同。在PLj7的131-200区域中，变异度高的环5区域和环6区域具有与在伯氏疏螺旋体OspC类型F和M中看到的基序分别相同的基序。另外，重组证据来自使用SimPlot(v 3.5.1)的Bbootscanning分析（Lole et al.,1999）。在Bootscanning中，通过产生在滑动时窗（40个碱基窗口、10个碱基组距）内部序列片段的系统发生树（Kimura模型,Ts/Tv比=2.0。相邻连接）来评估潜在的重组。树被自展（n=100），并且报道了在窗口内部支持序列分组的顺序改变的树的数量。当>70%顺序改变的树群集序列一起在窗口内部时，重组证据典型地被认为得到支持。在如上所述类型中（图22）、以及许多其他OspC类型中（数据未显示），观察到可能的重组证据。
通过在现有的OspC类型之间的交换（而非通过超变（hypermutation））发生OspC变异性的证据提供了如下证据：在广谱防护性疫苗原中内含物所要求的OspC类型特异性的表位的绝对数是有限度的。因为当前绘制的线性表位全部被包含在OspC的C末端区域（aa131-200）中，有可能限定了嵌合疫苗原所要求的表位的理论数目。通过在74个如上所述代表性序列中检查该区域，通过消除相同的或仅单个氨基酸改变的序列，含有独特表位的区域数量可能被减少至34个（图22）。可能该数目能够通过表位绘制而被进一步限制，因为一些表位可以传送对抗两个以上OspC类型的防护性。另外，要求的表位数目的减少还可能起因于要考虑仅与人类疾病（更具体地说，侵袭性的人类疾病）有关的那些OspC类型（参见实施例1）。对抗OspC表位子集的疫苗接种所涉及的一个理论方面是驱动选择针对未包括在疫苗原内的类型的潜力，这样可提高携带有那些稀有等位基因的种群的分数。然而，因为人类是仅有的偶发寄主，疫苗接种将不可能显著地改变表达特异性OspC类型的菌株在蜱载体或者哺乳动物蓄积中的种群分布。
总之，OspC数据库多方面的性质已经允许进行彻底的分析，这些分析已经限定了新的OspC类型，并且提供了关于它们的分离频度和与人类疾病相关的信息。该数据建议，在广谱防护性嵌合疫苗原中内含物所要求的含有OspC表位的序列数量是有限的，并且开发嵌合疫苗原是可行的。
实施例6.八价嵌合体的构建
ENICABKD八价构建体（在本文中也称作构建体A8.1，例如在实施例7中）被显示如下，并且当通过PROTPARAM程序计算时，构建体的数种特性被显示出来。在该表示法中，“TAG”代表在蛋白质氨基末端上的组氨酸标志。“RS”表示被携带限制酶切位点的DNA序列编码的氨基酸序列；这样的序列在蛋白质中主要地起连接物作用。“L”（例如L1、L2、L3、L6、L7、L8等）表示用于把类型特异性序列接到一起的连接物序列（例如非结构化的连接物序列）。
A8.1
Figure BDA00003370568800641
氨基酸数目：384
分子量：41263.7
理论等电点：6.52
氨基酸组成：
Ala(A)51   13.3%
Arg(R)2    0.5%
Asn(N)20   5.2%
Asp(D)25   6.5%
Cys(C)0    0.0%
Gln(Q)5    1.3%
Glu(E)42   10.9%
Gly(G)21   5.5%
His(H)12   3.1%
Ile(I)7    1.8%
Leu(L)46   12.0%
Lys(K)62   16.1%
Met(M)7    1.8%
Phe(F)7    1.8%
Pro(P)5    1.3%
Ser(S)27   7.0%
Thr(T)26   6.8%
Trp(W)0    0.0%
Tyr(Y)0    0.0%
Val(V)19   4.9%
带负电荷的残基（Asp+Glu）的总数：67
带正电荷的残基（Arg+Lys）的总数：64
原子组成：
碳 C 1787
氢 H 2983
氮 N 501
氧 O 597
硫 S 7
分子式：C1787H2983N501O597S7
原子总数：5875
估计的半衰期：
被考虑的序列的N末端是A（Ala）。
估计的半衰期是：4.4小时（哺乳动物网织红细胞，体外）。
>20小时（酵母，体内）。
>10小时（大肠杆菌，体内）。
不稳定性指数：
不稳定性指数（II）被计算为12.58
这将蛋白质归为稳定。
脂肪族指数：81.46
总平均亲水性（Grand average of hydropathicity，GRAVY）：-0.668
当给药于测试哺乳动物时，发现该嵌合蛋白质构建体引起强烈的免疫反应，并且可提供防止莱姆病发展的保护性。
实施例7.用作早期诊断试剂和疫苗抗原的构建体
数种嵌合蛋白质很有前途用于莱姆病早期诊断测定的开发、以及疫苗候选对象。早期检测（例如在大约3周内）很重要，因为病征可能是可治疗的、然后变成不可逆的，慢性损伤或许还没有发生，并且能够预防。然而，诊断可能在晚期阶段被使用，例如在6周内，必要时甚至更长。至于疫苗，它们可以预防性地或者治疗性地被给药。一般来讲，蛋白质是通过连接来自数种不同的疏螺旋体系统发生类型的外表面蛋白质C（OspC）或者外表面蛋白质A（OspA）的全长和/或抗原性的亚片段而形成的嵌合构建体。
通过使用A8.1构建体而产生的示例性数据被显示于图27中。存在于该图中的数据表明，在用实验方法感染的犬科模型中，能够特异性地、并且在感染后早期时间点检测出血清转化。狗被野生捕捉的蜱感染，所述蜱被证实包含表达呈聚集体形式大多数已被描述的OspC类型的螺旋体。该测定表明，嵌合蛋白质能够检测宽广矩阵的OspC血清型特异性的IgG抗体，该矩阵对于基于OspC的莱姆病诊断灵敏度的而言很关健。还显示了在感染后早期的时间点OspC血清转化的检测。因为OspC是在早期感染期间在疏螺旋体细胞表面处表达的主要蛋白质，其与潜在的诊断抗原相比在血清转化的早期检测中具有明确的优点。出于相同的原因，其还具有作为疫苗抗原的显著潜力。
也可以使用A9系列蛋白质作为诊断测定、或者可选地作为疫苗的基础。A9蛋白质含有来自OspC系统发生类型的抗原片段，所述类型主要在伯氏疏螺旋体的北美菌株中被发现。A9.1、A9.2、以及A9.3疫苗蛋白质每个都含有来自相同OspC类型的序列，但是它们在精确的亚片段和/或在蛋白质中亚片段组装次序方面有差异。A9.1包括来自环5至螺旋5的序列加上用于每个被显示类型的天然间插序列。图28A描绘了OspC蛋白质表位的一般位置和在构建体A9.1中表位的排列或者模式。图28B显示了在A9.1中的精确模式。在A9.1中，N末端和C末端被截断以便删除多余的序列；多种类型的表位在没有连接物序列的情况下被连接；并且保守的C末端基序存在于末端。对于所有的“A”构建体，包括在该实施例中描述的A10、A11和A12系列。表位包括伯氏疏螺旋体类型A、B、C、D、E、F、H、I、K、M、N、T、以及U的表位。
构建体A9.1
对于构建体A9.1，氨基酸的数量是569，分子量是60657.2，理论pI是6.35。
A9.2构建体的序列被提供如下（其中“Lp”表示“环”，“Hx”表示“螺旋”），并且被大略地描绘在图29A中。在该构建体中，N末端和C末端被截断以便删除多余的序列；多种类型的表位在没有连接物序列的情况下被连接；间插序列（螺旋4和环6）未被显示，而保守的C末端基序被显示。对于该构建体，表位次序与A9.1（如上所述）中的次序相同。
构建体A9.2
Figure BDA00003370568800681
对于构建体A9.2，氨基酸的数量是431，分子量是46088.0，理论pI是5.85。
A9.3构建体的序列被提供如下（其中“Lp”表示“环”，“Hx”表示“螺旋”），并且被大略地描绘在图30A中。在该构建体中，N末端和C末端被截断以便删除多余的序列；多种类型的表位在没有连接物序列的情况下被连接；间插序列（螺旋4和环6）未被显示，而保守的C末端基序被显示。对于该构建体，表位次序不同于A9.1和A9.2中的次序，并且作为替代，表位被排序为“螺旋-螺旋-环-环”。该蛋白质被设计成螺旋的疏水性表面定向为彼此相向、并且在被连接的螺旋之间。无需结合理论，应当相信该排列可以以类似于在天然OspC中发现的定向方式促进螺旋5表位的定向。
构建体A9.3
Figure BDA00003370568800682
Figure BDA00003370568800691
对于构建体A9.3，氨基酸的数量是432，分子量是46201.2，理论pI是5.85。
除A9系列之外，以类似方法构建的蛋白质已经被开发，覆盖了在北美洲不常发现、但是在欧亚更占优势的疏螺旋体OspC类型。在伽氏疏螺旋体或者嘎氏疏螺旋体中发现了这些OspC类型中的许多种。这些蛋白质被命名为B9系列和C9系列。对于B9系列，包括来自伽氏疏螺旋体类型PWa、Pli、Pbes、Pki、PfiM、H13、Smar和HT22（一些例外如下所述）的表位。对于C9系列，显示了来自嘎氏疏螺旋体（B.afzellii）类型Pko、PLj7、pHez、Pmit、Szid、VS461、HT25和DK15（一些例外如下所述）的表位。
B9.1和C9.1含有环5和螺旋5加上来自被显示类型的间插序列（如上所述用于A9.1的间插序列、以及图28C和28D中描述的间插序列）。
构建体B9.2和C9.2含有表位（如同上述用于A9.2的表位、以及如同图29B和29C中描述的表位），除了H13螺旋5与PKi螺旋5相同之外，因此被排除（即，该序列仅出现一次）并且Dkl5螺旋5与VS461螺旋5相同，使得序列也仅出现一次。另外，不存在C末端基序。
构建体B9.3和C9.3含有表位（如同上述用于A9.3的表位、以及如同图30B和30C中描述的表位），除了H13螺旋与PKi螺旋相同之外，因此被排除（即，该序列仅出现一次）并且Dkl5螺旋与VS461螺旋相同，使得序列也仅出现一次。另外，不存在C末端基序。
构建体B9.1
Figure BDA00003370568800701
对于构建体B9.1，氨基酸的数量是503，分子量是53102.4，理论pI是7.16。
构建体B9.2
Figure BDA00003370568800702
对于构建体B9.2，氨基酸的数量是381，分子量是39928.6，理论pI是5.79。
构建体B9.3
Figure BDA00003370568800711
对于构建体B9.3，氨基酸的数量是382，分子量是40056.8，理论pI是5.93。
构建体C9.1
对于构建体C9.1，氨基酸的数量是512；分子量是54372.0，理论pI是8.14。
构建体C9.2
对于构建体C9.2，氨基酸的数量是383，分子量是40492.5，理论pI是6.45。
构建体C9.3
Figure BDA00003370568800722
对于构建体C9.3，氨基酸的数量是383，分子量是40622.6，理论pI是6.10。
A10、A11、A12系列蛋白质也被开发成用于疫苗和/或诊断抗原的蛋白质，如下所述：
Figure BDA00003370568800731
对于构建体A10CF，氨基酸的数量是823，分子量是87013.4，理论pI是6.28。估计的半衰期（序列N末端被认为是S（丝氨酸Ser））是：1.9小时（哺乳动物网织红细胞，体外）；>20小时（酵母，体内）；>10小时（大肠杆菌，体内）。不稳定性指数（II）被计算为17.53。这使蛋白质归为稳定。脂肪族指数是86.18。总平均亲水性（GRAVY）是-0.487。
对于构建体A11，氨基酸的数量是335；分子量是35688.4，理论pI是5.87。估计的半衰期（序列N末端被认为是S（Ser））是：1.9小时（哺乳动物网织红细胞，体外）；>20小时（酵母，体内）；>10小时（大肠杆菌，体内）。不稳定性指数（II）被计算为17.08。这使蛋白质归为稳定。脂肪族指数是84.57。总平均亲水性（GRAVY）是-0.478。
Figure BDA00003370568800742
对于构建体A12，氨基酸的数量是298；分子量是31637.7，理论pI是7.19。估计的半衰期（序列N末端被认为是A（Ala））是：4.4小时（哺乳动物网织红细胞，体外）；>20小时（酵母，体内）；>10小时（大肠杆菌，体内）。不稳定性指数（II）被计算为17.79；这使蛋白质归为稳定。脂肪族指数是82.99。总平均亲水性（GRAVY）是-0.573。
Figure BDA00003370568800751
对于构建体A12A，氨基酸的数量是451；分子量是48061.1，理论pI是7.19。估计的半衰期（序列N末端被认为是A（Ala））是：4.4小时（哺乳动物网织红细胞，体外）；>20小时（酵母，体内）；>10小时（大肠杆菌，体内）。不稳定性指数（II）被计算为16.121；这使蛋白质归为稳定。脂肪族指数是81.84。总平均亲水性（GRAVY）是-0.579。
对于构建体A12CF，氨基酸的数量是488；分子量是51342.9，理论pI是7.18。估计的半衰期（序列N末端被认为是A（Ala））是：4.4小时（哺乳动物网织红细胞，体外）；>20小时（酵母，体内）；>10小时（大肠杆菌，体内）。不稳定性指数（II）被计算为17.56；这使蛋白质归为稳定。脂肪族指数是87.30。总平均亲水性（GRAVY）是-0.492。
可以用作诊断抗原的其他示例性的嵌合蛋白质被称为LDXl、LDX2、LDX3、以及LDX4，被显示于下文中。这些序列也可以在疫苗组合物中使用。在这些序列中，“ECR”代表“含有表位的区域”。ECR含有从（并包括）环5到（并包括）螺旋5的区域、以及来自被显示的类型的C末端基序。
Figure BDA00003370568800771
Figure BDA00003370568800781
Figure BDA00003370568800791
实施例8.在狗中评估对于嵌合A12CF蛋白质的免疫反应。
在该研究中使用10只大约两个月大、健康、此前未注射预防莱姆病的疫苗的狗。在第0天和第21天，一组（5只狗）在颈部项部/背部肩部处被皮下给药（皮下注射）1mL剂量的0.063% PBS。第二组（5狗）也在第0天和第21天被类似地给药1mL剂量含有Rehydragel LV的嵌合A12CF蛋白质佐剂。在第0、21、42和63天收集血清，并且通过ELISA和/或Western blot分析针对A12CF嵌合蛋白质的抗体。
在整个研究中，接受盐水给药的狗针对OspC的抗体保持血清反应阴性，滴度为41.0（第0天）、54.1（第21天）、58.7（第42天）、以及71.4（第63天）。然而，接受含有RehydragelLV的A12CF蛋白质佐剂的狗发动了强烈的针对该蛋白质的血清反应，滴度为77.6（第0天）、540.6（第21天）、16333.0（第42天）、以及8650.2（第63天）。
虽然本发明已经描述了其优选的实施方式，但本领域的技术人员应理解，在不违背本发明精神和附后的权利要求的范围的情况下，本发明能够具有各种变型。因此，本发明将不会限于如上所述实施方式，而是应该不违背在此提供的精神和描述的范围的情况下进一步包括所有的变型和其等效形式。
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Claims (33)

1.一种嵌合重组体蛋白质，其包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位。
2.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，包含来自5-13个OspC类型的表位。
3.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，包含来自5个OspC类型的表位。
4.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，包含来自6个OspC类型的表位。
5.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，包含来自7个OspC类型的表位。
6.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，包含来自8个OspC类型的表位。
7.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，包含来自9个OspC类型的表位。
8.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，包含来自13个OspC类型的表位。
9.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，所述OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。
10.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，所述嵌合蛋白质具有与选自下组的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%以上的一致性、或者完全（100%）一致性的氨基酸序列：SEQIDNO：250、SEQIDNO：251、SEQIDNO：252、SEQIDNO：253、SEQIDNO：254、SEQIDNO：255、SEQIDNO：256、SEQIDNO：257、SEQIDNO：258、SEQIDNO：259、SEQIDNO：260、SEQIDNO：261、SEQIDNO：262、SEQIDNO：263、SEQIDNO：264、SEQIDNO：265、SEQIDNO：266、以及SEQIDNO：267。
11.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，至少一种所述OspC类型与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
12.如权利要求1所述的嵌合重组体蛋白质，其特征在于，所述OspC类型中的每一种都与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
13.一种用于在需要其的个体中引起针对疏螺旋体的免疫反应的方法，包括下述步骤：
向所述个体提供嵌合重组体蛋白质，所述嵌合重组体蛋白质包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位，所述外表面蛋白质C（OspC）类型彼此不同。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述嵌合重组体蛋白质包含来自5-13个OspC类型的表位。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述嵌合蛋白质具有与选自下组的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%以上的一致性、或者完全（100%）一致性的氨基酸序列：SEQIDNO：250、SEQIDNO：251、SEQIDNO：252、SEQIDNO：253、SEQIDNO：254、SEQIDNO：255、SEQIDNO：256、SEQIDNO：257、SEQIDNO：258、SEQIDNO：259、SEQIDNO：260、SEQIDNO：261、SEQIDNO：262、SEQIDNO：263、SEQIDNO：264、SEQIDNO：265、SEQIDNO：266、以及SEQIDNO：267。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，至少一种所述OspC类型与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述OspC类型中的每一种都与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
19.一种用于确定个体是否已经暴露于或者感染了、或者既暴露于又感染了疏螺旋体的方法，包括下述步骤：
从所述个体中获得生物样品；
将所述生物样品暴露于至少一种重组体嵌合蛋白质，其中所述至少一种嵌合蛋白质包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位，所述外表面蛋白质C（OspC）类型彼此不同；以及
测定所述生物样品中的抗体是否结合于所述至少一种嵌合蛋白质，其中抗体结合的检出是先前暴露于或者感染了疏螺旋体的指示。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述嵌合重组体蛋白质包含来自5-13个OspC类型的表位。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述嵌合蛋白质具有与选自下组的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%以上的一致性、或者完全（100%）一致性的氨基酸序列：SEQIDNO:250、SEQIDNO：251、SEQIDNO：252、SEQIDNO：253、SEQIDNO：254、SEQIDNO：255、SEQIDNO：256、SEQIDNO：257、SEQIDNO：258、SEQIDNO：259、SEQIDNO：260、SEQIDNO：261、SEQIDNO：262、SEQIDNO：263、SEQIDNO：264、SEQIDNO：265、SEQIDNO：266、以及SEQIDNO：267。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，至少一种所述OspC类型与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述OspC类型中的每一种都与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
25.一种针对嵌合重组体蛋白质的抗体，所述嵌合重组体蛋白质包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位。
26.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，所述嵌合重组体蛋白质包含来自5-13个OspC类型的表位。
27.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，所述OspC类型选自下组：Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C和T。
28.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，所述嵌合蛋白质具有与选自下组的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%以上的一致性、或者完全（100%）一致性的氨基酸序列：SEQIDNO:250、SEQIDNO：251、SEQIDNO：252、SEQIDNO：253、SEQIDNO：254、SEQIDNO：255、SEQIDNO：256、SEQIDNO：257、SEQIDNO：258、SEQIDNO：259、SEQIDNO：260、SEQIDNO：261、SEQIDNO：262、SEQIDNO：263、SEQIDNO：264、SEQIDNO：265、SEQIDNO：266、以及SEQIDNO：267。
29.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，至少一种所述OspC类型与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
30.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，所述OspC类型中的每一种都与人感染侵袭性疏螺旋体有关。
31.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，所述抗体对于疏螺旋体螺旋体是杀菌性的。
32.一种嵌合重组体蛋白质的免疫原性混合物，其中，在所述混合物中的每个嵌合重组体蛋白质包含来自两种以上外表面蛋白质C（OspC）类型的环5区或者α螺旋5区、或两者的表位。
33.如权利要求32所述的免疫原性混合物，其特征在于，每种嵌合重组体蛋白质都包含来自6-13个所述OspC类型的表位。
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