CN101374858A

CN101374858A - 多价嵌合ospc疫苗原及诊断抗原

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Publication number: CN101374858A
Application number: CNA2006800518743A
Authority: CN
Inventors: 理查德·托马斯·马尔科尼; 克里斯托弗·厄尔哈特
Original assignee: Virginia Commonwealth University
Current assignee: Virginia Commonwealth University
Priority date: 2005-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2009-02-25

Abstract

提供了用作疫苗和用于诊断莱姆病的嵌合多价重组蛋白。该嵌合蛋白含有外表面蛋白(OspC)类型的环5区和/或α螺旋5区的表位。OspC类型可能与哺乳动物疏螺旋体感染有关。

Description

多价嵌合OSPC疫苗原及诊断抗原

发明背景

发明领域

总的来说，本发明涉及莱姆氏病的疫苗和诊断。具体来说，本发明提供了嵌合的多价重组蛋白，其含有与哺乳动物感染有关的外表面蛋白(OspC)C类型的环5区和/或α螺旋5区/结构域的优势免疫表位。

发明背景

莱姆病(Lyme disease)是北美和欧洲最常见的节肢动物传播的疾病。它由螺旋体伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)和埃氏疏螺旋体(B.afzelii)引起。哺乳动物的传播通过被感染的硬蜱属蜱的叮咬发生[Burgdorfer等，1982，Benach等，1983]。莱姆氏病有相当高的发病率，在美国和欧洲的某些地区，每年有多达3％的人口受到感染[Fahrer等，1991]。感染导致了多系统的炎性疾病，其早期症状可能包括游走性红斑、低烧、关节痛、肌肉痛和头痛[Steere等，1977a]。晚期临床表现可以严重，部分可能包括关节炎[Steere等，1977a；Eiffert等，1998；Steere等，2004]、心脏炎[Asch等，1994；Nagi等，1996；Barthold等，1991]和神经性并发症[Nachman和Pontrelli，2003；Coyle和Schutzer 2002]。此外，莱姆病具有显著的社会-经济成本，表现为由于担心接触蜱而减少户外娱乐和社会活动。

药物经济学研究表明，对莱姆病疫苗存在着明确的需求，特别是在每年发病风险超过1％的人群中[Meltzer等，1999；Shadick等，2001]。但是，目前还没有商业化的疫苗可用。第一个人类莱姆病疫苗是基于OspA的LYMErix(GlaxoSmithKline)；但是，它的使用期短，导致销售下降，在2002年自动撤出了市场。销售的下降可以追溯到对可能的副作用的真正的或感觉上的顾虑，这些副作用包括在HLA-DR4阳性的受者中理论上可能发生的慢性炎性关节炎[Kalish等，1993]。尽管正在开发新的基于OspA的疫苗原以减轻这种潜在的并发症[Koide等，2005；Willett等，2004]，但关于基于OspA的疫苗的存活力的问题仍然存在。一个顾虑是保持长期保护所需要的加强的频率。OspA在蜱的中肠中表达，在蜱进食后被快速下调，在哺乳动物中则不表达[Gilmore等，2001；Schwan等，1995]。基于OspA的疫苗的作用机理是靶向蜱内的螺旋体并防止它们传播[de Silva等，1999]。由于传播发生在蜱进食的48小时内，因此有效的保护依赖于抗OspA抗体的高循环滴度，这就需要频繁加强。基于OspA的疫苗涉及的固有的问题可以通过使用在感染早期高水平表达、并引发杀菌性抗体的抗原来避免。

在莱姆病疫苗开发中，OspC受到了相当的关注。它是22kDa的表面暴露的脂蛋白[Fuchs等，1992]，由在伯氏疏螺旋体(B.burgdorferisensu lato)复合物的分离体中普遍存在的26kb环状质粒编码[Marconi等，1993；Sadziene等，1993]。它的表达被蜱进食时被诱导，并在哺乳动物感染早期得以维持[Schwan，2004]，并且在感染期间遗传稳定[Hodzic等，2000；Stevenson等，1994]。抗OspC抗体已经被证明对感染有保护作用，但是仅仅针对表达在序列上与疫苗原密切相关的OspC的株系[Gilmore等，1996；Bockenstedt等，1997；Gilmore和Mbow，1999；Mathiesen等，1998；Scheiblhofer等，2003；Jobe等，2003；Rousselle等，1998；Wallich等，2001；Mbow等，1999；Probert等，1997；Brown等，2005；Probert和LeFebvre 1994]。对OspC的序列分析已经描绘出大约21个OspC种系组或类型，由字母命名加以区分(从A到U)[Seinost等，1999；Wang等，1999]。尽管在组内序列的变化一般少于2％，但在不同的OspC类型之间它可能高达22％[Wang等，1999；Theisen等，1995；Brisson和Dykhuizen，2004]。这种类型间的表位变动最有可能解释使用单一OspC类型进行免疫接种所能承担的保护范围有限。

Dunn和Luff的美国专利6,248,562(2001年6月19日)描述了由至少两个多肽组成的嵌合的疏螺旋体蛋白，这些多肽来自同样的和/或不同的疏螺旋体种类的相应的和/或不相应的蛋白。掺入嵌合蛋白的嵌合多肽来自任何疏螺旋体菌株的任何疏螺旋体蛋白，包括OspA、OspB、OspC、OspD、p12、p39、p41，p66和p93。嵌合蛋白可以被用作免疫诊断试剂，并作为针对疏螺旋体感染的疫苗免疫原。但是没有指涉及OspC蛋白中存在的环5和α5表位。

Livey的美国专利6,872,550和6,486,130(分别为2005年3月29日和2002年11月26日)描述了用作对抗含有OspC抗原的莱姆病的疫苗的构建体。但是，在这些专利中没有提到环5和α5表位。

Dattwyler等的美国专利7,008,625(2006年3月7日)公开了在单一蛋白内多种不同疏螺旋体菌株和/或蛋白的抗原性多肽。嵌合的疏螺旋体蛋白由外表面蛋白OspA和外表面蛋白OspC的多肽片段构成。这些蛋白可以有效针对莱姆疏螺旋体病以及用于免疫诊断试剂。但是，没有提到环5和第α5表位的特征。

出版物“用于诊断莱姆病的重组嵌合疏螺旋体蛋白(RecombinantChimeric Borrelia Proteins for Diagnosis of Lyme Disease)”(Maria J.C.Gomes-Solecki等，2000.J.Clin.Microbiol.，38：2530-2535)涉及两个上面描述的专利。作者工程制造了重组嵌合体，每个都含有伯氏疏螺旋体关键的抗原性蛋白OspA、OspB、OspC、鞭毛蛋白(Fla或p41)和蛋白p93的一部分。这篇论文涉及诊断，但是在结束段落中描述了在免疫原方面的应用。作者提到了通过进一步研究重要表位的遗传变异性可以产生更好的嵌合体，但是没有提到OspC的环5和α5表位。

到目前位置，现有技术未能提供针对多种OspC类型提供广泛保护的疫苗，以用于预防和/或治疗莱姆病。

发明简述

本发明提供了用作莱姆病的疫苗和诊断的嵌合的多价重组蛋白。

本发明部分基于对来自几个不同的OspC种系组(类型)的新的保护性表位的发现和性质，这些表位每个都与哺乳动物(例如人类)莱姆病感染有关。这些表位的鉴定使得构建含有来自不同OspC感染类型的多个表位的嵌合蛋白成为可能。因此，当用作疫苗时，嵌合重组蛋白引发针对表达这些OspC类型并与哺乳动物莱姆病相关的多个疏螺旋体菌株的广泛的保护。此外，嵌合蛋白可用作诊断工具以鉴别具有针对表位的抗体的个体，并从而确定个体是否已经暴露于或受到莱姆病病原体的感染。在本发明的某些实施方案中，表位是B细胞表位和/或优势免疫表位。

本发明的目的是提供含有来自两个或多个外表面蛋白C(OspC)类型的环5区或α螺旋5区的表位、或其二者的嵌合重组蛋白。在一个实施方案中，OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N和C。在一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型A、B、K和D的表位。在另一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在另一个实施方案中，嵌合重组蛋白具有SEQID NO：75或SEQ ID NO：249中显示的一级氨基酸序列。在某些实施方案中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。

本发明还提供了在需要的个体中引发针对疏螺旋体的免疫应答的方法。该方法包括了给个体施用嵌合重组蛋白的步骤，该嵌合重组蛋白含有来自两个或多个外表面蛋白C(OspC)类型的环5区或α螺旋5区的表位、或其二者。在本发明的一个实施方案中，OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N和C。在本发明一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型A、B、K和D的表位。在另一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在另一个实施方案中，嵌合重组蛋白具有SEQ ID NO：75或SEQ IDNO：249中显示的一级氨基酸序列。在某些实施方案中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。

本发明还提供了确定个体是否已经暴露于或受到了疏螺旋体的感染的方法。该方法包括步骤1)从个体获得生物学样品；2)将生物学样品暴露于至少一种重组嵌合蛋白，其中至少一种嵌合蛋白含有来自两个或多个外表面蛋白C(OspC)类型的环5区或α螺旋5区的表位、或二者；以及3)确定在所述生物学样品中抗体是否与至少一种嵌合蛋白结合，其中抗体结合的检测指示了之前暴露于或受到疏螺旋体的感染。在本发明的一个实施方案中，OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N和C。在本发明一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型A、B、K和D的表位。在本发明另一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在本发明另一个实施方案中，嵌合重组蛋白具有SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：249中显示的一级氨基酸序列。在某些实施方案中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。

本发明还提供了针对含有来自两个或多个外表面蛋白C(OspC)类型的环5区或α螺旋5区的表位、或二者的嵌合重组蛋白的抗体。在本发明的一个实施方案中，OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N和C。在一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型A、B、K和D的表位。在另一个实施方案中，嵌合重组蛋白含有来自OspC类型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在另一个实施方案中，嵌合重组蛋白具有SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：249中显示的一级氨基酸序列。在某些实施方案中，OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。抗体可以是多克隆的或单克隆的。在一个实施方案中，抗体对于疏螺旋体属螺旋体具有杀菌作用。

本发明还提供了嵌合重组蛋白的免疫原性混合物(cocktail)。混合物中的每个嵌合重组蛋白含有来自两个或多个外表面蛋白C(OspC)类型的环5区或α螺旋5区的表位、或二者。

附图简述

图1、来自马里兰的人类患者的OspC序列的进化关系：OspC类型鉴定。OspC基因被PCR扩增、测序，然后构建系统发生图。分析中包括了22个ospC类型的数据库序列描绘(指出了登记号)。为每个种系组指定的类型名称(大写字母)由大写字母在每个分支上标出。自展值(1000次试验)被显示在对于组的区分关键的每个节点上。

图2、表明了在感染过程中抗体对OspC的反应主要是OspC类型特异性的。产生了几种OspC类型的重组OspC蛋白(在图中标明)，通过SDS-PAGE分离，使用指示的HRP偶联的S蛋白或从用已知OspC类型的克隆分离物感染的小鼠收集的血清进行免疫印迹和筛选。

图3、A型OspC的优势免疫表位的定位。截短的A类型OspC作为与S-Tag融合蛋白而产生并表达在大肠杆菌中。图A显示了截短OspC的示意图。编号反映了伯氏疏螺旋体B31 MI OspC的残基编号。在图A中，右边的(+)或(-)表示每个截短的蛋白与感染抗体结合的能力。左边的数字表示包含每个截断的氨基酸残基。在图B和C中，用HRP偶联的S蛋白筛选重组蛋白的免疫印迹以证实表达和上样，或用被伯氏疏螺旋体B31 MI，一种A类型OspC产生株感染的小鼠的血清(α-B31 MI感染血清)来筛选。为了参比，在图b和c中的箭头指示了与α-B31 MI感染血清没有免疫反应性的重组体的迁移位置。在每个免疫印迹的右边显示了分子量标记。

图4、以表格形式显示了类型间和类型内水平的环5或α5表位的片段的比较性分析。

图5、证实了用不同的A型OspC产生菌株感染的多个动物中，环5抗体的反应。用感染血清筛选1)全长A型OspC或2)含有130-150位氨基酸的片段(包括环5)的免疫印迹。用于产生感染血清的菌株和被收集血清的特定小鼠(m)被标明在每个图的上方。感染过程中收集血清时的时间点也被标出。每种都以等量的蛋白进行免疫印迹，并且暴露于胶片的时间量也都相同。

图6、ELISA：鉴定包含A型OspC靶定抗体的血清样品。重组A型全长OspC、重组A型环5和牛血清白蛋白被用于包被ELISA板的孔。用来自人类莱姆体患者的血清筛选孔。所有的分析三份重复进行，给出平均值和标准偏差。所有的方法都描述在文本中。来自15号患者的血清被确定为对于伯氏疏螺旋体B31 MI的抗体为IgG阴性，用作阴性对照。

图7A和B、通过PepSpot分析，鉴定包含A型OspC环5表位的特定残基。跨越环5结构域的重叠肽在硝酸纤维素膜上产生和成斑。然后用来自被A型OspC产生菌株(B31 MI)的克隆种群感染的小鼠的血清或用来自人类莱姆病患者的血清(已标明)筛选被固定的肽。(A)环5结构域的免疫印迹结果；(B)肽序列。

图8、证实了环5是表面暴露的以及针对环5的抗体具有杀菌作用。IFA和杀菌分析使用针对A型环5产生的抗血清进行。(A)结果证实了抗环5的抗血清的特异性。伯氏疏螺旋体B31 MI、B.parkeri的全细胞裂解液以及重组A型环5片段通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，免疫印迹，并使用抗A型环5抗血清(1：1000)进行筛选。蛋白标记的分子量在图的右边。

图9A和B、四价嵌合OspC试验构建体的产生。A，产生四价ABKD嵌合疫苗原构建体的流程图显示在图A中。在ABKD嵌合疫苗原中使用的类型特异性OspC表位由不同的条状阴影代表。A型OspC的环5表位与B、K和D型的α螺旋5表位在第1轮PCR中进行扩增并凝胶纯化。然后在后续轮的PCR中将这些起始的扩增子合并，以产生完全的嵌合构建体。由于扩增子的末端(接头序列)是互补的，在变性后它们可以退火，以便在PCR后可以交叠地延伸。最后的扩增子被退火到pET46Ek/LIC载体中。B，在图B中，显示了ABKD嵌合疫苗原构建体的最终蛋白序列，标出了组成成分含有表位的区域和接头序列。

图10、表明抗ABKD抗血清与ABKD嵌合疫苗原和全长的OspC的免疫反应性的Western印迹。免疫原性通过对ABKD嵌合疫苗原、A、B、K和D型全长重组OspC蛋白(被注明)和rBBN39(阴性对照)进行免疫印迹来评估。印迹用抗His标签mAb进行筛选，以证实基本上相等的载样量，或用代表性的抗ABKD抗血清进行筛选(在下方标明)。分子量显示在右边。观察到了对A、B和K(但是不对D)的强IgG反应。

图11A和B、用ABKD嵌合疫苗原免疫的小鼠的血清反应性的ELISA滴定。A、对用ABKD嵌合疫苗原免疫的小鼠(n＝12)或用PBS/佐剂假免疫的小鼠(n＝3)的血清进行滴定，以测定与ABKD嵌合疫苗原或A、B、K和D型rOspC蛋白的反应性。图A表明了所有血清对ABKD嵌合疫苗原构建体的免疫反应性的滴定(每只小鼠使用带有不同符号的实线)。在假免疫的小鼠中没有观察到Ab反应(虚线)。B，也完成了对于每种OspC类型的特异性反应的滴定(没有显示曲线)，在1/2最大OD405处测定的滴度显示在图B中(每个小鼠1个点，水平线为平均滴度)。对照小鼠没有滴度，没有作图。

图12、抗ABKD抗血清的免疫球蛋白同种型分布情况。ELISA孔用ABKD嵌合疫苗原构建体包被(100ng/孔)，并用抗ABKD抗血清双份探查(1:10000；n＝12)。结合的Ig用生物素化的同种型特异性第二抗体(小鼠同种型分型试剂盒；Zymed Laboratories)和HRP偶联的链亲和素检测。通过测量HRP介导的ABTS底物的转化而产生的有色产物来对反应性进行定量。

图13A-D、构建ABKD疫苗变异体的示意图。ABKDppa(图A)是通过使用具有5′突出端以加上C末端氨基酸的反向引物来扩增原始的构建体而构建的。ABKDgg(未显示)以同样的方式构建，但是使用的是OCDH5ggLIC引物。ABKDD(图B)、ADBK(图C)和ADBKD(图D)都是通过使用加上了编码接头序列的尾部的引物，对组成序列进行PCR扩增而制备的。获得的PCR产物被凝胶纯化，通过交叠退火和延伸而连接起来。最终的产物被克隆到pET-46Ek/LIC载体中。含有OspC类型特异性表位的区域用字母表示，接头序列用数字表示(参见插入的编码氨基酸序列)。箭头表示引物，5′突出的LIC尾部或接头序列被标注在每个引物箭头的尾部。

图14、嵌合疫苗原试验构建体的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶。疫苗原重组蛋白被表达在大肠杆菌中，通过镍色谱进行亲和纯化，并通过BCA方法定量。将2μg纯化的蛋白在15％的SDS-PAGE凝胶(Criterion；Biorad)上进行电泳，并用考马斯亮蓝G-250染色。没有注意到污染的蛋白，重组蛋白降解很少或没有降解。

图15A和B、小鼠疫苗血清识别全长重组OspC的评估。在图A中，A、B、K和D型重组OspC在PVDF上电泳并形成印迹(类型指示在顶部；500ng/道)，并用1:2500稀释的来自用每种变异构建体(标注在左边)免疫的小鼠的代表性血清探查。二级检测使用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(1:40000)和化学发光进行。分子量标注在右边。图B是小鼠疫苗血清与全长重组OspC的反应性的定量ELISA滴定的结果。针对每种疫苗构建体(标注在底部)产生的血清针对固定的全长重组A、B、K和D型OspC进行滴定。还包括了用PBS透析的ABKD构建体(ABKD^*)[17]的滴度。条表示针对A(黑色)、B(灰色)、K(空心)和D(斜线)型的OspC的平均滴度。来自个体小鼠的滴度用空心三角形表示。下面列出的是平均滴度的数值，以及针对用PBS(ABKD^*)或Arg/Glu缓冲液(ABKD)透析的ABKD构建体的相应滴度指示的滴度。

图16A-C、表位特异的同种型对三种疫苗构建体的反应。将A、B、K和D型OspC固定在ELISA板上，使用来自用ABKD、ABKDD或ADBKD构建体免疫的小鼠的免疫血清双份探查。结合的Ig同种型用生物素化的同种型特异的第二抗体和过氧化物酶偶联的链亲和素检测。

图17、免疫的小鼠的脾细胞对使用免疫原的体外再刺激的IFN-γ反应。用6种疫苗构建体的每种免疫的3只小鼠的无红细胞的脾细胞被收集，合并，用最初的免疫抗原三份平行再刺激(在24孔板中每mL10⁷个细胞，抗原为10或5μg/mL)。在三个对照孔中施用10mg/mLBSA或不使用蛋白。孵育(37℃，5％CO2)96小时后，收集无细胞上清液，通过ELISA测定IFN-γ的浓度。在所有情况下，BSA和无蛋白孔中的IFN-γ浓度低于分析的检测限。

图18A和B、评估抗体对弗氏佐剂或明矾中施用的ABBCD疫苗原的反应。图A是针对在弗氏佐剂中乳化的ABKD疫苗(实心条)或吸附于明矾的ABKD疫苗(斜线条)产生的小鼠血清中IgG的定量ELISA滴定的结果。血清针对固定的ABKD疫苗原或A、B、K和D型全长重组OspC进行滴定。图B显示了与固定的ABKD疫苗原结合的血清的同种型分布情况。结合的Ig同种型用生物素化的同种型特异的第二抗体和过氧化物酶偶联的链亲和素检测。

图19、OspC蛋白序列一致性的成对比较的分布。使用PAM40计分矩阵将来自280个疏螺旋体分离株的OspC蛋白序列进行了Clustal比对，并计算了成对百分一致性。直方图间隔为1％，百分一致性没有低于50％的。

图20、指定的OspC类型的物种、地理和生物学分离数据。

图21A-C、代表性OspC蛋白序列的共有系统进化树。包含氨基酸20-200(A)、20-130(B)和131-300(C)的OspC序列被自展(n＝1000)，计算距离，产生邻近的结合树，并与严格一致性树一致。赫姆斯疏螺旋体(B.hermsii)的Vmp33序列被用作外类群。标记表示物种为伯氏疏螺旋体(Bb)、伽氏疏螺旋体(Bg)或埃氏疏螺旋体(Ba)、分离株的命名、指定的OspC类型(粗体)、以及该单一序列所代表的与其它菌株一致的OspC序列的数量(在括号中)。自引支持度显示在所有区分OspC类型的节点上。

图22、PLj7型OspC(埃氏疏螺旋体)的ospC序列与Pki型(伽氏疏螺旋体；黑色实线)、F型(伯氏疏螺旋体；灰色实线)和M型(伯氏疏螺旋体；黑色虚线)的OspC的比较的启动扫描(bootscan)分析。启动扫描窗口为40个碱基，每步10个碱基。通过与100个自引复本的严格一致性进行比较。图被简化了，只显示了那些轮排的树(permutedtrees)的百分数超过50％的峰，水平为70％被认为代表了可能的重组，它们被标明。

图23、来自本研究中定义的所有OspC类型的OspC蛋白序列的含有表位的区域的比对。在OspC类型内有超过一个氨基酸差异的所有序列被代表性的序列指出。阴影的一致性阈值为80％。二级结构α螺旋和环(对应于B31结构)被显示在比对序列的下方(Kumaran等，2001)。

图24、用于ABKD嵌合疫苗原的构建的亲本OspC序列的ClustalX比对和包含在疫苗原中的含有表位的区域的物理位置。在亲本序列的Clustal X比对中，A型(环5区，浅灰色框)和B、K及D型(α螺旋5区，深灰色框)OspC的含有表位的区域的位置被加亮。

图25A-J、示例的本发明嵌合疫苗原。构建体的标题表明构建体整合的OspC类型特异的环5和α螺旋5表位，及其次序。粗体X表示任选的接头序列的位置。

图26、来自几种疏螺旋体菌株的OspC的蛋白和DNA登记号。

本发明实施方案的具体描述

本发明是基于与人类莱姆病感染有关的OspC类型的新的、保护性的、类型特异性的表位的鉴定和表征。该新的表位位于OspC的羧基末端一半中的两个结构域(区域)内。这两个结构域以前都没有被鉴定为具有高度的免疫原性。第一个结构域(在本文中被称为“α螺旋5区/结构域”或“α5区/结构域”或“螺旋5区/结构域”)位于160和200位残基之间，并含有包括环6的一部分、α螺旋5和无结构的C末端结构域的二级结构元件(Kumaran等，2001)。第二个结构域(在本文中称为“环5区/结构域”)位于131和159位残基之间，并含有包括α螺旋3的一部分、环5和第螺旋α的二级结构元件(Kumaran等，2001)。这些区域每一个都含有至少一个可用于本发明的实践的表位。来自这两个结构域的表位、或来自这两个区域内的抗原性肽或多肽，单独或优选与嵌合免疫原中的其它表位组合，可以用于本发明的实践中。在本发明的某些实施方案中，表位是优势免疫表位。通常表位是B细胞表位，尽管也不排除T细胞表位。

新的表位的发现、以及对不同OspC类型的表位的作图，使得构建含有多个线性、类型特异性的来自多个OspC类型的优势免疫表位的多价嵌合蛋白成为可能。当用作疫苗时，多价重组嵌合蛋白引发针对疏螺旋体属螺旋体的感染的广泛保护作用，其中该疏螺旋体属螺旋体表达的OspC类型与嵌合蛋白中的相应，即具，有高度感染性的那些疏螺旋体。此外，嵌合蛋白可用作诊断工具以鉴别个体具有针对嵌合蛋白中包含的表位的抗体，从而确定该个体是否已经暴露于和/或受到了莱姆病病原体的感染。

为了便于理解本发明，提供了下面的定义：

抗原：历史上用于指称被抗体结合的实体的术语，也用于指诱导抗体产生的实体。近来的用法将抗原的意义限于被抗体结合的实体，而“免疫原”一词用于诱导抗体产生的实体。当本文讨论的实体兼有免疫原性和抗原性时，一般来说将根据其预期的应用将其称为免疫原或抗原。术语“抗原”、“免疫原”和“表位”在本文中可以互换使用。

B细胞表位：抗原上被B细胞受体识别、并可以被分泌的抗体结合的特定化学结构域。该术语可以与“抗原性决定簇”互换使用。

优势免疫表位：分子上诱导显性的、或最强烈的免疫应答的表位。

线性表位：包含被肽键连接在一起以形成肽或多肽的单个、不间断的连续氨基酸链的表位。这样的表位可以通过其一级结构，即链中氨基酸的线性序列来描述。

构象表位：该表位包含的至少某些氨基酸不是不间断的线性氨基酸序列的一部分，但这些氨基酸通过蛋白的二级、三级和/或四级相互作用被带到与所述表位中的其它残基接近。从一级结构来说，这些残基可能距表位中的其它残基位置很远，但是由于蛋白的折叠可能与构象表位中的其它残基在空间位置上接近。

环5区/结构域：OspC中包括了与图23中显示的A型OspC序列的131位到159位残基排列在一起的残基的区域。该区域中包含的B31菌株的OspC二级结构元件是α螺旋3的一部分、环5和第α螺旋4，如在Kumaran等(2001)所定义。

α螺旋5区/结构域：OspC中包括了与图23中显示的B31菌株(A型OspC)序列的160位到200位氨基酸排列在一起的残基、以及图23中没有显示的蛋白的C末端部分(B31序列的201-210位氨基酸)的区域。该区域中包含的B31菌株的OspC二级结构元件是环6的一部分、α螺旋5和无结构的C末端结构域，正如在Kumaran等所定义(2001)。

蛋白：大约100个或更多的氨基酸通过肽键共价连接的线性序列。

多肽：大约20个到大约100个氨基酸通过肽键共价连接的线性序列。

肽：大约20个或更少的氨基酸通过肽键共价连接的线性序列。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可以互换使用。

嵌合蛋白：其一级序列含有不会同时出现在自然中的单一分子中的多个肽、多肽和/或蛋白序列的重组蛋白。

嵌合蛋白的价(例如“多价”)是指嵌合疫苗原中包含的带有OspC类型特异性表位的多肽的数量。例如二价嵌合体可以由A型5螺旋α和B型α螺旋5构成，或由A型α螺旋5和A型环5构成。在每个带有多肽表位的区域中可能存在多个不同的表位。

原始或天然或野生型序列：与自然中发现的一样的肽、多肽、蛋白或核酸的序列。

重组肽、多肽、蛋白或核酸：使用分子生物学技术例如克隆、聚合酶链反应(PCR)等生产和/或操作过的肽、多肽、蛋白或核酸。

类型特异性：主要与单一种系组有关的。

侵袭性感染：如果在人类感染过程中从蜱叮咬最初接种的周围皮肤之外的地方(例如血浆、脑脊液等)分离到了带有OspC类型的疏螺旋体，那么OspC蛋白被称为是“与侵袭性感染有关”。

因此，本发明提供了含有多个来自环5和/或α螺旋5区的线性表位的重组嵌合蛋白，这些表位中至少两个来自与侵袭性感染有关的不同OspC类型。优选，代表了大约2到大约20个、优选从大约6个到大约10个不同的OspC类型的抗原性表位被包含在单一嵌合蛋白中。尽管通常一级结构中至少有两个表位彼此不同并来源于不同的OspC类型，但也可能在嵌合体中包含单一类型表位的多个拷贝，或包含基于或来自同样OspC类型的原始序列的几个序列。尽管嵌合体中线性表位的总数可以略有不同，但一般来说范围从大约10到20个。在本发明的一个实施方案中，优势免疫表位选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C型OspC的两种或多种。在一个实施方案中，嵌合蛋白是四价的，含有来自A、B、K和D型表位。在另一个实施方案中，嵌合蛋白是八价的，含有来自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。但是，本领域的专业技术人员将会认识到，也可以使用来自其它OspC类型组合的表位，只要获得的嵌合体产生适当的免疫应答、和/或作为疫苗有效地防止莱姆病就行。其它适当组合的例子包括但不限于：1)E、N、I、C、A、B、K、D；2)A、B、K、D、E、N、C；3)I、C、A、B、K、D；以及4)C、A、B、K、D。

在某些实施方案中，将同时包含环5和α螺旋5区。例如，“E、N、I、C、A、B、K、D”构建体可以同时含有每个E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的环5和螺旋5区。但是，情况并不必须是这样。例如，可以包含A型的环5区和E、N、I、C、B、K和D的α螺旋5区；或者可以仅包含每种OspC类型的环5区；或者仅包含α螺旋5区；或者可以包含其它组合(例如E、N、I和C型的环5区和A、B、K和D型的α螺旋5区)。对于本领域的专业技术人员来说可以产生许多这样的组合，所有这样的变化均旨在包含在本发明中。

此外，嵌合体内表位的线性次序可以变化。一般来说，从氨基到羧基末端的次序为“环5区，α螺旋5区，环5区，α螺旋5区……”等。例如，在E、N、I、C、A、B、K、D构建体的情况下，优选的次序为，沿着嵌合体的长度方向，“E型环5区，E型α螺旋5区；N型环5区，N型α螺旋5区；I型环5区，I型α螺旋5区；”等，不同的OspC类型和/或不同的结构域选择由中性接头序列分隔开。但是，这种次序可以改变，这依赖于例如被选择包含在嵌合体中的元件。可以使用任何的OspC类型和结构域的次序，只要获得的嵌合体产生适合的免疫应答和/或作为疫苗有效地防止莱姆病、或能够有效用于诊断就行。示例性的嵌合体序列的例子在图25A-J中给出。来自几个疏螺旋体菌株的OspC的关键的蛋白和DNA登记号以表格的形式显示在图26中。

嵌合蛋白中包含的氨基酸序列可以包括α螺旋5区和/或环5区，或其抗原性片段。对于“抗原性片段”来说，我们是指含有至少一个在感染中被识别的线性表位的一级OspC序列的片段。这样的表位，当表达在重组的OspC蛋白亚基中时，保留了以类似于结合表达在细胞表面的野生型蛋白的方式结合感染诱导的抗体的能力。单个抗原性片段可以包含一个以上的不同表位。本领域的专业技术人员将会认识到，测量抗体对表位的亲和性或亲和力略微有些不准确，在免疫应答过程中，由于例如亲和成熟/体细胞超突变，亲和性/亲和力可以显著地变化。但是，一般来说，抗体与嵌合蛋白结合的亲和性/亲和力与天然的完整α5或环5表现出的亲和性相比，在至少大约50％的范围内，优选大约60％，更优选大约70％，更加优选大约80％，最优选大约90-100％或甚至更高。一般来说，在嵌合体蛋白中包含的抗原性序列将含有大约20到大约100个氨基酸，优选从大约30个到大约70个氨基酸，嵌合蛋白本身将含有总共从大约160个到大约800个氨基酸，优选从大约240个到大约560个氨基酸。此外，抗原性序列在本文中可以被称为“表位”，无论它们是否包含了完整的“天然”表位，只要它们具有本文描述的抗体结合特性就行。

或者，合适的抗原片段或抗原性序列或表位当包含在嵌合蛋白中时，可以通过它们在施用嵌合蛋白的宿主中引发针对表位产生适当抗体的能力来鉴定。本领域的专业技术人员将会认识到抗体滴度的定义可以改变。在这里，“滴度”被取为在用100ng测试蛋白包被的ELISA孔中结合一半的可用结合位点的抗血清的稀释度的倒数。一般来说，产生适当的抗体的特征为抗体滴度在大约100到大约100,000的范围内，优选在大约10,000到大约10,000000的范围内。或者，特别是在诊断分析中，“滴度”应该为结合的背景水平的大约3倍。例如，要被认为是“阳性”，在测试中的反应性应该至少比在未感染的个体的血清中检测到的反应性高3倍。优选抗体反应是保护性的，即与未接种的宿主相比，防止或减少了后来暴露于疏螺旋体的接种宿主中疾病症状的发展。

本发明的一个示例性嵌合蛋白的氨基酸序列显示在图9B中。在该说明性实施方案中，嵌合体含有来自A型OspC的环5区氨基酸序列和来自B、K和D型OspC的α螺旋5区序列。在这种情况下，A型OspC序列来自菌株LDP56，核苷酸登记号为EF053513，蛋白登记号为ABK41054；B型OspC的序列来自菌株LDP73，核酸登记号为EF053525，蛋白登记号为ABK41066；K型OspC来自菌株LDP89，核苷酸登记号为EF053523，蛋白登记号为ABK41064；D型OspC来自菌株LDP116，核苷酸登记号为EF053527，蛋白登记号为ABK41068。本领域的专业技术人员将会认识到，来自许多疏螺旋体菌株的OspC是已知的或可以发现的，并可以用于本发明的实践中。

本领域的专业技术人员将会认识到，尽管在本发明的某些实施方案中，被选择包含在本发明嵌合蛋白中的氨基酸序列直接对应于OspC蛋白的原始或天然序列的一级氨基酸序列，但这种情况不是必须的。包含在本发明嵌合蛋白中的表位的氨基酸序列可以略有改变并仍然适合用于本发明中。例如，可以进行某些保守氨基酸取代而对表位引发免疫应答的能力没有有害的影响。本领域的专业技术人员将会认识到这种保守取代的本质，例如用带正电荷的氨基酸取代另一个带正电荷的氨基酸；用带负电荷的氨基酸取代另一个带负电荷的氨基酸；用疏水的氨基酸取代另一个疏水的氨基酸；等等。所有这种包含在本发明嵌合蛋白中的表位的序列的取代或改变都旨在被本发明包含，只要产生的表位仍然能够引发适当的免疫应答就行。此外，包含在本发明的嵌合蛋白中的氨基酸序列不必须包涵全长的天然表位或含有表位的结构域。本领域的专业技术人员将会认识到，已知是或含有表位的氨基酸序列的截短的版本可以由于各种原因优选用于本发明中，只要序列满足了为表位设置的标准就行。这样被取代或以其它方式改变的氨基酸序列在本文中可以被称为“基于”或“来自于”原始的野生型或天然序列。一般来说，线性表位所“来自”或线性表位所“基于”的OspC蛋白是自然中出现的OspC蛋白。这些天然的OspC蛋白也可以被称为天然或野生型蛋白。

出于多种原因可以导入这样的对一级序列的改变，例如，为了消除或引入蛋白酶切割位点，为了增加或降低溶解性，为了促进或阻碍分子内或分子间相互作用例如折叠、离子相互作用、盐桥等，否则它们可能干扰单个表位沿着嵌合体长径的呈递和可接近性。所有这样的改变都旨在包涵在本发明的范围之内，只要获得的氨基酸序列能作用于引发针对表位所源自的OspC类型的保护性抗体反应就行。一般来说，这样的取代序列将与相应的天然蛋白的序列具有至少大约50％的一致性，优选与野生型序列具有大约60-70、甚至70到80、或80到90％的一致性，优选大约95到大约100％的一致性。

在本发明的某些实施方案中，嵌合疫苗原中的单个线性表位彼此之间被间插序列分隔开，这些间插序列在性质上或多或少为中性，即它们不参与或本身不引发针对疏螺旋体的免疫应答。这样的序列在嵌合体的表位之间可以存在，也可以不存在。如果存在，它们可以，例如，用于分隔表位，并有助于表位彼此之间的空间隔离。或者，这样的序列可以仅仅是重组加工程序例如克隆程序的人为产品。这样的序列一般被称为接头或间隔肽，其许多例子为本领域的专业技术人员所熟知。参见例如Crasto，C.J.和J，A.Feng.2000.LINKER：a program togenerate linker sequences for fusion proteins.(LINKER：产生用于融合蛋白的接头序列的程序)Protein Engineering13(5)：309-312，它是描述了无结构接头的参考文献。结构(例如螺旋)序列接头也可以使用例如现有的已知具有二级结构的序列来进行设计，或者使用基本的已知生物化学原理来设计接头。此外，其它的元件也可以出现在嵌合蛋白中，例如前导序列或给蛋白“加标签”以便于蛋白的纯化或检测的序列，其例子包括但不限于组氨酸标签、检测标签(例如S-tag或Flag-tag)、其它的抗原性氨基酸序列，例如含有已知的T细胞表位的序列和蛋白稳定基序等。此外，嵌合蛋白可以被化学修饰，例如通过酰胺化、磺酰化、脂化或本领域的专业技术人员所熟知的其它技术。

本发明还提供了编码本发明的嵌合蛋白的核酸序列。这样的核酸包括DNA、RNA及其杂化物等。此外，本发明包含了含有或纳入这些编码序列的载体。适合的载体的例子包括但不限于质粒、粘粒、基于病毒的载体、表达载体等。在优选实施方案中，载体是质粒表达载体。

本发明的嵌合蛋白可以通过任何适当的方法来生产，它们中的许多已经为本领域的专业技术人员所熟知。例如，蛋白可以被化学合成，或使用重组DNA技术来生产(例如在细菌细胞中，在细胞培养物中(哺乳动物、酵母或昆虫细胞)，在植物或植物细胞中，或通过无细胞原核或基于真核的表达系统，通过其它的体外系统等)。本发明还提供了用于引发免疫应答的组合物，它可以被用作疫苗以预防或治疗疏螺旋体感染，特别是在证实为莱姆病(莱姆疏螺旋体病)时。对于引发免疫应答来说，我们是指抗原的施用引起了特异性抗体的合成(以上述的滴度)，和/或细胞的增殖，正如通过例如3H胸腺嘧啶的掺入所测量的那样。对于“疫苗”来说，我们是指引发免疫应答的嵌合蛋白，与未被接种(例如只使用佐剂)的对照生物体相比，其产生针对疏螺旋体攻击的保护作用，完全或部分防止或遏制了与疏螺旋体感染有关的症状(即莱姆病症状)的发展。组合物包括一种或多种本文描述的基本上纯化的重组嵌合蛋白以及合适的药用载体。组合物中的多种嵌合蛋白可以相同或不同，即组合物可以是不同嵌合体的“混合物”，或者组合物只含有单一类型的嵌合体。这种用作疫苗的组合物的制备对于本领域的专业技术人员来说是熟知的。一般来说，这样的组合物被制备成液体溶液或悬浮液，但是也可以考虑固体形式例如片剂、丸剂、粉末等。也可以制备适合于在给药前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。活性成分可以与可药用的并能与活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等或其组合。此外，组合物可以含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。本发明的疫苗制剂还可以含有佐剂，适合的例子包括但不限于Seppic、Quil A、Alhydrogel等。如果需要口服形式施用组合物，可以加入各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂等。本发明的组合物可以含有任何这样的附加成分以提供适合于给药形式的组合物。在制剂中嵌合蛋白的最终含量可以变化。但是，一般来说，制剂中的量为大约0.01-99％重量/体积比。

方法包括给哺乳动物施用在可药用的载体中含有嵌合重组蛋白的组合物。本发明的疫苗制剂可以通过本领域的专业技术人员所熟知的许多种适合的方法中的任何一种来施用，包括但不限于通过注射、吸入、口服、鼻内、通过消化含有嵌合蛋白的食品等。在优选实施方案中，给药模式是皮下或肌肉内。此外，组合物可以与其它的治疗形式一起使用，例如增强免疫系统的物质、化疗剂等。

本发明提供了在哺乳动物中引发针对疏螺旋体的免疫应答和针对疏螺旋体感染进行免疫接种的方法。在一个实施方案中，哺乳动物是人类。但是，本领域的专业技术人员将会认识到，其它哺乳动物可能也存在对这种免疫接种的需要，例如，制剂也可以用于兽医目的。例子包括但不限于陪伴“宠物”例如狗、猫等；食物来源、工作和娱乐动物例如牛、马、公牛、绵羊、猪、山羊等；或者甚至是作为疏螺旋体储主的野生动物(例如小鼠、鹿)。本发明还提供了诊断剂和使用诊断剂来鉴别个体具有针对本发明的嵌合蛋白内包含的表位的抗体的方法。来自被怀疑已经暴露于疏螺旋体或正处于暴露于疏螺旋体风险中的个体(例如疏螺旋体螺旋体易感的人类、鹿或其它哺乳动物)的生物学样品，与本发明的嵌合蛋白相接触。使用现有的方法，检测嵌合蛋白和生物学样品中抗体之间是否存在结合反应。阳性结果(结合发生了，因此抗体存在)表明个体已经暴露于和/或感染了疏螺旋体。就此而论，根据分析的目的，可以构建特异性针对所关注的OspC类型的任何亚类的嵌合体，即所有可能的OspC类型可以包括、或可以不包括在诊断嵌合体中。

此外，本发明的诊断方面不局限于临床使用和家庭使用，对于在实验室中作为研究工具也可能是有价值的，例如鉴定从蜱分离到的疏螺旋体属螺旋体，研究OspC类型的地理分布等。

本发明还涵盖了针对本文公开的表位和/或嵌合体蛋白的抗体。这样的抗体可以是多克隆的、单克隆的或嵌合的，并可以以本领域的专业技术人员所熟知的任何方式产生。在本发明的优选实施方案中，抗体是杀菌的(杀疏螺旋体的)，即将疏螺旋体属螺旋体暴露于抗体导致螺旋体的死亡。这样的抗体可以以多种方式使用，例如作为检测试剂诊断先前在疏螺旋体中的暴露，作为研究疏螺旋体的试剂盒的试剂、治疗疏螺旋体感染等。

提供了下面的实施例以阐述本发明的各种实施方案，但是它们不应被认为以任何方式构成限制。

实施例

实施例1、在侵袭性人类莱姆病分离株中证明OspC类型多样性和鉴定限定OspC抗体反应特异性的以前未表征的表位

简介

莱姆病通过被伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体或埃氏疏螺旋体感染的硬蜱属蜱的叮咬而传播到人类。外表面蛋白C(OspC)被认为是参与传播过程的重要毒力因子，并可能参与了哺乳动物中早期感染的建立(Grimm等，2004；Parl等，2004；Schwan等，1995)。OspC是可变的、大约22kDa的、表面暴露的、质粒编码的脂蛋白(Fuchs等，1992；Marconi等，1993；Sadziene等，1993)。已经确定了三个OspC蛋白的晶体结构(Eicken等，2001；Kumaran等，2001)。蛋白主要是螺旋状的，具有5个α螺旋，通过可变的环连接。据推测环形成了配体结合结构域(Eicken等，2001；Kumaran等，2001)。证据表明，OspC可能通过作为与唾液腺中未鉴定的受体结合的粘附素来帮助螺旋体从蜱中肠的转移(Pal等，2004)。在回归热族群的几个物种中已经鉴定出了OspC的种间同源基因，这提高了OspC相关蛋白在其它疏螺旋体物种中执行同样功能的可能性(Marconi等，1993；Margolis等1994)。OspC的表达受环境的调控，受蜱进食的诱导，并且在哺乳动物早期感染中OspC是优势抗原(Alverson等，2003；Schwan等，1998；Stevenson等，1995)。转录至少部分受到RpoN/S调控网络的调控(Hubner等，2001)。应该注意到，关于在传播期间和早期感染期间OspC表达的临时性质的精确细节的报道有冲突(Ohnishi等，2001；Schwan等，1995)。

OspC表现出明显的遗传和抗原多样性(Theisen等，1995；Theisen等，1993)。已经描述了21个OspC种系组(在后文中称为OspC类型)(Seinost等，1999；Wang等，1999)。OspC类型用字母命名(从A到U)来区分。对于数据库中的几百个OspC氨基酸序列进行的分析表明，OspC类型之间的趋异性可以高达30％，而在一种类型内一般少于6％。Seinost等假设在A、B、I和K型OspC与人类的侵袭性感染之间存在关联(Seinost等，1999)。Lagal等也报道了通过单链构象多态性分析确定的特异性OspC变异体与侵袭性人类感染有关(Lagal等，2003)。但是，Alghaferi及其同事的最近的研究对于这种关联的强度提出了疑问(Alghaferi等，2005)。OspC的类型或序列对功能和宿主-病原相互作用的影响代表了一个重要的、富于创造性的研究领域。对于OspC在莱姆病疫苗开发中的应用已经进行了研究(Bockenstedt等，1997；Gilmore等，2003；Gilmore等，1999a；Probert等，1994；Theisen等，1993；Wilske等，1996)。但是，OspC的变异以及对OspC抗原性结构的有限的了解使得这些工作很复杂。OspC具有保护性力，但是仅仅针对同样的菌株(Bockenstedt等，1997；Gilmore等，1999；Gilmore等，1999b；Probert和LeFebvre，1994；Wilske等，1996)。这表明保护性的表位位于序列高度可变的蛋白区域内。

本研究的目的有几层。首先，通过确定从马里兰州限定的患者人群中回收的侵袭性和非侵袭性分离株的OspC类型，寻求对OspC类型与侵袭性感染之间的推定关联性的进一步评估。第二，在尝试更好地理解针对OspC的反应抗体中，寻求确定该反应是否是类型特异性的。最后，通过鉴定在小鼠感染过程中引发抗体反应的表位，寻求OspC抗原性结构的确定。本文呈现的数据表明与侵袭性感染有关的OspC类型的数量超过以前的推测(Seinost等，1999)。此外，我们鉴定了两个以前未表征的表位，并证实了针对OspC的抗体反应被显示是类型特异性的。这些分析提供了重要的信息，增强我们对OspC在莱姆病致病机理中的作用的理解，并将便于基于OspC的疫苗的构建。

实验程序

细菌分离株，感染血清的培养和产生。从马里兰州人类患者回收的莱姆病分离株被用在这些分析中(表1)。患者在研究前提供了知情同意书，该研究被约翰霍普金斯医学研究机构审查委员会(JohnHopkins Medicine Institutional Review Board)批准。螺旋体在BSK-H完全培养基(Sigma)中在33℃下进行培养，通过暗视野显微镜监测，通过离心收集。对于某些分离株来说，通过以前描述的液面下铺板(Sung等，2000)产生了克隆种群。为了确定个体菌落的ospC类型，对ospC基因进行了PCR扩增、测序，并进行了比较性序列分析(如下所述)。为了产生针对一系列表达已知类型的OspC蛋白的克隆种群的抗血清，将10³个螺旋体在磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗，然后用针接种到C3H-HeJ小鼠中(皮下，肩胛之间；Jackson Labs)。小鼠的感染按照以前的描述(Zhang等，2005)，通过在接种后2或4周对耳穿刺活体组织使用靶定flaB基因的引物进行实时PCR来证实。在0、2、4和8周时通过剪截尾巴从每只小鼠收集血液，收获感染血清。其它在这些分析中使用的抗血清和感染血清在以前已经描述过了(McDowell等，2002)。

表1、细菌分离株、来源信息和OspC类型

伯氏疏螺旋体分离株	来源	OspC类型
伯氏疏螺旋体分离株	来源	OspC类型	B31 MI	蜱	A
5A4	来自B31 MI的克隆	A	B31 MI	蜱	A
5A4	来自B31 MI的克隆	A	LDP56	人类血液	A
LDP61	人类血液	A	LDP56	人类血液	A
LDP61	人类血液	A	LDP60	人类血液	A
LDP80	人类血液	A	LDP60	人类血液	A
LDP80	人类血液	A	LDP76	人类血液	A

LDS106	人类皮肤	A
LDS106	人类皮肤	A	LDP73	人类血液	B
LDS79	人类皮肤	H	LDP73	人类血液	B
LDS79	人类皮肤	H	LDS101	人类皮肤	H
LDP84	人类血液	C	LDS101	人类皮肤	H
LDP84	人类血液	C	LDP63	人类血液	N
LDC83	人类脑脊液	N	LDP63	人类血液	N
LDC83	人类脑脊液	N	LDP120	人类血液	N
LDP74	人类血液	K	LDP120	人类血液	N
LDP74	人类血液	K	LDS81	人类皮肤	K
LDS88	人类皮肤	K	LDS81	人类皮肤	K
LDS88	人类皮肤	K	LDP89	人类血液	K
LDP116	人类血液	D	LDP89	人类血液	K

DNA分离、OspC分型和计算机辅助结构分析。为了确定OspC类型，按照以前的描述从每个菌株分离总DNA(Marconi等，2003)，并作为模板与OspC20(+)LIC和OspC210(-)LIC引物一起进行PCR(表2)。PCR使用高保真聚合酶扩增(Expand High Fidelity polymerase(Roche))进行，使用下面的循环条件：初始变性94℃ 2分钟；94℃ 15秒、50℃ 30秒、60℃进行60秒10个循环；94℃ 15秒、50℃ 30秒、60℃ 60秒，最后20个循环每个额外加5秒；最后在68℃延伸7分钟。使用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)回收扩增子，用T4 DNA聚合酶处理以产生单链突出端，退火到pET-32 Ek/LIC载体(Novagen)中，并转化到大肠杆菌NovaBlue(DE3)细胞中(Novagen)。这些程序的方法按照制造商的描述。根据氨苄青霉素抗性(50μg/ml)筛选菌落，通过PCR筛选ospC插入片段。将选出的菌落转移到LB肉汤中(Fisher)，在37℃下振荡(300rpm)培养，使用QiaFilter Midi质粒分离试剂盒(Qiagen)分离质粒。ospC插入片段由收费性服务测序(MWG Biotech)。将测定的序列翻译并使用ClustalX(35)与缺省参数进行比对。为了确定OspC的类型，产生了邻接树，并计算了自展值(1000次试验)。获得的生物系统发生图使用N-J Plotter显示。数据库中其它可用的OspC序列也被包含在分析中。使用NCBI分子模拟数据库文件1GGQ、IflM和1G5Z(4，15)以及在ncbi.nlm.nih.gov/Stnicture/CN3D/cn3d.shtml网点上提供的CN3D软件产生了OspC的结构模型。

表2、在本研究中使用的聚合酶链反应引物

^aLIC尾部序列被下划线。

重组蛋白的产生。为了产生全长和截短的OspC，基于伯氏疏螺旋体B31MI的A型ospC序列(Fraser等，1997)设计引物。引物具有允许退火连接到pET-32Ek/LIC载体(Novagen)中的尾部序列，该载体是不依赖连接酶的克隆(LIC)和表达载体。所有的LIC程序和以前的描述一样(Hovis等，2004)。为了证实所有构建体的序列，使用QiaFilter Midi质粒纯化试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌NovaBlue(DE3)细胞中纯化了重组质粒，并对插入片段进行测序(MWG Biotech)。

SDS-PAGE和免疫印迹分析。按照以前的描述(Roberts等，2002)，将蛋白在12.5％的标准预制凝胶(Biorad)中通过SDS-PAGE进行分离，并免疫转印到PVDF膜上(Millipore)。使用S-蛋白辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(Novagen)证实重组蛋白的表达，该偶联物检测在本研究中所用的所有重组蛋白都携带的N-末端S-标签融合。HRP偶联的S-蛋白1:10,000稀释使用。对于免疫印迹分析来说，从被感染的小鼠收集的血清以1:1000稀释使用。HRP偶联的山羊抗小鼠IgG被用作第二抗体(Pierce)，1:10,000稀释使用。一般的免疫印迹方法和以前的描述一样(Metts等，2003)。

结果

从马里兰州的人类莱姆病患者回收的分离株的ospC分型分析。从被分析的每个从马里兰州的人类莱姆病患者回收的分离株都成功地扩增了ospC。每个扩增子的序列被测定，并进行了比较性序列分析以确定OspC的类型(图1)。鉴定了几个不同的OspC类型的代表，包括A(n＝6)、B(n＝1)、C(n＝1)、D(n＝1)、H(n＝2)、K(n＝4)和N(n＝3)。以前已经报道过只有A、B、I和K型OspC与人类中的侵袭性感染有关(Seinost等，1999)。在该研究中，侵袭性分离株被限定为从血液、器官或脑脊液回收的分离株，而非侵袭性分离株是从皮肤回收的、但是没有在身体的其它位置发现的分离株(Seinost等，1999)。但是，在这里证实了某些表达C、D和N型OspC的分离株是从血液(LDP84、LDP63、LDPl 16和LDPl 20)或脑脊液(LDC83)回收的，因此是侵袭性的。这项观察结果表明特定的OspC类型与侵袭性感染之间的相关性可能不是严格的，关联性的强度需要被重新评估。

在小鼠感染过程中针对OspC的抗体反应的类型特异性分析。为了确定在感染过程中针对OspC引发的抗体反应是否是类型特异性的，产生了A、B、C、D、H、K和N型重组OspC蛋白用作测试抗原。重组蛋白被免疫转印，并使用来自A、B或D OspC类型的伯氏疏螺旋体分离株(如上面确定)感染的小鼠收集的血清进行筛选(图2)。重组蛋白在大肠杆菌(E.coli)中的表达以及蛋白的相等载量，通过使用识别N-末端融合中的S-标签的HRP偶联的S-蛋白筛选一个免疫印迹来证实。当使用在感染2周时收集的抗伯氏疏螺旋体B31 MI抗血清(A型OspC)进行筛选时，只有使用A型蛋白才能检测到强反应性。针对OspC的强的和早期的IgG反应与较早的报道相符(Theisen等1995；Wilske等，1993)。在感染第8周收集的血清也主要与A型OspC反应，但是观察到了与其它OspC类型的弱的交叉免疫反应性。在用LDP116和LDP73(分别为D和B型OspC分离株)感染的小鼠中对OspC的抗体反应也是类型特异性的。可以得出结论，在针对OspC的抗体反应中存在相当程度的类型特异性，该特异性提示体内优势免疫表位位于蛋白的类型特异性结构域中。

在小鼠感染过程中引发抗体反应的OspC线性表位的定位。为了鉴定在感染过程中引发抗体反应的A型OspC的线性表位，产生了几个重组OspC片段，并用α-伯氏疏螺旋体B31MI感染血清(第8周)进行筛选(图3)。B31MI是产生A型OspC的菌株。重组蛋白的表达通过使用HRP偶联的S-蛋白的免疫印迹来证实。为了定位OspC的线性表位，用感染血清筛选OspC片段的免疫印迹。定位了含有1个或多个表位的两个结构域，一个位于蛋白的C-末端一半α螺旋5的168和203位残基之间，另一个在螺旋3和环5的136和150位残基之间(在后文中分别称为第α5和环5表位)。这些表位以前没有在文献中被表征过。

ospC序列分析和OspC结构的计算机模拟。为了确定α5和环5表位在OspC蛋白上的空间位置，评估通过X-射线晶体学分析(Eicken等，2001；Kumaran等，2001)确定的坐标，并对单体和二体形式的A型OspC产生条带和空间填充模型(数据未显示)。单体形式的I和E型OspC蛋白也被模拟。这些分析表明在单体和二体形式的A、E和I型OspC蛋白上，环5表位均是表面暴露的。在最初的X-射线晶体学分析中，N-和C-末端的部分或者不是重组蛋白的一部分，或者不能被模拟。在任何情况下，被确定的结构表明N-和C-末端的位置彼此非常接近，并接近细胞膜。

为了在类型内水平上评估环5和α5表位中的序列变异，对227个OspC序列进行了比对。这些分析表明，环5和α5表位在类型间水平上都是高度可变的，但是在类型内有相当高的保守性。图4提供了(以表格的形式)每种OspC类型的环5和α5结构域序列，并标明了在分析的OspC序列中检测到的每个特定序列的频率。作为类型内水平上环5的保守性的证据，对57个A型环5表位序列的比较显示出有53个与外面显示的序列相同，只有1个或两个残基的差别。对于α5表位也观察到了相似的结果。在43个A型OspC序列中，有42个在168和203位残基之间是相同的。注意到被分析的α5表位序列较少，这是因为在许多情况下数据库中可以获得的序列是不完整的，缺少了C-末端的变化量。

证明针对环5表位的抗体反应不是仅针对个体小鼠的。鉴于环5的类型内保守性及其相对短的长度，环5表位可能是非常好的候选者，可用于开发嵌合的基于OspC环5的疫苗原。为了证实针对环5表位的抗体反应通常在感染过程中发生而且不是仅针对个体小鼠的，用来自被A型OspC产生菌株B31MI、LDP56和5A4感染的另外几只小鼠的血清，筛查含有130-150位片段的环5的免疫印迹。在所有情况下，检测到了识别该表位的抗体(图5)。尽管在来自LDP56感染的小鼠2的感染血清中，针对环5的反应较弱，但较长时间的暴露清楚地显示出环5在该动物中是抗原性的。这证实了针对这些表位的免疫应答不是仅针对个体动物的，并为它在疫苗开发中的可能的应用提供了进一步的支持。

讨论

OspC被明确确定为莱姆病致病原因的重要因素(Grimm等，2004；Pal等，2004；Schwan等，1995)。有强烈的证据表明它在莱姆病螺旋体从中肠到唾液腺的转移中发挥了重要作用(Pal等，2004)。此外，它在感染早期被选择性表达，是优势免疫抗原(Fingerle等，1995；Schwan等，1998；Wilske等，1993)，并且已经被别人假设为在莱姆病分离株的传播能力中是关键的决定簇(Seinost等，1999)。本研究的目的是检验OspC类型和侵袭性感染之间的潜在关联性，确定针对OspC的抗体反应是否是类型特异性的，并通过对感染过程中呈递的线性表位进行定位来进一步定义OspC的抗原性结构。

OspC的序列分析已描绘出了21个不同的OspC类型(Seinost等，1999)，已经推测它们中仅有4种(A、B、I和K型)与人类中的侵袭性感染有关(Seinost等，1999)。但是，最近的研究对这种推测的关联性提出了疑问(Alghaferi等，2005)。为了进一步阐明这个问题，确定了从马里兰州人类患者回收的侵袭性和非侵袭性莱姆病分离株的OspC类型。为了完成这项任务，全长ospC基因被PCR扩增、测序，并进行了比较性序列分析。这些分析表明在该患者人群中与侵袭性人类感染有关的OspC类型还包括C、D和N型。尽管已经提出I型OspC产生菌株是与侵袭性人类感染有关的主要类型(Seinost等，1999)，但在马里兰州患者人群中没有鉴定到携带I型ospC的侵袭性分离株。同样地，Alghaferi等也没有检测到I型OspC产生菌株(Alghaferi等，2005)。综合起来，这两项研究已经在大巴尔的摩地区鉴定到了18种侵袭性分离株，分类如下：A，n＝5；B，n＝2；C，n＝1；D，n＝1；H，n＝1；K，n＝3和N，n＝7。因此，在该地理区域内，表现出产生A和N型OspC的侵袭性分离株占优势。这些数据与只有4种OspC类型与人类中侵袭性感染有关的假说相悖。还需要对来自不同地理区域的更大的患者人群回收的分离株进行更多的分析以进一步评估OspC类型-侵袭性感染相关性的真实性，并确定在限定的地理区域中是否存在特定OspC类型流行程度的差异。

使用OspC进行预防接种所提供的易变的保护作用结合不同OspC类型的描绘(Seinost等，1999)，增加了抗体反应可能是类型特异性的可能性。该假说得到了事实的支持，即用OspC预防接种被发现只提供了针对同样菌株的保护作用(Bockenstadt等，1997；Gilmore等，1999a；Probert和LeFebvre，1994)。直到本报告之前，在感染过程中针对OspC的抗体反应的类型特异性还没有被直接评估过。为了阐明这个问题，使用在表达已知OspC类型的克隆群体的小鼠中产生的感染血清，筛选了一系列A、B、C、D、H、K和N型全长重组OspC蛋白。感染血清的使用是重要的，因为这允许集中评估针对细菌在体内特异性呈递的表位的抗体反应。这些分析显示出，尽管在OspC的N和C末端结构域中存在强烈的序列保守性，但针对被分析的OspC类型的抗体反应是类型特异性的。例如，来自用A或D型菌株感染的小鼠的血清以类型特异性方式是免疫反应性的，与其它的OspC类型的交叉免疫性很少或没有。尽管没有分析对所有21个OspC类型的抗体反应，但上面显示的数据表明了保守的结构域不是免疫优势的，并且在感染过程中由细菌呈递的OspC的线性表位被包含在蛋白的可变结构域中(即类型特异性结构域)。

到目前为止只发表了几项探索OspC的表位的定位或鉴定的研究。线性和构象表位都已被鉴定。Gilmore和Mbow证明了分别在前导肽之外短达6个残基的独立N-末端删除和C-末端截掉13个残基消除了了与单克隆抗体B5的结合(Gilmore等1999a；Gilmore，1998)。从这个结果可以推论B5单克隆抗体识别构象限定的表位(Gilmore等，1999b)。在该构象限定的表位中没有鉴定包含抗体识别位点的精确残基。与用单克隆抗体B5观察到的相反，针对细胞关联的天然OspC的多克隆抗体反应的分析表明，删除OspC的C末端最后10个残基或N末端的延伸区不会消除OspC被感染过程中引发的IgG的识别。这种结果上的差别推断是关注多克隆抗体还是单克隆抗体的反映。该数据当然不排除构象表位的存在，同时也清楚地证明了在OspC中存在线性表位。在较早的研究中，Mathieson等也报道了OspC中的线性表位(Mathieson等，1998)。他们发现OspC的C末端7个残基构成了被从欧洲神经疏螺旋体病患者收集的血清中的IgM所识别的线性表位。尽管在该报告中没有评估IgM结合，但删除OspC的C末端10个残基不会消除IgG结合。被感染诱导的IgG识别的表位显示位于蛋白的几个位点上。但是，这并不表明C末端表位不存在或不被感染期间引发的抗体所识别，而是表示在OspC中的其它位置上存在其它的表位。

对较短OspC片段的免疫印迹分析允许对OspC表位的更准确定位。OspC的抗原性区被定位到两个区域。一个跨过136-150位残基，另一个跨过168-210位残基。使用X-射线衍射分析获得的坐标产生的结构模型，将136-150位残基主要放置在表面暴露的环中，称为环5(Kumaran等，2001)。环5在OspC的单体和二体模型中都是表面暴露的，并位于明显的转弯中。尽管已经证实重组OspC事实上形成二体，但还没有确定天然的OspC是否在体内形成二体或更大的寡聚体。OspC的二体模型指出了一个明显被包埋的界面，它包括了>30％以上的蛋白。这种程度的包埋界面表明了单体之间紧密的相互作用，被认为是蛋白的二体形式是生物学活性形式的指示(Kumaran等，2001；Eicken等，2001；Zuckert等，2001)。在OspC二体中，环5中的残基被预计是推定的构象限定的配体结合袋的一部分，可能有生物学重要性。该带电荷的袋排列有含有羰基的氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸残基。对于A、I(Kumaran等，2001)和E(Eicken等，2001)三种类型的OspC蛋白已经测定了晶体结构。在所有这些蛋白中，该推定的结合袋的溶剂结构是明显高度保守的。环5对感染血清中的抗体的可接近性支持了该结构域可能是表面暴露的和可能可用于配体结合的假说。尽管环5和推定的配体结合袋具有强烈的类型间结构保守性，该结构域的序列在类型间水平上是高度可变的。α5结构域168-210位跨越残基的序列在类型间水平上也是可变的，除了最后20个残基是高度保守的之外。为了确定在类型内水平下是否存在足够的保守性可以构建由一系列类型特异性表位组成的嵌合OspC疫苗，对OspC的序列进行了比对，并构建了树形图。通过这些分析，确定了227个序列的OspC类型(数据未显示)。发现了环5和α5表位在类型内水平上都是高度保守的。例如，在57个序列中的54个中，A型OspC蛋白的环5表位是一致的，而在43个A型序列的42个中，α5表位是保守的。在其它OspC类型中也注意到了这些结构域的显著保守性，在C到I、M、N和O型中在环5和α5表位中表现出了绝对的类型内保守性。

本研究证实了在侵袭性分离株中存在比以前认识到的更大的OspC多样性。本研究还证实了在小鼠中针对OspC的抗体反应主要是类型特异性的，是由以前未表征的环5和α5表位限定的。较早的研究和这里提交的数据清楚地证实了单一OspC蛋白不会赋予针对多样性菌株的保护作用(Bockenstedt等，1997)。一种可能的预防接种方法是利用在本报告中鉴定的表位开发重组嵌合OspC疫苗原。环5表位或环5和α5表位的组合，如果在人类中被证明具有一致的抗原性的话，将可以提供最大的希望。这些表位在长度上相对较短，是线性的，并且在类型内水平上高度保守。根据这些特点可以证明，构建可以赋予针对高度多样化的莱姆病分离株的保护作用的环5-α5嵌合免疫原在技术上是可行的。

实施例2、人类中针对A型OspC环5结构域的抗体反应的分析以及环5表位在莱姆病疫苗开发中的可能应用的评估

莱姆病螺旋体的外表面蛋白C(OspC)是22kDa的优势免疫(Fuchs等，1992)抗原，在蜱进食时和感染早期表达(Schwan等，1995)。尽管在天然感染过程中产生针对产生OspC的强烈抗体反应，但该反应并不能导致细菌被清除，因为OspC的产生在感染确立后不久就关闭了(Schwan等，1995)。OspC作为重要的毒力因子和莱姆病疫苗开发的潜在候选者而出现。但是，开发基于OspC的疫苗的努力受到了它在菌株间的异质性的阻碍(Theisen等，1993；Wilske等，1996；Wilske等，1993)。尽管用OspC预防接种引发了具有高度保护性的反应，但大多数研究报道的仅仅是菌株特异性的保护作用(Bockenstedt等，1997；Gihnore等，1996；Mbow等，1999；Probert等，1997；Rousselle等，1998；Scheiblhofer等，2003)。最近的分析为我们对OspC的抗原结构和菌株特异性保护作用的基础的理解提供了重要的了解。已经定义了21种OspC类型，命名从A到U(Lagal等，2003；Seinost等，1999；Wang等，1999)。通过用产生特定OspC类型的伯氏疏螺旋体克隆种群感染小鼠，证实了在感染早期抗体反应主要是OspC类型特异性的(参见实施例1)。这表明在感染早期呈递的优势表位可能位于OspC的类型特异性结构域内。尽管较早的研究表明在21个OspC类型中只有4个与侵袭性感染有关(Seinost等，1999)，但最近的研究证实产生其它OspC类型的分离株也能够建立侵袭性感染(Alghaferi等，2005；实施例1)。但是，A型OspC在引起人类侵袭性感染的菌株中显然是主要的。A型OspC的表位作图分析表明在小鼠中引发反应的优势线性表位之一位于环5结构域中(参见实施例1)。环5结构域在类型间水平上是高度可变的，但是在给定类型的序列中是保守的(参见实施例1)。在本研究中，我们提炼了表位的位置，证实了它在完整细菌上的表面暴露，并证实了它引发了杀菌性抗体。

大多数寻求确定OspC的优势免疫表位的研究是使用小鼠进行的(Bockenstedt等，1997；Gilmore等，1996；Mbow等，1999；Probert等，1994)。但是，已经证明了针对某些表位的抗体反应在人类相对于小鼠和其它哺乳动物中是不同的(Lovrich等，2005)。本研究的第一个目的是确定OspC的环5结构域是否是被在人类感染期间引发的抗体所识别。理想情况下，这些分析可以使用从A型产生菌株的克隆种群感染的个体中收集的血清来进行。因为人们不能绝对肯定地确定个体是被异源的还是被同源的种群所感染，因此我们寻求鉴定对A型特异性序列表现出反应的患者血清。为了完成这个任务，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)对从患有游走性红斑(莱姆病早期阶段)的患者中收集的一组血清样品进行了筛选。重组A型OspC和含有环5130到150位残基的重组A型OspC的亚片段被用来包被96孔板(250ng重组蛋白/孔；0.1M Na₂HPO₄；4℃过夜)。将板封闭(磷酸盐缓冲盐水中的10％脱脂奶粉，0.5％ Tween 20；37℃ 2小时)和清洗，在每个孔中加入人类莱姆病患者血清(1:400稀释)(37℃；1小时)。加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人免疫球蛋白G(IgG；Sigma)(50μl，1:40,000稀释)(1小时；37℃)，然后按照供应商(Sigma)的说明加入TMB底物(3，3，5，5-四甲基联苯胺)。使用读板器测定450nm的光密度值。用牛血清白蛋白包被另外的孔作为阴性对照。所有的分析都进行三份。显示了平均的A450值和标准偏差。如图6所示，发现几个血清样品对全长A型OspC和环5片段都具有强烈的IgG反应。血清样品8和44与环5片段显示出最强的免疫反应性，因此被选择用于进一步的分析。

为了更精确地确定环5结构域中被感染诱导的抗体所识别的残基，使用来自患者8和44的血清和来自A型OspC产生株B13 MI的克隆种群感染的小鼠的血清筛选了PepSpot阵列(参见实施例1)。PepSpot阵列由跨越A型OspC的环5结构域的12个到13个残基重叠的肽组成(2个氨基酸步骤)，它们在Whatman 50纤维素膜上成斑(150nmol/cm²；JPT Peptide Technologies GmbH，Berlin，德国)。将PepSpot膜阻断(磷酸盐缓冲液中的5％脱脂奶粉-0.5％ Tween 20)，清洗，用小鼠和人类血清样品(分别用阻断液1:1000和1:400稀释)进行筛选，使用种类特异性的抗IgG抗血清检测抗体的结合。尽管组成免疫反应性结构域的具体残基在小鼠和人中略微有些不同，但主要的表位位于130到146位残基之中(图7)。在A型OspC序列中，该区域涵盖了α螺旋3的C末端区域和环5的N-末端部分。

OspC的晶体结构将环5在空间上放置在蛋白的明显的弯曲上(Eicken等，2005；Kumaran等，2001；图24)。该环已经被推断是可能的配体结合袋的一部分(Kumaran等，2001)。为了确定环5是否展示在细胞表面并且在体外生长的螺旋体中可接近抗体，使用抗环5抗血清进行了免疫荧光分析(IFA)。使用伯氏疏螺旋体B31MI(A型OspC)，B.parkeri的全细胞裂解液和带有S-标签的重组A型OspC进行的免疫印迹分析证明了环5抗血清是特异性的，建立了该抗血清对IFA的适合性。通过IFA分析的菌株由伯氏疏螺旋体B31 MI(A型OspC)和LDP74(K类OspC)组成。螺旋体在33℃生长，转移到37℃生长3天以刺激OspC的表达。IFA使用被透化的细胞(丙酮固定的)和未透化的细胞(空气干燥的)进行，标准方法按照以前的描述(Roberts等，2002)。载玻片使用1:1000稀释的小鼠环5抗血清、小鼠免疫前的血清或兔鞭毛蛋白抗血清进行筛选。检测使用Alexa Fluor 568偶联的山羊α-小鼠IgG或Alexa Fluor 488偶联的山羊α-兔IgG(10μg/ml，在阻断缓冲液中)进行。如果合适，载玻片在Olympus BX51荧光显微镜下使用若丹明或荧光素滤光片组观察，或者通过暗视野显微镜观察，并使用Olympus MagnaFIRE照相机照相。通过IFA观察到的标记是高度特异性的，并与免疫印迹分析一致；产生A型的分离株是表面标记的，而伯氏疏螺旋体LDP74的K型OspC不是(数据未显示)。此外，与在升高的温度下OspC的上调相一致，IFA显示出生长在37℃的螺旋体表面标记比生长在33℃的细胞明显更多。识别内膜锚定的周质蛋白的α-FlaB抗血清不能标记未透化的细胞，但是可以容易地标记用丙酮透化的细胞(数据未显示)。该对照证实了环5表位事实上是表面暴露的，并且用在IFA中的实验条件不破坏细胞的完整性，并从而人为暴露了不是天然呈递于细菌表面上的表位。

环5抗血清有效结合细胞表面的OspC的能力增加了相互作用可能是杀菌性的可能性，正如对于针对全长OspC的抗体已经所证明的那样(Bockenstedt等，1997；Ikushima等，2000；Jobe等2003；Lovrich等，2005；Rousselle等，1998)。为了确定靶定环5的抗体是否也表现出杀菌活性，使用在33℃或移向37℃的温度下培养的伯氏疏螺旋体分离株B31MI和LDP74进行了杀菌分析。通过离心收获螺旋体、清洗，调整到每500μl 5x10⁵个细胞(在BSK-H培养基中)，然后将12.5μl转移到无菌的0.65ml的微量离心管中。然后加入10μl热失活(56℃；30分钟)的环5血清，加入或不加入豚鼠补体(7.5μl；Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)，将成分混合并在33或37℃孵育8小时。加入总共70μl的水，使用Live/Dead BacLight染料(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)按照制造商的说明书对螺旋体进行染色。简单来说，将两种染料加入到细胞中；SYTO 9和碘化丙啶。这些染料可以分辨活的细菌(即具有完整的膜)和膜损坏的细菌。活的细菌由于被SYTO 9染色而发出绿色荧光，而死的或损坏的细菌由于被碘化丙啶染色而发出红色荧光。在用免疫前的热失活的血清(含有或不含有补体)处理后，观察到的带有被破坏的膜的细胞的基线水平为25％。相反，暴露于抗α-环5抗血清的细胞有大约70％显示出膜破坏。杀菌活性被确定是补体依赖性的。在用抗环5抗体处理后，在这里观察到的空泡效应与使用其它抗OspC抗体时报道的一致(Bockenstedt等，1997；Escudero等，1997)。另外重要的是注意到与温度升高时OspC的上调相一致，在生长于37℃下的螺旋体中死细胞的百分率同样比生长在33℃下的细菌高(数据未显示)。从这些数据明确说明了抗环5抗体是杀菌性的。

数份报告已经为开发莱姆病疫苗概括出了清晰有力的合理性(综述见Hanson和Edelman，2004)。但是，到目前为止，还没有商业化的疫苗。在开发具有广泛保护性的莱姆病疫苗的努力中，Baxter推行一种产生14种不同的全长重组OspC蛋白的疫苗混合物的策略(Hanson和Edelman，2004)。但是，该混合物被认为具有不可接受的反应原性。反应原性可能是由引发针对混合物中每种类型的OspC蛋白的独特的保护性表位的足够的反应而需要的大量蛋白所引起的。使用多种全长蛋白的混合物疫苗的潜在的问题是错误地导向针对保守的、无关的、非保护性表位的抗体反应的可能性。通过开发由每种优势OspC类型的天然呈递的优势免疫线性表位构成的嵌合的重组免疫原，可能能够克服这个问题。这种普遍的概念源自使用来自在不同感染阶段表达的蛋白的表位开发疟疾疫苗的尝试(Hanson和Edelman，2004)。同样的概念已经应用于A型链球菌的六价M蛋白疫苗的开发中(Dale，1999)，以及针对几种其它病原体的疫苗的开发中，并获得了极大的成功(Apta等，2006；Caro-Aguilar等，2005；Fan等，2005；Horvath等，2005；Kotloff等，2005；McNeil等，2005；Wang等，2005)。随着对OspC的物理和抗原结构的新的了解，现在开发有效的、重组多价的、嵌合的OspC疫苗是可能的。新鉴定的环5结构域非常适合于包含在这样的疫苗中。

实施例3、基于OspC的四价重组嵌合疫苗原的开发

莱姆病是北美和欧洲最常见的节肢动物传播的疾病。目前，还没有商业化的疫苗可用于人类。外表面蛋白C(OspC)具有抗原性和表达特性，使得它成为有吸引力的疫苗候选者；但是序列的异质性阻碍了它用作疫苗原。序列分析已经鉴定了21个明确定义的OspC种系组或“类型”(命名为A到U)。本研究报告了在人类和鼠类感染中B、K和D型OspC呈递的线性表位的作图，以及利用这些表位(以及以前鉴定的A型OspC线性表位)开发重组的四价嵌合疫苗原。构建体被发现在小鼠中具有高度的免疫原性，被诱导的抗体能够表面标记体外培养的螺旋体。重要的是，疫苗接种诱导针对表达构建体中掺入的每种类型OspC的菌株的补体依赖性杀菌抗体。这些结果表明，有效的和广泛保护性的、基于OspC的、多价莱姆病疫苗可以作为重组嵌合蛋白被生产。

材料与方法

伯氏疏螺旋体分离株和培养

伯氏疏螺旋体分离株B31MI(A型OspC)、LDP73(B型)、LDP116(D型)和LDP74(K型)的克隆种群[参见实施例1]按照以前的描述通过液面下铺板来获得[Sung等，2000]。每个克隆的OspC类型通过PCR扩增(Taq聚合酶，Promega)和ospC的DNA测序来确定，并通过系统发育分析分派类型[参见实施例1]。螺旋体按照指示在33或37℃下在完全BSK-H培养基(Sigma)中培养。

不依赖连接酶的克隆和重组(r-)OspC蛋白的生产

通过每个分离株的相应基因的PCR扩增，产生了全长的B、K和D型OspC以及一系列截短物和片段。引物被设计成具有5′突出部，以允许pET-32 Ek/LIC载体中不依赖连接酶的克隆(LIC)(表3)[实施例1]。所有的LIC方法基本上按照制造商(Novagen)的说明进行。简单来说，在扩增和再生单链尾巴后，将扩增子与pET-32 Ek/LIC载体退火，然后转化到NovaBlue(DE3)大肠杆菌细胞中并繁殖。回收质粒并通过DNA测序证实插入片段的序列。为了蛋白纯化，纯化的质粒被用于转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并通过在对数生长期在培养基中加入IPTG(1mM)诱导蛋白表达，然后继续保温3小时。通过从pET-32Ek/LIC载体表达而加上的N-末端融合含有Trx-标签、S-标签以及六聚组氨酸(His-标签)基序。His-标签被用于允许通过镍亲和层析纯化重组蛋白。简单来说，将细胞裂解，分别用benzonase核酸酶和重组溶菌酶将核酸和细胞壁肽聚糖降解。按照制造商(Novagen)的说明，可溶的蛋白离心(16000xg，15分钟)澄清，通过固定的镍柱，清洗并洗脱。被洗脱的蛋白使用截留分子量为10kDa的膜(Slid-a-lyzer，Pierce)对磷酸盐缓冲液(PBS；pH7.4)进行深度透析，最终的蛋白浓度通过BCA分析(Pierce)进行定量，制备物的纯度通过SDS-PAGE进行评估。

表3、用于产生各种类型OspC片段的PCR引物。LIC尾部用粗体表示。

免疫印迹分析：B、D和K型OspC的表位作图。

为了允许对感染期间相关的表位进行作图，用104个表达B、K或D型OspC的螺旋体克隆种群感染C3H/HeJ小鼠，在第2、4、6、8和12周通过尾部取血收集血液。这些血清按照实施例1中的描述被用来筛选纯化的OspC蛋白和截短物。将重组蛋白进行SDS-PAGE，转移到PVDF上，用1:1000稀释的类型特异性鼠感染血清(在第6周收集)进行筛选。同样，重组蛋白用来自已知被表达B、K或D型OspC的伯氏疏螺旋体菌株感染的患者的血清(1:400)(由Dr.Allen Steere好意提供)进行筛选。使用适合的IgG特异性辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体，结果通过化学发光显示。

四价嵌合疫苗原的构建和表达。

选择A型的环5区(131到149位氨基酸)和B(160-201位氨基酸)、K(161-201位氨基酸)和D(161-201位氨基酸)型的α螺旋5区包含在四价试验疫苗原中。使用上述的重组质粒和表4中列出的引物对每个含有表位的区域进行PCR扩增。PCR条件是标准的，开始为2分钟94℃的变性步骤，然后进行35个循环的94℃变性15秒、50℃引物退火30秒和72℃延伸60秒，最后72℃延伸7分钟。引物被设计为具有载体特异性的LIC尾部或具有未结构的蛋白酶抗性接头序列作为5′突出部(图9A)[Crasto和Feng，2000]。所有的扩增子在使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶中通过电泳进行分析并进行凝胶纯化(QiaQuick凝胶提取试剂盒，Qiagen)。然后后续轮的PCR中使用被纯化的产物作为模板。在第二轮中，A型环5和B型α螺旋5的扩增子被合并作为模板。变性后，扩增子通过它们的互补接头序列进行退火，以允许使用A型环5正向引物和B型α螺旋5反向引物进行交叠延伸和随后的扩增。K和D型α螺旋5序列以同样方式被加入到构建体中，除了在前10个循环后将退火温度升高到60℃以增加退火特异性之外。最终的产物被退火到编码N-末端六聚组氨酸标签融合(Novagen)的pET-46Ek/LIC表达载体中，转化NovaBlue(DE3)大肠杆菌细胞。通过对纯化的质粒进行DNA测序来证实疫苗原的序列。蛋白的表达和纯化按照上面的描述完成。

表4、用于产生ABKD嵌合疫苗原的PCR引物。LIC尾巴用粗体表示，接头序列被下划线。

使用四价ABKD嵌合疫苗原免疫小鼠。

26周龄的雄性C3H/HeJ系小鼠用完全弗氏佐剂(CFA)按1：1比率乳化的50μg嵌合疫苗原进行免疫接种。给药的疫苗原的总体积为200μL，分开用于腹膜内和皮下脂肪中。三只对照小鼠施用CFA中的PBS进行假免疫接种。在第2和第4周，小鼠用在弗氏不完全佐剂中的50μg蛋白进行加强。假接种的小鼠接受佐剂中的PBS。在首次注射之前和第6周时，通过剪尾对所有小鼠进行取血。

ABKD嵌合疫苗原的免疫原性的评估

通过免疫印迹分析和ELISA评估疫苗原的免疫原性。免疫印迹按照上面的描述产生和筛选。通过免疫印迹对每种纯化的重组蛋白(A、B、K、D型OspC以及嵌合疫苗原)1μg进行分析。重组的BBN39，一种来自伯氏疏螺旋体的无关的带有His-标签的蛋白(旁系同源蛋白家族163)，被用作阴性对照。为了证实同样的蛋白载量，用抗His标签的单克隆抗体(mAb)(1:2000，Novagen)筛选一个斑点。为了评估对免疫接种的反应，同样的斑点用1:500稀释的小鼠抗ABKD抗血清进行筛选。HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(1:40000稀释)被用作第二抗体，通过化学发光观察结合。ELISA分析使用96孔板(Costar 3590；Corning)进行，每个孔用碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的100ng疫苗构建体或重组OspC(A、B、K或D型)进行包被(4℃16小时)。将板封闭(1％ BSA的PBS，含有0.2％ Tween-20(PBS-T)；2小时)，用PBS-T洗3次，在双份板的孔中加入连续稀释的抗ABKD抗血清(100μL；1:50到1:109350稀释)(1小时)。HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(1:20000)被用作第二抗体，ABTS用作显色底物。在ELISA读板器(ELx 808；Biotek)上，在反应速度是线性时，在405nm读取吸光度。通过对吸光值曲线用四参数逻辑方程(SigmaPlot)拟合S形曲线并计算对应于最高吸光度平台的50％的稀释度的倒数，来计算滴度。

抗ABKD抗体反应的免疫球蛋白同种型分布

通过用每孔100ng嵌合构建体包被双份ELISA板来评估抗ABKD抗体反应的同种型分布。按照上面的描述进行洗板和封闭。双份分析了从12只被免疫的小鼠收集的抗ABKD抗血清(100μL；1:10000倍；1小时)。被结合的疫苗原特异性Ig通过与同种型特异的生物素化的第二抗体孵育(1小时；小鼠同种型试剂盒；Zymed)来检测。结合的生物素化抗体通过HRP偶联的链亲和素(30分钟)和生色底物ABTS来检测。所有的孵育都在室温完成。

间接免疫荧光分析(IFA)

为了确定ABKD嵌合疫苗原中包含的表位是否呈递在体外培养的伯氏疏螺旋体的表面，进行了IFA分析。为了最大化OspC的生产，将产生A、B、K和D型OspC的克隆种群的培养物的温度从33℃改变为37℃。通过离心(7000xg，15分钟)收集5mL浓培养物(大约10⁷-10⁸个细胞/mL)中的螺旋体，用PBS洗3次，重新悬浮在5mL PBS中，将100μL铺在带电荷的玻片(Superfrost Plus，Fisher Scientific)的2cm²面积上。一组玻片空气干燥，另一组用丙酮固定。将玻片封闭(1小时，3％ BSA的PBS-T)，然后用1:100稀释的抗ABKD抗血清、免疫前血清或1:1000稀释的兔抗鞭毛蛋白抗血清进行筛选(1小时)。被结合的抗体通过Alexafluor 568偶联的山羊抗小鼠IgG或Alexafluor 488-偶联的山羊抗兔IgG(10μg/mL封闭缓冲液)进行检测。在每个步骤之间玻片用PBS-T洗3次，所有的孵育都是在加湿的暗室中于室温进行1小时。玻片带有Fluoromount-G(Electron Microscopy Sciences)，视情况在Olympus BX51荧光显微镜下用若丹明或荧光素滤光片组观察，或者通过暗视野显微镜观察，使用Olympus MagnaFire数码照相机照相。

杀菌活性的评估

体外评估抗ABKD抗血清杀死伯氏疏螺旋体的能力。如上所述，将温度从33℃移到37℃的螺旋体用BSK-H培养基洗3次，细胞密度被调整为大约10⁶细胞/mL。将8μL细胞与8μL豚鼠补体(Sigma)和4μL每种试验血清混合(在56℃热失活；30分钟)。对照包括不含补体的热失活抗ABKD抗血清、只有补体、和合并的含有补体的热失活的免疫前血清。视需要，通过加入BSK-H培养基将总反应体积调整到20μL，将样品在37℃孵育18小时。使用BacLight LIVE/DEAD分析(Molecular Probes)，和使用带有荧光素或若丹明滤光片组的OlympusBX51荧光显微镜对5个高倍率视野中活的和死的/损伤的细胞进行人工计数，评估杀死情况。

结果

鉴定小鼠和人类感染过程中呈递的B、D和K型OspC的表位

到目前为止，已经从被确定患有侵袭性感染的患者中回收了A、B、C、D、H、I、K和N型OspC[Seinost等，1999；实施例1；Alghaferi等，2005]。从这些OspC类型中选择了4个(A、B、K和D)来为使用多价嵌合OspC疫苗的原理建立验证。因为只鉴定了在感染期间呈递的A型OspC的表位，因此在本研究中第一步是鉴定B、K和D型OspC中与感染相关的表位。为了完成这项任务，用来自被伯氏疏螺旋体(B、K或D型OspC)的克隆种群感染的小鼠的血清、或已经被确定至少部分被产生B、K或D型OspC的伯氏疏螺旋体菌株感染的人类莱姆病患者的血清(个人交流，Dr.Allen Steere和Kathryn Jones)，对每种类型的截短物或片段的免疫印迹进行筛选。在小鼠中第6周时的抗体反应是类型特异性的；但是，某些人类血清显示出类型间的交叉免疫反应性(数据未显示)，表明这些患者可能感染了混合的螺旋体种群。对于小鼠感染血清来说，B型OspC的表位位于α螺旋5中(175和200位氨基酸之间)。人类的感染血清与位置相同的片段(164到185位氨基酸)反应，表明B型的α螺旋5区是抗原性的。在小鼠中，K型OspC的表位被作图在148到160位氨基酸之间，在人类中作图于第α螺旋5区中(160到175位氨基酸之间)。在小鼠和人类中，D型OspC的表位被作图在α螺旋5区(167到180位氨基酸之间)，尽管人类血清识别其它多个表位。这些数据表明适合选择B、K和D型OspC的α螺旋5区包含在四价ABKD疫苗原构建体中。

四价嵌合OspC疫苗原的构建、表达和纯化

使用上面定义的B、K和D型α螺旋5表位和较早的研究中[实施例1]定义的A型环5表位，产生了由4个含有表位的区域构成的多价的嵌合重组疫苗原。这些表位由短的、无结构的、具有蛋白酶抗性的接头序列相连(图9B)。重组疫苗原长度为169个氨基酸，分子量为18.0kDa，等电点为6.49。其结构被预测为基本上是螺旋的[Gasteiger等2005；Kneller等，1990]，并具有高稳定指数[Guruprasad等，1990]。在用PBS透析后，重组疫苗原有一些沉淀；但是，大约500μg/mL保持溶解，该溶解的蛋白被用于所有的实验。纯化的疫苗原蛋白的SDS-PAGE分析证实了分子量18kDa的单一条带，没有污染蛋白。

ABKD嵌合疫苗原在小鼠中的免疫原性

为了评估ABKD嵌合疫苗原及其个体组成表位的抗体反应，对C3H/HeJ小鼠施用弗氏佐剂中的疫苗原。从被免疫的(n＝12)和假(PBS+佐剂)免疫的小鼠(n＝3)收集血清，并评估与ABKD嵌合疫苗原和A、B、K和D型全长重组OspC蛋白的反应性。Western印迹分析证实了抗ABKD抗血清与疫苗原蛋白和A、B和K型重组OspC发生强烈的反应。相反，与嵌合构建体的C末端D型OspC表位的反应性相当弱(图10)。任何血清都与阴性对照蛋白(r-BBN39)没有反应性，来自假免疫小鼠的血清不与任何蛋白反应。对血清反应性的基于ELISA的定量滴定证实了针对ABKD嵌合疫苗原蛋白的高滴度IgG反应，平均滴度为27800(图11A)。通过对与固定的全长重组OspC蛋白的结合进行评估，完成了对针对类型特异性的表位的反应性的滴定。观察到了针对个体表位的抗体滴度显著不同(图11B)。值得注意的是，表位特异性的滴度随着接近疫苗原的C末端而降低。

抗ABKD抗血清的免疫球蛋白同种型分布

免疫球蛋白同种型分布对于评估疫苗特异性抗体的潜在效应器功能是关键的。为了评估ABKD嵌合疫苗原诱导的免疫球蛋白重链类别转换，通过ELISA确定同种型分布。主要的同种型是IgG1，略低一些的是IgG2a和IgG2b。6周的血清只显示出有限水平的IgM、IgG3或IgA(图12)。

间接免疫荧光分析

通过间接免疫荧光显微镜评估了针对ABKD嵌合疫苗原的每个表位引发的抗体与疏螺旋体细胞表面上的OspC结合的能力。在产生A、B、K和D型OspC的细胞上观察到了特异性的表面标记(数据未显示)。荧光信号的强度与类型特异性滴度相一致，并具有对于带有A或B型OspC细胞所观察到的最大强度的荧光。带有K或D型细胞的荧光强度较弱，染色不规则，使细胞具有斑驳的外表。在用匹配的免疫前血清进行探测的细胞中没有观察到反应性。抗鞭毛蛋白抗体对空气固定的细胞没有表面标记，这被用来证实细胞的外膜是完整的，并且被检测的表位天然呈递于细胞的表面。正如预期的那样，用丙酮通透化的细胞被抗鞭毛蛋白抗体所标记(数据未显示)。

证明用ABKD嵌合疫苗原进行预防接种诱导杀菌抗体

使用LIVE/DEAD BacLight分析[TiIy等，2001；Ledin等，2005；Elias等，2000；Montgomaery等，2006；Elias等，2002；Shin等，2004]评估了抗ABKD抗血清的杀菌活性。检测了针对带有包含在嵌合疫苗构建体中的所有类型的OspC的菌株的杀菌活性。与抗ABKD抗血清一起孵育，诱导了明显的细胞聚集。活的和死的细胞都存在于聚集体中。由于对聚集体中细胞进行计数的固有的困难度，只对没有聚集的游离细胞进行计数来确定了活的和死的细胞的百分数。对于所有4种OspC类型来说，用于杀菌分析的培养物中死细胞的背景水平大约为20-30％。该死细胞的背景水平与在我们实验室中在将培养物从33℃转移到37℃以上调OspC表达后观察到的相一致。在杀菌分析中，杀死以补体依赖性的方式进行，死细胞的百分率显著地增加到背景之上，到56-90％。在所有情况下死细胞的数量至少为在任何对照中看到的死细胞数量的两倍。仅用补体不引发杀菌。合并的免疫前血清不引发杀菌活性，表明针对疫苗原的特异性免疫应答为杀菌活性所必需。

讨论

几项研究已经探索了莱姆病螺旋体的OspC作为潜在的疫苗原的可能应用。尽管用OspC免疫接种引发了保护性的抗体反应，但已有报道保护作用主要是菌株特异性的[Gilmore等，1996；Scheiblhofer等，2003；Wallich等，2001；Brown等，2005；Probert和LeFebvre，1994；Gilmore等，2003]。使用多种OspC蛋白的混合物引发更广的保护作用的尝试被证明是不成功的。Baxter试验了由14种不同的全长OspC变异体组成的OspC混合物；但是，它们不能引发针对每个变异体的独特结构域的足够的抗体滴度，而这是产生广泛保护作用的先决条件。此外，还报道了不能接受反应原性[Hanson等，2004]。对于混合物疫苗的普遍的担心是可能会误导针对在感染中不是天然呈递以及不能引发保护性抗体的表位的抗体反应。嵌合疫苗的产生提供了一种替代方法，可以避开这些在使用简单的重组蛋白的混合物时遇到的问题。在针对疟疾[Hanson等2004；Caro-Aguilar等，2005]、A类链球菌[McNeil等，2005；Dale等，2005；Hu等，2002；Dale，1999；Kotloff等，2005；Horvath等，2005]和几种病毒[Apt等，2006；Fan和Mei，2005；Wang等，2005；Bouche等，2005]的疫苗的开发中，已经探索由一系列优势免疫表位组成的嵌合疫苗。如果多价OspC疫苗要具有广泛的保护作用，必需在疫苗原中掺入足够多的表位以引发针对多样的菌株的保护性反应。系统进化分析极大地便利了朝向这种疫苗原的构建前进的能力，在系统进化分析中已描绘了21个不同的OspC类别，命名从A到U[Seinost等，1999]，其中只有一个亚类已经与人类中的侵袭性感染相关联[Seinost等，1999；实施例1；Alghaferi等，n2005]。

嵌合疫苗原的开发需要对OspC的表位结构的详细理解。以前已有几个报道描述了OspC表位的位置[Gilmore等，1996；Jobe等，2003；Lovrich等，2005]。两项研究报道了负责引发杀菌性抗体的表位位于OspC的C末端结构域中[Jobe等，2003；Lovrich等，2005]；但是，因为该结构域是相对保守的，因此不清楚为什么针对C末端的抗体不具有广泛的保护作用。Matheisen等也建议C末端是抗体反应的主要目标，并注意到了从欧洲神经疏螺旋体病患者获得的血清与全长OspC的反应性高于与C末端截去了10个氨基酸的形式的反应性[Mathiesen等，1998]。从此，推断必定是C末端表位；但是，因为测试的抗原由未知类型的单一OspC变异体构成，C末端的更广泛识别可能是由于该结构域的更高的保守性，而不必须表明C末端是免疫优势的。Gilmore等证实了用非变性的，而不是变性的，重组OspC免疫接种小鼠产生了针对同源分离株的攻击的保护作用[Gilmore等，1996；Gilmore和Mbow，1999]，表明保护性表位可能是构象限定的。在另一项分析中，Gilmore等分析了来自单一类型的OspC(A型)的有限数量的截短OspC与造成被动免疫的抗OspC单克隆抗体的免疫反应性[Gilmore和Mbow，1999]。删除N-端或C-端消除了重组蛋白被单克隆抗体检测，进一步提示了构象或不连续表位的存在。还不清楚单克隆抗体识别的表位是否是免疫优势的、是否与自然感染过程相关、或是否在不同的OspC类型中是保守的。最近，已经对A型OspC的线性优势免疫表位进行了作图，发现它位于环5和α螺旋5区内[实施例1]。含有A型环5表位的重组蛋白在小鼠中引发了杀菌性抗体，提高了个体类型特异性表位可以用于疫苗开发中的可能性[参见实施例2]。在本报告中，对感染早期呈递的B、K和D型OspC表位作图，并已经构建了基于这些表位的四价嵌合疫苗原。该ABKD嵌合疫苗原在小鼠中是高度免疫原性的，引发结合细胞表面的OspC的抗体，并以补体依赖性的方式有效地杀死产生A、B、K和D型OspC的菌株。

在我们开发四价嵌合试验疫苗的工作中，第一步是鉴定在小鼠和人类感染过程中出现的B、K和D型OspC的线性表位。这些分析基本上是按照实施例1中鉴定A型OspC的环5和α螺旋5表位的描述进行。简单来说，使用来自克隆分离株感染的小鼠和来自至少部分被表达相应OspC类型的菌株感染的人类的血清筛选了广泛的B、K和D型OspC截短物和片段组。使用来自实验感染小鼠的血清进行精确的表位作图是可能的；但是，在自然感染的人类中，抗体反应将针对更广泛的表位阵列。这并不令人吃惊，可能反映了针对早期感染过程中通常不在细菌细胞表面呈递的OspC表位的抗体反应的扩展。新的表位，其中某些可能来自OspC的保守结构域(例如α螺旋1)，一旦细菌细胞死亡并从膜上释放OspC时，可以变得能够接近。这表明了在表位作图中使用人类血清样品的警告；即感染的准确过程一般来说是不清楚的，感染种群的克隆性是值得怀疑的[Wang等，1999；Ruzic-Sabljic等，2006；Hofmeister等，1999；Guttman等，1996；Rijpkema等，1997]。无论如何，从人类血清样品的分析中可以清楚地看到，第α螺旋5区中的表位在感染过程中被产生A、B、K和D型OspC的菌株所识别。此外，在几种不同类型OspC产生菌株中对α螺旋5的反应的一致性可能是该OspC结构域功能相关性的指示。

尽管α螺旋5和环5的序列在OspC类型之间是可变的，但这些区域在每个类型内是高度保守的[参见实施例1]。这表明对于嵌合疫苗来说，只有有限数量的OspC表位对于产生广泛的保护作用来说是需要的。作为开发广泛保护性的疫苗原的第一步，A型的环5表位和来自B、K和D型OspC的α螺旋5表位被用于开发试验疫苗原。使用被设计成编码接头序列的引物，对含有这些表位的区域进行PCR扩增。这允许在产生嵌合的构建体中使用PCR交叠延伸，并提供了将表位与短的、无结构的、具有蛋白酶抗性的氨基酸序列分离开的方法[Crasto和Feng，2000]。在本研究中开发的实验性的基于OspC的、四价ABKD嵌合疫苗原在所有的试验小鼠(n＝12)中引发了一致的、高滴度的IgG抗体反应。此外，疫苗原引发了针对每种被掺入的表位的抗体。有趣的是，表位特异性滴度显得受到表位在构建体中的位置的影响。从N-末端表位(A型的环5)到C-末端的表位(D型的αα螺旋5)，滴度逐渐减小。C-末端表位滴度降低的现象在早期基于链球菌M蛋白的嵌合疫苗的研究中也有报道[Dale等，1993；Dale等，1996]。这种滴度的位置特异性影响的基础还不清楚，但是可能是由于C-末端结构的体内降解或改变[Dale等，1999]。

尽管针对疏螺旋体感染的保护作用所必需的Th细胞因子反应和相关的免疫球蛋白同种型的分布还没有被完全解决[Kraiczy等，n2000；Widhe等，2004；Keane-Myers等，1995；Keane-Myers等，1996；Keane-Myers和Nickell，1995]，但该模式的确定是疫苗原开发中的重要步骤，可以提供关于不同的疫苗原构建体的潜在保护能力的重要信息。反应的同种型分布通过ELISA确定，观察到了与混合的Th1和Th2细胞因子反应有关的重链Ig同种型。在本研究中注意到的类型转换提示了充分的T细胞辅助，即使是在疫苗原中没有掺入确定的T-细胞表位的情况下。使用预测性肽结合算法对鼠(H2 Ak/H2Ek)和人类(HLA-DRB 1)II类MHC亚群进行了疫苗原序列分析，发现了疫苗原中预计能结合所有可用的等位基因的可能的T-细胞表位[Rammensee等，1999；Zhang等，2005]。预测的结合肽之一，LANSVKELT，在构建体中重复了3次，该重复对于引发Th反应可能是重要的[Jiang等，1999；Ahlborg等，1998；Kjerrulf等，1997；Theisen等，2000]。尽管对可能的T-细胞表位的分析不是穷尽式的，但预测支持了我们的数据，表明嵌合疫苗原可以在小鼠中引发T-淋巴细胞辅助。此外，它提示该构建体在人类中可能也是这样做的，不需要合并混杂的T-细胞表位序列。弗氏佐剂在产生这种同种型分布中的重要性还不了解，但是对于明矾和其它适合用于人类的佐剂来说，需要评估反应和同种型分布[ten Hagen等，1993；Lindblad，2004；Petrovsky和Aguilar，2004；Brewer等，1999；McNeela和Mills，2001]。此外，嵌合疫苗原的表位次序或结构的改变可以提供一种机制，通过它可以对免疫应答进行定制，以最大化体内保护作用[Tongren等，2005；Cai等，n2004]。

对于疫苗开发来说，因为对疫苗原的反应是生产性的，被引发的抗体必须能够结合到完整的伯氏疏螺旋体细胞的表面并导致杀菌。IFA分析显示出在产生A、B、K和D型OspC的菌株的细胞表面有很强的标记。即使针对D型表位的抗体滴度比更靠近N-末端的表位引发的滴度明显要低，但D型产生菌株的表面标记也相当明显。在每种OspC类型的培养物中的细胞亚群中观察到没有被抗ABKD抗血清标记，表明那些细胞不表达OspC。但是，在体内，已经证实了在从蜱向哺乳动物的传播过程中以及哺乳动物感染早期，大多数的细胞、即便不是所有的、都表达OspC[Gilmore等，2001；Zhong等，1997]。抗ABKD抗体有效杀死细胞的能力也被评估。来自疫苗接种的小鼠的血清以补体依赖性方式有效杀死表达A、B、K和D型OspC蛋白的螺旋体。尽管对于所有的OspC类型来说，杀死低于100％，这可能是在种群的细胞中，体外OspC表达的异质性的作用，这种现象在体内已经被很好地记录了[Schwan等，1995；Schwan和Piesman，2000；Hu等，1996]。

本实施例描述了新的、重组的、嵌合的、多价的、基于OspC的莱姆病疫苗的构建及其原理证明。使用基于表位的重组嵌合蛋白允许在同一个构建体中覆盖多种OspC类型，并避开误导针对无关的蛋白结构域的免疫应答的潜在的问题。对主动感染过程中被识别的线性表位的作图是嵌合疫苗开发的关键组成，对于4种与人类侵袭性感染有关的OspC类型已经被成功完成。包含在疫苗原中的表位引发了类型特异性的IgG抗体，它们能够结合疏螺旋体细胞表面的OspC，并行使补体介导的杀菌。

实施例4、针对目的在于提高免疫原性的嵌合多价莱姆病疫苗变异体的免疫应答

在本研究中，我们探索了改善构建体的溶解性，并评估了表位布置、表位重复以及包含推定的C-末端稳定化标签对免疫应答的潜在影响。这些分析为广泛保护性的OspC疫苗和普遍意义上构建嵌合疫苗的设计策略提供了新的了解。

材料和方法

重组OspC的表达和纯化

A、B、K和D型重组全长OspC蛋白按照以前的描述产生[参见实施例1和2]。简单来说，来自伯氏疏螺旋体分离株B31 MI(A型OspC)、LDP73(B型)、LDP74(K型)和LDP 116(D型)的克隆种群的ospC基因被PCR扩增，使用具有5′突出的引物，以允许在pET-32 Ek/LIC载体(Novagen)中不依赖连接酶的克隆(LIC)[实施例1]。在扩增和再生单链尾部后，将扩增子与pET-32 Ek/LIC载体退火，载体转化到NovaBlue(DE3)大肠杆菌细胞中并进行增殖。通过DNA测序(MWG-Biotech)证实插入序列之后，使用IPTG(1mM)诱导蛋白的表达。通过镍亲和层析，使用pET-32 Ek/LIC表达标签编码的六聚组氨酸基序(Novagen)来纯化蛋白。将咪唑洗脱的蛋白穿过截留分子量为10kDa的膜(Slid-a-lyzer，Pierce)对磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH7.4)深度透析，蛋白浓度通过BCA分析(Pierce)进行定量，制备物的纯度通过SDS-PAGE评估。

ABKD疫苗变异体的构建、表达和纯化

为了研究跨疫苗构建体的具体表位的IgG滴度降低的可能机制和解决方法，构建了原始疫苗的多种变异体。所有的疫苗变异体都是基于以前描述的ABKD疫苗原的序列[实施例3]，并含有同样的含有表位的序列。这些包括A型的环5区(131到149位氨基酸)以及B型(160-201位氨基酸)、K型(161-201位氨基酸)和D型(161-201位氨基酸)的α螺旋5区(图13小图)。ABKDppa和ABKDgg分别在原始的ABKD构建体的C-末端加上了Pro-Pro-Ala或Gly-Gly基序。这两种构建体都是通过使用反向引物(表5)扩增原始的ABKD构建体而制备的，这些引物通过编码适当氨基酸的5’突出部加入基序(图13A)。其它的疫苗变异体通过交叠退火和延伸技术制备，与原始的ABKD疫苗原的构建[实施例3]中使用的相同。ABKDD构建体通过使用带有编码无结构的、具有蛋白酶抗性的接头的3’尾部序列的反向引物，再次扩增ABKD构建体而制备。这使得PCR产物退火到含有D型OspC表位的序列中，所述序列已经使用在5’端编码互补接头的序列扩增，对退火的构建体进行后续的交叠延伸和扩增(图13B)。ADBK构建体通过将分别扩增的含有A和D型表位的区域彼此退火，然后与从原始ABKD构建体扩增的B和K型α螺旋5表位区域进行退火而制备(图13C)。ADBKD构建体通过将来自ABKD和ADBK序列的重组子退火而制备(图13D)。在所有情况下，PCR扩增以GoTaq Green(Promega)完成，使用起始2分钟的94℃变性步骤，接着为35个循环的94℃ 15秒、引物在50℃退火30秒、在72℃延伸60秒，最后72℃延伸7分钟。所有在这些疫苗原的构建中使用的引物列在表5中。所有的PCR产物在用作后续PCR反应的模板之前被凝胶纯化(Qiagen)。最后的扩增子通过不依赖连接酶的克隆退火到pET-46 Ek/LIC载体中，并转化到Novablue(DE3)大肠杆菌细胞中。使用T7引物筛选具有插入片段的菌落，回收质粒(Qiafilter Midi，Qiagen)，通过DNA测序证实插入片段。重组蛋白按照上面的描述表达和纯化。在纯化后，将疫苗蛋白通过截留分子量为10kDa的膜(Slid-a-lyzer，Pierce)对PBS(pH7.4)或含有100mM磷酸盐、100mM NaCl、50mM精氨酸、50mM谷氨酸的pH8缓冲液(Arg/Glu缓冲液)[GoIo vanov等，2004]进行透析，更换3次缓冲液。构建体的纯度通过SDS-PAGE进行评估。

表5、用于构建嵌合疫苗原的引物。LIC尾部用粗体表示，接头序列被下划线。

用疫苗变异体免疫小鼠

用6种疫苗原变异体的每种免疫6周龄的雄性C3H/HeJ小鼠(每种构建体3只)。因为变异体的免疫原性将被互相比较，因此希望以摩尔基础施用蛋白，以补偿每单位疫苗原质量的表位数的差别。每只小鼠每次免疫接种接受大约2.8纳摩尔蛋白，为50μgABKD、ABKDppa、ABKDgg和ADBK构建体或62.5μgABKDD和ADBKD构建体。小鼠用在弗氏完全佐剂中的疫苗免疫，然后在第2周和第4周用弗氏不完全佐剂加强。在第一次接种前和第6周，通过剪尾从所有小鼠收集血清。为了确定佐剂对总的和表位特异性抗体的滴度的影响以及对同种型分布的影响，用如上所述在弗氏佐剂中乳化的、或吸附在明矾(ImiectAlum，Pierce)上的ABKD疫苗原免疫小鼠(每种佐剂6只)，在第6周通过剪尾收集血清。

疫苗变异体诱导的表位特异性IgG滴度的评估

通过Western印迹和ELISA对每种疫苗原的免疫原性进行了评估。在western印迹中，A、B、K、D型重组OspC以每道500ng在还原性样品缓冲液中上样，在12.5％的SDS-PAGE凝胶Criterion，Biorad)上电泳，然后电转印到PVDF(Immobilon-P，Millipore)。用含有0.2％Tween-20的磷酸盐缓冲的盐水(PBS-T)中的1％BSA封闭印迹。使用PBS-T1:2500稀释的每种抗血清探查印迹1小时，然后洗3次。为了证实同样的蛋白载量，一个印迹用抗His标签的单克隆抗体(1:2000；Novagen)进行筛选。第二级检测使用1:40000稀释的过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG和化学发光(Super Signal Pico，Pierce)进行。对于定量分析来说，通过ELISA分析确定OspC类型特异性IgG的滴度。A、B、K或D型重组OspC被包被在96孔板上(Costar 3590；Corning)，100ng/孔，在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中于4℃进行16小时。将板封闭(含有0.2％ Tween-20的PBS(PBS-T)中的1％ BSA；2小时)，用PBS-T洗3次，然后在双份板的孔中加入连续稀释的抗疫苗原抗血清(100μL)(1小时)。HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(1:20000)用作第二抗体，ABTS用作生色底物。在反应速度为线性时，在ELISA读板器(ELx 808；Biotek)上于405nm读取吸光度，通过四参数逻辑方程(SigmaPlot)将S形曲线拟合成吸光度曲线拟合来计算滴度。滴度被报告为对应于50％最大吸光度平台的稀释度的倒数。

表位特异性免疫球蛋白同种型分布的确定

通过ELISA评估了针对ABKD、ABKDD和ADBKD疫苗变异体构建体的抗体反应的同种型分布。将96孔板用每孔100ng的A、B、K和D型重组OspC包被。按照上面的描述对板进行封闭和清洗。抗疫苗原的抗血清被加入到板中，进行双份分析(100μL；1:10000；1小时)。结合的表位特异性Ig通过与同种型特异性的生物素化第二抗体孵育(1小时；小鼠同种型分型试剂盒；Zymed)来检测。第二抗体通过过氧化物酶偶联的链亲和素(30分钟)和生色底物ABTS来检测。所有的孵育都在室温下进行。

疫苗特异性T淋巴细胞产生IFN-γ和IL-4的测定

被免疫接种的小鼠的脾细胞的细胞因子反应通过使用疫苗原按照修改的Abuodeh等[1999]的方法在体外再刺激来进行评估。被接种的小鼠通过二氧化碳麻醉来安乐死，无菌取出脾脏并放置在RPMI培养基中(Sigma)。将用每种疫苗构建体接种的3只小鼠的脾脏合并，通过使用22号针头反复向脾被膜中注射RPMI来收获细胞。将细胞悬浮液转移到50mL离心管中，200xg 5分钟收获细胞。通过在3mL 8.3mg/mL的氯化铵(R-7757，Sigma)中暴露1分钟来裂解红细胞。然后用20mL RPMI(Sigma)稀释氯化铵，将细胞离心并清洗3次。将细胞重新悬浮在10mL含有10％ FCS、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素、2.5μg/mL两性霉素B的RPMI中。细胞用锥虫蓝染色以评估存活性，用血细胞计数器进行计数，将所有的细胞悬浮液调整到10⁷个细胞/mL。以10⁷个细胞/孔的量将细胞等分到24孔板(Costar 3526)中(每种疫苗原类型12个孔)。使用5或10μg/mL的免疫疫苗原刺激三份孔。对照包括三份用10μg/mL的无关蛋白——牛血清白蛋白刺激的孔和未刺激的孔(无蛋白)。所有的板在37℃、5％ CO2下孵育96小时，然后收获上清液并冷冻在-80℃下，等候对细胞因子进行ELISA定量。

为了对Th1/Th2细胞因子IFN-γ和IL-4的水平进行定量，按照制造商的说明书使用基于ELISA的分析(ELISA-Max；Biolegend)。简单来说，将捕获抗体包被在96孔ELISA板上，将板封闭，将双份100μL的每种培养上清液在板中孵育2小时。对于IL-4检测来说，使用未稀释的培养上清液，而对于IFN-γ来说，用未稀释的和用PBS 1:20稀释的上清液来测试。使用含有已知浓度的每种细胞因子的样品来产生标准曲线。通过生物素化第二抗体、然后通过HRP偶联的链亲和素和使用TMB底物的生色检测来检测结合的细胞因子。

结果

变异体疫苗构建体的构建、表达和纯化

使用具有5’突出部的引物与交叠退火和延伸PCR技术，产生了原始ABKD疫苗的5种变异体(图13)。所有这些构建物的DNA序列得以证实。疫苗原的选择的理化性质显示在表6中[Gasteiger等，2005]。通过镍层析纯化重组疫苗原后，注意到了有相当比例的重组蛋白在针对PBS透析过程中沉淀。这在ABKD疫苗原的初始报告中也被注意到了[实施例3]。尽管分子量较高的构建体ABKDD和ADBKD在PBS中具有较高的溶解度，重组蛋白的沉淀仍然明显。因此，基于Golovanov等[2004]的工作开发了修改的透析缓冲液(Arg/Glu缓冲液)。缓冲液的pH从PBS(pH7.4)增加到pH8.0，以增加缓冲液的pH与重组蛋白的等电点(pI 6.49或6.85)之间的差别。此外，盐浓度从150mM降低到100mM，并加入了50mM精氨酸和50mM谷氨酸。使用该缓冲液，没有注意到任何重组蛋白的沉淀，可溶性蛋白的浓度明显增加。正如通过SDS-PAGE可见，重组蛋白是纯的，不含有降解产物(图14)。

表6、疫苗原的理化性质

构建体	氨基酸	分子量(Da)	等电点	不稳定指数
构建体	氨基酸	分子量(Da)	等电点	不稳定指数	ABKD	169	18014.4	6.49	10.14
ABKDppa	172	18279.7	6.49	14.93	ABKD	169	18014.4	6.49	10.14
ABKDppa	172	18279.7	6.49	14.93	ABKDgg	171	18128.5	6.49	10.86
ABKDD	214	22632.7	6.85	15.49	ABKDgg	171	18128.5	6.49	10.86
ABKDD	214	22632.7	6.85	15.49	ADBK	170	18027.4	6.49	8.51
ADBKD	215	22645.7	6.85	14.18	ADBK	170	18027.4	6.49	8.51

疫苗原变异体的免疫原性

为了评估ABKD疫苗变异体的相对免疫原性，将小鼠用弗氏佐剂中的每种变异体进行免疫。通过western印迹评估血清的表位特异性反应性，其中血清被用于探测4种类型中每一种的PVDF固定的重组OspC。蛋白被证实在印迹上带有同样的载量，正如通过与标签特异性的小鼠抗His标签单克隆抗体的反应性所评估的那样。来自被免疫的小鼠的血清证实了在与每种重组OspC蛋白的反应性水平上存在疫苗原依赖性差异(图15A)。值得注意的是，在用ABKDppa和ABKDgg变异体接种的小鼠中与D型α螺旋5表位的反应性降低了，最明显的是用ADBK变异体。为了以定量的方式评估这些变化，通过ELISA，再通过使用4种类型的每种全长重组OspC作为固定的抗原，完成了IgG与每种包含在构建体中的OspC型特异性表位的反应性滴定。滴度基本上模拟了定性western印迹的发现，证实了在免疫血清与个体表位的反应性中的疫苗特异性差异(图15B)。最显著的区别在与D型表位的反应性中见到，对于ABKDppa、ABKDgg和ADBK变异体可见特别低的滴度。

疫苗变异体特异性免疫球蛋白的同种型分布

为了更详细地了解变异体疫苗原诱导的免疫应答，通过表位特异性滴度测定，完成了3个具有最好的疫苗潜力的变异体(ABKD、ABKDD、ADBKD)的表位特异性免疫球蛋白同种型分布。总的来说，在抗原特异性免疫球蛋白中，存在着占优势的IgG1、少量的IgG2a和IgG2b，以及非常少的IgG3或IgM，这种模式以前已经被注意到了[实施例3](图16)。对于所有的表位和所有的疫苗变异体来说，Ig同种型的模式是相似的，只有一个例外。在用ABKDD免疫的小鼠中K和D型表位特异性IgG2a和IgG2b的反应性比用ABKD或ADBKD变异体免疫的小鼠高。

疫苗特异性T淋巴细胞的Thl/Th2细胞因子的生产

为了评估在ABKD疫苗原中变异诱导的细胞因子环境和Th1/Th2平衡的潜在的影响，用已经用于免疫小鼠的疫苗原在体外重新刺激小鼠的脾细胞。在不同免疫的小鼠之间注意到了IFN-γ的诱导水平的显著差异。所有的疫苗变异体都与培养上清液中IFN-γ水平的增加有关，尽管ADBK和ADBKD具有的水平比其它疫苗原诱导的高2到3倍(图17)。在所有情况下，浓度为5μg/mL和10μg/mL的抗原都诱导IFN-γ，其水平在0.5到8.6ng/mL的范围内。来自未刺激的脾细胞或用牛血清白蛋白刺激的脾细胞的的细胞培养上清液都具有低于15.6pg/mL的分析检测限的IFN-γ水平。在疫苗刺激的和对照的培养上清液中都没有检测到IL-4，表明浓度低于2.0pg/mL的分析检测限。

佐剂类型对抗体滴度和同种型分布的影响

为了确定佐剂类型对针对疫苗原反应的影响，用在弗氏佐剂中乳化的或吸附于明矾的ABKD蛋白对小鼠进行免疫。在用明矾佐剂免疫的小鼠中，针对整个疫苗原以及针对每个组分表位的IgG滴度都稍低，尽管在两种佐剂之间反应的总体模式相似(图18A)。尽管IgG1水平相似，但用明矾免疫的小鼠具有减少的疫苗原特异性IgG3、IgG2a和IgG2b(图18B)。表位特异性同种型分布与使用整个疫苗原时观察到的分布非常相似(数据未显示)。

讨论

使用含有多个B细胞表位的嵌合蛋白，与全蛋白多价疫苗原和肽偶联物相比，在疫苗开发中具有潜在的优势。仅包含保护性表位序列减小了误导针对亲本分子或肽载体中无关表位的反应的可能性。如果，象OspC那样，具有在重组疫苗原中是优势免疫的、但是在感染过程中不被细菌呈递的大的保守结构域[实施例1；Kumaran等，2001；Eicken等，2001]，这将是重要的。这样的表位与保护性免疫应答的产生无关。但是，产生新的蛋白的需要考虑到可能封闭表位或影响蛋白的稳定性和溶解性的分子间和分子内相互作用。在本实施例中，我们对基于OspC的重组的多价嵌合莱姆病疫苗原进行了深入的研究。原始的ABKD疫苗在小鼠中是高度免疫原性的，被诱导的IgG结合细菌细胞表面上的天然OspC并引发补体依赖性的杀菌作用[实施例3]。尽管这成功了，但ABKD构建体还有两个因素需要改进，它在PBS中的溶解性差，这妨碍了重组蛋白的生产并可能影响储存稳定性，以及针对蛋白中的个体表位的IgG滴度的差异。具体来说，滴度随着表位与疫苗的C-末端的接近而减小。本研究的目的是改进疫苗原的溶解性，以及使用在表位位置、表位重复以及包含稳定基序方面不同的修改过的疫苗原以改进整体的和表位特异性的免疫应答。

在较早的研究中，已经注意到重组疫苗原在针对PBS透析后有明显的沉淀[实施例3]。这种差溶解性不仅限制了疫苗原的生产，而且也对疫苗的免疫原性有影响。ABKD构建体在对PBS透析后能够达到的最大浓度是0.5mg/mL，通常更低。OspC的晶体结构表明在天然OspC蛋白中螺旋5表位区参与了单体内4个螺旋的成束[Kumaran等，2001；Eicken等，2001]。这可以导致疫苗原蛋白之内和之间的暴露的疏水螺旋面之间的相互作用，进而引起沉淀。在透析缓冲液中加入精氨酸和谷氨酸被发现使所有重组疫苗原蛋白的溶解度增加了4到100倍(表7)。这种增加的溶解性的基础可能是通过与精氨酸和谷氨酸侧链的脂肪族部分的相互作用，精氨酸和谷氨酸与带有相反电荷的暴露的残基、以及与疏水残基的相互作用[Golovanov等，2004]。使用在Arg/Glu缓冲液中透析的ABKD构建体免疫的小鼠具有比用PBS透析的ABKD疫苗原免疫的小鼠明显更高的滴度[实施例3]。Arg/Glu缓冲液可以导致更有优势的折叠模式或更少的分子间或分子内相互作用，因而使表位能够更好地与B-细胞受体接近。精氨酸和谷氨酸与重组蛋白的吸附明显不干扰表位识别。Arg/Glu缓冲液已经被报道在体外针对蛋白酶的活性有保护作用[Golovanov等，2004]。尽管在PBS和Arg/Glu透析的样品中都没有明显的蛋白酶降解现象，但不能排除体内针对蛋白水解裂解的保护作用。针对含有精氨酸和谷氨酸的缓冲液的透析可能是一种有用的工具，可以用于其它具有明显的分子间相互作用的新的嵌合蛋白。

表7、针对PBS或Arg/Glu缓冲液透析的疫苗原的可溶性蛋白浓度

以前已经在嵌合链球菌M蛋白疫苗原中报道了免疫应答差与C-末端表位位置的关系，这可能是由于与C-末端有关的结构问题或被羧肽酶的蛋白水解降解[Dale等，1993；Dale等，1996；Dale等，1999]。已经提出了许多方法保护肽和重组蛋白免遭蛋白酶活性，包括C-末端的酰胺化或PEG化、氨基(N)末端的乙酰化以及添加保护性的氨基酸基序[Brickerhoff等，1999；Powell等，1992；Lee等，2005；Alvarez等，2004；Kawarasaki等，2003；Walker等，2003]。氨基酸基序也已经被报道能够通过抑制羧肽酶的作用而稳定蛋白的C-末端；但是，它们的保护能力只对几个蛋白进行了评估。评估了两个稳定性基序增加针对ABKD疫苗原的抗体反应的能力。加入两个中性的亲水Gly残基可以降低羧肽酶C和D的活性，这两种酶分别对疏水的和碱性的C-末端氨基酸具有特异性[Alvarez等，2004；Kawarasaki等，2003；Remington和bredam，1994]。加入Pro-Pro-Ala基序可以通过并列的、大体积的脯氨酸残基在空间上阻碍羧肽酶的前进[Walker等，2003]。

为了评估加入这些基序对针对ABKD嵌合疫苗原的抗体反应的影响，用ABKDgg或ABKDppa构建体免疫小鼠。在这两种情况下，与用未修饰的ABKD构建体免疫的小鼠相比，血清针对多种表位中的一种具有较低的平均IgG滴度。ABKDppa构建体对D型特异性IgG的滴度降低了，尽管这主要是由于单一的异常值。ABKDgg构建体对K和D型表位的滴度降低了。在IgG滴度的基础上，使用任何这些基序的任何一个都没有优势。对C-末端表位的滴度的降低表现为不是由那些被这些基序赋予了抗性的羧肽酶的作用所介导的，尽管有可能任何由于蛋白酶保护作用导致的优势可能被Arg/Glu缓冲液所提供的类似的保护作用所掩盖[Golovanov等，2004]。

为了研究涉及对C-末端表位的免疫应答差的可能的结构因素，产生了几种其它的构建体。在嵌合链球菌疫苗中，在C末端重复N-末端表位通过未知的机制“保护”了先前的C-末端表位[Dale等，1999；Dale等，2005；Hu等，2002；McNeil等，2005]。基于这种成功，开发了ABKD疫苗原的类似变异体。产生了ABKDD构建体以评估针对D型表位的反应是否能够被第二个C-末端D型表位所保护。为了评估滴度的降低是否主要是由于C-末端表位的位置，将D型表位移到第二位最靠近N-末端的位置(ADBK)。最后，使用ADBKD构建体来评估重复的C-末端表位的保护作用，并使用ABKDD，评估重复的表位对特异性免疫应答的影响。在ABKDD疫苗原中表位重复使D型特异性IgG滴度加倍，但是同时引起了针对邻近的K型表位的滴度降低。在ADBK构建体中，当D型表位被放置在更N-末端的位置上时，D型特异性IgG滴度被显著降低了。此外，在ADBK构建体中针对C-末端的K型表位的反应性与ABKD中的相比被提高了。加上C-末端D型表位(ADBKD)没有增加K型特异性滴度；但是，它产生了明显增加的、尽管不是加倍的、针对D型表位的滴度。这些结果表明D型表位的C-末端位置比内部位置优选，另加的“保护性”C-末端表位对C-末端表位没有明显的保护作用。在该疫苗原中表位特异性滴度的主要决定因素不是它与C-末端的接近性，而更可能是嵌合蛋白的三级结构。

疫苗原诱导的Ig同种型可能对体内保护效应有重要意义。通过改变表位或它们的次序，可能可以改变同种型的分布[Tongren等，2005]，从而改变抗体的效应子功能。为了测定表位特异性的同种型分布，将针对最有希望的疫苗原(ABKD、ABKDD、ADBKD)的抗血清与固定的A、B、K或D型重组OspC相结合，并使用同种型特异性的抗血清检测结合的抗体。正如以前对ABKD疫苗原报道的那样[实施例3]，主要的同种型是IgG1、以及水平略低的IgG2a和IgG2b，这取决于构建体，以及低水平的IgM和IgG3。在ABKD和ADBKD抗血清之间表位特异性Ig同种型分布是类似的，IgG2a和IgG2b的水平从N-到C-末端表位降低，模拟了总IgG滴度。ABKDD对于所有的表位有一致的IgG2a和IgG2b水平，尽管K型特异性总IgG滴度较低。

ABKD疫苗原引发补体依赖性的杀菌抗体[实施例3]。在小鼠中，IgG1不激活补体[Dangl等，1988；Miletic和Frank，1995]，表明大部分被诱导的同种型可能不具有保护作用。尽管已经报道了OspA特异性IgG1可以通过不依赖补体的机制杀死疏螺旋体[Munson等，2000]，ABKD疫苗原诱导的抗体的杀菌作用是补体依赖性的[实施例3]。被引发的同种型分布可能受到使用C3H/HeJ小鼠——一种莱姆病研究的标准动物模型——的影响。在伯氏疏螺旋体感染期间，已经注意到了C3H/HeJ和BALB/c系小鼠之间的体液免疫的差异，特别是在总IgG水平，特别是在IgG2a的水平上，这二者在C3H/HeJ小鼠中都较高[Yang等，1992；Keane-Myers和Nickell，1995]。此外，C3H/HeJ小鼠种系缺少TLR-4，尽管预计它对于预防接种或感染期间针对莱姆病的保护作用不是关键的，因为疏螺旋体不产生脂多糖[Takayama等，1987；Barthold等，1990]。

因为普遍接受的是体液杀疏螺旋体活性是补体依赖性的，因此引发Th1细胞因子反应可能是有利的，因为它出现在许多细菌性疾病中(综述于[Spellberg可Edwards，2001])。在主动感染过程中细胞因子参与莱姆病及其后遗症的发展和消退。几项研究已经发现IL-4对于发展杀疏螺旋体的抗体反应来说不是关键的细胞因子[Munson等，2000；Potter等，2000；Christie等，2000；Satoskar等，2000-64]，意味着Th1型反应可能与保护作用有关。此外，分泌IFN-γ的Th1细胞促进了与莱姆病有关的心脏炎的消退[Bockenstedt等，2001；Kelleher等，1998]。相反，在感染过程中，关节炎的严重性和皮肤螺旋体的载量通过施用重组IL-4减少，通过施用α-IL-4抗体而增加[Keane-Myers和Nickell，1995；Keane-Myers等，1996]。在天然感染过程中，IFN-γ的生产与慢性莱姆病的发展有关[Widhe等，2004]，并与莱姆关节炎中关节肿胀的程度有关[Gross等，1998]。IFN-γ还涉及抑制从体外淋巴结培养物中诱导杀疏螺旋体的抗OspA抗体的产生有关[Munson等，2002]。为了研究免疫接种诱导的Th细胞因子环境，在体外用疫苗原、Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子对小鼠脾细胞进行了重新刺激，并通过ELISA定量。在用疫苗原重新刺激的细胞的上清液中检测到了IFN-γ，尽管其浓度根据构建体而不同。相反，在任何脾细胞上清液中没有检测到IL-4。ABKD、ABKDppa和ABKDD构建体都具有类似的IFN-γ浓度。ADBKD具有几乎双倍的IFN-γ浓度，ADBK的水平甚至更高。在重新刺激的细胞的上清液中IFN-γ水平与总的表位特异性血清IgG滴度或同种型分布之间没有明显的相关性。

细胞因子和相关的Ig同种型分布可以通过选择免疫佐剂来改变。弗氏完全佐剂与Th1细胞因子反应有关[Cribbs等，2003；Shibaki和Katz，2002]，它可以增加IgG2a的水平。唯一目前被批准用于人类的佐剂是明矾，它已知增加Th2细胞因子的分泌[Cribbs等，2003；Brewer等，1999；Lindblad，2004；Petrovsky和Aguilar，2004]。在用明矾免疫的小鼠中，注意到了与使用弗氏佐剂相比，针对疫苗原及其组成表位的IgG滴度预料中的适度降低。此外，与IgG1相比，IgG3、IgG2a和IgG2b同种型成比例降低。这证实了使用这种佐剂时预期的较低Th1细胞因子反应。但是，疫苗原继续引发能够结合补体的抗体，表明针对构建体的明显改变或对佐剂的修饰对于有效的反应来说可能不是必需的。

在本实施例中，我们研究了对潜在的嵌合多价莱姆病疫苗原的改变，其目的是优化被诱导的体液免疫应答。通过用对Arg/Glu缓冲液进行透析来增加其溶解性，实现了构建体免疫原性的显著提高。这可能在体内减少了蛋白相互作用，使更多的表位暴露[Theisen等，2000]。加上蛋白酶保护性的C-末端基序或加上“保护性的”C-末端表位都不能改进针对疫苗原的免疫应答。对表位进行重新排序导致了针对被移动的表位的免疫应答显著降低。针对本疫苗构建体中的组成表位的免疫应答的差别被显示主要是依赖于蛋白的结构，而不是蛋白对蛋白酶消化的抗性。此外，有证据表明疫苗原引发的Th细胞因子和IgG同种型可以被嵌合构建体的结构和佐剂的制剂所改变。本研究在对针对嵌合疫苗原的亚最适免疫应答的基础、以及改进这些反应的方法方面，提供了重要的信息。

实施例5、可用的OspC序列分析证实了广泛保护性多价嵌合莱姆病疫苗的可行性

为了便于进一步发展广泛保护性的嵌合构建体，我们对可以从数据库中获得的OspC序列进行了系统发育分析。被分析的OspC片段跨越20到200位的残基(使用对B31MI序列的编号)。数据库中较短的序列被排除出这些分析，留下来自280个疏螺旋体菌株的序列用于分析。分派每个序列的OspC类型通过比对(PAM40计分矩阵)和两两一致性矩阵分析来确定。与以前的研究一致，表现出95％或更高的序列一致性的序列被认为属于同样的OspC类型(Attie等，2006；Wang等，1999)(图19)。观察到了序列比较的明确双峰分布，不同的OspC类型序列之间平均序列一致性为65％，类型内部的一致性大于97％。除了被Wang等(1999)描述的21个类型之外，还定义了其它17个簇群。对于包含少于3个序列的簇群我们没有指派OspC类型。在新的OspC类型的命名中，我们选择了维持现有的从A到U的OspC类型命名(Wang等，1999)，根据包含在每个簇群中的原型菌株对其它的类型进行命名。在280个被分析的序列中，有202个被指派了OspC类型，它们都来自引起莱姆病的种类。没有被指派到OspC类型的78个序列包括引起莱姆病的螺旋体(51个分离株)和其它的疏螺旋体种类(27个分离株)。获得每个OspC序列的分离株的地理和生物学来源以表格的形式显示在图20中。大部分伯氏疏螺旋体分离株来自北美(80％)，少数来自欧洲(16％)和亚洲(4％)。53％的伯氏疏螺旋体、48％的埃氏疏螺旋体和79％的伽氏疏螺旋体OspC序列来自从人类收集到的分离株。值得注意的是来自人类分离株的伽氏疏螺旋体OspC序列主要是脑脊液(CFS)来源的(68％)，而埃氏疏螺旋体分离株主要来自皮肤(83％)。相反，伯氏疏螺旋体来源的OspC序列是来自从人类皮肤(51％)、血浆(30％)和CSF(19％)回收的分离株。这些发现与这些生物体引起的已知疾病类型一致，表明在本报告中评估的OspC序列的样品代表了莱姆病螺旋体的真实种群。

为了便于进一步的系统发育分析，通过删除一致的序列将被分析的序列组减少到74个。然后使用Phylip(v.3.66)系统发育分析软件包使用自展(n＝1000)对这些序列进行比对和分析。使用Dayhoff PAM矩阵计算跨越20到200、20到130和131到200位区域的距离，通过邻近结合产生树。B.hermsii OspC直系同源(Vmp33)序列被用作外类群(Margolis等，1994)。通过多数性规则(对于组的包含来说界限为50％)产生严格一致性树(consensus tree)。在Dayhoff PAM模型下通过最大似然率方法重新为严格一致性树计算距离(图21)。

使用OspC的20-200位氨基酸片段产生的严格一致性树在终端节点得到很好的支持，所有确定的OspC类型按照预期分簇。尽管自展分析对几个较深的分支获得了的支持较少(图21A)，但这并不是没有预料到的，因为序列间扩展的一致区域使它们的系统发育差异很精细。使用OspC的20-200和20-130位氨基酸片段产生的严格一致性树显示出类似的系统发育分簇(图21A、21B)，这主要基于物种的同一性。但是，使用131-200位氨基酸产生的严格一致性树(图21C)产生了明显不同的分簇模式，没有得到自展分析的强有力支持。这种观察符合不同OspC类型的菌株之间已经发生ospC基因的短片段之间的重组的假说。OspC类型之间OspC短片段重组的证据可以在特定的序列中看见。例如，埃氏疏螺旋体的OspC类型PLj7的序列，在20-130位氨基酸的结构域中具有的区域与在形成Pki簇的伽氏疏螺旋体的OspC序列中看到的相同。在PLj7的131-200位区域中，高变的环5和环6区具有的基序分别与F和M型伯氏疏螺旋体OspC中看到的相同。重组的其它证据来自使用SimPlot(v.3.5.1)的启动扫描(Lole等，1999)。在启动扫描中，通过在滑动窗口中(40个碱基的窗口，每步间隔10个碱基)为序列片段产生系统发育树(Kimura模型，Ts/Tv比率＝2.0，邻近结合)，来评估潜在的重组。这些树被自展(n＝100)，报告了该窗口中支持序列分组的轮排的树的数量。当大于70％轮排的树将序列归集在窗口中时，一般认为重组的迹象得到了支持。在上面描述的类型中(图22)以及大量其它类型中(数据未显示)，发现了可能的重组的迹象。

OspC变异性的发生是通过现有的OspC类型之间的交换而不是通过超突变的证据，为在广泛保护性疫苗原中需要包含的OspC类型特异性表位的绝对数量存在限度提供了证据。因为目前作图的线性表位都包含在OspC的C-末端区域(131-200位氨基酸)中，确定嵌合疫苗原所需的表位的理论数量是可能的。通过在74个上述的代表性序列中检查该区域，含有独特表位的区域的数量通过消除一致的或仅有一个氨基酸变化的序列被减少到了34个(图22)。通过表位作图可能可以进一步限制这个数量，因为某些表位可以赋予针对两种或多种OspC类型的保护作用。考虑到那些与人类疾病、或更具体来说侵袭性人类疾病有关的OspC类型，所需的表位数量也可以进一步减少(参见实施例1)。对于针对OspC表位亚类进行预防接种的一种理论上的顾虑是可能驱动了针对未包含在疫苗原中的类型的选择性，从而增加了带有那些罕见等位基因的种群的比例。但是，因为人类仅仅是偶然宿主，免疫接种明显改变蜱载体或哺乳动物储主中表达特定OspC类型的菌株的种群分布是不可能的。

概括来说，OspC数据库的深入的本质使得完全的分析得以进行，它已经定义了新的OspC类型，并提供了关于它们被分离的频率和与人类疾病的相关性的信息。数据表明，在广泛保护性的嵌合疫苗原中需要包含的含有OspC表位的序列的数量是有限的，嵌合疫苗原的开发是可行的。

实施例6、八价嵌合体的构建

ENICABKD八价构建体显示在下面，使用PROTPARAM程序计算的构建体的几个性质被列出。被命名为“L#”的片段是接头序列。“RS”标明了在制造构建体中使用的限制性位点的位置。

<----TAG----->RS<----------------------E型---------------

1 AHHHHHHVDDDDKITGLKSEHAVLGLDNLTDDNAQRAILKKHANKDKGAAELEKLFKAVE

-------------<L9>-----------------N型-----------------><L

61 NLSKAAQDTLKNAPGVGATTDEEAKKAILRTNAIKDKGADELEKLFKSVESLAKAAQDAT

6><----------------I型----------------><L7><-------------

121 QMLKTNNDKTKGADELEKLFESVKNLSKAAKEMLTNSVKELTSTEPSEEFTKKLKEKHTD

------C型---------------------><L8RS<------A型-----><-

181 LGKKDATDVHAKEAILKTNGTKDKGAAELEKLFESGEDVSETFTNKLKEKHTDLGKEGSM

L1><----------------B型-----------------><L2><-----------

241 GMLKANAAGKDKGVEELEKLSGSLESLSKAAKEMLANSVKELTSTNGNLITDAAKDKGAA

----K型------------------><L3><---------------D型-----

301 ELEKLFKAVENLAKAAKEMLANSVKELTSSMSVLKTHNAKDKGAEELVKLSESVAGLLKA

----------------------->

361 AQAILANSVKELTSPVVAESPKKP(SEQ ID NO：249)

氨基酸的数量：384

分子量：41263.7

理论等电点：6.52

氨基酸组成：

Ala(A) 51 13.3％

Arg(R) 2 0.5％

Asn(N) 20 5.2％

Asp(D) 25 6.5％

Cys(C) 0 0.0％

Gln(Q) 5 1.3％

Glu(E) 42 10.9％

Gly(G) 21 5.5％

His(H) 12 3.1％

Ile(I) 7 1.8％

Leu(L) 46 12.0％

Lys(K) 62 16.1％

Met(M) 7 1.8％

Phe(F) 7 1.8％

Pro(P) 5 1.3％

Ser(S) 27 7.0％

Thr(T) 26 6.8％

Trp(W) 0 0.0％

Tyr(Y) 0 0.0％

Val(V) 19 4.9％

带负电荷的残基的总数(Asp+Glu)：67

带正电荷的残基的总数(Arg+Lys)：64

原子组成：

碳 C 1787

氢 H 2983

氮 N 501

氧 O 597

硫 S 7

分子式：C1787H2983N501O597S7

原子总数：5875

估计的半衰期：

考虑序列的N-末端是A(Ala)。

估计的半衰期是：4.4小时(哺乳动物网织红细胞，体外)

>20小时(酵母，体内)

>10小时(大肠杆菌，体内)

不稳定性指数：

不稳定指数(II)被计算为12.58

这将蛋白分类为稳定

脂肪族指数：81.46

总平均亲水性(GRAVY)：-0.668

当施用于试验动物时，发现该嵌合蛋白构建体引发强烈的免疫应答，并针对莱姆病的发展提供了保护。

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尽管本发明已经参照其优选实施方案进行了描述，但本领域的专业技术人员将会认识到，在随附的权利要求的精神和范围内进行修改后，本发明仍然能够被实践。因此，本发明不限于上面描述的实施方案，而是应该进一步包括在本文提供的描述的精神和范围之内的所有修改及其等价物。

序列表

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<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222>(501)..(501)

<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223>Chimeric protein

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<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222>(286)..(286)

<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222>(357)..(357)

<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222>(428)..(428)

<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<222>(499)..(499)

<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

Claims

1.嵌合重组蛋白，包含来自两种或多种类型的外表面蛋白C(OspC)的环5区或α螺旋5区或这二者的表位。

2.权利要求1中的嵌合重组蛋白，其中所述OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa，、B、K、N和C。

3.权利要求2中的嵌合重组蛋白，其中所述嵌合重组蛋白包含来自A、B、K和D型OspC的表位。

4.权利要求2中的嵌合重组蛋白，其中所述嵌合重组蛋白包含来自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。

5.权利要求1中的嵌合重组蛋白，其中所述嵌合重组蛋白具有SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：249中显示的一级氨基酸序列。

6.权利要求1中的嵌合重组蛋白，其中所述OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。

7.在需要的个体中引发针对疏螺旋体的免疫应答的方法，包括下述步骤：

给所述个体施用包含来自两种或多种类型的外表面蛋白C(OspC)的环5区或α螺旋5区或这二者的表位的嵌合重组蛋白。

8.权利要求7中的方法，其中所述OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa，、B、K、N、C。

9.权利要求7中的方法，其中所述嵌合重组蛋白包含来自A、B、K和D型OspC的表位。

10.权利要求7中的方法，其中所述嵌合重组蛋白包含来自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。

11.权利要求7中的方法，其中所述嵌合重组蛋白具有SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：249中显示的一级氨基酸序列。

12.权利要求7中的方法，其中所述OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。

13.确定个体是否已经暴露于或感染了疏螺旋体、或这二者的方法，包括下列步骤：

从所述个体获得生物学样品；

将所述生物学样品暴露于至少一种重组嵌合蛋白，其中所述至少一种嵌合蛋白包含来自两种或多种类型的外表面蛋白C(OspC)的环5区或α螺旋5区或这二者的表位；以及

确定在所述生物学样品中抗体是否与所述至少一种嵌合蛋白结合，其中抗体结合的检测指示了以前暴露于或感染了疏螺旋体。

14.权利要求13中的方法，其中所述OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa，、B、K、N和C。

15.权利要求13中的方法，其中所述嵌合重组蛋白包含来自A、B、K和D型OspC的表位。

16.权利要求13中的方法，其中所述嵌合重组蛋白包含来自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。

17.权利要求13中的方法，其中所述嵌合重组蛋白具有SEQ IDNO：75或SEQ ID NO：249中显示的一级氨基酸序列。

18.权利要求13中的方法，其中所述OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。

19.针对含有来自两种或多种类型的外表面蛋白C(OspC)的环5区或α螺旋5区或这二者的表位的嵌合重组蛋白的抗体。

20.权利要求19中的抗体，其中所述OspC类型选自Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa，、B、K、N和C。

21.权利要求19中的抗体，其中所述嵌合重组蛋白包含来自A、B、K和D型OspC的表位。

22.权利要求19中的抗体，其中所述嵌合重组蛋白包含来自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。

23.权利要求19中的抗体，其中所述嵌合重组蛋白具有SEQ IDNO：75或SEQ ID NO：249中显示的一级氨基酸序列。

24.权利要求19中的抗体，其中所述OspC类型与侵袭性疏螺旋体感染有关。

25.权利要求19中的抗体，其中所述抗体是多克隆的。

26.权利要求19中的抗体，其中所述抗体是单克隆的。

27.权利要求19中的抗体，其中所述抗体对于疏螺旋体属螺旋体来说是杀菌性的。

28.嵌合重组蛋白的免疫原性混合物，其中所述混合物中的每种嵌合重组蛋白包含来自两种或多种类型的外表面蛋白C(OspC)的环5区或α螺旋5区或这二者的表位。