CN103304665A - 一种抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体及其应用，所述的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。实验表明：本发明提供的抗NT-proBNP单克隆抗体可与NT-proBNP高度特异性结合，可用于制备NT-proBNP检测试剂盒。尤其是，应用本发明提供的单克隆抗体和胶体金免疫层析法制备的NT-proBNP检测试剂盒，可以快速、简捷检测人血清、血浆或全血标本中的NT-proBNP，且具有较高的灵敏度、准确性、批内不精密度和批间不精密度，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对心力衰竭的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
氨基末端脑利钠肽前体（简称为NT-proBNP）来自心室肌细胞，最初合成的为前脑利钠肽原（pre-proBNP），是由134个氨基酸组成的多肽链。前脑利钠肽原在心肌细胞中裂解为脑利钠肽前体（proBNP，108个氨基酸）和信号肽（26个氨基酸）。脑利钠肽前体(proBNP)进入血液后裂解为具有活性的BNP和NT-proBNP，理论上两者是1：1的关系。
BNP作用于参与钠调节、维持血压动态平衡的组织，促进尿钠排泄和利尿；扩张血管；拮抗肾素、血管紧张素、醛固酮系统的作用。BNP的产生和分泌可能为心脏的一种良性应激或者代偿机制，用来调节心脏的功能，BNP由于心室受到牵拉刺激或者张力升高而分泌，能够早期反映整体甚至局部心脏结构改变导致的功能变化。引起循环BNP和NT-proBNP水平升高的主要病理生理机制是左室整体收缩或舒张功能受损而使左室壁受到的牵拉力增加所致。此外，BNP和NT-proBNP水平升高不仅反映了室壁张力的增加，也是心肌缺血的直接后果，所以临床上将NT-proBNP作为理想的心衰标志物。
NT-proBNP的检测对心脑血管疾病的诊断及治疗有着重要的价值。可在无症状的患者中对早期/轻度心脏功能不全进行早期筛查；对心源性及非心源性呼吸困难的患者进行鉴别诊断；是心衰病人的诊断及临床预后最敏感的预测指标，还可以判断心衰患者对药物治疗的反应。
采用胶体金标记技术的免疫层析法具有方便、快捷、试剂易于保存等优点，已被广泛应用于免疫诊断的各个领域，但胶体金免疫层析法的应用关键要解决其特异性、灵敏度及准确性的问题，这都需要选用具有高度特异性和高亲和力的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种高度特异性的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体（简写为抗NT-proBNP单克隆抗体）及其在胶体金免疫层析法制备的氨基末端脑利钠肽前体（简写为NT-proBNP）检测试剂盒中的应用，以实现利用胶体金免疫层析法能快速、准确、高灵敏度检测NT-proBNP的目的。
本发明所提供的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，其特征在于：其轻链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。
作为一种优选方案，所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体由保藏号为：CCTCCNo.C2012194的杂交瘤细胞株8C7E11分泌产生。
作为一种优选方案，所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体属于IgG亚型。
作为一种优选方案，所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体的腹水效价为1：106。
本发明提供的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体不仅可以与NT-proBNP高度特异性结合，而且灵敏度高、稳定性好，可通过本领域技术人员所公知的方法制备成NT-proBNP的各种检测试剂盒。尤其是，应用本发明提供的抗NT-proBNP单克隆抗体和胶体金免疫层析法制备的NT-proBNP检测试剂盒，可以快速、简捷检测人血清、血浆或全血标本中的NT-proBNP，不仅使检测灵敏度达到93.16%，检测特异度达到93.59%，检测准确度达到93.41%，而且能使Kappa检验值达到0.866，远大于0.75，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对心力衰竭的辅助诊断。
附图说明
图1为5’RACE产物电泳图，其中1号为轻链结果，2号为重链结果，M为DNA Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：抗NT-proBNP单克隆抗体的制备
一、动物免疫
取雌性6～8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫用浓度为5mg/mL的NT-proBNP纯品，经腹腔和四肢腋下注射，总量1mL；每隔2周以同样的方法加强免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，从经三次免疫后小鼠眼球采血，离心分离血清，用ELISA法选出效价高的小鼠准备融合。
二、杂交瘤细胞系的制备
将完成免疫过程的小鼠准备取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，在融合前一天制备饲养细胞；融合时无菌下取小鼠脾细胞，与SP2/0细胞以10：1混合，以50%PEG介导融合，离心后重悬于HAT选择性培养基中，接种于含有饲养细胞的96微孔板中，置37℃、5%CO2培养箱培养，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培养液半量换液，两周后换用HT培养液。
观察杂交瘤细胞的生长情况，等克隆长至孔底面积的1/3～1/2，取培养上清液，用ELISA法进行抗体检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100%，选出高分泌特异性细胞株（即ELISA效价在1：106以上的阳性克隆），此时可将阳性克隆细胞进一步扩大培养。将杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，定期收集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。
三、单克隆抗体的制备和纯化
选用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡，1～2周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞株8C7E11【该细胞株已在设置于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期为：2013年1月18日，保藏号为：CCTCC NO.C2012194】，每只腹腔注射1mL。接种2周左右的小鼠腹部可见明显膨大，以颈椎脱臼法处死后打开腹腔，取出腹水。离心后吸取上清，用硫酸铵沉淀后，再用DEAE离子交换柱纯化，用pH5.6、20mM的醋酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液。再用亲和层析纯化法（蛋白A-Sepharose4B柱）继续纯化，上样条件：样品和蛋白A-Sepharose4B柱用pH8.2、1.0M的Tris缓冲液平衡后再上样。洗脱条件：用pH3.0、50mM的甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，即得特异的单克隆抗体。
四、单克隆抗体的腹水效价及鉴定
取小鼠腹水抗体，用筛选抗体的方法测定效价为1：106，亚型鉴定为IgG型。
实施例2：单克隆抗体的特异性鉴定
材料：A型钠尿肽，B型钠尿肽，肌钙蛋白I。
方法：采用ELISA法检测，以NT-proBNP为阳性对照。
结果：显示A型钠尿肽、B型钠尿肽、肌钙蛋白I均为阴性。
说明：本发明提供的抗NT-proBNP单克隆抗体对NT-proBNP有高度特异性。
实施例3：单克隆抗体的可变区序列的克隆与测序
采用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术，从分泌抗NT-proBNP单克隆抗体的杂交瘤细胞株8C7E11中克隆功能性抗体的可变区序列。其步骤可简述为：由一个反义的基因特异性引物（GSP1）来合成cDNA第一链，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal dioxynucleotidy transferase，TdT）在cDNA的3’末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式基因特异性引物（GSP2）和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cDNA。具体实验过程如下：
材料：
-由杂交瘤细胞株8C7E11分泌产生的抗NT-proBNP单克隆抗体；
-大肠杆菌Top10菌株；
-pGEM-T Easy克隆载体；
引物设计：
根据免疫球蛋白基因的特点，设计两套分别对应Ig和Kappa恒定区的基因特异性引物GSP1、GSP2，引物序列如下：
pRace-H-GSP1：GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTTCC
pRace-H-GSP2：GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC
pRace-K-GSP1：ACTTGACATTGATGTCTTTG
pRace-K-GSP2：CACGACTGAGGCACCTCCAGATG；
克隆过程：
A、第一链合成
以总RNA为模板，以GSP1为引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。具体步骤如下：
1）在一个0.5mL的微量离心管中加入一下组分：
GSP1 2.5mL
总RNA 1～5μg
补充经DEPC处理的水至总体积为15.5μL，混匀。
2）70℃变性10min，冰浴1min，短暂离心后依次加入以下组分：
3）混匀，短暂离心后置42℃1min。
4）在反应体系中加入1μL SuperScript TMII RT（Life Science公司），轻轻混匀后置42℃反应50min。
5）反转录结束后置70℃、15min以终止反应。
6）离心10～20秒后置于37℃。
7）加入1μL RNase mix，轻轻混匀后置于37℃反应30min。
8）将反应管取出置冰上备用。
B、DNA纯化
使用QIAGEN公司QIAquick PCR纯化试剂盒。
1）加5倍体积于反转录体系的PB缓冲液于反转录反应管中，混匀。
2）将QIAquick离心柱置于2mL收集管中，把样品加入离心柱，13000rpm离心60秒。
3）弃去液体，将离心柱放回原来的收集管中，加入0.75mL PE缓冲液于QIAquick离心柱，13000rpm离心60秒。
4）弃去液体，将QIAquick离心柱放回原来的收集管，13000rpm离心60秒。
5）将QIAquick离心柱置于一干净的1.5mL离心管，在QIAquick膜中央加入30μL EB缓冲液，静置1min后，13000rpm离心60秒。
C、cDNA加尾
1）在一个0.5mL的微量离心管中依次加入一下组分：
2）将反应管置94℃维持3min后，冰浴1min，短暂离心后置冰上。
3）加入1μL TdT，混匀后置37℃反应10min。
4）将反应管置于65℃中作用30min终止反应，离心后置于冰上备用。
D、PCR
在一个0.2mL的PCR薄壁管中加入以下组分：
混匀后置PCR仪中进行反应。
E、PCR产物电泳纯化
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示：其中1号为轻链结果，在约460bp处有一特异性条带；2号为重链结果，在约490bp处有一特异性条带。
F、使用Promega公司的pGEM-T Easy试剂盒，将PCR产物克隆到pGEM-T Esey载体，转化大肠杆菌Top10（Life Science公司）具体过程为：
1）轻链和重链PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，分别回收460bp和490bp的条带，最终定容于20μL体积的灭菌水中；
2）在一个0.5mL的微量离心管中，加入以下组分：
混匀后室温连接2小时或者4℃连接16小时以上。
3）转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37℃培养12小时左右。
G、测定所克隆的PCR产物的碱基序列
各选取至少5个质粒测定其所含的PCR产物的碱基序列。
H、根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架，确定相应可变区的氨基酸序列，其轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。根据免疫球蛋白基因的特点验证其为抗体序列。
实施例4：本发明所述的抗NT-proBNP单克隆抗体的应用
采用本领域技术人员公知的胶体金免疫层析法，制作NT-proBNP快速检测试剂盒，在体外定量检测人血清、血浆或全血标本的NT-proBNP，用于临床上辅助诊断心力衰竭。
一、检测原理
采用胶体金标记的免疫层析技术，标本中的NT-proBNP与胶体金标记物结合，然后沿硝酸纤维素膜层析至检测区，与检测区所包被的抗NT-proBNP单克隆抗体结合，在检测区形成色带，通过特定的免疫层析检测仪对此色带信号的强度进行分析，根据预置的分析曲线，计算出标本中NT-proBNP的浓度。
二、检测方法
A、标本收集及准备
1）采用标准实验室程序收集血清、血浆或全血标本；
2）避免热灭活标本，以防止出现溶血或蛋白变性；
3）全血标本采集：使用肝素或EDTA为抗凝剂，收集血液标本；
4）血浆标本采集：将抗凝全血标本离心以获得血浆标本；
5）血清标本采集：将未使用抗凝管采集的全血标本离心以获得血清标本；
6）全血标本应在4小时内检测；血浆或血清标本如果不能马上用于检测，置2～8℃保存24小时，如果不能在24小时内进行检测，需置-20℃或更低温度下保存。【注意：标本在检测前需平衡至室温。】
B、操作步骤
1）实验前将所需物质及标本平衡至室温，然后撕开铝箔袋，从中取出检测卡，放在水平的表面上；
2）用移液器加80μL标本于样品孔中；
3）将检测卡置于免疫层析检测仪中，在反应进行15分钟时，分析计算检测结果。
三、结果判定
基于预设的标准曲线，免疫层析检测仪根据所测定点检测区色点信号强度，计算标本中NT-proBNP的浓度。
当标本中NT-proBNP的浓度低于300pg/mL时，排除心衰可能；当标本中NT-proBNP浓度高于300pg/mL时，结合临床症状及其它检测结果辅助诊断心力衰竭，NT-proBNP浓度与心衰的严重程度呈正比。
四、临床应用结果
为评价本发明提供的NT-proBNP检测试剂盒（胶体金免疫层析法）在临床上应用于心力衰竭辅助诊断的适用性与准确性，在上海中医药大学附属普陀医院核医学科和中国人民武装警察部队浙江省总队医院检验科两个地点对此试剂盒进行了临床应用研究。从临床中选出273例样本作为研究对象。入选对象中病例组为具有心衰症状或病征的病人，对照组为确定无心衰症状或病征的就诊患者。采用德国罗氏公司的NT-proBNP检测试剂盒（电化学发光法）作为参比产品。比较本发明提供的NT-proBNP检测试剂盒的检测结果与参比产品的检测结果的差异性，并进行统计分析。
临床试验结果表明：本发明提供的NT-proBNP检测试剂盒对NT-proBNP检测具有较高的灵敏度、准确性、批内不精密度和批间不精密度；本发明提供的NT-PROBNP检测试剂盒在医学决定水平预期偏倚的可信区间小于允许误差的限值，可被临床接受；且本发明提供的NT-proBNP检测试剂盒与对比产品的检测结果无统计学差异且显著相关（P=0.236，r=0.976），诊断一致性好（Kappa=0.866）；而且本发明提供的NT-proBNP检测试剂盒在辅助诊断心力衰竭时，检测灵敏度达到93.16%，检测特异度达到93.59%，检测准确度达到93.41%。
综上所述可见：本发明提供的NT-proBNP检测试剂盒具有快速、便捷的特征，并且在定量分析性能上与大型检测设备一致性好，具有广阔的临床应用与推广前景。
Claims (6)
1.一种抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，其特征在于：其轻链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，其特征在于：所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体由保藏号为CCTCC No.C2012194的杂交瘤细胞株8C7E11分泌产生。
3.如权利要求1所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，其特征在于：所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体属于IgG亚型。
4.如权利要求1所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，其特征在于：所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体的腹水效价为1：106。
5.一种应用权利要求1至4中任一项所述的抗氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体制备的氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒。
6.如权利要求5所述的氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒是胶体金免疫层析法检测试剂盒。
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