CN103290144A - 一种借助rt-lamp检测人感染h7n9亚型禽流感病毒的引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测病毒的引物及应用，尤其是一种检测禽流感病毒的引物及应用，属于医学技术领域。本发明利用RT-LAMP技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，设计并合成针对人感染H7N9亚型禽流感病毒血凝素（H7）和神经氨酸酶（N9）基因的亚型特异性的RT-LAMP引物和环引物。缩短反应时间，实现高度特异、快速的检测目的核酸。另外，通过在反应体系中加入RT-LAMP目测荧光染料，使其反应结果可以通过目测进行判读，简单方便。其优点是：检测敏感性和特异性极高，反应时间短、操作简便、对仪器设备无特殊要求。适合对人感染H7N9亚型禽流感病毒进行快速特异的检测和早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测病毒的引物及应用，尤其是一种检测禽流感病毒的引物及应用，属于医学技术领域。
背景技术
自2013年2月以来，上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例。患者病情发展迅速，多在5-7天出现重症肺炎可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、感染性休克，甚至多器官功能障碍，病死率极高。病原学研究表明其病原体为人感染H7N9亚型禽流感病毒。不同于禽类中流行的H7N9亚型病毒，人感染H7N9亚型禽流感病毒基因组内部发生了重配，使其获得了感染人的属性。这也是H7N9亚型禽流感病毒感染人的首次报道。
由于该病病情凶险，进程快，对该病的早发现、早诊断已经成为提高治愈率，降低病死率的关键。而针对人感染H7N9亚型禽流感病毒的病原学检测是该病早发现和早诊断主要依据。目前，禽流感病毒的主要检测方法包括病毒分离、病毒抗原和基因检测以及血清学检查三个方面。其中，病毒分离耗时长，技术要求高，不利于快速诊断；血清学检查只能用于回顾性诊断；病毒抗原检测耗时、费力；在病毒基因检测方面，WHO推荐的禽流感H7N9实时荧光定量PCR检测体系，目前已经成为人感染H7N9亚型禽流感病原学检测的主要方法。采用实时荧光定量PCR的方法检测禽流感可以做到高通量、快速准确，但是，该系统需要特殊仪器，且检测成本较高，不适宜在基层医疗卫生单位开展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提出一种借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物及应用，可快速检测人感染H7N9亚型禽流感病毒。
本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物，包括简并引物和环引物，所述简并引物和环引物是依据现有核酸数据库中人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段序列和N9基因节段序列分别进行同源性比对，根据保守序列，针对各基因设计而得，所述H7基因简并引物的序列为：
H7-F3TGTCTGTTATCCTGGGAAAT
H7-B3AGCATTATCTGTGTTTGACAG
H7-FIP GTATGTGAATCCCATTGCTTCCTTGGTGAATGAAGAAGCTCTGAGG
H7-BIP GGAATAAGAACTAATGGARCAACCAAGCCATTTCATTTCTGCATAG；
所述H7基因环引物的序列为：
H7-LF CCGCCTGATTCTCTGAGWATTT
H7-LB GCATGTAGGAGATCAGGATCTTCA；
所述N9基因简并引物的序列为：
N9-F3CGAGGTCTGGATACGAGA
N9-B3TTATCYTCCTTGGGTCTTCC
N9-FIP AGCGTTTARTACAATTGTCTGACCTTTAAAAGTGCCAAATGCATTGA
N9-BIP CTGGAGTGGTTACAGTGGATCTYTCCACATAAAAACACGCTC；
所述N9基因环引物的序列为：
N9-LF TGAATGGGCTTTGATCTATCATCTG
N9-LB TGGACTATTGGGCTGARGGGGAC。
本发明借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，包括以下步骤：
步骤一：针对人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段序列，设计并合成包含T7启动子的引物,对扩增的目的基因片段进行体外转录，转录产物纯化和定量后，将其稀释为106-100拷贝/μl，即得人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段的标准RNA模板，作为对照，用于比较本发明方法的敏感性；
步骤二：将人感染H7N9亚型禽流感病毒的HA和NA基因分别进行H7亚型RT-LAMP反应和N9亚型RT-LAMP反应，在所述RT-LAMP反应体系中加入目测荧光染料，于反应结束后依据目测结果进行结果判读。
进一步地，所述步骤一中，H7基因T7启动子引物的序列为：
HA:CCTGGTATTCGCTCTGATTGC
HA-T7:ACTCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGGCACCGCATGTTTCCATTCT；
N9基因T7启动子引物的序列为：
NA:TCTATGCACTTCAGCCACTG
NA-T7:ACTCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGCCATCAGGCCAGTTCCATTG。
所述H7亚型和N9亚型的RT-LAMP反应条件均为60～65℃，30～60min。
在所述步骤二中，H7亚型的RT-LAMP反应体系为25μl，反应体系中含有H7-FIP引物40～80pmol，H7-BIP引物40～80pmol，H7-F3引物5～10pmol，H7-B3引物5～10pmol，H7-LF引物20～40pmol，H7-LB引物20～40pmol，硫酸镁200nmol，甜菜碱20μmol，dNTPs每种35nmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，10×Bst缓冲液2.5μl，荧光检测试剂1μl，再加入待检测样品的RNA1～5μl，继续加入经过DEPC处理的灭菌双蒸水至总体积25μl；N9亚型的RT-LAMP反应体系为25μl，反应体系中含有N9-FIP引物40～80pmol，N9-BIP引物40～80pmol，N9-F3引物5～10pmol，N9-B3引物5～10pmol，N9-LF引物20～40pmol，N9-LB引物20～40pmol，硫酸镁200nmol，甜菜碱20μmol，dNTPs每种35nmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，10×Bst缓冲液2.5μl，荧光检测试剂1μl，再加入待检测样品的RNA1～5μl，继续加入经过DEPC处理的灭菌双蒸水至总体积25μl。
其中，所述dNTPs包括dATP,dCTP,dGTP和dTTP。所述荧光检测试剂是LMP221。
使用时，人感染H7N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测通过目测进行检测结果判读，阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原色不变。
环介导恒温扩增技术(loop mediated isothermalamplification,LAMP)是日本学者Notomi发明的一种新式恒温核酸扩增技术。
本发明利用RT-LAMP技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，设计并合成针对人感染H7N9亚型禽流感病毒血凝素（H7）和神经氨酸酶（N9）基因的亚型特异性的RT-LAMP引物和环引物。通过能高度特异识别靶序列上位点的4条引物及一种有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），能在恒温条件下（60-65℃左右）高效（30-60min）扩增目的核酸片段。同时针对H7基因和N9基因分别加入一组亚型特异的环引物，进一步缩短反应时间，实现高度特异、快速的检测目的核酸。另外，通过在反应体系中加入RT-LAMP目测荧光染料，使其反应结果可以通过目测进行判读，简单方便。其优点是：检测敏感性和特异性极高，反应时间短、操作简便、对仪器设备无特殊要求。适合对人感染H7N9亚型禽流感病毒进行快速特异的检测和早期诊断；并为开发其它各种亚型流感病毒的快速高效检测方法提供依据。
附图说明
图1为RT-LAMP敏感性检测结果。图中，A为对106-100拷贝/μl的H7基因标准模板用所述方法对H7亚型进行检测的目测结果；B为对106-100拷贝/μl的H7基因标准模板用所述方法对N9亚型进行检测的目测结果。
图2为WHO所公布的H7N9检测Real-Time PCR体系对106-100拷贝/μl的H7基因标准模板进行检测扩增图谱。
图3为WHO所公布的H7N9检测Real-Time PCR体系对106-100拷贝/μl的H7基因标准模板进行检测扩增标准曲线。
图4为WHO所公布的H7N9检测Real-Time PCR体系对106-100拷贝/μl的N9基因标准模板进行检测扩增图谱。
图5为WHO所公布的H7N9检测Real-Time PCR体系对106-100拷贝/μl的N9基因标准模板进行检测扩增标准曲线。
图6为RT-LAMP特异性检测结果。图中，A为用所述方法对H7N9、H5N1、H1N1、H3N2亚型流感标本和乙型流感标本进行H7亚型检测的目测结果；B为用所述方法对H7N9、H5N1、H1N1、H3N2亚型流感标本和乙型流感标本进行N9亚型检测的目测结果。
具体实施方式
实施例
本实施例中所用试剂均为本领域常用试剂，可由市面购买。
本实施例按以下方法制备引物及使用引物：
依据现有核酸数据库中人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段序列和N9基因节段序列分别进行同源性比对，根据保守序列，针对各基因设计得到人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物，包括简并引物和环引物，其中，H7基因简并引物的序列为：
H7-F3TGTCTGTTATCCTGGGAAAT
H7-B3AGCATTATCTGTGTTTGACAG
H7-FIP GTATGTGAATCCCATTGCTTCCTTGGTGAATGAAGAAGCTCTGAGG
H7-BIP GGAATAAGAACTAATGGARCAACCAAGCCATTTCATTTCTGCATAG；H7基因环引物的序列为：
H7-LF CCGCCTGATTCTCTGAGWATTT
H7-LB GCATGTAGGAGATCAGGATCTTCA；
N9基因简并引物的序列为：
N9-F3CGAGGTCTGGATACGAGA
N9-B3TTATCYTCCTTGGGTCTTCC
N9-FIP AGCGTTTARTACAATTGTCTGACCTTTAAAAGTGCCAAATGCATTGA
N9-BIP CTGGAGTGGTTACAGTGGATCTYTCCACATAAAAACACGCTC；
N9基因环引物的序列为：
N9-LF TGAATGGGCTTTGATCTATCATCTG
N9-LB TGGACTATTGGGCTGARGGGGAC。
上述引物的应用，按以下步骤进行：
步骤一：针对人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段序列，设计并合成包含T7启动子的引物，该引物序列委托TaKaRa公司制备，序列如下：H7基因T7启动子引物的序列为：
HA:CCTGGTATTCGCTCTGATTGC
HA-T7:ACTCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGGCACCGCATGTTTCCATTCT；
N9基因T7启动子引物的序列为：
NA:TCTATGCACTTCAGCCACTG
NA-T7:ACTCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGCCATCAGGCCAGTTCCATTG。用上述包含T7启动子的引物对扩增的目的基因片段进行体外转录，转录产物纯化和定量后，将其稀释为106-100拷贝/μl，即得人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段的标准RNA模板，作为对照，用于比较本发明方法的敏感性；
步骤二：将人感染H7N9亚型禽流感病毒的HA和NA基因分别进行H7亚型RT-LAMP反应和N9亚型RT-LAMP反应，H7亚型的RT-LAMP反应体系为25μl，反应体系中含有H7-FIP引物40～80pmol，H7-BIP引物40～80pmol，H7-F3引物5～10pmol，H7-B3引物5～10pmol，H7-LF引物20～40pmol，H7-LB引物20～40pmol，硫酸镁200nmol，甜菜碱20μmol，dNTPs（包括dATP,dCTP,dGTP和dTTP）每种35nmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，10×Bst缓冲液2.5μl，荧光检测试剂（LMP221，EIKEN）1μl，再加入待检测样品的RNA1～5μl，继续加入经过DEPC处理的灭菌双蒸水至总体积25μl；N9亚型的RT-LAMP反应体系为25μl，反应体系中含有N9-FIP引物40～80pmol，N9-BIP引物40～80pmol，N9-F3引物5～10pmol，N9-B3引物5～10pmol，N9-LF引物20～40pmol，N9-LB引物20～40pmol，硫酸镁200nmol，甜菜碱20μmol，dNTPs每种35nmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，10×Bst缓冲液2.5μl，荧光检测试剂1μl，再加入待检测样品的RNA1～5μl，继续加入经过DEPC处理的灭菌双蒸水至总体积25μl，反应条件均为63℃，30min。反应结束后依据目测结果进行结果判读，阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原色不变。
1.敏感性和特异性分析
利用本实施例的步骤对临床疑似标本进行检测，并与Real-TimePCR的检测结果进行比较，具体检测结果如下：
（1）本实施例检测H7亚型与N9亚型的敏感性测定
对已知拷贝数的RNA模板用本实施例的方法检测并与WHO所公布的H7N9检测Real-Time PCR体系相比，结果如图1，图1中A为对106-100拷贝/μl的H7基因标准模板用本实施例的方法进行H7亚型检测的目测结果,B为对106-101拷贝/μl的H7基因标准模板用本实施例的方法进行N9亚型检测的目测结果。通过目测判读反应结果，本实施例对人感染H7N9亚型禽流感病毒H7亚型和N9亚型的检出限均为101拷贝/μl。其中本实施例的方法对H7亚型的检测敏感性与Real-Time PCR体系相同，而本实施例的方法对N9亚型的检测敏感性优于Real-Time PCR体系一个数量级，也达到101拷贝/μl（见图2～图5）。
（2）本实施例检测H7亚型与N9亚型的特异性测定
采用本实施例检测人感染H7N9、H5N1、H1N1、H3N2亚型流感标本和乙型流感标本，结果见图6，图6中A为本实施例对H7N9、H5N1、H1N1、H3N2亚型流感标本和乙型流感标本进行H7亚型检测的目测结果；B为本实施例对H7N9、H5N1、H1N1、H3N2亚型流感标本和乙型流感标本进行N9亚型检测的目测结果。通过目测判读反应结果，仅人感染H7N9亚型禽流感标本在H7亚型与N9亚型的检测中表现为阳性绿色荧光，其余亚型流感标本在H7亚型与N9亚型的检测中均表现为阴性原色不变，特异性高。
（3）本实施例检测人感染H7N9亚型禽流感临床疑似样本中的H7N9病毒，并与WHO所公布的H7N9检测Real-Time PCR体系的检测结果进行比较。收集临床疑似人感染H7N9亚型禽流感病人下呼吸道分泌物样本127份，将本实施例检测结果同Real-Time PCR的检测结果进行比较，见表1。其中H7亚型部分，本实施例与Real-Time PCR体系的结果完全相同；而N9亚型部分，Real-Time PCR体系对2份H7阳性的标本未检出，而本实施例全部检出，并与H7的结果完全一致。因此，所述本实施例对H7亚型的检测敏感性与Real-Time PCR体系相同，且对N9亚型的检测敏感性优于WHO所公布的Real-TimePCR体系。
表1人感染H7N9亚型禽流感病毒RT-LAMP法同Real-Time PCR的检测结果比较。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物，包括简并引物和环引物，所述简并引物和环引物是依据现有核酸数据库中人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段序列和N9基因节段序列分别进行同源性比对，根据保守序列，针对各基因设计而得，所述H7基因简并引物的序列为：
H7-F3TGTCTGTTATCCTGGGAAAT
H7-B3AGCATTATCTGTGTTTGACAG
H7-FIP GTATGTGAATCCCATTGCTTCCTTGGTGAATGAAGAAGCTCTGAGG
H7-BIP GGAATAAGAACTAATGGARCAACCAAGCCATTTCATTTCTGCATAG；所述H7基因环引物的序列为：
H7-LF CCGCCTGATTCTCTGAGWATTT
H7-LB GCATGTAGGAGATCAGGATCTTCA；
所述N9基因简并引物的序列为：
N9-F3CGAGGTCTGGATACGAGA
N9-B3TTATCYTCCTTGGGTCTTCC
N9-FIP AGCGTTTARTACAATTGTCTGACCTTTAAAAGTGCCAAATGCATTGA
N9-BIP CTGGAGTGGTTACAGTGGATCTYTCCACATAAAAACACGCTC；
所述N9基因环引物的序列为：
N9-LF TGAATGGGCTTTGATCTATCATCTG
N9-LB TGGACTATTGGGCTGARGGGGAC。
2.根据权利要求1所述借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，包括以下步骤：
步骤一：针对人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段序列，设计并合成包含T7启动子的引物,对扩增的目的基因片段进行体外转录，转录产物纯化和定量后，将其稀释为106-100拷贝/μl，即得人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段的标准RNA模板，作为对照；
步骤二：将人感染H7N9亚型禽流感病毒的HA和NA基因分别进行H7亚型RT-LAMP反应和N9亚型RT-LAMP反应，在所述RT-LAMP反应体系中加入目测荧光染料，于反应结束后依据目测结果进行结果判读。
3.根据权利要求2所述借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，其特征在于：所述步骤一中，
H7基因T7启动子引物的序列为：
HA:CCTGGTATTCGCTCTGATTGC
HA-T7:ACTCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGGCACCGCATGTTTCCATTCT；N9基因T7启动子引物的序列为：
NA:TCTATGCACTTCAGCCACTG
NA-T7:ACTCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGCCATCAGGCCAGTTCCATTG。
4.根据权利要求2所述借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，其特征在于：所述H7亚型和N9亚型的RT-LAMP反应条件均为60～65℃，30～60min。
5.根据权利要求2所述借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，其特征在于：所述步骤二中，H7亚型的RT-LAMP反应体系为25μl，反应体系中含有H7-FIP引物40～80pmol，H7-BIP引物40～80pmol，H7-F3引物5～10pmol，H7-B3引物5～10pmol，H7-LF引物20～40pmol，H7-LB引物20～40pmol，硫酸镁200nmol，甜菜碱20μmol，dNTPs每种35nmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，10×Bst缓冲液2.5μl，荧光检测试剂1μl，再加入待检测样品的RNA1～5μl，继续加入经过DEPC处理的灭菌双蒸水至总体积25μl；N9亚型的RT-LAMP反应体系为25μl，反应体系中含有N9-FIP引物40～80pmol，N9-BIP引物40～80pmol，N9-F3引物5～10pmol，N9-B3引物5～10pmol，N9-LF引物20～40pmol，N9-LB引物20～40pmol，硫酸镁200nmol，甜菜碱20μmol，dNTPs每种35nmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，10×Bst缓冲液2.5μl，荧光检测试剂1μl，再加入待检测样品的RNA1～5μl，继续加入经过DEPC处理的灭菌双蒸水至总体积25μl。
6.根据权利要求5所述借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，其特征在于：所述dNTPs包括dATP,dCTP,dGTP和dTTP。
7.根据权利要求5所述借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，其特征在于：所述荧光检测试剂是LMP221。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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