CN111197112B - 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒。本发明根据新型冠状病毒2019‑nCoV的ORF1ab基因、E基因、N基因、S基因和M基因设计特异性引物和探针，用于新冠病毒的鉴别检测。本发明检测2019‑nCoV的特异性引物/探针和试剂盒，灵敏度、精密度、准确度高，特异性好，稳定性好，检测所需模板量少，检测结果客观准确。五靶标设计能够更好的克服RNA病毒传代过程变异导致的假阴性，可有效提升阳性检出率，尽可能避免漏检的情况出现。具有较高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，更具体地，涉及一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒。
背景技术
核酸检验（RT-PCR）是新冠肺炎诊断的“金标准”。国家药品监督管理局应急审批首批7家企业的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒【一文读懂新型冠状病毒的核酸检测,国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心,中国医药报,2020-2-11第002版】，批准产品均基于新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b（Openreading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N）三个基因设计。
但病毒的进化非常迅速【Bartoszewicz J M, Seidel A, Renard B Y.Interpretable detection of novel human viruses from genome sequencing data[J]. BioRxiv, 2020.】，通过对序列的比对和文献检索，可以发现，ORF1ab基因已经发现相关SNP位点突变，编码结构蛋白的基因（如，S、E、M和N）在β冠状病毒属中表现高度保守性，但E基因与蝙蝠物种高度同源，针对E基因的引物探针很难或不能与这两个物种进行区分。
中国科学院主办的《国家科学评论》（National Science Review）于3月3日发表论文《关于SARS-CoV-2的起源和持续进化》（On the origin and continuing evolution ofSARS-CoV-2），中国科研团队最新发现显示：新冠病毒已于近期产生了149个突变点。一份发表在病毒学国际交流平台，由巴西Adolfo Lutz国家研究所、国家参考实验室，以及圣保罗大学、牛津大学热带医学研究所共同完成的题为《First report of COVID-19 in SouthAmerica》的研究首次分析了南美洲新冠病毒的基因序列，初步的遗传分析表明，这株巴西“Brazil/SPBR1/2020”病毒的基因组，跟中国此前公布的“Hu-1参考株”有3处不同，表示病毒在传播的过程中已经开始突变。
因此，目前核酸检测在应用中准确性遭到质疑。一些流行病学史、临床症状吻合，甚至CT显示肺部病毒感染的病患未能得到核酸“阳性”确诊。有学者认为现有核酸检测对于阳性病人，最高30～50%的阳性率。新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南中推荐检测ORF1ab和N基因，检测阳性判断要求两个基因均为阳性；在检测方法的局限性中强调不能排除因病毒变异导致的假阴性可能。Ai J W【Ai J W, Zhang H C, Xu T, et al.Optimizing diagnostic strategy for novel coronavirus pneumonia, a mµlti-center study in Eastern China[J]. medRxiv, 2020.】认为RT-PCR有15%假阴性率，建议设计RT-PCR时建议扩增超过1个基因靶标分析。
综上，在新冠疫情全面爆发的当下，亟需一种特异性强、准确率高用于检测新型冠状病毒的寡核苷酸组合物及其检测试剂盒和应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒，该试剂盒包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的特异性引物；
所述ORF1ab基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:1~2所示，所述N基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:4~5所示，所述E基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:7~8所示，所述S基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:10~11所示，所述M基因的特异性引物序列如SEQ IDNO:13~14所示。
优选地，所述试剂盒还包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的探针；所述ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID NO: 3所示，所述N基因的探针序列如SEQ ID NO: 6所示，所述E基因的探针序列如SEQ ID NO: 9所示，所述S基因的探针序列如SEQ ID NO: 12所示，所述M基因的探针序列如SEQ ID NO: 15所示。
优选地，所述试剂盒的反应体系为：
2×One Step RT-PCR Buffer III 10ul，
5U/ul Takara Ex Taq HS 0.4ul，
PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4ul，
10uM Forward Primer 0.4ul，
10uM Reverse Primer 0.4ul，
Probe 0.8ul，
Total RNA 2ul，
RNase Free dH2O 5.6ul。
优选地，所述试剂盒的反应条件为：55℃ 15min，1个循环；95℃ 30s，1个循环；95℃ 10s；55℃ 30s，10个循环；95℃ 10s；55℃ 30s，35个循环。
一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQ ID NO:1~2所示。
一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的RT-PCR探针，其序列如SEQ ID NO: 3所示。
一种检测新型冠状病毒N基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQ ID NO:4~5所示。
一种检测新型冠状病毒N基因的RT-PCR探针，其序列如SEQ ID NO: 6所示。
一种检测新型冠状病毒E基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQ ID NO:7~8所示。
一种检测新型冠状病毒E基因的RT-PCR探针，其序列如SEQ ID NO: 9所示。
一种检测新型冠状病毒S基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQ ID NO:10~11所示。
一种检测新型冠状病毒S基因的RT-PCR探针，其序列如SEQ ID NO: 12所示。
一种检测新型冠状病毒M基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQ ID NO:13~14所示。
一种检测新型冠状病毒M基因的RT-PCR探针，其序列如SEQ ID NO: 15所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明发现新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因、E基因、N基因、S基因和M基因具较强保守性，并根据该5基因特异性的设计引物和探针，用于新型冠状病毒的鉴别检测。本发明检测试剂盒除检测ORF1ab、E和N基因外，增加了表面糖蛋白（S）和膜糖蛋白（M）基因的检测，通过五靶标联合检测，综合判断，能够提高RT-PCR方法检测新型冠状病毒的准确性。
本发明检测新型冠状病毒2019-nCoV的特异性引物探针和试剂盒，灵敏度、精密度、准确度高，特异性好，稳定性好，检测所需模板量少，检测结果客观准确。五靶标（包括ORF1ab、N、E、S和M基因）设计能够更好的克服RNA病毒传代过程变异导致的假阴性，可有效提升阳性检出率，尽可能避免漏检的情况出现，具有较高的临床应用价值。
附图说明
图1为多种冠状病毒靶基因序列比对结果。其中，框内标示为引物、探针的结合位点。
图2为ORF1ab基因不同引物探针组合检测低值假病毒上机对比图。图A为引物探针组1，图B为引物探针组2。
图3为N基因不同引物探针组合检测低值假病毒上机对比图。图A为引物探针组1，图B为引物探针组2。
图4为E基因不同引物探针组合检测低值假病毒上机对比图。图A为引物探针组1，图B为引物探针组2。
图5为S基因不同引物探针组合检测低值假病毒上机对比图。图A为引物探针组1，图B为引物探针组2。
图6为M基因不同引物探针组合检测低值假病毒上机对比图。图A为引物探针组1，图B为引物探针组2。
图7为本发明引物和探针与CDC推荐的引物和探针对比结果。图A为中国CDC推荐的ORF1ab基因引物和探针的扩增曲线，图B为本发明引物和探针的扩增曲线，图C为中国CDC推荐的N基因引物和探针的扩增曲线，图D为美国CDC推荐的ORF1ab引物和探针的扩增曲线。1～5曲线分别依次对应包含新型冠状病毒5个相关基因（ORF1ab、N 、E、S和M）的假病毒RNA的上机检测结果。
图8为一步法混合体系的ORF1ab基因、N基因和E基因线性关系图。图A为ORF1ab基因的线性关系图，图B为N基因的线性关系图，图C为E基因的线性关系图。
图9为一步法混合体系的M基因和S基因线性关系图。图A为M基因的线性关系图，图B为S基因的线性关系图
图10为一步法不同反应条件的扩增曲线。图A为反应条件1的扩增曲线，图B为反应条件2的扩增曲线。
图11为阳性参考品检测结果。图A为混合体系1检测结果，图B为混合体系2检测结果。
图12为ORF1ab、E和N基因的检测限参考品的检测结果。图A为1.0×104copies/mL的假病毒的检测结果，图B为1.0×103copies/mL的假病毒的检测结果，图C为5.0×102copies/mL的假病毒的检测结果。
图13为S和M基因的检测限参考品的检测结果。图A为1.0×104copies/mL的假病毒的检测结果，图B为1.0×103copies/mL的假病毒的检测结果，图C为5.0×102copies/mL的假病毒的检测结果。
图14为分析特异性参考品的检测结果。图A为体系1的检测结果，图B为体系2的检测结果。
图15为本发明试剂盒检测人冠状病毒 HCoV特异性测试结果。图A为OC43病毒的检测结果，图B为HKU1病毒的检测结果，图C为229E病毒的检测结果，图D为NL63病毒的检测结果。
图16为本发明试剂盒检测SARS、MERS、甲型流感和乙型流感病毒特异性测试结果。图A为SAES病毒的检测结果，图B为MERS病毒的检测结果，图C为甲型流感H1N1病毒的检测结果，图D为乙型流感INFB病毒的检测结果。
图17为本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒特异性测试结果。图A为呼吸道合胞病毒RSV的检测结果，图B为人副流感病毒PV的检测结果，图C为腺病毒ADV的检测结果。
图18为本发明试剂盒检测人类基因组DNA、2019-nCoVRNA阴性样本特异性测试结果。图A为人类基因组DNA的检测结果，图B为阴性样本RNA的检测结果，
图19为体系1、体系2精密度参考品的检测结果。图A为体系1低值精密度检测结果，图B为体系2低值精密度检测结果，图C为体系1中值精密度检测结果，图D为体系2中值精密度检测结果。
图20为对照组、I1干扰物参考品的检测结果。图A为对照阳性RNA检测结果，图B为I1干扰物对体系1的检测结果，图C为I1干扰物对体系2的检测结果。
图21为I2和I3干扰物参考品的检测结果。图A为I2干扰物对体系1的检测结果，图B为I2干扰物对体系2的检测结果，图B为I3干扰物对体系1的检测结果，图D为I3干扰物对体系2的检测结果。
图22为本发明试剂盒检测ORF1ab、E、N基因准确度测试结果。图A为ORF1ab基因准确度测试结果，图B为N基因准确度测试结果，图C为E基因准确度测试结果。
图23为本发明试剂盒检测M、S基因准确度测试结果。图A为M基因准确度测试结果，图B为S基因准确度测试结果。
图24（NCRM)-GBW(E)091090（低浓度）梯度样本上机结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。
实施例1、特异性引物和探针的设计
引物探针的设计中，需要选择组内保守和组间特异的区域进行设计，从而避免漏检造成假阴性，或特异性不佳导致的假阳性。
本发明通过序列比对、文献检索发现，2019-nCoV结构基因S、M、ORF1ab、E和N基因具较强保守性，可作为用于新冠病毒的鉴别检测的靶区。
本实施例选择地方性人类冠状病毒（HKU1、OC43、229E 和NL63）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、蝙蝠冠状病毒（MG772933_Bat_bat_SL_CoVZC45）、SARS样病毒（MG772934_Bat_SARS_like_bat_SL_CoVZXC21）序列进行比对，结果如图1所示。开放读码框1ab（ORF1ab）、核壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）、表面糖蛋白（S）和膜糖蛋白（M）基因在不同病毒中具有特异性，可以用于设计特异性引物和探针序列。
应用Mega对Genbank中检索到的2019-nCoV病毒序列进行同源性比较，分别对应5个基因的序列确认保守区段设计两组用于靶基因区检测的引物和探针。将设计的引物探针组1和引物探针组2，分别结合其他组分配制成PCR反应体系，以低值假病毒（1.49×103copies/ml）为样本，进行检测，通过对检测CT值和扩增曲线线型进行对比，确认优选地的引物和探针组，作为检测新冠病毒2019-nCoV靶基因检测的特异性引物和探针序列。ORF1ab基因的引物探针组1：
ORF-F（SEQ ID NO:16）：5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’；
ORF-R（SEQ ID NO:17）：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’；
ORF-P（SEQ ID NO:18）：5’-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3’；
RF1ab基因的引物探针组2：
ORF-F（SEQ ID NO:1）：5’-CCATGTAGAAACATTTTACCCA-3’；
ORF-R（SEQ ID NO:2）：5’-TTCTAATAGCATTCTTTGCATTTT-3’；
ORF-P（SEQ ID NO:3）：5’-TTACAATCTAGTCAAGCGTGGCAACCG-3’。
ORF1ab基因探针的5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ1基团。
检测结果如图2所示，ORF1ab基因两组引物探针组的CT值相似-21，但引物探针组2表现进入平台期更早。故选择引物探针组2进行后续试验。
N基因的引物探针组1：
N-F（SEQ ID NO:4）：5’-TGCCACTAAAGCATACAATGTAA-3’；
N-R（SEQ ID NO:5）：5’-GTTCCTTGTCTGATTAGTTCCTG-3’；
N-P（SEQ ID NO:6）：5’-AGCTTTYGGCAGACGTGGTCCAG-3’；其中Y为兼并碱基，指C或T，下文中Y指代与本处相同，不再赘述。
N基因的引物探针组2：
N-F（SEQ ID NO:19）：5’-CGCAAATTGCACAATTT-3’；
N-R（SEQ ID NO:20）：5’-TTCTTTTTGTCCTTTTTAGG-3’；
N-P（SEQ ID NO:21）：5’-CGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATC-3’；
N基因探针的5’端标记CY5基团，3’端标记BHQ2基团。
检测结果如图3所示，N基因两组引物探针组的CT值相似-35，但引物探针组1表现进入平台期更早。故选择引物探针组1进行后续试验。
E基因的引物探针组1：
E-F（SEQ ID NO:7）：5’-TTGCTTTCGTGGTATTCTTGC-3’；
E-R（SEQ ID NO:8）：5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’；
E-P（SEQ ID NO:9）：5’-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3’；
E基因的引物探针组2：
E-F（SEQ ID NO:22）：5’-TACTGCTGCAATATTGTTAACG-3’；
E-R（SEQ ID NO:23）：5’ -ATCAGGAACTCTAGAAGAATTCAG-3’；
E-P（SEQ ID NO:24）：5’-TCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCT-3’；
E基因探针的5’端标记ROX基团，3’端标记BHQ2基团。
检测结果如图4所示，E基因两组引物探针组的CT值相似-19，但引物探针组1表现进入平台期更早。故选择引物探针组1进行后续试验。
S基因的引物探针组1：
S-F（SEQ ID NO:10）：5’-TTGTGCCCTTTTGGTGAAGT-3’；
S-R（SEQ ID NO:11）：5’-TAGGACAGAATAATCAGCAACACA-3’；
S-P（SEQ ID NO:12）：5’-CCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTG-3’；
S基因的引物探针组2：
S-F（SEQ ID NO:25）：5’-TTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCA-3’；
S-R（SEQ ID NO:26）：5’-TAACGCAGCCTGTAAAATCAT-3’；
S-P（SEQ ID NO:27）：5’-ACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGG-3’；
S基因探针的5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ1基团。
检测结果如图5所示，S基因引物探针组1的CT值为-20，引物探针组2的CT值为-22。故选择引物探针组1进行后续试验。
M基因的引物探针组1：
M-F（SEQ ID NO:28）：5’-TATTCTGACCAGACCGCTTCT-3’；
M-R（SEQ ID NO:29）：5’-TTTAGGCAGGTCCTTGATGTC-3’；
M-P（SEQ ID NO:30）：5’-CGGAGCTGTGATCCTTCGTGGACAT-3’；
M基因的引物探针组2：
M-F（SEQ ID NO:13）：5’-TGCYGTTTACAGAATAAATTGGA-3’；
M-R（SEQ ID NO:14）：5’-GAAGTAGCTGAGCCACATCAA-3’；
M-P（SEQ ID NO:15）：5’-CGGTGGAATTGCTATCGCAATGG-3’。
M基因探针的5’端标记ROX基团，3’端标记BHQ2基团。
检测结果如图6所示，M基因引物探针组1的CT值为-20，引物探针组2的CT值为-19。故选择引物探针组2进行后续试验。
实施例2、本发明特异性引物和探针与CDC推荐序列对比分析
为评价实施例1优选的引物和探针，使用CDC（疾病预防控制中心）推荐序列作为对比序列，进行检测评价。
中国CDC针对E基因、S基因和M基因没有推荐引物和探针序列，仅针对ORF1ab和N基因推荐了引物和探针序列，其推荐的针对ORF1ab和N区的引物和探针序列如下：
ORF1ab-F（SEQ ID NO:16）：5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’；
ORF1ab-R（SEQ ID NO:17）：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’；
ORF1ab-P（SEQ ID NO:18）：5’-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3’；
N-F（SEQ ID NO:31）：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；
N-R（SEQ ID NO:32）：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’；
N-P（SEQ ID NO:33）：5’-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3’。
美国CDC针对N基因、E基因、S基因和M基因没有推荐引物和探针序列，仅针对ORF1ab基因推荐了引物和探针序列，其推荐的引物和探针序列如下：
ORF1ab-F（SEQ ID NO:34）：5’-GGGAGCCTTGAATACACCAAAA-3’；
ORF1ab-R（SEQ ID NO:35）：5’-TGTAGCACGATTGCAGCATTG-3’；
ORF1ab-P（SEQ ID NO:36）：5’-AYCACATTGGCACCCGCAATCCTG-3’。
检测评价使用的反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer III 10ul，5U/ul的Takara Ex Taq HS 0.6ul，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4ul，10uM Primer 各0.4ul，10uM Probe 0.8ul，Total RNA 2ul，RNase Free dH2O 5.4ul。
检测评价使用的反应条件为：55℃ 15min，1个循环；95℃ 30s，1个循环；95℃10s；55℃ 30s，45个循环。
结果如图7所示，其中1～5曲线分别依次对应包含新型冠状病毒5个相关基因（ORF1ab、N 、E、S和M）的假病毒RNA的上机检测结果。假病毒的拷贝数在1.0×103copies/mL～1.0×107copies/mL。中国CDC推荐的ORF1ab的引物和探针荧光值低且曲线不佳，中国CDC和美国CDC推荐的N基因的引物和探针灵敏度和扩增曲线不佳。
实施例3、RT-PCR方法的优化试验
基于荧光RT-PCR的病毒RNA检测有两种方法，即先逆转录成cDNA后，再进行PCR的两步法，和在同一个体系中同时进行RT-PCR的一步法体系。两者各有优缺点。使用两步法体系，逆转录得到的cDNA易于保存；而一步法快速、简便、减少污染机会。对于多重PCR来说，需要考虑引物和探针间的干扰情况。
本发明对比了两种反应体系的检测效果，先评估单对引物探针的检测效果，再将合成序列按反应管进行组合测试。
本实施例中，两步法使用Takara RNA PCR Kit（RR019A）和Takara Ex TAQ HS（RR390L），按产品说明书操作。两步法的逆转录反应体系如表1所示。
表1 两步法的逆转录反应体系
逆转录上机程序：①42℃ 30min，1循环；②95℃ 5min，1循环；③5℃ 5min，1循环。
两步法的qPCR反应体系如表2所示。
表2 两步法的qPCR反应体系
qPCR程序：①95℃ 30s，1个循环；②95℃ 10s；55℃ 30s，45个循环【信号收集：55℃收集FAM、Cy5、ROX和HEX（或VIC）的信号】。
一步法使用Takara Primer Script one step RT-PCR Kit（RR064A），按产品说明书操作。一步法逆转录体系如表3所示。
表3 一步法逆转录体系
一步法上机程序：①55℃ 15min，1个循环；②95℃ 30s，1个循环；③95℃ 10s；55℃ 30s，45个循环【信号收集：55℃收集FAM、Cy5、ROX和HEX（或VIC）的信号】。
一步法的检测线性关系效果如图8和图9所示。其中，ORF1ab基因的荧光基团为FAM，斜率为-3.356，截距为34.722，相关系数为0.998，扩增效率为98.614%，线性关系式为y=-3.356x+116.527（R2=0.998）；N基因的荧光基团为CY5，斜率为-3.928，截距为38.636，相关系数为0.986，扩增效率为79.714%，线性关系式为y=-3.928x+151.762（R2=0.986）；E基因的荧光基团为ROX，斜率为-2.998，截距为34.439，相关系数为0.984，扩增效率为115.554%，线性关系式为y=-2.998x+103.248（R2=0.984）；M基因的荧光基团为ROX，斜率为-3.216，截距为37.082，相关系数为0.996，扩增效率为104.61%，线性关系式为y=-3.216x+119.256（R2=0.996）；S基因的荧光基团为FAM，斜率为-2.942，截距为34.832，相关系数为0.997，扩增效率为118.757%，线性关系式为y=-2.942x+102.476（R2=0.997）。
表4对比了两种检测体系的检测效果。单体系（针对单一靶标的检测）方面，一步法的体系在灵敏度上较两步法体系高，检测限是两步法体的2倍；但是两步法体系在逆转录步骤有样本的2倍的稀释关系，换算之后，两体系的扩增效率是相同的。
混合体系（针对五种靶标的检测）方面，由于混合体系中引物之间的相互干扰，一步法和两步法体系的扩增效率均有所下降，两步法的检测限降为103copies/ml，而一步法体系的检测限降为500copies/ml，进行换算之后，二者的扩增效率依然相同。
综合一步法体系的简便性和高灵敏度，优选一步法检测体系。试剂盒的检测限500copies/ml，检测灵敏度高；线性范围0.983～0.999；精密度的变异性数≤5%。
表4 两种体系检测结果对比
实施例4、RT-PCR反应条件优化试验
本实施例进一步优化了五靶标联检体系一步法的反应条件。
上机程序（反应条件）1（45循环）：①55℃ 15min，1个循环；②95℃ 30s，1个循环；③95℃ 10s；55℃ 30s，45个循环【信号收集：55℃收集FAM、Cy5、ROX和HEX（或VIC）的信号】。
上机程序2（10+35循环）：①55℃ 15min，1个循环；②95℃ 30s，1个循环；③95℃10s；55℃ 30s，10个循环；④95℃ 10s；55℃ 30s，35个循环【信号收集：55℃收集FAM、Cy5、ROX和HEX（或VIC）的信号】。
结果如图10所示。上机程序1（图A）和上机程序2（图B）对扩增体系的灵敏度基本上没有影响，只是对低浓度的扩增曲线会有影响，使用上机程序2（10+35循环）的低浓度样本的扩增曲线会更加挺拔，更S型。因此选择上机程序2作后续试验。
实施例5、五靶标联检试剂盒
本发明用于新型冠状病毒（2019-nCoV）检测的五靶标联检试剂盒，采用多重Taqman荧光探针技术，选取2019 新型冠状病毒（2019-nCoV）开放读码框1ab（ORF1ab）、核壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）、表面糖蛋白（S）和膜糖蛋白（M）基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针；选取核糖核酸酶P（RNase P）基因作为内标，设计特异性的引物和荧光探针如下。
Rnase P-F（SEQ ID NO：37）：5’- AGATTTGGACCTGCGAGC-3’；
Rnase P-RSEQ ID NO：38）：5’-AACAACTGAATAGCCAAGGTG-3’；
Rnase P-PSEQ ID NO39：）5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’。该探针5’有HEX基团，3’有BHQ1基团。
本发明试剂盒包括：2019-nCoV反应液A、2019-nCoV反应液B、2019-nCoV反应液C和2019-nCoV阴性质控品、2019-nCoV阳性质控品。其中，ORF1ab、N和E基因特异引物和探针在反应液A中，S和M基因特异引物和探针在反应液B中。各探针和引物的浓度为10-15pmol，优选12 pmol。此外，反应液A和反应液B中还含有缓冲液和dNTPs。反应液C为酶液，如mMLV酶、HS-Taq酶、RNasin、UDG酶等。
为了验证本发明试剂盒的灵敏度、特异性、精密度、干扰因素、准确度，通过全自动荧光PCR检测仪的4个通道同时检测上述4种荧光信号（见表5）。
表5 检测通道及其检测基因对应表
通过人工质粒和高浓度假病毒稀释梯度评估检测性能，通过性能评估标准盘（来源于广州邦德盛）评价序列/体系特异性。新型冠状病毒核糖核酸（COVID-19 RNA)液体系列性能评估标准盘包含阳性参考品、检测限参考品、分析特异性参考品、精密度参考品和干扰物参考品。
阳性参考品P1~P10，是由拷贝数不同的包含新型冠状病毒5个相关基因（ORF1ab、N、E、S和M）的假病毒构成，拷贝数在1.0×103copies/mL～1.0×106copies/mL。
检测限参考品L1~L3，是由拷贝数不同的包含新型冠状病毒5个相关基因（ORF1ab、N 、E、S和M）的假病毒构成，拷贝数分别为1.0×104 copies/mL、1.0×103 copies/mL和5.0×102 copies/mL。
分析特异性参考品N1~N20，是由含人冠状病毒 HCoV-OC43 RNA阳性、含人冠状病毒 HCoV-HKU1 RNA阳性、含人冠状病毒 HCoV-229E RNA阳性、含人冠状病毒HCoV-NL63 RNA阳性、含新型冠状病毒SARS RNA阳性、含中东呼吸综合征症状病毒MERS RNA阳性、含甲型HIN1流感病毒HIN1 RNA阳性、含乙型流感病毒INFB RNA阳性、含呼吸道合胞病毒A+B型阳性、含人副流感病毒阳性、含腺病毒阳性、含肠道病毒阳性、含肺炎支原体阳性、含EB病毒阳性、含人巨细胞病毒阳性、含结核分枝杆菌阳性、含人类基因组DNA、含人类基因组DNA、含COVID-19 RNA阴性、含COVID-19 RNA阴性样品构成。
精密度参考品R1（低值2.0×103 copies/mL）和R2（中值2.0×105 copies/ mL）。
干扰物参考品I1~I3由含血红蛋白 2.0×103 copies/mL阳性样本（I1）、含白蛋白2.0×103 copies/mL阳性样本（I2）和含利巴韦林+阿奇霉素2.0×103 copies/mL阳性样本（I3）组成，阳性对照组为2.0×103copies/ml /ml阳性样本。
性能评估标准盘的评估结果要求：阳性参考品的检测结果应为阳性，检测限参考品检测结果应为阳性，分析特异性参考品检测结果应为阴性，精密度参考品检测结果均为阳性，且CT值的变异系数（CV，%）不大于5.0%。干扰物参考品检测结果应为阳性。
阳性参考品的检测结果如图11所示，不同拷贝数的阳性参考品ORF1ab、N、E、S和M基因的检测结果均为阳性。
检测限参考品的检测结果如图12和图13所示，使用1.0×104、1.0×103和5.0×102进行ORF1ab、E、N、S和M基因的检测，均为阳性，且重复性好。试剂盒的最低检测限为500copies/ml。
分析特异性参考品的检测结果如图14所示，分析特异性参考品在体系1、体系2中仅内标为阳性，待检测靶基因ORF1ab、N、E、S和M基因均为阴性。
使用含相关病毒的阳性样本进行分别进行体系1和体系2的特异性测试，结果如图15-18所示。检测可见，结果除内标体系外，待检测靶标均为阴性（箭头示内标扩增曲线）。结果表明，与地方性人类冠状病毒（HKU1、OC43、229E 和NL63）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒无交叉反应，与甲型H1N1流感病毒（H1N1 influenza virus，H1N1）、乙型流感病毒（influenza B virus，INFB）、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、人副流感病毒（Parainfluenza virus，PV）、腺病毒（adenovirus，ADV）和人类基因组DNA等无交叉反应。
精密度测试结果如图19所示。检测可见，分别使用低值精密度参考品（2019-nCoVRNA 2.0×103 copies/ml阳性样本）和中值精密度参考品（2019-nCoV RNA 2.0×105copies/ml阳性样本）重复上机，使用体系1（ORF1ab、N和E基因）和体系2（S和M基因）分别检测，结果均为阳性，试剂盒重复性好，CV值不大于5.0%。
干扰物参考品的检测结果如图20和图21所示。以对照样品和三种干扰物模拟样本为检测对象，使用体系1和体系2分别检测，结果均为阳性，三个干扰物质在体系1、体系2中均可检出，干扰物质血红蛋白、白蛋白、利巴韦林/阿奇霉素等对检测结果不产生干扰。
准确度测试结果如图22-23所示。使用各基因的人工质粒（1×104 copies/ml）进行检测，结果为各型别对应阳性，其他型别质粒未见阳性扩增。
实施例6、五靶标联检试剂盒国家标准物质评估结果
新型冠状病毒核酸国家标准物质（中国计量科学研究院） (NCRM)-GBW(E)091090（低浓度）为体外转录RNA，采用绝对定量方法-数字PCR对基因拷贝数浓度进行测定。目标基因范围涵盖已公布的新冠病毒3个主要基因：核壳蛋白N基因全长、包膜蛋白E基因全长、开放阅读框1ab （ORF1ab）基因片段（基因组坐标：14911-15910）；量值（表6和表7）为N、E和ORF1ab基因的拷贝数浓度。
表 6 （NCRM)-GBW(E)091090（低浓度）特性量值及不确定度
经检索，除了ORF1ab因区段不同，国家标准物质可用于本发明的新型冠状病毒（2019-nCoV）五靶标联检试剂盒的N和E基因性能评价。将定值标准物质（批次编号2001）使用DEPC处理水十倍梯度稀释，得到梯度样本。使用实施例5中的检测试剂盒，将定值标准物质梯度样本加入到反应体系中，使用实施例4 上机程序2（10+35循环）进行RT-PCR扩增和荧光采集。检测结果见图24。
N基因-1、N基因-2、N基因-3、N基因-4对应的理论拷贝数分别为9.8×104copies/ml、9.8×103copies/ml、9.8×102copies/ml、4.9×102copies/ml。
E基因-1、E基因-2、E基因-3、E基因-4对应的理论拷贝数分别为7.63×104copies/ml、7.63×103copies/ml、7.63×102copies/ml、3.82×102copies/ml。。
检测结果见图24。结果表明，试剂盒能够检测出低值定值标准品梯度样本，对于N基因490copies/ml和E基因382copies/ml样本检出效果好。
综上，本发明试剂盒设计合理，技术可行；质量控制体系稳定可靠；产品稳定性能良好，检测所需模板量少，检测结果客观准确。五靶标（包括ORF1ab、N、E、S和M基因）设计能够更好的克服RNA病毒传代过程变异导致的假阴性，可有效提升阳性检出率，尽可能避免漏检的情况出现，具有较高的临床应用价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的诸多实施方式中的少数，虽然其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州安必平医药科技股份有限公司
<120> 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
<130> 2020
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttctaatagc attctttgca tttt 24
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<212> DNA
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ttacaatcta gtcaagcgtg gcaaccg 27
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<212> DNA
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tgccactaaa gcatacaatg taa 23
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gttccttgtc tgattagttc ctg 23
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<212> DNA
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ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttg 28
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tgcygtttac agaataaatt gga 23
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<212> DNA
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cggtggaatt gctatcgcaa tgg 23
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<212> DNA
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<212> DNA
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tcttgtaaaa ccttcttttt acgtttactc t 31
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tttaggcagg tccttgatgt c 21
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ggggaacttc tcctgctaga at 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
Claims (5)
1.一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的特异性引物；
所述ORF1ab基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:1~2所示，所述N基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:4~5所示，所述E基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:7~8所示，所述S基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:10~11所示，所述M基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:13~14所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的探针；所述ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID NO: 3所示，所述N基因的探针序列如SEQ ID NO: 6所示，所述E基因的探针序列如SEQ ID NO: 9所示，所述S基因的探针序列如SEQ ID NO: 12所示，所述M基因的探针序列如SEQ ID NO: 15所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含反应液A、反应液B、
反应液C和阴性质控品、2019-nCoV阳性质控品，所述反应液A含有SEQ ID NO:1~3所示的ORF1ab基因的特异引物和探针、SEQ ID NO:4~6所示的N基因的特异引物和探针、SEQ IDNO:7~9所示的E基因的特异引物和探针，所述反应液B含有SEQ ID NO:10~12所示的S基因特异引物和探针、SEQ ID NO:13~15所示的M基因特异引物和探针，反应液C为酶溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：
2×一步法逆转录-聚合酶链式反应缓冲液 III 10ul，
5U/ul Takara Ex 热启动Taq 酶 0.4ul，
PrimeScript逆转录酶混合物 0.4ul，
10uM 上游引物 0.4ul，
10uM 下游引物 0.4ul，
10uM探针 0.8ul，
总 RNA 2ul，
无核糖核酸酶灭菌纯化水 5.6ul。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：55℃
15min，1个循环；95℃ 30s，1个循环；95℃ 10s；55℃ 30s，10个循环；95℃ 10s；55℃30s，35个循环。
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