CN103282501A - 植物表达系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于在植物中表达目的蛋白的植物表达系统和方法。所述植物表达系统包含第一核酸序列和第二核酸，所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节区序列、目的核苷酸序列、一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，所述第二核酸编码双粒病毒组复制酶。在植物中产生目的蛋白的方法，包括将植物表达系统引入植物或植物的部分，并在允许所述核苷酸序列表达的条件下培养所述植物或植物的部分，并产生所述目的蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及目的蛋白在植物中的表达。本发明还提供了用于在植物中生产目的蛋白的方法和组合物。
背景技术
流行性感冒是人类中由呼吸道病毒引起的死亡的主要原因。常见症状包括发热、咽喉痛、呼吸急促及肌痛等。在流感季节中，流感病毒感染全世界10-20%的人口，每年导致250-500,000例死亡。流感大流行通常由高传染性且致命的流感病毒导致，并可在全世界导致疾病和死亡水平增高。在二十世纪新的A亚型流感的出现导致了4次主要的大流行，导致了显著的死亡率和经济破坏。人们越来越多地担心该病毒可能变得对人有高传染性。对于人类健康来说，主要问题是这样的事实：流感病毒是抗原上不稳定的，即，它们迅速地突变。
基于存在的核蛋白和基质蛋白抗原，流感病毒被分类为A型、B型或C型。根据存在的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面糖蛋白的组合，A型流感病毒可被进一步分为亚型。HA控制着所述病毒结合并穿透宿主细胞的能力。NA可从宿主细胞和病毒表面蛋白上的聚糖链除去末端的唾液酸残基，这可以防止病毒聚集并有助于病毒移动。
人当前与流感斗争的方法是通过每年疫苗接种。每年，世界卫生组织选择某些病毒株以将其包括每年度流感疫苗内，所述疫苗在受精卵（fertilized eggs）中生产。但是，每年生产的疫苗剂量数量不足以接种全世界的人口。另外，这种生产方法面临很多可能的缺陷，包括由于使用全病毒而引起污染的可能性、取决于病毒株的不定的产率、为了获取卵的大量计划需求、由于纯化中使用化学品的污染风险以及长的生产时间。此外，对卵蛋白过敏的人可能不适于接受通过这种方法产生的疫苗。
已经研究了替代的生产方法。例如，已经在哺乳动物细胞培养物（例如在MDCK或PERC.6细胞等）中生产了流感病毒。另一种方法是反向遗传学，其中通过用病毒基因进行细胞转化来生产病毒。但是这些方法也需要使用全病毒以及复杂的方法和特殊的培养环境。
为保护世界人口免于流感并避免未来的大流行，疫苗制造商将需要开发用于生产疫苗用量（vaccine dose）的有效、迅速的方法。当前使用受精卵生产疫苗是不够的并且包括漫长的过程。重组技术提供了生产流感抗原的有前景的方法。但是，血凝素的生产已经受限于膜相关蛋白（所述膜相关蛋白涉及低产率的复杂提取过程），或受限于免疫原性差的可溶性蛋白。
植物作为重组蛋白的生产系统拥有巨大的潜力。一种在植物中生产外源蛋白的方法是产生稳定的转基因植物株系。但是这是一个耗时且劳动密集的过程。转基因植物的替代方法是使用基于植物病毒的表达载体。基于植物病毒的载体可使得蛋白在植物中快速的、高水平的、短暂表达。
已经修饰了许多不同的植物病毒以使其作为表达载体起作用。例如，豇豆花叶病毒（Cowpea Masaic Virus,CPMV）已被用于生产多种蛋白质（参见，例如，WO2007/135480;WO2009/087391;Sainsbury F.etal.,2008,Plant Physiology;148:121-1218;Sainsbury F.et al.,2008,Plant Biotechnology Journal;6:82-92;Sainsbury F.et al.,2009,PlantBiotechnology Journal;7:682-693）。
已建议将一种双粒病毒组来源的基于植物的系统用于生产病毒样颗粒（Huang et al.,2009,Biotechnology and Bioengineering,103:706-714）。通过对本生烟（Nicotiana benthamiana）叶的农杆菌渗透（agroinfiltration）共递送衍生自大豆黄矮病毒（BeYDV）的载体和提供Rep/RepA的载体，导致了复制子扩增和蛋白质产生。
基于植物的表达系统优选具有若干特性，例如含有用于目的基因的合适克隆位点，可以以经济有效的方式容易地感染植物，和/或可以导致所接种的植物的有效的局部/系统性感染。另外，所述感染应提供有用蛋白物质的良好产率。尽管在修饰病毒以作为植物表达系统方面取得了进步，但仍有改进空间。
发明内容
本发明涉及目的蛋白在植物中的表达。本发明还提供用于在植物中生产目的蛋白的方法和组合物。还提供了在植物中生产目的蛋白的核酸和表达系统。所述表达系统包含基于豇豆花叶病毒组（comovirus）的表达盒和基于双粒病毒组（geminivirus）的扩增元件。还提供了包含编码目的蛋白的基因构建体的植物细胞、植物组织、完整植物、核酸以及在植物中表达目的蛋白的方法。
本公开内容还提供了一种在植物中表达血凝素蛋白的表达系统。
本发明还提供了一种包含第一核酸序列和第二核酸的植物表达系统（A），所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节区、目的核苷酸序列以及一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，所述第二核酸编码双粒病毒组复制酶。所述调节区可选自质体蓝素启动子、CaMV35S启动子、2×CaMV35S启动子、CAS启动子、RbcS启动子、Ubi启动子或肌动蛋白启动子。此外，所述一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可以是豇豆花叶病毒组5’UTR，例如豇豆花叶病毒（CPMV）5’UTR，或者所述CPMV5’UTR可包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。此外，所述一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可以包含豇豆花叶病毒组3’UTR，例如豇豆花叶病毒3’UTR以及质体蓝素3’UTR。另外，所述一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件可以选自大豆黄矮病毒长基因区间（Bean Yellow DwarfVirus long intergenic region,BeYDV LIR）和BeYDV短基因区间（BeanYellow Dwarf Virus short intergenic region,BeYDV SIR）。
本发明还提供了如上所述的植物表达系统（A），其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可以位于同一核酸分子上，或者它们可以位于不同的DNA分子上。
如上定义的植物表达系统（A）还可包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码沉默抑制子。所述沉默抑制子可选自HcPro和p19。所述第三核酸序列和所述第一核酸序列可位于同一分子上，或者所述第三核酸序列和所述第一核酸序列可位于不同的分子上。所述植物表达系统还可包含第四核酸序列，所述第四核酸序列编码伴侣蛋白。所述伴侣蛋白可选自Hsp40和Hsp70。所述所述第四核酸序列和所述第一核酸序列可位于同一分子上，或者所述第四核酸序列和所述第一核酸序列可位于不同DNA分子上。
本发明提供了如上定义的植物表达系统（A），其中所述目的核苷酸序列编码流感血凝素。所述流感血凝素可包含天然的信号肽序列或非天然的信号肽。此外，所述流感血凝素可选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。所述流感血凝素还可选自B型流感血凝素、A型流感H1亚型血凝素、A型流感H3亚型血凝素和A型流感H5亚型血凝素。
本发明还涉及包含核酸序列的植物表达系统（B），所述核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节序列；目的核苷酸序列；一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，以及编码双粒病毒组复制酶蛋白的核酸序列。所述调节区可选自质体蓝素启动子、CaMV35S启动子、2×CaMV35S启动子、CAS启动子、RbcS启动子、Ubi启动子或肌动蛋白启动子。此外所述一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可以是豇豆花叶病毒组5’UTR，例如豇豆花叶病毒（CPMV）5’UTR，或者所述CPMV5’UTR可包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。此外，所述一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可以包含豇豆花叶病毒组3’UTR，例如豇豆花叶病毒3’UTR以及质体蓝素3’UTR。另外，所述一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件可以选自大豆黄矮病毒长基因区间（BeYDV LIR）和BeYDV短基因区间（BeYDVSIR）。
如上定义的植物表达系统（B）还可包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码沉默抑制子。所述沉默抑制子可选自HcPro和p19。所述第二核酸序列和所述核酸序列（包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节序列；目的核苷酸序列；一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，以及编码双粒病毒组复制酶蛋白的核酸序列）可位于同一分子上，或者所述第二核酸序列和所述核酸序列可位于不同的分子上。所述植物表达系统还可包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码伴侣蛋白。所述伴侣蛋白可选自Hsp40和Hsp70。所述第三核酸序列和所述核酸序列（包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节序列；目的核苷酸序列；一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，以及编码双粒病毒组复制酶蛋白的核酸序列）可位于同一分子上，或者所述第三核酸序列和所述核酸序列可位于不同DNA分子上。
本发明提供了如上定义的植物表达系统（B），其中所述目的核苷酸序列编码流感血凝素。所述流感血凝素可包含天然的信号肽序列或非天然的信号肽。此外，所述流感血凝素可选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。所述流感血凝素还可选自B型流感血凝素、A型流感H1亚型血凝素、A型流感H3亚型血凝素和A型流感H5亚型血凝素。
本发明还提供了一种在植物或植物的一部分中生产流感病毒样颗粒（VLP）的方法（A），所述方法包含，
-将所述包含第一核酸序列和第二核酸的植物表达系统引入所述植物或植物的部分，所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节区、目的核苷酸序列、所述目的核苷酸序列编码流感血凝素以及一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，
-所述第二核酸编码双粒病毒组复制酶，和
-在允许所述编码流感血凝素的核苷酸序列表达的条件下培养所述植物或植物的部分，从而生产所述流感VLP。
本发明还涉及如上所述的方法（A），其中在所述引入步骤中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可以位于同一分子上，或者所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可以位于不同的分子上。如果所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于不同的分子上，那么可将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分，或者可将所述不同的分子在不同时间引入所述植物或植物的部分，例如通过连续浸润（infiltration）。
本发明还提供了如上所述的方法（A），其中在所述培养步骤中，所述编码流感血凝素的核苷酸序列的表达是短暂表达。此外，所述方法可以包括收获所述植物或植物的部分的步骤，从而获得所收获的含有所述流感VLP的植物或植物的部分。所述方法还可包含从所述收获的含有所述流感VLP的植物或植物的部分中分离所述流感VLP的步骤，从而获得分离的流感VLP。
本发明提供了如上所述的方法（A），其中在所述引入步骤中，所述植物表达系统还可包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码沉默表达的抑制子。所述第三核酸序列和所述第一核酸序列可位于同一分子上，或者所述第三核酸序列和所述第一核酸序列可位于不同的分子上。如果所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，那么可将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。此外，在所述引入步骤中，所述植物表达系统还可包含第四核酸序列，所述第四核酸序列编码伴侣蛋白。所述第四核酸序列和所述第一核酸序列可位于同一分子上，或者所述第四核酸序列和所述第一核酸序列可位于不同的分子上。如果所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，那么可将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
本发明还提供了一种在植物或植物的一部分中生产目的蛋白的方法（B），所述方法包含，
-将所述包含第一核酸序列和第二核酸的植物表达系统引入所述植物或植物的部分，所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节区、目的核苷酸序列以及一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，所述第二核酸编码双粒病毒组复制酶，和
-在允许所述编码目的蛋白的核苷酸序列表达的条件下培养所述植物或植物的部分，从而生产所述目的蛋白。
本发明还涉及如上所述的方法（B），其中在所述引入步骤中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可以位于同一分子上，或者所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可以位于不同的分子上。如果所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于不同的分子上，那么可将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
本发明还提供了如上所述的方法（B），其中在所述培养步骤中，所述编码流感血凝素的核苷酸序列的表达是短暂表达。此外，所述方法可以包括收获所述植物或植物的部分的步骤，从而获得所收获的含有所述目的蛋白的植物或植物的部分。所述方法还可包含从所述收获的含有所述目的蛋白的植物或植物的部分中分离所述目的蛋白的步骤，从而获得分离的目的蛋白。
本发明提供了如上所述的方法（B），其中在所述引入步骤中，所述植物表达系统还可包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码沉默表达的抑制子。所述第三核酸序列和所述第一核酸序列可位于同一分子上，或者所述第三核酸序列和所述第一核酸序列可位于不同的分子上。如果所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，那么可将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。此外，在所述引入步骤中，所述植物表达系统还可包含第四核酸序列，所述第四核酸序列编码伴侣蛋白。所述第四核酸序列和所述第一核酸序列可位于同一分子上，或者所述第四核酸序列和所述第一核酸序列可位于不同的分子上。如果所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，那么可将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
该发明内容不必描述本发明的所有特征。在阅读以下对本发明具体实施方案的描述后，本发明的其他方面、特征和优势对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
根据以下参考附图的描述，本发明的这些和其他特征将变得更加显而易见，其中：
图1示出了本发明中描述的若干构建体的核苷酸序列。图1A示出了表达盒972的核苷酸序列（SEQ ID NO:1），其包含从PacI位点（粗体：启动子上游）到AscI位点（粗体；紧接着NOS终止子的下游）的序列，并且包括H5A/印尼/5/2005的野生型HA0（下划线）。图1B示出了表达盒560的核苷酸序列（SEQ ID NO:2），其包含从PacI位点（粗体；启动子上游）到AscI位点（粗体；紧接着NOS终止子的下游）的序列。PDI信号肽（PDISP）-H1A/加利福尼亚/4/2009的HA0（下划线）。图1C示出了表达盒971的核苷酸序列（SEQ ID NO:3），其包含从PacI位点（粗体；启动子上游）到AscI位点（粗体；紧接着NOS终止子的下游）的序列。PDISP-H3A/布里斯班/10/2007的HA0（下划线）。图1D示出了表达盒973的核苷酸序列（SEQ ID NO:4），其包含从PacI位点（粗体；启动子上游）到AscI位点（粗体；紧接着NOS终止子的下游）的序列。PDISP-B/佛罗里达/4/2006的HA0（下划线）。图1E示出了LIR-MCS-SIR+LIR的核苷酸序列（SEQ ID NO:9）。849构建体的LIR（长基因区间）-MCS（多克隆位点）-短基因区间（SIR）+LIR序列。图1F示出了表达盒853的核苷酸序列（SEQ ID NO:10），其包含从AscI位点（粗体；LIR的上游）到PmeI位点（粗体；SIR+LIR的下游）的序列。PDISP-B/佛罗里达/4/2006的HA0（下划线）。图1G示出了表达盒561的核苷酸序列（SEQ ID NO:11），其包含从AscI位点（粗体；LIR的上游）到PmeI位点（粗体；SIR+LIR的下游）的序列。PDISP-H1A/加利福尼亚/4/2009的HA0（下划线)。图1H示出了表达盒851的核苷酸序列（SEQ ID NO:12），其包含从AscI位点（LIR的上游）到PmeI位点（SIR+LIR的下游）的序列。PDISP-H3A/布里斯班/10/2007的HA0（下划线）。图1I示出了表达盒852的核苷酸序列（SEQ ID NO:13），其包含从AscI位点（LIR的上游）到PmeI位点（SIR+LIR的下游）的序列。带有来自H5A/印尼/05/2005的HA0的天然Sp（信号肽）（下划线）。图1J示出了848构建体的LIR–MCS-SIR-复制酶-LIR序列的核苷酸序列（SEQ ID NO:14）。图1K示出了表达盒475的核苷酸序列（SEQ ID NO:15），其包含从AscI位点（粗体；LIR的上游）到PmeI位点（粗体；SIR-C1/C2-LIR的下游）的核苷酸。PDISP-B/佛罗里达/4/2006的HA0（下划线）。图1L示出了表达盒471的核苷酸（SEQ ID NO:16），其包含从AscI位点（粗体；LIR的上游）到PmeI位点（粗体；SIR-C1/C2-LIR的下游）的核苷酸。PDISP-H1A/加利福尼亚/4/2009的HA0（下划线)。图1M示出了表达盒473的核苷酸序列（SEQ ID NO:17），其包含从AscI位点（粗体；LIR的上游）到PmeI位点（粗体；SIR-C1/C2-LIR的下游）的核苷酸。PDISP-H3A/布里斯班/10/2007的HA0（下划线）。图1N示出了表达盒474的核苷酸序列（SEQ ID NO:18），其包含从AscI位点（粗体；LIR的上游）到PmeI位点（粗体；SIR-C1/C2-LIR的下游）。带有来自H5A/印尼/05/2005的HA0的天然Sp（信号肽）（下划线）。
图2示出了可用于在本生烟中短暂表达HA的若干构建体的示意图。图2A示出了用于HA表达的基于CPMV-HT的构建体（构建体编号971、972、973和560）的示意的构建体。图2B示出了用于HA表达的基于CPMV-HT+BeYDV的构建体（构建体编号851、852、853和561）的示意的构建体。图2C示出了BeYDV复制酶表达构建体（构建体编号834）的示意的构建体。图2D示出了用于HA表达的基于CPMV-HT+BeYDV的构建体（构建体编号471、473、474和475）的示意的构建体，所述构建体包含LIR控制下的复制酶基因（C1/C2）。
图3示出了单独使用基于CPMV-HT的表达系统或者使用与BeYDV扩增系统结合的基于CPMV-HT的表达系统时，短暂HA积累的比较。图3A示出了使用基于CPMV-HT的表达盒（构建体编号973；见图1D和2A）或结合BeYDV扩增系统（构建体编号853和834（提供病毒复制酶的表达）；见图1F和2B）时植物中HAB（来自株系B/佛罗里达/4/2006）积累的比较。对每个构建体分析了三株植物（1、2和3）。对每个分析的提取物上样20微克蛋白质。图3B示出了单独使用基于CPMV-HT的表达盒（构建体编号971；见图1C和2A）或结合BeYDV扩增系统（构建体编号851；见图1H和2B）时植物中H3（来自株系A/布里斯班/10/2007）积累的比较。对每个构建体，分析了三株植物（1、2和3）。如所示出的，将来自转化植物的20微克或5微克蛋白质被上样。非转化植物的15微克蛋白质被加入到所述5μg上样品中。图3C示出了单独使用基于CPMV-HT的表达盒（构建体编号972；见图1A和图2A）或结合BeYDV扩增系统（构建体编号852，见图1I和2B）时植物中H5（来自株系A/印尼/05/05）积累的比较。在提取之前将三株植物的叶子合并。示出了每个泳道中来自转化植物的蛋白质的量。为确保等量上样，将来自转化植物的提取物用来自非转化植物的蛋白提取物补足到4μg。图3D示出了单独使用基于CPMV-HT的表达盒（构建体编号560；见图1B和2A）或结合BeYDV扩增系统（构建体编号561；见图1G和2B）时植物中H1（来自株系A/加利福尼亚/04/2009）积累的比较。对于每个构建体，在浸润后第2、3、4和5天收获三株植物（分别表示为d2、d3、d4和d5）。在提取之前将三株植物的叶子合并。在上样之前将来自转化植物的5微克蛋白与来自非转化植物的15μg蛋白混合。
图4示出了使用若干基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统以及在单独质粒上提供的复制酶时，或使用若干基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统以及在同一质粒上处于LIR控制下的复制酶时，植物中短暂HA积累的比较。图4A示出了使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统（构建体编号853；见图1F和2B；和质体蓝素-P19；构建体编号472）以及与在单独质粒上的的复制酶基因时，或使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统以及在同一质粒上处于LIR控制下的复制酶基因（构建体编号475；见图1K和2D；和质体蓝素P-19；构建体编号472）时，植物中HA（来自株系B/佛罗里达/4/2006）积累的比较。对每个构建体分析了三株植物（1、2和3）。对每个分析的提取物上样20微克蛋白质。图4B示出了使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统（构建体编号851；见图1H和2B；和质体蓝素-P19；构建体编号472）以及在单独质粒上的复制酶基因时，或使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统以及在同一质粒上在所述LIR控制下的复制酶基因（构建体编号473；见图1M和2D；和质体蓝素P-19；构建体编号472）时，植物中H3（来自株A/布里斯班/10/2007）积累的比较。对每个构建体分析三株植物（1、2和3）。在上样之前将来自转化植物的0.5微克蛋白与来自非转化植物的10μg蛋白混合。图4C示出了使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统（构建体编号852；见图1I和2B；和质体蓝素-P19；构建体编号472）以及在单独质粒上的复制酶基因时，或使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统以及在同一质粒上在所述LIR控制下的复制酶基因（构建体编号474；见图1N和2D；和质体蓝素P-19；构建体编号472）时，植物中H5（来自株系A/印尼/05/05）积累的比较。对每个构建体分析三株植物（1、2和3）。在上样之前将来自转化植物的0.5微克蛋白与来自非转化植物的10μg蛋白混合。图4D示出了使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统（构建体编号561；见图1G和2B；和质体蓝素-P19；构建体编号472）以及在单独质粒上的复制酶基因时，或使用基于CPMV-HT的表达盒与BeYDV扩增系统以及在同一质粒上在所述LIR控制下的复制酶基因（构建体编号471；见图1L和2D；和质体蓝素P-19；构建体编号472）时，植物中H1（来自株系A/加利福尼亚/04/2009）积累的比较。对每个构建体分析三株植物（1、2和3）。在上样之前将来自转化植物的2.5微克蛋白与来自非转化植物的10μg蛋白混合。
具体实施方式
本发明还涉及用于在植物中生产目的蛋白的核酸和表达系统。所述表达系统包含基于豇豆花叶病毒组的表达盒和基于双粒病毒组的扩增元件。还提供了包含所述目的蛋白的植物细胞、植物组织、完整植物、接种物、核酸（例如基因构建体）以及在植物中表达目的蛋白的方法。
本发明还提供了一种包含第一核酸序列和第二核酸的植物表达系统，所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节区、目的核苷酸序列以及一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，所述第二核酸编码双粒病毒组复制酶。所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可位于同一核酸分子上，或者它们可位于不同DNA分子上。例如，所述植物表达系统可包含核酸序列，所述核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节序列；目的核苷酸序列；一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，以及编码双粒病毒组复制酶蛋白的核酸序列。
本发明还提供了核酸，所述核酸包含在同一或不同的核酸上提供的启动子（调节区）序列、豇豆花叶病毒组调节区、编码一种或多种目的蛋白的一条或多条序列，以及双粒病毒组扩增元件。所述核酸还可包含编码双粒病毒组复制酶的序列、豇豆花叶病毒组3’非翻译区（UTR）或质体蓝素3’UTR，或双粒病毒组复制酶与豇豆花叶病毒组3’UTR或质体蓝素3’UTR的组合。
在下面的描述中，广泛使用了多个术语，提供以下定义以帮助理解本发明的各方面。本说明书中实施例包括术语实例的使用仅用于示例性目的，并不意欲限制本发明实施方案的范围和意义。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，例如氨基酸类似物。本文使用的所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质例如抗原，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。
本文中使用的术语“衍生物”，在用于多肽或蛋白质例如抗体时，是指包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加而改变的氨基酸序列的多肽或蛋白质。本文使用的术语“衍生物”也是指已被修饰的多肽或蛋白质，即通过共价连接任何类型的分子至所述抗体。例如，可修饰多肽或蛋白质，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接到细胞配体或其他蛋白等。衍生物、多肽或蛋白质可使用本领域技术人员已知技术通过化学修饰产生，所述技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。在某些实施方案中，衍生物、多肽或蛋白质拥有与用于衍生其的多肽或蛋白质相似或相同的功能。
本文所述表达系统包含基于二分病毒（bipartite virus）或具有二分基因组的病毒的表达盒。例如，本发明的二分病毒可以是豇豆花叶病毒科家族的病毒。豇豆花叶病毒科家族的属包括豇豆花叶病毒组、线虫传多角体病毒组（Nepovirus）、蚕豆萎蔫病毒组（Fabavirus）、樱桃锉叶病毒属（Cheravirus）和S温州蜜柑萎缩病毒属（Sadwavirus）。豇豆花叶病毒组包括豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（Cowpeasevere mosaic virus，CPSMV）、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）、红三叶草斑驳病毒（Red clover mottle virus，RCMV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）、芜菁环斑病毒（Turnipringspot virus，TuRSV）、蚕豆真花叶病毒（Broad bean true mosaicvirus，BBtMV）、蚕豆色染病毒（Broad bean stain virus，BBSV）、萝卜花叶病毒（Radish mosaic virus，RaMV）。包含可用于本发明多个方面的增强子元件的豇豆花叶病毒组RNA-2序列的实例包括但不限于：CPMV RNA-2（GenBank登录号NC_003550）、RCMV RNA-2（GenBank登录号NC_003738）、BPMV RNA-2（GenBank登录号NC_003495）、CPSMV RNA-2（GenBank登录号NC_003544）、SqMVRNA-2（GenBank登录号NC_003800）、TuRSV RNA-2（GenBank登录号NC_013219.1）、BBtMV RNA-2（GenBank登录号GU810904）、BBSV RNA2（GenBank登录号FJ028650）、RaMV（GenBank登录号NC_003800）。
二分豇豆花叶病毒RNA基因组的片段称为RNA-1和RNA-2。RNA-1编码参与复制的蛋白质，而RNA-2编码细胞-至-细胞移动所必需的蛋白质以及两种衣壳蛋白。可以使用任何适合的基于豇豆花叶病毒组的盒，包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，例如所述表达盒可以基于CPMV。
“表达盒”是指包含目的核酸的核苷酸序列，所述目的核酸在适合的启动子或其他调节元件的控制下或者与所述适合的启动子或其他调节元件可操作地连接，用于所述目的核酸在宿主细胞中的转录。
已经证明了，用CPMV两个基因组RNA的全长、能复制的cDNA拷贝转化本生烟可以导致生产性感染（Liu et al.,2004,Virology323,37-48，其以引用的方式纳入本文）。基于CPMV的表达盒的实例记载于WO2007/135480;WO2009/087391;和Sainsbury F.et al.,(2008,Plant Physiology;148:1212-1218;Sainsbury F.et al.,(2008,PlantBiotechnology Journal;6:82-92;Sainsbury F.et al.,2009,PlantBiotechnology Journal;7:682-693；这些文件以引用的方式纳入本文）。作为不应被认为是限制性的实例，可以按照WO2009/087391中所描述的，使用从所述豇豆花叶病毒（CMV）的基因组RNA2获得的非翻译区（UTR），在所述非翻译区中存在于5’前导序列中的两个第一翻译起始密码子已经被缺失。当与所述CaMV35S启动子和胭脂碱合酶（NOS）终止子结合时，修饰的CPMV UTR增强了侧翼编码区的翻译。所述基于CPMV的表达系统被命名为CPMV-HT（hyperanslatable）。
如本文所述，表达增强子序列可用于表达目的核酸序列，所述表达增强子序列衍生自二分RNA病毒（例如豇豆花叶病毒组）的RNA-2基因组片段（或与其有同源性）且其中靶起始位点已被突变的。本发明还提供了用于增加衍生自二分病毒RNA-2基因组片段的序列的表达或增强翻译活性（translational enhancing activity），所述方法包含突变其中的靶起始位点。
“增强子”序列（或增强子元件），包括这样的序列，所述序列衍生自二分RNA病毒（例如豇豆花叶病毒组）的RNA-2基因组片段（或与其有同源性）且其中靶起始位点已被突变。这种序列可以增强与其连接的异源ORF的下游表达。可不受限制地认为，当存在于转录的RNA中时，这种序列可增强与其连接的异源ORF的翻译。
本文及增强子序列上下文中提到的“靶起始位点”是二分病毒（例如豇豆花叶病毒组）的野生型RNA-2基因组片段的起始位点（起始密码子），所研究的增强子序列衍生自所述RNA-2基因组片段。所述靶起始位点作为产生（翻译）所述105K蛋白的起始位点，所述105K蛋白是由所述野生型RNA-2基因组片段编码的两个羧基共末端蛋白（carboxycoterminal protein）中较长的那个。105K蛋白的产生始自野生型CPMVRNA-2基因组片段中位置161处的起始位点。因此，衍生自CPMVRNA-2基因组片段的增强子序列中的靶起始位点可以是野生型CPMVRNA-2中位置161处的起始位点。在位置161处起始密码子附近的突变可具有与突变位置161处起始密码子本身时相同或相似的效果，所述突变是通过例如扰乱所述起始密码子附近的环境来进行，这可能意味着所述起始密码子更经常地被绕开的（by-passed）。
所述增强子序列可以包含间接突变的靶起始位点，其通过突变所述靶起始位点上游和/或下游的一个或多个核苷酸但保留野生型靶起始位点来产生。突变上游和/或下游的核苷酸的效果与突变所述靶起始位点本身时所观察到的效果相同或相似。
当靶起始位点作为起始位点用于产生由野生型RNA-2基因组片段编码的两个羧基共末端蛋白中较长的一个时，其遵循以下原则，靶起始位点与在同一野生型RNA-2基因组片段上的第二起始位点是同框内的（in-frame）（同相的），所述第二起始位点作为起始位点产生由野生型RNA-2编码的两个羧基共末端蛋白中较短的一个。如果两个起始位点在同一三联体阅读框内，则两个起始位点是同框内的。例如，衍生自野生型CPMV RNA-2基因组片段的增强子序列中的靶起始位点（位置161处的起始位点），与野生型CPMV RNA-2基因组片段中位置512处的起始位点是同框内的，所述位置512处的起始位点作为起始位点用于产生由CPMV RNA-2编码的两个羧基共末端蛋白中较短的一个（95K蛋白）。
因此，位于野生型RNA-2基因组片段（所述增强子序列衍生自该片段）中第二起始位点上游（5’）的靶起始位点可以作为起始位点用于产生由野生型RNA-2基因组片段编码的两个羧基共末端多聚蛋白中较短的一个。另外，靶起始位点还可位于野生型RNA-2基因组（所述增强子序列衍生自该片段）中第三起始位点的下游（3’）。在CPMV中，在位置161处的靶起始位点位于在位置512处的第二起始位点的上游，其作为起始位点用于产生所述95K蛋白。还存在位于位置115处的第三起始位点。因此衍生自二分病毒的RNA-2基因组片段的增强子序列中的靶起始位点是用于产生由野生型RNA-2编码的两个羧基共末端蛋白的两个起始位点中的第一个。‘第一个’在该上下文中是指位置更接近野生型RNA-2基因组片段5’末端的起始位点。
如果需要，可以突变所述序列中多于一个的起始位点。例如也可缺失或改变在（或对应于）位置115处的‘第三’起始位点。已经证明，除了除去AUG161之外，除去AUG115进一步增强了表达（Sainsbury andLomonossoff,2008,Plant Physiology;148:1212-1218）。例如，本发明的增强子序列可以基于来自二分RNA病毒的RNA-2基因组片段的修饰序列。
这些豇豆花叶病毒组和若干具体株的RNA-2基因组片段的序列可以用如下括号内列出的登录号从NCBI数据库获得：豇豆花叶病毒RNA-2（NC_003550)、豇豆重花叶病毒RNA-2（NC_003544）、南瓜花叶病毒RNA-2（NC_003800）、南瓜花叶病毒株Kimble RNA-2（AF059533）、南瓜花叶病毒株Arizona RNA-2（AF059532）、红三叶草斑驳病毒RNA-2（NC_003738）、菜豆荚斑驳病毒RNA-2（NC_003495）、菜豆荚斑驳病毒株K-Hopkins1RNA-2（AF394609）、菜豆荚斑驳病毒株K-Hancock1 RNA-2（AF394607）、安第斯马铃薯斑驳病毒（Andean potato mottle virus）（APMoV:L16239）以及萝卜花叶病毒（RaMV; AB295644）。还有部分RNA-2序列可从菜豆粗缩花叶病毒（bean rugose mosaic virus，BRMV;AF263548）以及豇豆花叶病毒组属的暂定成员，芜菁环斑病毒（EF191015）获得。也可获得许多来自豇豆花叶病毒科家族其他属的序列。迄今，所有已经研究的豇豆花叶病毒组都被证明具有两个可替代起始密码子，用于表达来自其RNA-2基因组片段的两个羧基共末端多聚蛋白。具体地，已知CPMV、CPSMV、BPMV、SqMV和RCMV的RNA-2基因组片段包含两个可替代起始密码子，用于表达两个羧基共末端多聚蛋白。
因此在其他豇豆花叶病毒组中与CPMV野生型RNA-2片段中位置161处起始位点等价的靶起始位点可通过本领域已知方法来鉴定。例如，可使用标准序列比对方法（例如BLAST）或通过人工比对来将目的序列与CMPV的序列比对，以确定对应的、等价起始位点的位置。
如本文所述，所述增强子序列可以包含例如CPMV RNA-2基因组片段的核苷酸1-512或1-509，其中位置161处的靶起始位点已经被突变。或者，所述增强子序列可以包含来自另一豇豆花叶病毒组的等价序列，其中所述与CPMV位置161处起始密码子等价的靶起始位点已经被突变。所述靶起始位点可以通过置换、缺失或插入进行突变。例如，所述靶起始位点可以通过点突变来进行突变。所述CPMV增强子可包含如下所示的SEQ IDNO:23（突变的ATG——ATG115和161——有下划线）：
TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAAC
CAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTG
TCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGT
ACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTA
CTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTT
GGGAAAAGAAAGCTTGJCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTT
ACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAG
GTATTCTTCCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAA
ATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGCJTTTTCCAACTTGGAGAA
AGATTGTTAAGCTTCTGTAATATTCTGCCCAAATTTG
本发明增强子序列可以与CPMV RNA-2序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%的同一性，或具有其中间的任何值的同一性，其中对应于野生型CPMV RNA-2基因组片段的位置161处的靶起始位点已经通过置换、缺失或插入进行突变。例如，所述增强子序列可以与CPMV RNA-2序列具有约80%至约99%、约90%至约99%或约95%至约99%的同一性，或具有其中间的任何值的同一性，其中对应于野生型CPMV RNA-2基因组片段的位置161处的靶起始位点已经通过置换、缺失或插入进行突变。
当提及具体序列时，例如如University of Wisconsin GCG软件程序中所述，使用了术语“相似性百分数”、“同一性百分数”以及“同源性百分数”。用于比较的序列比对方法是本领域中熟知的。可以如下进行用于比较的最佳序列比对，使用例如Smith&Waterman,(1981,Adv.Appl.Math.2:482)的算法、通过Needleman&Wunsch,(1970,J.Mol.Biol.48:443)的比对算法、通过Pearson&Lipman,(1988,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现（例如：Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.）或通过人工比对和目视检查（参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.1995supplement）。
适于确定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别记载于Altschul et al.,(1977,Nuc.Acids Res.25:3389-3402)和Altschul et al.,(1990,J.Mol.Biol.215:403-410)。以本文所述的参数使用BLAST和BLAST2.0，来确定本发明核酸和蛋白质的序列同一性百分数。例如BLASTN程序（用于核苷酸序列）可以使用字长（W）11、期望（E）10、M=5、N=-4以及两条链的比较作为默认设置。对于氨基酸序列，BLASTP程序可以使用字长3和期望（E）10，以及BLOSUM62打分矩阵（参见Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915）比对(B)50，期望(E)10，M=5，N=-4，并且两条链的比较作为默认设置。公众可以通过美国国立生物技术信息中心得到实施BLAST分析的软件(见URL：ncbi.nlm.nih.gov/)。
增强子序列还可在严格条件下与CPMV RNA-2的互补序列杂交，附带条件是对应于野生型CPMV RNA-2基因组片段中位置161处的靶起始位点已经被突变。
在严格杂交条件下的杂交是本领域已知的（参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.1995andsupplements;Maniatis et al.,in Molecular Cloning(A LaboratoryManual),Cold Spring Harbor Laboratory,1982;Sambrook and Russell,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition2001；所述文献各自以引用的方式纳入本文）。这种严格杂交条件的实例可以是65℃下在4×SSC中杂交约16-20小时，然后65℃下在0.1×SSC中洗涤1小时，或者65℃下在0.1×SSC中洗涤2次，每次20或30分钟。或者，示例性的严格杂交条件可以是42℃下在50%甲酰胺、4×SSC中过夜（16-20小时），然后65℃下在0.1×SSC中洗涤1小时，或者65℃下在0.1×SSC中洗涤2次，每次20或30分钟，或过夜（16-20小时）；或者65℃下在Church水性磷酸缓冲液（7%SDS；pH7.2的0.5M NaPO4缓冲液；10mM EDTA）中杂交，然后50℃下在0.1×SSC、0.1%SDS中洗涤2次，每次20或30分钟，或者65℃下在2×SSC、0.1%SDS中洗涤2次，每次20或30分钟。
本发明增强子序列中靶起始位点可以通过缺失、插入或置换进行突变，以使得其不再作为翻译起始位点起作用。例如，可以在所述增强子序列中靶起始位点的位置进行点突变。或者，所述增强子序列中的靶起始位点可被部分或整个地缺失。例如，可以在所述增强子序列中作出跨越所述靶起始位点的缺失。当与作为所述增强子序列衍生来源的野生型RNA-2基因组片段的序列比较时，跨越所述靶起始位点的缺失的长度可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸，附带条件是所述缺失跨越所述起始位点。
不希望囿于理论，在CPMV中位置161处起始密码子的突变被认为可导致翻译抑制子的失活，这导致了来自位于所述失活的翻译抑制子下游的起始密码子开始的翻译增强。因此，如本文中使用的增强子序列可以衍生自二分病毒的RNA-2基因组片段，其中所述增强子序列包含失活的翻译抑制子序列。
翻译抑制子序列可以是作为所研究的增强子序列衍生来源的二分病毒（例如豇豆花叶病毒组）野生型RNA-2基因组片段中的序列，所述翻译抑制子序列包含用于产生（翻译）由所述野生型RNA-2基因组片段编码的两个羧基共末端蛋白中较长那个的起始位点，或由所述起始位点组成。衍生自所述CPMV RNA-2基因组片段的增强子序列中的翻译抑制子序列，是包含上述靶起始位点或由其组成的序列。因此，翻译抑制子序列包含如上定义的靶起始位点或由其组成，并可通过上述的诱变而失活。
本公开内容提供了包含如上所述的表达增强子序列的分离的核酸。本文使用的“核酸”或“核酸分子”是指任何单链或双链的DNA或RNA分子，如果为单链，则也指线性或环状形式的其互补序列的分子。论述核酸分子时，本文根据以5’-3’方向给出序列的通常惯例描述了具体核酸分子的序列或结构。对于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。当该术语用于DNA时是指从序列中分离的DNA分子，所述DNA分子在作为其来源的生物的天然存在基因组中与所述序列是紧邻的。例如，“分离的核酸”可以包含插入到载体（例如质粒或病毒载体）中的DNA分子，或整合到原核或真核细胞或宿主生物的基因组DNA中的DNA分子。当用于RNA时，术语“分离的核酸”主要是指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，所述术语可以指已经充分地从其他核酸中分离的RNA分子，所述RNA分子在其天然状态中（即在细胞或组织中）与所述其他核酸结合。“分离的核酸”（DNA或RNA）还可表示通过生物或合成方法直接产生并且在其产生过程中与存在的其他组分分离的分子。
因此所述核酸可以包含作为所述增强子衍生来源的二分RNA病毒的RNA-2基因组片段的一部分或片段。例如，所述核酸可以不包含作为其衍生来源的RNA-2基因组片段的至少一部分编码区。所述编码区可以是编码两个羧基共末端蛋白中较短那个的RNA-2基因组片段的区域。所述核酸可以包含二分病毒RNA-2基因组片段一部分，所述部分从所述野生型RNA-2基因组片段的5’末端延伸到所述起始位点，由所述野生型RNA-2基因组片段编码的两个羧基共末端蛋白中较短那个的产生（翻译）是从所述起始位点起始的。
如本文所述，提供了一种或多种包含上述增强子序列的表达系统。所述表达系统还可包含插入所述增强子序列下游的编码目的蛋白的目的核酸。
“目的基因”、“目的核苷酸（或核酸）序列”或“目的编码区”意指要在宿主生物（例如植物）中表达并可产生目的蛋白的任何基因、核苷酸序列或编码区（这些术语可互换使用）。这种目的核苷酸序列可以包括但不限于，其产物是用于饲料和/或食物的工业酶、蛋白补充物、营养制品、增值产品或其片段的基因或编码区。目的核苷酸序列或编码区还可以包括编码药物活性蛋白（例如生长因子、生长调节剂、抗体、抗原及其片段，或可用于免疫或疫苗接种它们的衍生物等）的基因。这种蛋白包括但不限于白细胞介素（例如IL-1至IL-24、IL-26和IL-27中的一种或多于一种）、细胞因子、红细胞生成素（EPO）、胰岛素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它们的组合、干扰素（例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ）、凝血因子（例如凝血因子VIII、凝血因子IX）或tPA hGH、受体、受体激动剂、抗体、神经多肽、胰岛素、疫苗、生长因子（例如但不限于表皮生长因子、角质化细胞生长因子、转化生长因子）、生长调节剂、抗原、自身抗原、它们的片段或它们的组合。
所述目的蛋白还可包括流感血凝素（HA：参见WO2009/009876，其以引用的方式纳入本文）。HA为同源三聚体的（homotrimeric）I型膜糖蛋白，通常包含信号肽、HA1结构域以及包含位于C末端的跨膜锚定位点和小胞质尾区的HA2结构域。编码HA的核苷酸序列是公知的且可获得的（参见，例如生物防御和公共健康数据库（现在为流感研究数据库;Squires et al.,2008Nucleic Acids Research36:D497-D503）URL为：biohealthbase.org/GSearch/home.do？decorator=Influenza；或者由美国国立生物技术信息中心维护的数据库（见URL：ncbi.nlm.nih.gov），两者均以引用的方式纳入本文）。
HA蛋白可以属于A型流感、B型流感，或者是选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的A型流感HA的亚型。在本发明的某些方面，所述HA可以来自A型流感，选自H1、H2、H3、H5、H6、H7和H9。如上列出的HA片段也可被认为是目的蛋白。此外，可组合来自以上列出的HA型或亚型的结构域以产生嵌合的HA’s（参见例如WO2009/076778，其以引用的方式纳入本文）。
包含HA蛋白的亚型的实例包括A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/印尼/5/2006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/银鸥/DE/677/88(H2N8)、A/德克萨斯/32/2003、A/野鸭/MN/33/00、A/鸭/上海/1/2000、A/北方针尾鸭/TX/828189/02、A/火鸡/安大略/6118/68(H8N4)、A/琵嘴鸭/伊朗/G54/03、A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英国/56(H11N6)、A/鸭/艾伯塔/60/76(H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、A/野鸭/Gurjev/263/82、A/鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/红嘴鸥/瑞典/5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/约翰内斯堡/66、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门岛3/2006(H1N1)、A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康辛/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭（Teal）/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56(H7N7)、A/香港/1073/99(H9N2))。
所述HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亚型。例如，所述H1蛋白可以来自A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门岛3/2006(H1N1)、A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)或A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)株。所述H3蛋白还可来自A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康辛/67/2005(H3N2)或A/珀斯/16/2009(H3N2)株。在本发明的另一方面，所述H2蛋白可以来自A/新加坡/1/57(H2N2)株。所述H5蛋白可以来自A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)或A/印尼/5/2005株。在本发明的一方面，所述H6蛋白可以来自A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)株。所述H7蛋白可以来自A/马/布拉格/56(H7N7)株。在本发明的一方面，所述H9蛋白来自A/香港/1073/99(H9N2)株。在本发明的另一方面，所述HA蛋白可以来自可以是B型病毒的流感病毒，包括B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006或B/布里斯班/60/08。来自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B亚型的HA蛋白的氨基酸序列的实例包括记载于WO2009/009876、WO2009/076778、WO2010/003225（以引用的方式纳入本文）中的序列。所述流感病毒HA蛋白可以是H5印尼。
所述HA可以包含天然或非天然信号肽；所述非天然信号肽可以是植物来源的。例如，所述信号肽可以是蛋白质二硫键异构酶信号肽。所述天然信号肽可以对应于被表达的血凝素，或可以对应于第二血凝素。
本发明还提供了包含编码HA蛋白的序列的核酸分子。所述核酸分子还可包含与编码HA蛋白的序列可操作地连接的一个或多个调节区。所述核酸分子可包含编码H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或来自B型流感的HA的序列。例如，由所述核酸分子编码的HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9亚型、来自B型的HA。由所述核酸分子编码的H1蛋白可以来自A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门岛3/2006(H1N1)、A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)或A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)株。由所述核酸分子编码的H3蛋白可以来自A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康辛/67/2005(H3N2)或A/珀斯/16/2009(H3N2)株。由所述核酸分子编码的H2蛋白可以来自A/新加坡/1/57(H2N2)株。由所述核酸分子编码的H5蛋白还可以来自A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)或A/印尼/5/2005株。由所述核酸分子编码的H6蛋白可以来自A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)株。由所述核酸分子编码的H7蛋白还可以来自A/马/布拉格/56(H7N7)株。另外，由所述核酸分子编码的H9蛋白可以来自A/香港/1073/99(H9N2)株。由所述核酸分子编码的来自B型的HA蛋白可以来自B/佛罗里达/4/2006、B/马来西亚/2506/2004或B/布里斯班/60/08株。编码这种来自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9亚型或B型的HA蛋白的核酸分子序列实例包括记载于WO2009/009876、WO2009/076778、WO2010/003225（以引用的方式纳入本文）的序列。所述核酸序列可以编码流感病毒HA蛋白H5印尼。
如果所述目的核酸序列编码对植物直接或间接有毒的产物，那么这种毒性可以通过在所需要的组织内或在植物发育中所需要的阶段时选择性地表达所述目的核苷酸序列而降低。
所述目的编码区或目的核苷酸序列可以在任何适合的植物中表达，所述植物被转化有或者包含本发明的核苷酸序列或核酸分子或遗传构建体或载体。适合宿主的实例包括但不限于拟南芥属（Arabidopsis）、农业作物包括例如芸苔（canola）、芸苔属（Brassica spp.）、玉米（maize）、烟草属（Nicotiana spp.）、（烟草）例如本生烟、苜蓿、马铃薯、甘薯（Ipomoea batatus）、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、葵花、棉花、玉米（corn）、黑麦（Secale cereale）、高粱属（Sorghumbicolor、Sorghum vulgare）、红花（Carthamus tinctorius）。
因此如本文所述，提供了表达系统，其包含：(a)上述的增强子序列；和(b)编码目的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述增强子序列的下游。所述核苷酸序列和目的蛋白与作为所述增强子序列衍生来源的野生型二分RNA病毒可以是异源的并且不是由其编码的。
表达系统可被用于在宿主生物中表达目的蛋白。例如，所述目的蛋白可以与所研究的宿主生物是异源的，并通过使用基因工程、转化方法或转化并随后繁殖而被引入所研究的细胞。生物中的异源核苷酸序列可以替代通常执行相同或相似功能的内源等价核苷酸序列，或者所述插入序列可以是在所述内源核苷酸序列之外额外添加的。本领域技术人员会理解，表达目的核苷酸序列需要存在位于要表达的基因上游的起始位点（AUG）。这种起始位点可以作为增强子序列的一部分或作为编码目的蛋白的核苷酸序列的一部分而提供。
“调节区”、“调节元件”或“启动子”一般是指基因的蛋白编码区上游（但不总是这样）的核酸的一部分，其可包括DNA和/或RNA。当调节区域有活性并且与目的基因可操作地结合或可操作地连接时，这可导致目的基因的表达。调节元件可以能够介导器官特异性，或控制发育基因或或时序基因激活。“调节区”包括启动子元件、显示出基本启动子活性的核心启动子元件、在可响应于外部刺激而诱导的元件、介导启动子活性的元件例如负调节元件或转录增强子。本文使用的“调节区”还包括转录后有活性的元件，例如调整基因表达的调节元件例如翻译和转录增强子、翻译和转录抑制子、上游激活序列以及mRNA不稳定性决定子。这些后面的元件中若干个元件的位置可以邻近编码区。
在本公开内容上下文中，术语“调节元件”或“调节区”一般是指（通常但不总是）位于结构基因编码序列上游（5’）的DNA序列，其通过为在特定位点起始转录所需要的RNA聚合酶和/或其他因子提供识别来控制所述编码区的表达。但是应理解，位于内含子内或所述序列3'的其他核苷酸序列也可有助于对目的编码区表达的调节。可提供对RNA聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点起始的调节元件的实例为启动子元件。大多数但不是所有的真核启动子元件含有TATA框——由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序列，通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处。启动子元件可包含负责转录起始的基本启动子元件，以及改变基因表达的其他调节元件（如上所述）。
有数种类型的调节区，包括受发育调节的、可诱导的或组成型的那些。受发育调节或控制在其控制下的基因的差异表达的调节区，在某些器官或器官的组织的发育过程中的特定时间在该器官或组织内被激活。但是，受发育调节的某些调节区在特定发育阶段的特定器官或组织内可被优先激活，其也可以在植物内的其他器官或组织中以受发育调节的方式或以基础水平而激活。组织特异性调节区（例如see-特异性调节区）的实例，包括napin启动子和cruciferin启动子（Rask et al.,1998,J.Plant Physiol.152:595-599;Bilodeau et al.,1994,Plant Cell14:125-130）。叶-特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子（参见US7,125,978，其以引用的方式纳入本文）。
诱导型调节区域是响应于诱导物而直接或间接激活一个或多个DNA序列或基因的转录的调节区。没有诱导物时，所述DNA序列或基因将不会被转录。通常，特异性结合诱导型调节区以激活转录的蛋白因子可以无活性的形式存在，然后其被所述诱导物直接或间接转化为有活性的形式。但是，所述蛋白因子也可不存在。所述诱导物可以是化学试剂例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或者是由热、冷、盐或有毒元素直接强加或通过病原体或疾病媒介（disease agent）例如病毒的作用间接强加的生理应激。可通过向所述细胞或植物外部施用所述诱导物而使含有诱导型调节区的植物细胞与诱导物接触，例如通过喷洒、浇水、加热或类似的方法。诱导型调节元件可以衍生自植物或非植物基因（例如Gatz,C.and Lenk,I.R.P.,1998,Trends Plant Sci.3,352-358，其以引用的方式纳入本文）。潜在的诱导型启动子的实例包括但不限于四环素-诱导型启动子（Gatz,C.,1997,Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48,89-108；其以引用的方式纳入本文）、类固醇诱导型启动子（Aoyama,T.and Chua,N.H.,1997,Plant J.2,397-404；其以引用的方式纳入本文）和乙醇诱导型启动子（Salter,M.G.,et al,1998,Plant Journal16,127-132；Caddick,M.X.,et al,1998,Nature Biotech.16,177-180，其以引用的方式纳入本文）、细胞分裂素诱导的IB6和CKI1基因（Brandstatter,I.and Kieber,J.J.,1998,Plant Cell10,1009-1019；Kakimoto,T.,1996,Science274,982-985，其以引用的方式纳入本文）以及生长素诱导型元件DR5（Ulmasov,T.,et al.,1997,Plant Cell9,1963-1971；其以引用的方式纳入本文）。
组成型调节区整个植物发育过程中持续指导植物各部分的基因表达。已知的组成型调节元件的实例包括与所述CaMV35S转录物有关的启动子。（p35S；Odell et al.,1985,Nature,313:810-812）、水稻肌动蛋白1（Zhang et al,1991,Plant Cell,3:1155-1165）、肌动蛋白2（An et al.,1996,Plant J.,10:107-121）或tms2（U.S.5,428,147，其以引用的方式纳入本文）和磷酸丙糖异构酶1（Xu et.al.,1994,Plant Physiol.106:459-467）基因、玉米泛素1基因（Cornejo et al,1993,Plant Mol.Biol.29:637-646）、拟南芥泛素1和6基因（Holtorf et al,1995,Plant Mol.Biol.29:637-646）、烟草翻译起始因子4A基因（Mandel et al,1995Plant Mol.Biol.29:995-1004）、木薯叶脉花叶病毒（Cassava Vein Mosaic Virus）启动子，pCAS（Verdaguer et al.,1996）；二磷酸核酮糖羧化酶的小亚基启动子，pRbcS：（Outchkourov et al.,2003）、pUbi（用于单子叶植物和双子叶植物）。
如本文所述，已经在叶表达中证明其效力的含有增强子序列的启动子已被发现在短暂表达中有效。不希望囿于理论，通过连接到核基质而连接光合基因的上游调节元件可介导强的表达。例如从豌豆质体蓝素基因的翻译起始位点直到-784可被用于介导强的报告基因表达。
本文中使用的术语“组成型”不必一定表明在组成型调节区控制下的基因在所有细胞类型中均以相同水平表达，而是所述基因可在大范围的细胞类型中表达，尽管经常观察到丰度差异。
“可操作地连接”意指，具体序列例如调节元件和目的编码区直接或间接相互作用以实现预期的功能，例如介导或调整基因表达。可操作地连接的序列的相互作用可以例如通过与所述可操作地连接的序列相互作用的蛋白来介导。
本发明的一个或多于一个的核苷酸序列可在任何适合的植物宿主中表达，所述植物宿主已被本发明的核苷酸序列或构建体或载体转化。适合宿主的实例包括但不限于拟南芥属、农业作物包括例如芸苔、芸苔属、玉米、烟草属、（烟草）例如本生烟、苜蓿、马铃薯、甘薯、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、葵花、棉花、玉米、黑麦、高粱属、红花。
本发明的一个或多个构建体还可包含3’非翻译区。3’非翻译区是指包含DNA片段的基因的一部分，所述DNA片段含有能够影响mRNA加工或基因表达的加A信号和任何其他调节信号。所述加A信号的特征通常在于影响多聚腺苷酸尾至mRNA前体的3’末端的添加。加A信号通常通过存在与典型形式5’AATAAA-3’的同源性而识别，但是变化并不少见。本发明的一种或多种嵌合的基因构建体还可包括其他增强子，根据需要，可以是翻译或转录增强子。这些增强子区域是本领域技术人员熟知的，可包括ATG起始密码子和邻接序列。所述起始密码子必须是与所述编码序列的阅读框是同相的以确保翻译整个序列。
适合的3’区域的非限制性实例为3’转录的非翻译区，其含有农杆菌属（Agrobacterium）致瘤（Ti）质粒基因（例如胭脂碱合酶（Nos基因））的加A信号以及植物基因（例如大豆贮藏蛋白基因（soybeanstorage protein genes）、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因（ssRUBISCO；US4,962,028；其以引用的方式纳入本文））、在调节质体蓝素表达中使用的启动子（Pwee and Gray1993；其以引用的方式纳入本文）。终止（终止子）序列还可以是衍生自二分RNA病毒（例如豇豆花叶病毒组）的RNA-2基因组片段的终止序列。例如，所述终止序列可以衍生自作为所述增强子序列衍生来源的同一二分RNA病毒。所述终止序列可包含终止密码子。终止序列后面还可以为加A信号。
本文描述的表达系统可操作地连接启动子和终止子序列。因此，表达系统还可包含终止序列，并且编码目的蛋白的基因可以位于所述增强子序列和所述终止序列之间，即所述增强子序列的下游（3’）和所述终止序列的上游（5’）。因此本公开内容还提供了表达盒，其包含：(i)启动子，其可操作地连接到(ii)上述增强子序列(iii)目的核苷酸序列，以及(iv)终止子序列。
本发明的表达盒、表达构建体和表达系统还可包含非翻译区（UTR）。所述UTR可位于表达盒（基因表达构建体或基因表达系统）中存在的终止子序列的上游。所述表达盒（基因表达构建体或基因表达系统）包含编码目的蛋白的核酸时，所述UTR可位于所述目的核酸的下游（3’UTR）。因此，所述UTR可位于编码目的蛋白的核酸与终止子序列之间。所述UTR可以衍生自二分RNA病毒，例如衍生自二分RNA病毒的RNA-2基因组片段。所述UTR可以是作为所述表达盒（表达构建体或基因表达系统）中增强子序列衍生来源的同一RNA-2基因组片段的3’UTR。优选地，所述UTR为豇豆花叶病毒组RNA-2基因组片段的3’UTR，例如CPMV RNA-2基因组片段的3’UTR。
上述表达构建体可存在于载体中。所述载体可包含边界序列，其使得所述表达盒转移并整合到所述生物或宿主的基因组中。所述构建体可以是植物二元载体，例如基于pPZP的二元转化载体（Hajdukiewicz,etal.1994）。其他示例性构建体包括pBin19（参见Frisch,D.A.,L.W.Harris-Haller,et al.1995,Plant Molecular Biology27:405-409）。
如果需要，还可处理本发明的构建体以包括选择性标记。但是，这不是必需的。有用的选择性标记包括酶，其可提供对化学品例如抗生素（例如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素）或除草剂（例如草铵膦（phosphinothrycin）、草甘膦（glyphosate）、氯磺隆（chlorosulfuron））等的抗性。类似地，可以使用确保产生可通过以下方式来鉴别的化合物的酶：通过颜色改变（例如GUS（β-葡糖醛酸糖苷酶））或通过发光（例如萤光素酶或GFP）。
可如本文所述使用的载体的实例为pEAQ载体，其通过使用表达盒5’前导区和3’UTR之间的聚合接头而允许直接克隆。该载体还可以包括本文所述的翻译增强子，位于也含有基因沉默抑制子和NPTII的T-DNA上。所述聚合接头还可编码一组或两组6×组氨酸残基，以使得在目的蛋白的N-或C-末端包括His-标签以帮助蛋白纯化。
转录后基因沉默（PTGS）可参与限制植物中转基因的表达，可以使用来自马铃薯病毒Y（HcPro）的沉默抑制子的共表达来抵抗转基因mRNA的特异性降解（Brigneti et al.,1998,EMBO J.17,6739-6746，其以引用的方式纳入本文）。可供选择的沉默抑制子是本领域熟知的并可如本文所述使用（Chiba et al.,2006,Virology346:7-14；其以引用的方式纳入本文），例如但不限于TEV-p1/HC-Pro（烟草蚀纹病毒（Tobaccoetch virus）-p1/HC-Pro）、BYV-p21、番茄丛矮病毒（Tomato bushy stuntvirus）的p19（TBSV p19；其结构描述于WO2010/0003225，其以引用的方式纳入本文）、番茄皱缩病毒（Tomato crinkle virus）的衣壳蛋白（TCV–CP）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus）的2b（CMV-2b）、马铃薯X病毒的p25（PVX-p25）、马铃薯M病毒的p11（PVM-p11）、马铃薯S病毒的p11（PVS-p11）、蓝莓焦枯病毒（Blueberry scorch virus）的p16（BScV–p16）、柑桔衰退病毒（Citrus tristeza virus）的p23（CTV-p23）、葡萄卷叶相关病毒（Grapevine leafroll-associated virus）-2的p24（GLRaV-2p24）、葡萄病毒A的p10（GVA-p10）、葡萄病毒B的p14（GVB-p14）、独活潜伏病毒（Heracleum latent virus）的p10（HLV-p10）或大蒜普通潜伏病毒（Garlic common latent virus）的p16（GCLV-p16）。
因此，一种或多种沉默抑制子，例如但不限于HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、rgscam、FHV的B2蛋白、CPMV的小外壳蛋白（small coat protein）、TCV的外壳蛋白、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10，可以与基于豇豆花叶病毒组的表达盒、衍生自双粒病毒组的扩增元件以及编码目的蛋白的核酸序列一起共表达，以进一步确保在植物内高水平的蛋白生产。
所述表达系统还可包含来自双粒病毒组的扩增元件，例如来自大豆黄矮病毒（BeYDV）的扩增元件。BeYDV属于适合于双子叶植物的玉米线条病毒（Mastreviruses）属。BeYDV是具有单链环状DNA基因组的单分病毒（monopartite）并可以通过滚环机制复制出非常高的拷贝数。衍生自BeYDV的DNA复制子载体系统已被用于在植物中进行快速高收率的蛋白生产。
本文使用的短语“扩增元件”是指包含双粒病毒组基因组的一个或多个长基因区间或长基因间重复（LIR）的至少一部分的核酸片段。本文使用的“长基因区间”、“长基因间重复”是指含有可通过双粒病毒组Rep蛋白介导切除和复制的rep结合位点的长基因区间。在某些方面，所述包含一种或多种LIR的核酸片段还可包含双粒病毒组基因组的短基因区间或小基因区间（SIR）。本文使用的“短基因区间”、“小基因区间”是指互补链（玉米线条病毒属的短IR（SIR））。本文中可以使用任何适合的衍生自双粒病毒组的扩增元件。参见例如WO2000/20557;WO2010/025285;Zhang X.et al.(2005,Biotechnology andBioengineering,Vol.93,271-279),Huang Z.et al.(2009,Biotechnologyand Bioengineering,Vol.103,706-714),Huang Z.et al.(2009,Biotechnology and Bioengineering,Vol.106,9-17)，其以引用的方式纳入本文。如图2B和2D所示，如果在所述构建体中使用了多于一个LIR，例如两个LIR，那么所述启动子、CMPV-HT区域以及目的核酸序列和终止子位于所述两个LIR之间。此外，所述扩增元件可例如源自Halley-Stott et al.(2007)Archives of Virology152:1237-1240中公开的序列，以GenBank登录号DQ458791存储，其以引用的方式纳入本文。所述包含LIR的核酸片段可通过将需要的序列与本文提供的BeYDV序列比对来确定。所述包含LIR的核酸片段是连接的核苷酸2401至2566和1至128。所述包含SIR的核酸片段是核苷酸1154至1212。
如本文所述，通过对本生烟叶的农杆菌浸润共递送衍生自大豆黄矮病毒（BeYDV）的载体和提供Rep/RepA的载体，导致了有效的复制子扩增和强的蛋白质生产。
基于豇豆花叶病毒组的表达盒和衍生自双粒病毒组的扩增元件可以分别包含在第一和第二载体中，或所述组成部分可包括在一个载体中。如果使用两个载体，可将所述第一和第二载体同时或分别引入植物细胞。
在本文所述表达系统中还可包括病毒复制酶以增加目的核酸的表达。复制酶的非限制性实例为编码BeYDV Rep和RepA的BeYDV复制酶（pREP110）（C2/C1;Huang et al.,2009,Biotechnol.Bioeng.103,706-714；其以引用的方式纳入本文）。复制酶的另一个非限制性实例在Halley-Stott et al.(2007),Archives of Virology152:1237-1240中公开，以GenBank登录号DQ458791存储（其以引用的方式纳入本文）。包含C1:C2基因的核酸片段为核苷酸1310至2400。
“共表达”意指两个或多于两个核苷酸序列在植物内并且在相同的植物组织内大约同时表达。但是，所述核苷酸序列不需要在完全相同的时间表达。相反，所述两个或多个核苷酸序列可以这样的方式表达，即使得所编码的产物有机会相互作用。所述两个或多于两个核苷酸序列可以使用短暂表达系统共表达，其中所述两个或多个序列在所有序列都表达的条件下被大约同时引入所述植物。或者，可将包含所述核苷酸序列之一的平台植物以稳定的方式转化，同时将编码目的蛋白的另外序列以短暂方式引入所述平台植物。
可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等将本发明的构建体引入到植物细胞。这些技术的综述参见例如Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academy Press,New York VIII,pp.421-463(1988);Geierson and Corey,Plant Molecular Biology,2d Ed.(1988);和Miki and Iyer,Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In Plant Metabolism,2d Ed.DT.Dennis,DHTurpin,DD Lefebrve,DB Layzell(eds),Addison Wesly,Langmans Ltd.London,pp.561-579(1997)。其他方法包括直接DNA摄入、使用脂质体、电穿孔，例如使用原生质体、微注射、微粒或晶须（whiskers）以及真空浸润。参见，例如，Bilang,et al.(1991,Gene100:247-250),Scheidet al.(1991,Mol.Gen.Genet.228:104-112),Guerche et al.(1987,PlantScience52:111-116),Neuhause et al.(1987,Theor.Appl Genet.75:30-36),Klein et al.,(2987,Nature327:70-73);Freeman et al.(1984,Plant Cell Physiol.29:1353),Howell et al.(1980,Science208:1265),Horsch et al.(1985,Science227:1229-1231),DeBlock et al.,(1989,PlantPhysiology91:694-701),Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.,Academic Press Inc.,1988),Methodsin Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski,eds.,Academic PressInc.,1989)、WO92/09696、WO94/00583、EP331083、EP175966、Liu andLomonossoff(2002,J Virol Meth,105:343-348)、EP290395；WO8706614；美国专利No.4,945,050；5,036,006；和5,100,792、1995年5月10日提交的美国专利申请08/438,666和1992年9月25日提交的07/951,715，（所述文献以引用的方式纳入本文）。
可以使用短暂表达方法表达本发明的构建体（参见D’Aoust et al.,2009,Methods in molecular biology,Vol483,pages41-50;Liu andLomonossoff,2002,Journal of Virological Methods,105:343-348；其以引用的方式纳入本文）。或者，可以使用基于真空的短暂表达方法，其记载于Kapila et al.,（1997,Plant Sci.122,101-108；其以引用的方式纳入本文）或WO00/063400、WO00/037663（其以引用的方式纳入本文）中。这些方法可以包括例如，但不限于农杆菌接种（Agro-inoculation）或农杆菌浸润（Agro-infiltration）、注射器浸润的方法，但是还可以使用上述的其他短暂表达方法。使用农杆菌接种、农杆菌浸润或注射器浸润时，包含所需核酸的农杆菌（Agrobacteria）混合物可进入组织（例如叶、植物地上部分（包括茎、叶和花）、植物其他部分（茎、根、花）或整个植物）的胞间隙。穿过表皮后，所述农杆菌感染细胞并将t-DNA拷贝转移到所述细胞中。所述t-DNA作为游离基因被转录并且所述mRNA被翻译，导致在感染细胞中产生目的蛋白，但是，核内t-DNA的传代（passage）是短暂的。
本发明还考虑的部分是含有本发明的嵌合基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子，其可被用作适合于本文描述的短暂蛋白表达的平台植物。从植物细胞再生整株植物的方法也是本领域中已知的（例如参见Guerineau and Mullineaux(1993,Plant transformation andexpression vectors.In:Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford,BIOS Scientific Publishers,pp121-148）。通常，转化的植物细胞被培养在适当培养基中，所述培养基可以含有选择性试剂例如抗生素，其中使用选择性标记以帮助鉴别转化的植物细胞。一旦愈伤组织形成，可根据已知方法使用适当的植物激素来促进芽（shoot）形成，将所述芽转移到生根培养基以再生植物。然后可以使用所述植物由种子或使用营养繁殖技术来建立重复的世代。不使用组织培养也可以生成转基因植物。用于稳定转化以及再生这些生物的方法在本领域中已经建立并且是本领域技术人员已知的。可使用的技术在Vasil et al.,(Cell Cultureand Somatic Cell Genetics of Plants,VoI I,Il and III,LaboratoryProcedures and Their Applications,Academic Press,1984)和Weissbachand Weissbach,(Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989)中综述。获得转化和再生的植物的方法不是本发明的关键。
如果要用两个或多个核酸构建体转化或共转化植物、植物的部分或植物细胞，那么可将所述核酸构建体在单次转染事件中引入到所述农杆菌，其中将所述核酸合并并按上述转染所述细菌细胞。或者，可将所述构建体连续地引入。在该情形中，按上述将第一构建体引入到所述农杆菌，在选择性条件下（例如存在抗生素）培养所述细胞，其中只有单转化的细菌可以生长。在该第一选择步骤后，按上述将第二核酸构建体引入到所述农杆菌，在双选择性条件下培养所述细胞，其中只有双转化的细菌可以生长。然后可按本文所述使用所述双转化细菌转化植物、植物的部分或植物细胞，或者可以进行另一转化步骤以接纳第三核酸构建体。
本公开内容还提供了包含本发明表达系统的转基因植物，其中与缺少本文所述表达系统的一种或多种组件的其他类似表达系统相比，所述盒中的异源目的核酸以增强的水平表达。
本公开内容还包含用于生产目的蛋白的方法，其包含以下步骤，提供表达本文所述表达系统的植物或植物的部分，收获至少一种其中已表达所述目的蛋白的组织，以及任选地，从所述组织中分离所述目的蛋白。
因此在多个方面，本发明非限制性地提供了：
-一种或多种表达系统，其包含基于豇豆花叶病毒组的表达盒、一个或多个BeYDV扩增元件、启动子、编码目的蛋白的核酸或聚合接头，以及任选的终止子。
-使用一种或多种本文所述表达系统或载体在宿主生物例如植物中表达目的蛋白的方法。
-可从本发明的一种或多种表达系统或载体表达目的蛋白的宿主细胞和生物，以及产生所述宿主和生物的方法。
表1:序列列表
将在如下实施例中进一步解释本发明。但是，应理解，这些实施例仅用于示例性目的，不应被用于以任何方式限制本发明的范围。
表达盒的装配
可用于生产VLP的构建体记载于WO2009/009876、WO2009/076778和WO2010/003225以及美国临时申请No.61/220,161（2009年6月24日提交），所有文献以引用的方式纳入本文。构建体的非限制性实例还可包括表2中所列的那些。这些构建体的装配记载于WO2009/009876、WO2009/076778、WO2010/003225和US61/220,161。但是包含已知HA（包括但不限于在表2提供的那些）以及相似或不同的调节元件和启动子的其他构建体，也可被用于生产本文所述的VLP。
表2：用于血凝素生产的构建体的实例。
实施例
材料和方法-分子克隆
基于CaMV2×35S-CPMV HT的表达盒
2×35S-CPMV HT–天然Sp-HA0H5A/印尼/5/2005(构建体编号 972；SEQ ID NO:1；图1A)。构建体编号972的装配已在前面描述（WO2010/003225，以引用的方式纳入本文），其包含在CaMV2×35S-CPMV HT表达盒控制下的H5A/印尼/5/2005的HA0编码区以及其天然信号肽。所产生的表达盒的序列在图1A提供（SEQ ID NO:1）。
2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0H1A/加利福尼亚/4/2009(构建体 编号560；SEQ ID NO:12；图1B)。构建体编号560的装配已在前面描述（WO2010/003225），其包含在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码——融合到H1A/加利福尼亚/4/2009的HA0的苜蓿PDI信号肽（SpPDI）——的核苷酸序列。所产生的表达盒的序列在图1B提供（SEQ ID NO:2）。
2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0H3A/布里斯班/10/2007(构建体编 号971；SEQ ID NO:3；图1C)。将编码融合到H3A/布里斯班/10/2007的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到CaMV2×35S-CPMV-HT调节元件中。构建体编号736已在前面记载（装配和序列见PCT公开No.WO2010/003225）——简言之，用限制性内切酶ApaI（紧邻ATG的上游）和StuI（紧邻终止密码子的下游）消化构建体736以移除编码融合到H3A/布里斯班/10/2007的HA0的SpPDI的片段。将所产生的片段克隆到之前用ApaI和StuI消化的构建体972（SEQ ID NO:1；图1A）中。将所产生的构建体编号为971（SEQ IDNO:3，图1C）。
2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0B/佛罗里达/4/2006(构建体编号 973；SEQ ID NO:4；图1D)。将编码融合到B/佛罗里达/4/2006的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到CaMV2×35S-CPMV-HT中。构建体编号739已在前面记载（装配和序列见PCT公开No.WO2010/003225）——简言之，用限制性内切酶ApaI（紧邻ATG的上游）和StuI（紧邻终止密码子的下游）消化构建体739以移除编码融合到B/佛罗里达/4/2006的HA0的SpPDI的片段。将所产生的片段克隆到之前用ApaI和StuI消化的构建体972中。将所产生的构建体编号为973（SEQ ID NO:4，图1D）。
带有BeYDV扩增元件的基于CaMV2×35S-CPMV HT的盒
在基于pCAMBIA的载体中含有LIR-多克隆位点(MCS)-SIR+LIR 的受体质粒（构建体849；SEQ ID NO:9；图1E）。将来自大豆黄矮病毒（BeYDV）的长基因区间（LIR）和短基因区间（SIR）按如下方式插入到pCAMBIA二元载体。使用MfeI-MluI-AscI-LIR.c(SEQ ID NO:5)：
CAATTGACGCGTGGCGCGCCCTAGCAGAAGGCATGTTGTTGTGACTCCGAGG
和SbfI-AflII-HindIII-LIR.r(SEQ ID NO:6)：
CCTGCAGGCTTAAGAAGCTTGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAA
作为引物，扩增含有BeYDV LIR序列的第一PCR片段。将构建体pBYGFP（由Arizona State University的Hugh Mason博士惠赠）的2963pb BglII限制性片段进行凝胶提取并用作所述第一PCR反应的模板。载体pBYGFP之前已经记载于Huang et al.(Biotechnology andBioengineering103:706-714(2009))。将所产生的片段用SbfI消化并克隆到pCAMBIA2300(Cambia,canberra，澳大利亚)中，所述pCAMBIA2300在之前已经用HindIII消化，用T4DNA聚合酶处理以形成平末端并最后用SbfI消化。将所产生的质粒命名为pCAMBIA-LIR。使用SacI-EcoRI-SIR.c(SEQ ID NO:7)
TACCGAGCTCGAATTCCGAGTGTACTTCAAGTCAGTTGGAAATC
和SpeI-FseI-LIR.r(SEQ ID NO:8)
ACTAGTGGCCGGCCGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAAATACCTGA
作为引物，并以2116pb BglII限制性pBYGFP片段作为模板，扩增含有BeYDV LIR和SIR序列的第二片段。将所产生的片段用SacI消化并克隆到pCAMBIA-LIR中，所述pCAMBIA-LIR在之前已经用EcoRI消化，用T4DNA聚合酶处理以形成平末端并最后用SacI消化。将所产生的质粒命名为pCAMBIA-LIR-MCS-SIR+LIR。为改变所述LIR-MCS-SIR+LIR序列相对于T-DNA边界方向（orientation）的方向，将pCAMBIA-LIR-MCS-SIR+LIR用MluI和SpeI限制性内切酶消化，并且使用T4DNA聚合酶使所产生的片段形成平末端并重新连接。对用该连接产物转化获得的克隆进行方向筛选，选择其中LIR-MCS-SIR+LIR元件为从左至右的T-DNA方向的克隆并保留作为受体构建体849。有注释的LIR-MCS-SIR+LIR序列在SEQ ID NO:9（图1E）中提供。
在BeYDV扩增元件中的2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0B/佛罗里 达/4/2006（构建体编号853；SEQ ID NO:10；图1F)。将在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码融合到B/佛罗里达/4/2006的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到所述BeYDV扩增元件中。将构建体编号973（SEQ ID NO:4，图1D）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和XbaI（NOS终止子的下游）消化以移除含有整个2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0B/佛罗里达/4/2006表达盒的片段。将所产生的片段克隆到之前用SbfI和XbaI消化的构建体编号849（SEQ IDNO:9；图1E）中。将所产生的构建体编号为853（SEQ ID NO:10，图1F)。
在BeYDV扩增元件中的2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0H1A/加 利福尼亚/4/2009（构建体编号561；SEQ ID NO:11，图1G）。将在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码融合到H1A/加利福尼亚/4/2009的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到所述BeYDV扩增元件中。将构建体编号560（SEQ ID NO:2，图1B）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和StuI（终止密码子的下游）消化以移除含有2×35S-CPMVHT–SpPDI-H1A/加利福尼亚/4/2009表达盒但没有NOS终止子的片段。将所产生的片段克隆到之前用SbfI和StuI消化的构建体编号853（SEQID NO:10；图1F）（含有NOS终止子）中。将所产生的构建体编号为561（SEQ ID NO:11，图1G)。
在BeYDV扩增元件中的2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0H3A/布 里斯班/10/2007（构建体编号851；SEQ ID NO:12，图1H）。将在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码融合到H3A/布里斯班/10/2007的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到所述BeYDV扩增元件中。将构建体编号971（SEQ ID NO:3，图1C）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和StuI（终止密码子的下游）消化以移除含有2×35S-CPMVHT–SpPDI-H3A/布里斯班/10/2007表达盒但没有NOS终止子的片段。将所产生的片段克隆到之前用SbfI和StuI消化的构建体编号853（SEQID NO:10；图1F）（含有NOS终止子）中。将所产生的构建体编号为851（SEQ ID NO:12，图1H)。
在BeYDV扩增元件中的2×35S-CPMV HT–天然Sp-HA0H5A/印 尼/5/2005(构建体编号852；SEQ ID NO:13；图1I）。将在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码H5A/印尼/5/2005的HA0以及其天然信号的序列按如下方式装配到所述BeYDV扩增元件中。将构建体编号972（SEQ ID NO:1，图1A）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和StuI（终止密码子的下游）消化以移除含有2×35S-CPMV HT–天然Sp-HA0H5A/印尼/5/2005表达盒但没有NOS终止子的片段。将所产生的片段克隆到之前用SbfI和StuI消化的构建体编号853（SEQ ID NO:10；图1F）（含有NOS终止子）中。将所产生的构建体编号为852（SEQID NO:13，图1I)。
复制酶表达构建体
复制酶表达构建体（构建体编号834）。携带有用于表达BeYDV复制酶的构建体的质粒由Hugh Mason博士(Arizona State University)惠赠。构建体编号834对应于Huang et al.(2009,Biotechnol.Bioeng.103,706-714)中记载的质粒pREP110。
带有在LIR控制下的BeYDV扩增元件和复制酶基因的基于CaMV2×35S-CPMV HT的盒
在基于pCAMBIA的载体中含有LIR-多克隆位点(MCS)-SIR-复制 酶-LIR的受体质粒（构建体848；SEQ ID NO:14；图1J）。将所述BeYDV复制酶（带有缺失的内含子的C1/C2）按如下方式插入BeYDv SIR和LIR重复之间。使用SacI-EcoRI-SIR.c(SEQ ID NO:7)和SpeI-FseI-LIR.r(SEQ ID NO:8)作为引物扩增PCR片段。将构建体pBYGFP.R（由Arizona State University的Hugh Mason博士惠赠）的2180pb SacI-FseI限制性片段进行凝胶提取并用作所述PCR反应的模板。载体pBYGFP.R之前已经记载于Huang et al.(Biotechnology andBioengineering103:706-714(2009))。将所产生的片段用SacI消化并克隆到构建体849（SEQ ID NO:9，图1E）中，所述构建体849在之前已经用MfeI消化，用T4DNA聚合酶处理以形成平末端并最后用SacI消化。将所产生的受体构建体编号为848（SEQ ID NO:14，图1J)。
在BeYDV+复制酶扩增系统中的2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0B/ 佛罗里达/4/2006（构建体编号475；SEQ ID NO:15，图1K)。将在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码融合到B/佛罗里达/4/2006的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到BeYDV+复制酶扩增系统中。将构建体编号973（SEQ ID NO:4，图1D）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和XbaI（NOS终止子的下游）消化以移除含有整个2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0B/佛罗里达/4/2006表达盒的片段。将所产生的片段克隆到之前用SbfI和XbaI消化的构建体编号848（SEQ IDNO:14；图1J）中。将所产生的构建体编号为475（SEQ ID NO:15，图1K）。
在BeYDV+复制酶扩增系统中的2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0 H1A/加利福尼亚/4/2009（构建体编号471；SEQ ID NO:16，图1L）。5将在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码融合到H1A/加利福尼亚/4/2009的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到BeYDV+复制酶扩增系统中。将构建体编号560（SEQ ID NO:2，图1B）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和StuI（终止密码子的下游）消化以移除含有2×35S-CPMV HT–SpPDI-H1A/加利福尼亚/4/2009表达盒但没0有NOS终止子的片段。将所产生的片段克隆到之前用SbfI和StuI消化的构建体编号475（SEQ ID NO:15；图1K）（含有NOS终止子）中。将所产生的构建体编号为471（SEQ ID NO:16，图1L）。
在BeYDV+复制酶扩增系统中的2×35S-CPMV HT–SpPDI-HA0 H3A/布里斯班/10/2007（构建体编号473；SEQ ID NO:17，图1M）。5将在CaMV2×35S-CPMV-HT控制下的编码融合到H3A/布里斯班/10/2007的HA0的苜蓿PDI信号肽的序列按如下方式装配到BeYDV+复制酶扩增系统中。将构建体编号971（SEQ ID NO:3，图1C）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和StuI（终止密码子的下游）消化以移除含有2×35S-CPMV HT–SpPDI-H3A/布里斯班/10/2007表达盒但没0有NOS终止子的片段。将所产生的片段克隆到之前用SbfI和StuI消化的构建体编号853（SEQ ID NO:10；图1F）（含有NOS终止子）中。将所产生的构建体编号为473（SEQ ID NO:17，图1M)。
在BeYDV+复制酶扩增系统中的2×35S-CPMV HT–天然Sp-HA0 H5A/印尼/5/2005(构建体编号474；SEQ ID NO:18，图1N)。将在CaMV52×35S-CPMV-HT控制下的编码H5A/印尼/5/2005的HA0以及其天然信号的序列按如下方式装配到BeYDV+复制酶扩增系统中。将构建体编号972（SEQ ID NO:1，图1A）用SbfI（CaMV2×35S启动子的上游）和StuI（终止密码子的下游）消化以移除含有2×35S-CPMV HT–天然Sp-HA0H5A/印尼/5/2005表达盒但没有NOS终止子的片段。将所产生0的片段克隆到之前用SbfI和StuI消化的构建体编号853（SEQ ID NO:10；图1F）（含有NOS终止子）中。将所产生的构建体编号为474（SEQID NO:18，图1N）。
质体蓝素-P19（构建体编号R472）。p19的构建记载于WO2010/0003225（其以引用的方式纳入本文）。简言之，将番茄丛矮病毒（TBSV）p19蛋白的编码序列通过Darveau et al.(Methods inNeuroscience26:77-85(1995))中记载的基于PCR的连接方法连接到苜蓿质体蓝素表达盒。在第一轮PCR中，以构建体660（记载于WO2010/0003225，其以引用的方式纳入本文）作为模板，使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO:19):
GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC
和supP19-plasto.r(SEQ ID NO:20)
CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATG
扩增了质体蓝素启动子的片段。同时，使用Voinnet et al.(2003,ThePlant Journal33:949-956)中记载的构建体35S:p19作为模板，使用引物supP19-1c(SEQ ID NO:21):
ATGGAACGAGCTATACAAGG
和SupP19-SacI.r(SEQ ID NO:22):
AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAG
扩增了含有p19编码序列的另一片段。然后混合扩增产物，并用作引物为Plasto-443c和SupP19-SacI.r的第二轮扩增（装配反应）的模板。将产生的片段用BamHI（在质体蓝素启动子中）和SacI（在p19编码序列末端）消化并克隆到之前用相同限制性内切酶消化的构建体编号660中，以得到构建体编号R472。通过电穿孔用所述质粒转化致瘤农杆菌（Agrobacteium tumefaciens，AGL1;ATCC,马纳萨斯,VA20108,USA）（Mattanovich et al.,1989,Nucleic Acids Res.17,6747）。通过限制性内切酶谱确认所有致瘤农杆菌株的完整性。包含R472的致瘤农杆菌株称为“AGL1/R472”。
制备植物生物量、接种物、农杆菌浸润和收获
在填充商业化泥炭藓基质的平地（flats）上由种子培养本生烟植物植株。所述植株可在16/8光周期和白天25℃/夜晚20℃的温度方案下生长在温室中。播种后三周，挑出单个小苗，移植到盆中并使其在相同环境条件下再在温室中生长三周。
将用每个构建体的农杆菌培养在补充有10mM2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素、pH为5.6的YEB培养基中，直到它们的OD600达到0.6-1.6。在使用前将农杆菌悬浮液离心并重悬在浸润培养基（10mM MgCl2和10mM MES，pH5.6）中，然后在4℃储存过夜。在浸润当天，将各批培养物以2.5倍培养物体积稀释并可在使用前将其加热。将本生烟整株植物倒置在处于20-40托（Torr）真空下的气密不锈钢容器中的所述细菌悬浮液中，持续2分钟。使植物返回到温室中进行2-6天的培养，直到收获。除非另有说明，所有浸润均是与AGL1/R472株以1:1比例进行的共浸润或者与AGL1/834共转染时（用于共表达BeYDV复制酶）以1:1:1比例进行的共渗透。
提及包含本文所述多种构建体的致瘤农杆菌株时使用“AGL1”前缀。例如包含构建体编号972（图1A）的致瘤农杆菌被称为“AGL1/972”。
叶取样和总蛋白提取
培养后，收获植物的地上部分，在-80℃下冷冻，粉碎成片。通过在3个体积的冷50mM pH8.0的Tris、0.15M NaCl、0.1%Triton X-100和1mM苯甲基磺酰氟中均质化（Polytron）每个冷冻粉碎的植物材料的样品，提取总可溶蛋白。均质化之后，在4℃下以10,000g离心浆体10分钟，并保留这些澄清的粗提取物（上清液）用于分析。
蛋白分析和免疫印迹
使用牛血清白蛋白作为参考标准通过Bradford分析（Bio-Rad,Hercules,CA）确定澄清的粗提取物的总蛋白含量。将蛋白通过SDS-PAGE分离并电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Roche DiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN）上用于免疫检测。在免疫印迹之前，在4℃下用溶于Tris-缓冲盐水中的5%脱脂乳和0.1%吐温-20（TBS-T）封闭所述膜16-18小时。
通过与溶于TBS-吐温200.1%中2%脱脂奶中的2μg/ml适合一抗（表3）孵育进行免疫印迹。用于化学发光检测的二抗在表3示出，按表所示在TBS-吐温200.1%中2%脱脂奶中稀释。使用鲁米诺作为底物（Roche Diagnostics Corporation）通过化学发光检测免疫反应复合物。使用EZ-Link 
活化过氧化物酶共轭试剂盒（Pierce,Rockford,IL）进行人IgG抗体的辣根过氧化物酶缀合。
表3：用于表达蛋白的免疫印迹的电泳条件、抗体和稀释度
FII:Fitzgerald Industries International,Concord,MA,USA；
NIBSC:National Institute for Biological Standards and Control;
JIR:Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA；
ITC:Immune Technology Corporation,Woodside,NY,USA；
TGA:Therapeutic Goods Administration,Australia。
实施例1-将CPMV-HT表达系统与BeYDV扩增系统结合。
Sainsbury和Lomonossoff已经开发了一种用于在植物中表达重组蛋白的有效系统（2008,Plant Physiology148,1212-1218）。如WO2009/087391中所教导，所述系统使用了豇豆花叶病毒（CMV）基因组RNA2的非翻译区（UTR），其中存在于5’前导序列中的两个第一翻译起始密码子已经被缺失。当与所述CaMV35S启动子和胭脂碱合成酶（NOS）终止子结合时，修饰的CPMV UTR被证明增强侧翼编码区的翻译。所述基于CPMV的表达系统被命名为CPMV-HT（hyperanslatable）。
WO2010/025285教导了，基于大豆黄矮病毒（BeYDV）复制机制的DNA扩增系统有效地增加了植物中重组蛋白的短暂表达水平。
用于在本生烟中通过农杆菌浸润生产流感血凝素（HA）的CPMV-HT表达系统被发现在测试的若干但不是所有的HA类型中产生高水平的HA积累（数据未示出）。还观察到，可以通过用携带有上游调节元件副本的修饰版本，称为双CaMV35S启动子替代所述CaMV35S启动子可以增强可表达的HA的积累水平（数据未示出）。
为进一步增强HA积累水平，制备了将CPMV-HT表达系统与BeYDV扩增系统结合的DNA构建体。所述构建体的装配记载于材料和方法部分（上文；见图1A-1M和表1）。所测试的构建体的示意图在图2中提供。比较了所产生的构建体与其基于CPMV-HT的对应构建体在农杆菌浸润植物中驱动高HA积累水平的效力。在浸润后5-6天收获在CPMV-HT控制下生产HA的植物并将其冷冻，而在浸润后3-4天收获在CPMV-HT+BeYDV控制下生产HA的植物并将其冷冻。在分析当天，从冷冻的生物质提取总可溶蛋白并按上文所述通过蛋白质印迹（Western blot）分析HA积累水平。
对生物质中HA积累水平的蛋白印迹分析显示，与单独使用CPMV-HT系统（AGL1/973；见图1D+AGL1/R472；图3A）时B型流感病毒HA（来自流感B/佛罗里达/4/2006）的无可检测的表达相比，在用结合BeYDV扩增系统与CPMV-HT表达系统的构建体（AGL1/853；见图1F+AGL1/834+AGL1/R472）转化的植物中检测到高水平的相同B型病毒HA。对于H3（A/布里斯班/10/2007；H3N2），相同表达策略的比较表明，虽然CPMV-HT可单独驱动H3的可检测表达（AGL1/971；见图1C+AGL1/R472），但是所述BeYDV扩增系统与CPMV-HT的结合进一步增加了H3积累水平（AGL1/851；见图1H+AGL1/834+AGL1/R472；图3B）。
使用来自流感A/印尼/05/2005的H5时，与结合所述BeYDV扩增系统和CPMV-HT表达系统的构建体（AGL1/852；见图1I+AGL1/834+AGL1/R472）相比，单独使用CPMV-HT表达系统时（AGL1/972；见图1A+AGL1/R472）观察到更高的积累。当比较0.25μg与1μg上样量时，这尤其明显（图3C）。与用AGL1/560（见图1B）+AGL1/R472（在CPMV-HT单独控制下的H1（见图3D））转化的植物相比，在用AGL1/561（见图1G）+AGL1/834+AGL1/R472（在CPMV-HT+BeYDV控制下的H1）转化的植物中A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)株的H1积累更低。进一步研究H1的积累谱以确保积累峰的时间与所测试的其他HA没有不同。当使用CPMV-HT表达系统（AGL1/560+AGL1/R472）时在浸润后第3-5天观察到了H1的最大积累，然而结合的CPMV-HT/BeYDV系统（AGL1/561+AGL1/834+AGL1/R472）在第2-4天产生了较低的H1积累（图3D）。这些结果表明BeYDV扩增系统与基于CPMV-HT的表达系统的结合不总是有益的，并且在某些结合中，与单独使用CPMV-HT表达系统时相比，所述结合可能降低HA积累。
实施例2.使用在单个质粒中的CPMV-HT表达系统和BeYDV扩增系统组合在植物中生产HA。
WO2010/025285教导了在单个载体中装配的基于BeYDV的DNA扩增系统的用途。在该系统中，所述复制酶基因（C1和C2）在病毒LIR启动子的控制之下。所记载的结果显示所述单个载体BeYDV系统与复制酶基因位于独立质粒上的BeYDV系统是等价的。本发明人已经测试了当CPMV-HT+BeYDV表达系统装配在单个载体上时其是否能对HA表达有效。用于HA和复制酶表达的单个载体的示意图在图2D提供。在所测试的所有情况中，携带有在病毒LIR启动子控制下的C1/C2基因（即复制酶为正向）的单个载体系统，比其中复制酶基因位于单独质粒上（复制酶为反向）的双载体系统产生更多的HA。结果在图4A-4D提供。
应该想到，本说明书中论述的任何实施方案均可以实现本发明的任何方法或组合物或者与本发明的任何方法或组合物结合，反之亦然。此外，本发明的组合物可被用于实现本发明的方法。
所有引文以引用的方式纳入本文，犹如具体且单独地指出每个单独的出版物都以引用的方式纳入本文一样，并且如同其在本文中全文叙述一样。本文中对参考文献的引用不应被解释为也不应被认为是承认这些参考文献是本发明的现有技术。
任何未在本文中直接定义的术语应被理解为具有与在本发明领域内的常见理解相关的意义。一些术语已在下文或本说明书中他处论述，以在描述本发明实施方案的装置、方法等以及怎样制造或使用它们时为专业人员提供另外的指导。应理解同一事物可以多于一种方式叙述。因此，替代的语言和同义词可被用于本文所述的任何一个或多个术语。术语是否在本文中详细阐述或论述并不重要。提供了某些同义词或可代换的方法、物质等。除非明确说明，一个或几个同义词或等价物的陈述不排除使用其他的同义词或等价物。说明书中实施例包括术语实例的使用仅用于示例性目的，并不限制本发明实施方案的范围和意义。
如上文所述并参考实施例和附图，本发明实质上包括所有实施方案、修改和变化。对本领域技术人员显而易见的是，可作出许多变化和修改而不背离权利要求所确定的本发明范围。这种修改的实例包括用已知等价物替代本发明任何方面以便以基本相同的方式达到相同的结果。
Claims (44)
1.一种包含第一核酸序列和第二核酸的植物表达系统，所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组（comovirus）增强子可操作地连接的调节区、目的核苷酸序列以及一个或多于一个的双粒病毒组（geminivirus）扩增元件，所述第二核酸编码双粒病毒组复制酶。
2.权利要求1的植物表达系统，其中所述调节区选自质体蓝素启动子、CaMV35S启动子、2×CaMV35S启动子、CAS启动子、RbcS启动子、Ubi启动子或肌动蛋白启动子。
3.权利要求1的植物表达系统，其中所述一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子为豇豆花叶病毒组5’UTR。
4.权利要求3的植物表达系统，其中所述豇豆花叶病毒组5’UTR为豇豆花叶病毒（CPMV）5’UTR。
5.权利要求4的植物表达系统，其中所述豇豆花叶病毒（CPMV）5’UTR包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。
6.权利要求3的植物表达系统，其中所述一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子还包含豇豆花叶病毒组3’UTR。
7.权利要求6的植物表达系统，其中所述豇豆花叶病毒组3’UTR选自豇豆花叶病毒3’UTR和质体蓝素3’UTR。
8.权利要求1的植物表达系统，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列位于同一核酸分子上，或者它们位于不同的DNA分子上。
9.权利要求1的植物表达系统，其中所述一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件选自大豆黄矮病毒（Bean Yellow Dwarf Virus）长基因区间（BeYDV LIR）和BeYDV短基因区间（BeYDV SIR）。
10.权利要求1的植物表达系统，其中所述目的核苷酸序列编码流感血凝素。
11.权利要求10的植物表达系统，其中所述流感血凝素包含天然信号肽序列或非天然的信号肽。
12.权利要求10的植物表达系统，其中所述流感血凝素选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。
13.权利要求10的植物表达系统，其中所述流感血凝素选自B型流感血凝素、A型流感H1亚型血凝素、A型流感H3亚型血凝素和A型流感H5亚型血凝素。
14.权利要求1的植物表达系统，还包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码沉默抑制子。
15.权利要求14的植物表达系统，其中所述沉默抑制子选自HcPro和p19。
16.权利要求14的植物表达系统，其中所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于同一分子上，或者所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上。
17.权利要求14的植物表达系统，还包含第四核酸序列，所述第四核酸序列编码伴侣蛋白。
18.权利要求17的植物表达系统，其中所述伴侣蛋白选自Hsp40和Hsp70。
19.权利要求18的表达系统，其中所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于同一分子上，或者所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于不同DNA分子上。
20.一种包含核酸序列的植物表达系统，所述核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒组增强子可操作地连接的调节区；目的核苷酸序列；一个或多于一个的双粒病毒组扩增元件，以及编码双粒病毒组复制酶蛋白的核酸序列。
21.一种在植物或植物的一部分中生产流感病毒样颗粒（VLP）的方法，所述方法包括将权利要求10的植物表达系统引入所述植物或植物的部分，并在允许所述编码流感血凝素的核苷酸序列表达的条件下培养所述植物或植物的部分，从而生产所述流感VLP。
22.权利要求21的方法，其中在所述引入步骤中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于同一分子上，或者所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于不同的分子上。
23.权利要求22的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于不同的分子上，并且将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
24.权利要求21的方法，其中在所述培养步骤中，所述编码流感血凝素的核苷酸序列的表达是短暂表达。
25.权利要求21的方法，还包括收获所述植物或植物的部分的步骤，从而获得所收获的含有所述流感VLP的植物或植物的部分。
26.权利要求25的方法，还包含从所述收获的含有所述流感VLP的植物或植物的部分中分离所述流感VLP的步骤，从而获得分离的流感VLP。
27.权利要求21的方法，其中在所述引入步骤中，所述植物表达系统还包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码沉默表达的抑制子。
28.权利要求27的方法，其中所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于同一分子上，或者所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上。
29.权利要求28的方法，其中所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，并且将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
30.权利要求27的方法，其中在所述引入步骤中，所述植物表达系统还包含第四核酸序列，所述第四核酸序列编码伴侣蛋白。
31.权利要求30的方法，其中所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于同一分子上，或者所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上。
32.权利要求31的方法，其中所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，并且将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
33.一种在植物或植物的一部分中生产目的蛋白的方法，所述方法包括将权利要求1的植物表达系统引入所述植物或植物的部分，并在允许所述编码目的蛋白的核苷酸序列表达的条件下培养所述植物或植物的部分，从而生产所述目的蛋白。
34.权利要求33的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于同一分子上，或者所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于不同的分子上。
35.权利要求34的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列位于不同的分子上，并且将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
36.权利要求33的方法，其中所述编码目的蛋白的核苷酸序列的表达是短暂表达。
37.权利要求33的方法，还包括收获所述植物或植物的部分的步骤，从而获得所收获的含有所述目的蛋白的植物或植物的部分。
38.权利要求37的方法，还包括从所述收获的含有所述目的蛋白的植物或植物的部分中分离所述目的蛋白的步骤，从而获得分离的目的蛋白。
39.权利要求33的方法，其中在所述引入步骤中，所述植物表达系统还包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码沉默表达的抑制子。
40.权利要求39的方法，其中所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于同一分子上，或者所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上。
41.权利要求40的方法，其中所述第三核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，并且将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
42.权利要求40的方法，其中在所述引入步骤中，所述植物表达系统还包含第四核酸序列，所述第四核酸序列编码伴侣蛋白。
43.权利要求42的方法，其中所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于同一分子上，或者所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上。
44.权利要求43的方法，其中所述第四核酸序列和所述第一核酸序列位于不同的分子上，并且将所述不同的分子同时引入所述植物或植物的部分。
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