CN103261394B

CN103261394B - 细胞培养室及其制造方法、以及利用该细胞培养室的组织模型及其制作方法

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Publication number: CN103261394B
Application number: CN201180054332.2A
Authority: CN
Inventors: 竹泽俊明; 山口宏之; 黑山浩之; 泽口智哉
Original assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An; Kanto Chemical Co Inc
Current assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An; Kanto Chemical Co Inc
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2011-11-10
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2031-11-10
Also published as: US20130280807A1; EP2639293A1; EP2639293B1; JP5933223B2; CN103261394A; WO2012063925A1; EP2639293A4; JP2012115262A

Abstract

本发明提供在筒状框体的一个开放端面被覆固定有玻璃化凝胶膜干燥体的1室型细胞培养室，并且提供由同一平面截面形状形成的2个筒状框体以在对置的开放端面之间存在玻璃化凝胶膜干燥体的状态被粘接固定、并经由玻璃化凝胶膜干燥体形成第1室和第2室的2室型细胞培养室。

Description

细胞培养室及其制造方法、以及利用该细胞培养室的组织模型及其制作方法

技术领域

本发明涉及具备玻璃化凝胶膜干燥体的细胞培养室及其制造方法、以及利用了该细胞培养室的组织模型及其制作方法。

背景技术

在原研药及动物实验代替法的研究中，长久以来需要开发出能够使用各种功能细胞而简便地构建反映生物体的三维组织模型的培养系统。尤其将胶原凝胶用于细胞的培养载体的三维培养技术对再构建血管新生模型、肿瘤浸润模型、上皮间充质模型等有用，但并未得到广泛普及。

作为其理由，认为是由于：以往的胶原凝胶由低密度的纤维构成，因此难以轻柔地进行处理，并且由于其不透明，因此培养细胞的相位差显微镜观察未必容易等。

为了解决这样的问题，本发明人确立以下技术：在培养皿内注入提供了对于在低温凝胶化(gelation)最佳的盐浓度和氢离子浓度(pH值)的胶原的溶胶，再在最佳的温度进行保温而使胶原的溶胶凝胶化，然后通过使其在低温充分干燥而不仅除去自由水还逐渐除去结合水，发生玻璃化(vitrification)，通过进一步使其再水合化(rehydration)，由此将胶原凝胶的物性再现性良好地转化到强度和透明性优异的薄膜上(专利文献1)。

而且，只要是水凝胶，即使是胶原以外的成分的凝胶，通过在玻璃化后使其再水合化，也可以转化到使凝胶稳定的新物性状态，因此将经过该玻璃化工序制作的新物性状态的凝胶命名为玻璃化凝胶(玻璃化凝胶)(非专利文献1)。

尤其，迄今为止开发的胶原玻璃化凝胶薄膜是与生物体内的结缔组织相匹敌的高密度胶原纤维相互缠绕成的厚度几十微米的透明薄膜，其特征为具有优异的蛋白透过性及强度。此外，由于在制作工序的胶原溶胶中可以添加各种物质，因此可以将所添加的物质的特性反映在胶原玻璃化凝胶薄膜上。进而，例如，包埋有环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶薄膜可以容易地用镊子进行处理。

而且，本发明人等进一步扩展有关该胶原玻璃化凝胶薄膜的技术，还提出了以下技术：用于使胶原玻璃化凝胶薄膜的透明性、制作再现性提高的技术(专利文献2)；将胶原玻璃化凝胶制成线状或管状的形状而不是膜形状的技术(专利文献3)；利用磁力固定或移动胶原玻璃化凝胶的技术(专利文献4)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平8-228768号公报

专利文献2：WO2005/014774

专利文献3：日本特开2007-204881号公报

专利文献4：日本特开2007-185107号公报

非专利文献

非专利文献1：Takezawa T，et al.，Cell Transplant.13：463-473，2004

非专利文献2：Takezawa T，et al.，J.Biotechnol.131：76-83，2007

发明内容

发明要解决的技术问题

但是，在以往的胶原玻璃化凝胶薄膜的制造方法中，例如如图21所例示的那样，以使胶原玻璃化凝胶薄膜为任意厚度的方式，在塑料制培养皿中注入规定量的胶原溶胶，使其凝胶化，通过干燥使其玻璃化及再水合化，由此制造胶原玻璃化凝胶薄膜。

因此，在以往的制造方法中，不能从培养皿剥离胶原玻璃化凝胶薄膜的干燥体，胶原玻璃化凝胶薄膜的干燥体被制作成附着于培养皿的底面和壁面的状态。因此无法以膜状态自由地处理胶原玻璃化凝胶薄膜的干燥体，此外，还不能将胶原玻璃化凝胶薄膜的干燥体切断成任意的微细形状。

在此种状况下，本发明人发明出能够成形为所需形状、且用于迅速且大量生产处理性优异的玻璃化凝胶膜干燥体的方法，并进行了专利申请(日本特愿2010-188887)。

根据该方法，可以以膜状态取得玻璃化凝胶膜干燥体而不使其附着于培养皿，因此，利用其处理性、加工性可以确立以往难以实现的玻璃化凝胶膜干燥体的新用途。

另一方面，在开发药品、化妆品或洗涤剂等家庭用化学品时，就作为其原料的化学物质对生物的作用而言，对药效、毒性进行了评价。在此种评价中，以往，将人或动物源性的细胞进行二维平面培养，暴露化学物质，进行讨论其影响的细胞培养实验。进而，当在细胞的二维培养实验中无法充分达成作为目标的药效、毒性的评价时，对小鼠、大鼠、兔、犬、猴等动物投与化学物质，进行讨论其影响的动物实验。但是，近年来，从动物保护意识的提高、成本问题来看，利用能够反映生物体内的组织、尤其是能够反映上皮·间充质等器官单位的三维组织模型的生化学的评价、分子生物学的评价、组织病理学的评价受到瞩目。进而，从外推出化学物质对人的ADMET(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)的观点来看，使用无种差问题的人细胞的评价体系受到瞩目。迄今为止还开发出在组织工程学方面从人细胞再构建成的各种三维组织模型，但是现状是未必提倡再度构建对应哪个器官均能够预测化学物质的ADMET的三维组织模型的技术。

本发明鉴于以上的情况而完成，其目的在于，提供利用了能够成形为所需形状且处理性优异的玻璃化凝胶膜干燥体的细胞培养室、以及利用该细胞培养室能够进行化学物质的ADMET评价等的三维组织模型。

用于解决技术问题的手段

为了解决上述课题，本发明提供以下的细胞培养室、组织模型等。

<1>一种1室型细胞培养室，其特征在于，在筒状框体的一个开放端面被覆固定有玻璃化凝胶膜干燥体。

<2>上述1室型细胞培养室，其特征在于，玻璃化凝胶膜干燥体的形状为与框体的开放端面大致相同的形状。

<3>上述1室型细胞培养室，其特征在于，通过聚氨酯系粘接剂将玻璃化凝胶膜干燥体固定于框体的开放端面。

<4>上述1室型细胞培养室，其特征在于，通过双面胶带将玻璃化凝胶膜干燥体固定于框体的开放端面。

<5>上述1室型细胞培养室，其特征在于，通过热熔敷将玻璃化凝胶膜干燥体固定于框体的开放端面。

<6>上述1室型细胞培养室，其特征在于，在框体中的、与被覆固定有玻璃化凝胶膜干燥体的端面对置的开放端面的外周缘部，配设有向外侧突出的卡止部。

<7>一种2室型细胞培养室，其特征在于，2个筒状框体以在对置的开放端面之间存在玻璃化凝胶膜干燥体的状态相互连结固定，并借助玻璃化凝胶膜干燥体形成第1室和第2室。

<8>上述2室型细胞培养室，其特征在于，玻璃化凝胶膜干燥体的形状为与框体的开放端面大致相同的形状。

<9>上述2室型细胞培养室，其特征在于，通过聚氨酯系粘接剂将玻璃化凝胶膜干燥体固定于框体的开放端面。

<10>上述2室型细胞培养室，其特征在于，通过双面胶带将玻璃化凝胶膜干燥体固定于框体的开放端面。

<11>上述2室型细胞培养室，其特征在于，通过热熔敷将玻璃化凝胶膜干燥体固定于框体的开放端面。

<12>上述2室型细胞培养室，其特征在于，从外侧通过膜状粘接部件将2个框体的对置的开放端面的周围粘接固定。

<13>一种组织模型，其为通过对在上述1室型细胞培养室内的玻璃化凝胶膜干燥体上接种的细胞进行单层或多层培养而构建成的组织模型。

<14>根据<13>的组织模型，其特征在于，其为化学物质的经皮吸收模型、角膜透过性模型、肠道等消化道吸收模型、肺等呼吸道吸收模型、血管透过性模型、肝代谢模型、肾小球过滤排泄模型、皮肤毒性评价模型、角膜毒性评价模型、口腔粘膜毒性评价模型、神经毒性评价模型、肝脏毒性评价模型、肾脏毒性评价模型、胚胎发育毒性评价模型、用于药剂开发的血管新生模型、肿瘤浸润模型中的任一种。

<15>一种组织模型的制作方法，其特征在于，包括以下工序：在上述1室型细胞培养室内的玻璃化凝胶膜干燥体上接种1种以上的细胞，进行单层或多层培养。

<16>一种组织模型，其为通过对在上述2室型细胞培养室内的玻璃化凝胶膜干燥体的两面上接种的细胞进行单层或多层培养而构建成的组织模型。

<17>根据<16>的组织模型，其特征在于，其为化学物质的经皮吸收模型、角膜透过性模型、肠道等消化道吸收模型、肺等呼吸道吸收模型、血管透过性模型、肝代谢模型、肾小球过滤排泄模型、皮肤毒性评价模型、角膜毒性评价模型、口腔粘膜毒性评价模型、神经毒性评价模型、肝脏毒性评价模型、肾脏毒性评价模型、胚胎发育毒性评价模型、用于药剂开发的血管新生模型、肿瘤浸润模型中的任一种。

<18>一种组织模型的制作方法，其特征在于，其为在上述2室型细胞培养室内制作组织模型的方法，其包括以下的工序：从第1室侧将细胞接种于玻璃化凝胶膜上，进行单层或多层培养的工序；以及使培养室上下翻转，从第2室侧将细胞接种于玻璃化凝胶膜上，进行单层或多层培养。

<19>一种1室型细胞培养室的制造方法，其特征在于，其包括以下的工序：(1)在基板上铺设能够剥离玻璃化凝胶膜干燥体的膜，在配置于该膜上的壁面铸型内部形成水凝胶，使水凝胶内的自由水的一部分从基板与壁面铸型的间隙流出的工序；(2)从基板上除去壁面铸型的工序；(3)使水凝胶干燥而除去所残留的自由水，制作玻璃化后的水凝胶干燥体的工序；(4)使水凝胶干燥体再水合化而制作玻璃化凝胶膜的工序；(5)使玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，制作玻璃化后的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；(6)将吸附于膜上的状态的玻璃化凝胶膜干燥体与膜一起从基板上剥离，在筒状框体的一个开放端面粘接固定玻璃化凝胶膜干燥体侧的工序；(7)将玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序；以及(8)从玻璃化凝胶膜干燥体除去膜的工序。

<20>一种1室型细胞培养室的制造方法，其特征在于，其包括以下的工序：(1)在容器内部形成内包有支撑体的水凝胶，使其干燥而除去自由水，制作玻璃化后的带支撑体的水凝胶干燥体的工序；(2)使带支撑体的水凝胶干燥体再水合化而制作带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；(3)使带支撑体的玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，制作在容器内玻璃化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；(4)使带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而从容器剥离后，在夹持于磁石的状态下使其干燥，由此制作从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；(5)在筒状框体的一个开放端面粘接固定从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；以及(6)将带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序。

<21>一种1室型细胞培养室的制造方法，其特征在于，其包括以下的工序：(1)在配置于基板上的壁面铸型内部形成内包有支撑体的水凝胶，使水凝胶内的自由水的一部分从基板与壁面铸型的间隙流出的工序；(2)从基板上除去壁面铸型的工序；(3)使内包有支撑体的水凝胶干燥而除去所残留的自由水，制作玻璃化后的带支撑体的水凝胶干燥体的工序；(4)使带支撑体的水凝胶干燥体再水合化而制作带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；(5)使带支撑体的玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，在基板上制作玻璃化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；(6)使带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而从基板剥离后，在夹持于磁石的状态下使其干燥，由此制作从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；(7)在筒状框体的一个开放端面粘接固定从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；以及(8)将带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序。

<22>一种1室型细胞培养室的制造方法，其特征在于，其包括以下的工序：(1)在容器内部形成内包有支撑体的水凝胶，使其干燥而除去自由水，制作玻璃化后的带支撑体的水凝胶干燥体的工序；(2)使带支撑体的水凝胶干燥体再水合化而制作带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；(3)使带支撑体的玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，在容器内制作玻璃化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；(4)使带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而从容器剥离后，载置于膜上的工序；(5)在筒状框体的一个开放端面粘接固定被再水合化且与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；(6)使与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥，而制作与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；(7)将与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序；以及(8)从带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体除去膜的工序。

<23>一种2室型细胞培养室的制造方法，其特征在于，包括以下工序：利用上述<19>～<22>中任一项的方法制造1室型细胞培养室，从该1室型细胞培养室的粘接固定于筒状框体的玻璃化凝胶膜干燥体或带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的非粘接面侧，抵接由与上述筒状框体相同的平面截面形状形成的另一筒状框体的开放端面，以2个筒状框体之间存在玻璃化凝胶膜干燥体或带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的状态将框体之间相互连结固定的工序。

发明效果

本发明的细胞培养室，利用玻璃化凝胶的特性(高分子透过性、蛋白质等生理活性物质的缓释性、透明性、与生物体接近的纤维密度、稳定性等)，可以容易地构建反映生物体内的组织、器官单位的各种组织模型。

例如，在将各器官的最小单位理解为上皮·间充质·内皮时，化学物质的动态可以分成像皮肤和角膜那样从上皮侧向间充质·内皮侧移行的路径和像投与到血管内的药剂那样从内皮侧向间充质·上皮侧移行的路径。

本发明的组织模型可以构建成以下的模型：仅由最初暴露化学物质的上皮细胞或内皮细胞构成的“组织片(1种细胞)”模型；包括紧接着上皮细胞或内皮细胞而暴露化学物质的间充质细胞在内的、由上皮细胞和间充质细胞、或者内皮细胞和间充质细胞2种细胞构成的“器官样平板(plate)(2种细胞)”模型、以及由伴随化学物质的移行而进行暴露的、上皮细胞、间充质细胞和内皮细胞3种细胞构成的“器官样平板(3种细胞)”模型等。

因此，在构建于以玻璃化凝胶膜为培养载体的腔室内的、本发明的组织模型中，即使不使用实验动物，也能够反映化学物质的移行路径而在药理学、生化学、分子生物学或组织病理学方面解析ADMET的动态。进而，在本发明的组织模型中，在生化学、分子生物学或组织病理学方面不仅能够解析细胞之间的相互作用，而且还能够解析外来性的各种生理活性物质的作用。

附图说明

图1是例示出玻璃化凝胶膜干燥体的制造方法的一个实施方式的流程图。

图2是例示出玻璃化凝胶膜干燥体的制造方法中使用的壁面铸型的立体图。

图3中，(A)是例示出本发明的1室型细胞培养室的制作方法的一个实施方式的立体图。(B)是例示出本发明的1室型细胞培养室的制作方法的一个实施方式的照片图。

图4中，(A)是例示出本发明的1室型细胞培养室的一个实施方式的立体图，(B)是照片图。

图5中，(A)是例示出在容器中插入有本发明的1室型细胞培养室的状态的剖面概略图，(B)为照片图。

图6是例示出使用本发明的1室型细胞培养室制作出组织模型的状态的剖面概略图。

图7是例示出使用本发明的1室型细胞培养室制作出组织模型的状态的剖面概略图。

图8是例示出使用本发明的1室型细胞培养室将细胞以“液相-玻璃化凝胶膜-气相”的状态进行培养的形态的剖面概略图。

图9中，(A)是例示出本发明的2室型细胞培养室的制作方法的一个实施方式的立体图。(B)是例示出本发明的2室型细胞培养室的一个实施方式的立体图。

图10是例示出本发明的2室型细胞培养室的一个实施方式的照片图。

图11是例示出使用本发明的2室型细胞培养室制作出组织模型的状态的剖面示意图。

图12是例示出在讨论蛋白透过性时将玻璃化凝胶腔室悬挂保持于容器内的状态的剖面概略图。

图13是例示出为了讨论玻璃化凝胶腔室的蛋白透过性而将PC-12细胞保持于玻璃化凝胶腔室内、并经由玻璃化凝胶膜使NGF起作用的形态的剖面概略图。

图14中，上栏的图表示在经由玻璃化凝胶膜的NGF的作用下PC-12细胞发生神经突延伸的状态。下栏的图表示在利用了市售的胶原膜腔室时的PC-12细胞的状态。

图15是表示利用了1室型细胞培养室的组织模型的构建工序的概略图。

图16是表示培养出的角膜模型冻结切片的染色像的图。

图17是表示利用人角膜上皮模型得到的眼刺激性物质的评价结果的图。

图18是与图11的示意图中例示出的形态对应的各层细胞的照片。

图19是在相位差显微镜图像中观察到的以市售的PET膜腔室制作出的角膜上皮模型的冻结切片的图。在PET膜的部分确认到切片被分割且PET膜与细胞层剥离。

图20是利用了2室型细胞培养室的组织模型(由2张胶原玻璃化凝胶膜和3种细胞构建的器官状平板)的剖面示意图和制作成的组织模型的冻结切片的染色像的图。

图21是例示出以往的玻璃化凝胶薄膜的制造方法的一个实施方式的流程图。

具体实施方式

以下，对本发明的1室型细胞培养室的制造方法的第1实施方式进行说明。

本发明的1室型细胞培养室中使用的玻璃化凝胶膜干燥体，可以经过例如以下的工序(1)～(5)来制作。

(1)在基板上铺设能够剥离玻璃化凝胶膜干燥体的膜，在配置于该膜上的壁面铸型内部形成水凝胶，使水凝胶内的自由水的一部分从基板与壁面铸型的间隙流出的工序

(2)从基板上除去壁面铸型的工序

(3)使水凝胶干燥而除去所残留的自由水，制作玻璃化后的水凝胶干燥体的工序

(4)使水凝胶干燥体再水合化而制作玻璃化凝胶膜的工序

(5)使玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，制作玻璃化后的玻璃化凝胶膜干燥体的工序

本发明中，“水凝胶”是指高分子利用化学键形成网状结构并在其网眼保有大量水的物质，更具体而言，是指在源于天然物的高分子或合成高分子的人工原材料中引入交联而凝胶化所得的物质。

此外，“水凝胶干燥体”是指从水凝胶除去自由水而玻璃化后的干燥体。进而，“玻璃化凝胶膜”是指使该水凝胶干燥体再水合化而成的膜。需要说明的是，如上所述，“能够经过玻璃化(vitrification)工序制作的新型稳定状态的凝胶”被本发明人命名为“玻璃化凝胶(vitrigel)”。而且，“玻璃化凝胶膜干燥体”是指将该玻璃化凝胶再度玻璃化后的干燥体。玻璃化凝胶膜干燥体可以在需要时通过再水合化而转化成玻璃化凝胶膜。

以下，对各工序进行说明。图1是例示出玻璃化凝胶膜干燥体的制作方法的一个实施方式的流程图。需要说明的是，图1中例示出作为溶胶而使用胶原溶胶的形态。

工序(1)：在基板上铺设能够剥离玻璃化凝胶膜干燥体的膜，在该膜上配置壁面铸型。然后，在该壁面铸型内部注入溶胶，凝胶化后，使水凝胶内的自由水的一部分从基板与壁面铸型的间隙流出。

基板和壁面铸型适宜使用耐受70％乙醇的材料或耐受利用高压灭菌器等的灭菌的材料。具体而言，可例示出聚苯乙烯、亚克力等的塑料、玻璃、或不锈钢等。

作为能够剥离玻璃化凝胶膜干燥体的膜，可例示出石蜡膜、聚乙烯、聚丙烯、Teflon(注册商标)、硅、莎伦包装膜(Saran wrap)、乙烯类树脂等非吸水性膜，特别优选石蜡膜。石蜡膜为以石蜡为原料的热塑性膜，其具有以下特征：具有伸缩性和粘接性，气密性、防水性也优异。以下，仅记载为“膜”。

壁面铸型可以制成例如不具有上面和底面的筒状框体，壁面铸型的形状可以设计成与所需玻璃化凝胶膜的形状相同的形状。具体而言，例如，在制作圆形玻璃化凝胶膜的情况下，可以如图2所例示的那样使用壁面(框)为环状的铸型(圆筒状)。此外，在制作矩形的玻璃化凝胶膜时，可以采用壁面(框)为矩形状的铸型(角筒状)。

而且，在铺设于基板的膜上配置壁面铸型。此时，铺设有膜的区域比壁面铸型的剖面大，膜与壁面铸型的底面呈抵接状态，但物理学上呈现出形成能够利用膜和壁面铸型的表面的凹凸使自由水流出的程度的微小间隙。需要说明的是，可以根据所需数量的玻璃化凝胶膜而在膜上配置多个壁面铸型。

作为在制作水凝胶中使用的原料的源自天然物的高分子，可例示出例如胶原(I型、II型、III型、V型、XI型等)、由小鼠EHS肿瘤提取物(包含IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等)再度构成的基底膜成分(商品名：MATRIGEL)、明胶、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、糖胺聚糖、透明质酸、蛋白聚糖等。能够选择对于各自的凝胶化最佳的盐等成分、其浓度、pH值等来制作水凝胶。通过将原料组合，能够得到模拟各种生物体内组织的玻璃化凝胶膜。

此外，作为在水凝胶的制作中使用的合成高分子，可举出聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、甲基纤维素、聚环氧乙烷、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯/聚己内酯等。此外，也可以使用2种以上上述高分子来制作水凝胶。水凝胶的量可以考虑所制作的玻璃化凝胶膜的厚度来进行调节。

其中，水凝胶的原料优选胶原，在使用胶原凝胶时，可以使用如下而成的胶原凝胶，即，将胶原溶胶注入配置于基板上的壁面铸型中，在培养箱中使其凝胶化而成胶原凝胶。图1中例示出胶原溶胶作为水凝胶的原料。

在以使用胶原溶胶的情况为例进行说明时，关于胶原溶胶，作为具有最佳盐浓度的胶原溶胶，可以用生理盐水、PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲生理盐水)、HBSS(Hank′s Balanced Salt Solution，汉克氏平衡盐溶液)、基础培养液、无血清培养液、含血清培养液或含血清培养液等来制备。此外，胶原凝胶化时的溶液的pH值优选6～8左右。

在此，胶原溶胶的制备优选在4℃进行。然后，凝胶化时的保温必须在比依赖所用胶原的动物种的胶原的变性温度低的温度，通常可以在37℃以下的温度下以能够凝胶化几分钟～几十分钟的温度进行保温。

此外，在胶原浓度为0.2％以下时，胶原溶胶过于稀薄，凝胶化弱，在胶原浓度为0.3％以上时，胶原溶胶过于浓厚而难以均匀化。因此，胶原溶胶的胶原的浓度优选为0.2～0.3％，更优选为0.25％左右。

将经过如此调制的胶原溶胶注入壁面铸型内部。由于上述浓度的胶原溶胶具有粘性，因此，只要将胶原溶胶注入壁面铸型内部后迅速地进行保温，即可使胶原溶胶在几分钟以内凝胶化而不会从基板与壁面铸型的间隙流出。

而且，所形成的胶原凝胶密合于基板和壁面铸型，但通过放置规定的时间，会随着时间的推移而使胶原凝胶内的自由水的一部分从基板与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流出。在此，通过使壁面铸型略微地向上下等移动，凝胶与壁面铸型间的粘着就会被解除，产生微小的间隙，因此能够促进自由水的流出。

进而，例如，在每单位面积(1.0cm²)注入的0.25％胶原溶胶的量为0.4ml以上时，优选在凝胶化后的胶原凝胶内的自由水减至1/4～2/3左右之前经时性地去除从基板与壁面铸型的间隙流出的自由水。由此，凝胶的胶原浓度变为0.375～1.0％左右，因此能够得到即使除去壁面铸型也不会使凝胶形状变形的凝胶强度。需要说明的是，之后，也可以在伴有基板上流出的自由水的状态下，使残留在凝胶内的自由水自然干燥而除去，进行玻璃化。在此，从迅速大量生产的观点出发，使胶原凝胶内的自由水减至1/4～2/3左右的时间优选为2～8小时。进而，之后，使残留在凝胶内的自由水自然干燥而完全除去的时间优选为48小时以内。因此，每单位面积(1.0cm²)注入的0.25％胶原溶胶的量优选为0.1～2.4ml，其结果能够制作每单位面积(1.0cm²)含有250μg～6mg胶原的胶原玻璃化凝胶膜。

工序(2)：从基板上除去壁面铸型。

在铺设于基板的膜上保留水凝胶而除去壁面铸型。由于自由水流出，因此水凝胶能够在膜上维持保持于壁面铸型的形状而不发生变形等。

工序(3)：使水凝胶干燥而除去所残留的自由水，制作玻璃化后的水凝胶干燥体。

利用干燥而完全除去水凝胶内的自由水，进行玻璃化。该玻璃化工序的时间越长，在再水合化时越能够得到透明度、强度越优异的玻璃化凝胶膜。需要说明的是，也可以根据需要将在短时间的玻璃化后再水合化而得的玻璃化凝胶膜用PBS等洗净，再度进行玻璃化。

作为干燥方法，可以使用例如风干、在密闭容器内进行干燥(使容器内的空气循环，不断供给干燥空气)、在放置有二氧化硅凝胶的环境下进行干燥等各种方法。例如，作为风干的方法，可例示出：在10℃、40％湿度下在保持无菌的培养箱中使其干燥2天；或者在无菌状态的洁净台内在室温下干燥一昼夜等方法。

工序(4)：使水凝胶干燥体再水合化而制作玻璃化凝胶膜。

通过用PBS或所使用的培养液等使水凝胶干燥体再水合化，可以制作玻璃化凝胶膜。在此，再水合化的液体中可以含有生理活性物质等各种成分，例如，作为生理活性物质，可举出以抗生物质为代表的各种药品、细胞增殖因子、分化诱导因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、凝集素、或者作为不发生凝胶化的细胞外基质成分的纤连蛋白(fibronectin)、玻连蛋白、巢蛋白(entactin)、骨桥蛋白(Osteopontin)等。此外，也可以含有多种上述物质。

工序(5)：使玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，制作玻璃化后的玻璃化凝胶膜干燥体。

与工序(3)同样，干燥方法可以使用风干、在密闭容器内进行干燥(使容器内的空气循环，不断供给干燥空气)、在放置有二氧化硅凝胶的环境下进行干燥等各种方法。

通过使玻璃化凝胶膜再干燥，能够制作玻璃化后的玻璃化凝胶膜干燥体。该玻璃化凝胶膜干燥体可以在需要时通过再水合化而再度转化成玻璃化凝胶膜。

由于该玻璃化凝胶膜干燥体与能够剥离的膜复层化，因此能够将玻璃化凝胶膜干燥体与膜一起进行自由地处理，并且能够将玻璃化后的玻璃化凝胶膜干燥体切断加工成任意形状。

需要说明的是，“水凝胶干燥体”和“玻璃化凝胶膜干燥体”中含有的成分未必相同。“水凝胶干燥体”含有水凝胶的成分，但“玻璃化凝胶膜干燥体”包含在使水凝胶干燥体再水合化时的水溶液中平衡化后的玻璃化凝胶膜上残留的成分。

此外，与工序(4)中得到的玻璃化凝胶膜相比，通过使工序(5)的玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而得的玻璃化凝胶膜的玻璃化的时间更长，因此强度和透明性优异。

进而，玻璃化的时间也可在“水凝胶干燥体”的状态下进行延长，但“水凝胶干燥体”是水凝胶制作时的成分全部共存的状态，在继续维持水凝胶干燥体时或者利用玻璃化凝胶膜时还会混杂不需要的成分。另一方面，对于使“水凝胶干燥体”再水合化并除去不需要的混杂成分后的玻璃化凝胶膜，其干燥体也要除去不需要的成分。因此，在需要维持较长的玻璃化的时间时，优选在该玻璃化凝胶膜干燥体的状态下继续维持，由于在使玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而得的玻璃化凝胶膜中不会混杂不需要的成分，因此在这一点上是优异的。

进而，玻璃化凝胶膜干燥体也可以经过例如在凝胶化之前的溶胶溶液混合想要含有的生理活性物质、之后进行凝胶化和玻璃化等玻璃化凝胶膜的制作工序来制作。

含有生理活性物质的玻璃化凝胶膜干燥体，能够从玻璃化凝胶膜侧供给细胞的粘附、增殖、分化等所需的因子，因此能够实现更良好的培养环境。此外，非常有用的是进行调查含有的生理活性物质对细胞的影响的试验。此外，含有生理活性物质的玻璃化凝胶膜能够通过移植到体内而作为药物送达系统发挥功能(非专利文献2)。

进而，玻璃化凝胶膜能够透过分子量大的生理活性物质，由此对于在被接种到该玻璃化凝胶膜的不同2个面上的各个细胞之间的、由生理活性物质介导的相互作用的试样和研究大有贡献(非专利文献2)。

根据以上的方法，能够以膜状态取得玻璃化凝胶膜干燥体而不使其附着在培养皿上。此外，该玻璃化凝胶膜干燥体容易进行切断加工，因此能够利用在本发明的细胞培养室中。

图3的(A)是例示出本发明的1室型细胞培养室的制作方法的一个实施方式的立体图。图3的(B)是例示出本发明的1室型细胞培养室的制作方法的一个实施方式的照片图。图4的(A)是例示出本发明的1室型细胞培养室的一个实施方式的立体图。图4的(B)是例示出本发明的1室型细胞培养室的一个实施方式的照片图。

1室型细胞培养室X中，在筒状框体1的一个开放端面1a被覆固定玻璃化凝胶膜干燥体2(图4的(A)(B))。

如图3的(A)(B)所例示的那样，筒状框体1具有用于使内部保持细胞的空间。框体1的材料可以适宜选择适合细胞培养的材料。此外，框体1的形状也没有特别限定，例如可以例示出圆筒状、角筒状。具体而言，框体1可优选例示出亚克力制、聚苯乙烯制的圆筒管。

而且，例如，在该框体1的一个开放端面1a涂布粘接剂，粘接固定玻璃化凝胶膜干燥体2。对开放端面的形状没有特别限定，可例示出例如平面状、段差状、锥形状、槽状等。在使用与膜3复层化的玻璃化凝胶膜干燥体2的情况下，将玻璃化凝胶膜干燥体2侧与框体1粘接后，可以剥离去除膜3。粘接剂可以考虑粘接性、细胞毒性来适宜选择，具体而言，可优选例示出氨基甲酸酯系粘接剂。例如，橡胶系、氰基丙烯酸酯系、丙烯酸系有时显示细胞毒性，热熔体(hot melt)系有时会使玻璃化凝胶膜干燥体2热变性，故不优选。此外，作为其他粘接固定玻璃化凝胶膜干燥体2和框体1的方法，可例示出在玻璃化凝胶膜干燥体2与框体1之间存在双面胶带来进行粘接固定的方法；使用热封机、热板、超声波、激光等将玻璃化凝胶膜干燥体2和框体1热熔敷的方法等。

进而，粘接固定于框体1的一个端面1a的玻璃化凝胶膜干燥体2，可以切断加工成与框体1的端面1a大致相同的形状。与膜3复层化的玻璃化凝胶膜干燥体2，容易进行切断加工，因此可以对从框体1的开放端面1a溢出的多余的部分进行切断。此时，也可以在玻璃化凝胶膜干燥体2的切断加工后剥离除去膜3。由此，如图4的(A)(B)所例示的那样，可以制作处理性优异的1室型细胞培养室。

而且，通过在1室型细胞培养室X内的玻璃化凝胶膜干燥体2上接种所需的细胞并进行培养，可以构建组织模型。通过添加含有细胞的悬浮液、培养液，1室型细胞培养室X的玻璃化凝胶膜干燥体2转化成玻璃化凝胶膜。在此，“组织模型”是指模拟生物体内的细胞状态、组织、器官的模型，其能够检定例如生理活性物质(各种药品等药剂、营养成分、增殖因子等)等对组织(细胞)的影响。

组织模型可以通过例如接种并培养各种哺乳动物源性的细胞等来构建，优选为人源性的细胞。根据采用人源性的细胞的组织模型，在讨论人体中的化学物质的ADMET(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)时，可以确立无种差问题的评价体系。

对组织模型的形态没有限定，但可举出例如能够通过培养被覆上皮细胞、腺上皮细胞等而构建的上皮组织模型；能够通过培养成纤维细胞、脂肪细胞等而构建的结缔组织模型；能够通过培养成肌组织、心肌细胞、平滑肌细胞等而构建的肌肉组织模型；能够通过培养神经细胞、神经胶质细胞等而构建的神经组织模型；以及能够通过将源自其他2种以上的组织的细胞组合而构建的器官样模型等。在此，所用的细胞并不限定于正常的成熟分化细胞，也可以是胚胎干(ES；Embryonic Stem)细胞、成体干(Somatic Stem)细胞、人工多能性干(iPS；Induced pluripotent Stem)细胞等未分化细胞、癌细胞等病灶源性细胞、或者如引入外来性遗传基因之类的转化细胞。通过如此适当地选择所用的细胞，不仅可以创出正常的组织模型，还可以创出在发育或再生过程的组织模型、以癌为代表的病灶的组织模型、或者由人工转化后的细胞构成的组织模型等形态。尤其，作为能够外推出药品、生理活性物质、化妆品或洗涤剂等化学物质对生物体的作用的组织模型的形态，重要的是构建出能够反映在生物体中暴露或投与的化学物质的移行路径的组织模型。从该观点出发，可例示出仅由最初暴露化学物质的上皮细胞或内皮细胞构成的“组织片(1种细胞)”模型；包括紧接着上皮细胞或内皮细胞暴露化学物质的间充质细胞在内的、由上皮细胞和间充质细胞、或者内皮细胞和间充质细胞2种细胞构成的“器官样平板(2种细胞)”模型；以及伴随化学物质的移行而进行暴露的、由上皮细胞、间充质细胞和内皮细胞3种细胞构成的“器官样平板(3种细胞)”模型等。作为此种组织模型，具体而言，包括以化学物质的经皮吸收模型、角膜透过性模型、肠道等消化道吸收模型、肺等呼吸道吸收模型、血管透过性模型、肝代谢模型、肾小球过滤排泄模型为代表的、对化学物质的毒性评价有用的皮肤、角膜、口腔粘膜、神经、肝脏、肾脏等各器官的成熟组织模型以及对化学物质的产生毒性的评价有用的胚组织模型、或者对药剂开发也有用的血管新生模型、肿瘤浸润模型等。

组织模型的检定方法没有具体地限定，但可例示出例如在腔室内直接添加化学物质的方法；利用玻璃化凝胶膜的透过性而使化学物质作用于细胞的方法等。

作为利用玻璃化凝胶膜的透过性的方法，可例示出例如以下方法：将1室型细胞培养室放入注入有生理活性物质的容器内，生理活性物质经由玻璃化凝胶膜向培养细胞浸透，由此检定对细胞的影响。

具体而言，例如，如图5所例示的那样，在与被覆固定有玻璃化凝胶膜干燥体2的框体1的端面对置的开放端面的外周缘部，配设向外侧突出的卡止部4(图4的(A)(B))，从容器H的上侧插入1室型细胞培养室X。然后，在容器H的上部悬挂在框体1配设的卡止部4，由此可以在容器H内保持1室型细胞培养室X。卡止部4不限于图1中例示的形态，例如也可以利用塑料材料等制成棒状、凸缘状等形态。可以在容器H内适宜注入生理活性物质，生理活性物质经由玻璃化凝胶膜向培养细胞浸透，由此可以检定对细胞的影响。

此外，在使用预先含有生理活性物质的玻璃化凝胶膜干燥体时，通过在玻璃化凝胶膜干燥体上培养所需的细胞，能够从水合后的玻璃化凝胶膜向腔室内的培养细胞侧供给生理活性物质，因此能够检定其作用效果。

进而，玻璃化凝胶膜比PET等塑料膜柔软，因此能够容易地制作组织模型的冻结切片。因此，也能够三维性地观察生理活性物质对组织模型的影响。

在1室型细胞培养室X内可以根据目的构建各种组织模型。

具体而言，1室型细胞培养室X，例如，如图6(A)所例示的那样，可以在玻璃化凝胶膜21上接种1种以上所需的细胞。而且，在适宜的条件下，通过对接种后的细胞进行单层或多层培养，从而可以在1室型细胞培养室X内的玻璃化凝胶膜21上构建组织模型。

此外，1室型细胞培养室X，例如，如图6(B)所例示的那样，通过在玻璃化凝胶膜21上添加悬浮有1种以上细胞的胶原培养液(胶原溶胶)并进行培养，从而可以在玻璃化凝胶膜21上构建胶原凝胶内培养有细胞的组织模型。进而，在图6(B)所例示的组织模型上添加悬浮有异种细胞的培养液，以单层或多层状态进行复层培养，由此可以构建例如如图7(A)所例示的那样的组织模型。

此外，例如，利用以以往的方法制作的包埋有环状尼龙膜支撑体的玻璃化凝胶膜，在单面或两面培养1种以上的细胞，并将该玻璃化凝胶膜在图6的(A)(B)、图7的(A)所例示的组织模型上进行复层培养，由此可以构建复层化的组织模型。需要说明的是，图7的(B)例示出在图7的(A)所例示的组织模型上进行复层培养的状态。

由此，根据本发明的1室型细胞培养室，利用玻璃化凝胶的特性(高分子透过性、蛋白质等生理活性物质的缓释性、透明性、与生物体接近的纤维密度、稳定性等)，可以容易地构建反映生物体内的组织、器官单位的各种三维组织模型。具体而言，例如，可以容易地构建仅由最初暴露于化学物质的上皮细胞或内皮细胞构成的“组织片(1种细胞)”模型；包括紧接着上皮细胞或内皮细胞而暴露化学物质的间充质细胞在内的、由上皮细胞和间充质细胞、或者内皮细胞和间充质细胞2种细胞构成的“器官样平板(2种细胞)”模型；以及伴随化学物质的移行而进行暴露的、由上皮细胞、间充质细胞和内皮细胞3种细胞构成的“器官样平板(3种细胞)”模型等。

因此，在即便不使用实验动物也将玻璃化凝胶膜作为培养载体的构建于腔室内的组织模型中，也会反映化学物质的移行路径，可以在药理学、生化学、分子生物学或组织病理学方面对ADMET的动态进行解析。进而，在即使不使用实验动物也会将玻璃化凝胶膜作为培养载体的构建于腔室内的组织模型中，在生化学、分子生物学或组织病理学方面不仅可以解析细胞之间的相互作用，而且可以解析外来性各种生理活性物质的作用。

此外，作为1室型细胞培养室的利用形态，可例示出以下的形态。

例如，在腔室内的玻璃化凝胶膜上接种悬浮于培养液的所需细胞后，将腔室放入注入有培养液的容器中，由此可以在“液相-玻璃化凝胶膜-液相”的状态下培养细胞。进而，通过除去腔室内的培养液，可以在“气相-玻璃化凝胶膜-液相”的状态下培养细胞。该“气相-玻璃化凝胶膜-液相”的培养法，适合于培养例如通常在生物体内也以与空气接触的状态存在的皮肤、口腔、鼻腔、肺的上皮细胞等，能够维持细胞功能而长期进行培养。

进而，例如，如图8所例示的那样，可以将添加有培养液的1室型细胞培养室经由卡止部悬挂在任何物质也无法进入的容器的上部，并保持在容器内的空中。由此，玻璃化凝胶膜上的细胞接触腔室内的培养液、和经由玻璃化凝胶膜的外侧的空气，因此可以在“液相-玻璃化凝胶膜-气相”的状态下从细胞的下侧(作为细胞的粘附面的玻璃化凝胶膜侧)良好地供给氧气进行培养。该“液相-玻璃化凝胶膜-气相”的培养法，也适合于培养例如氧要求性高的肝实质细胞、神经细胞或癌细胞等，能够维持细胞功能而长期进行培养。

进而，通过在使添加有培养液的1室型细胞培养室的玻璃化凝胶膜的外面与容器或其他固体物质抵接的状态下培养玻璃化凝胶膜上的细胞，也可以在“液相-玻璃化凝胶膜-固相”的状态下培养细胞。

图9(A)是例示出本发明的2室型细胞培养室的制作方法的一个实施方式的立体图。图9(B)是例示出本发明的2室型细胞培养室的一个实施方式的立体图。图10是例示出本发明的2室型细胞培养室的一个实施方式的照片图。

本发明的2室型细胞培养室Y中，2个筒状框体1以对置的开放端面1a之间存在玻璃化凝胶膜干燥体2的状态粘接固定，形成被玻璃化凝胶膜干燥体2分隔成的2个室(以下，为了方便起见，有时记载为第1室、第2室)。筒状框体1的形状只要在形成2个室时保持水密性(无漏液)，则没有特别限定，可以适宜使用剖面形状、高度、粗细、厚度不同的各种形状，但作为优选的形状，可例示出例如由同一平面形状形成的2个框体1。

具体而言，2室型细胞培养室Y，例如如下制作：利用上述方法制作1室型细胞培养室X，从该1室型细胞培养室X的玻璃化凝胶干燥体2的非粘接面侧(玻璃化凝胶干燥体2的外面侧)，抵接相同形状的框体1并使其粘接，由此可以制作经由玻璃化凝胶膜干燥体2形成第1室R1和第2室R2的2室型细胞培养室Y。在夹持玻璃化凝胶干燥体2而将2个框体1彼此进行连结时，例如，与1室型细胞培养室X的制作同样，可以适宜使用聚氨酯系粘接剂、双面胶带等。此外，例如，也可以使用石蜡膜等膜状粘接部件，从外侧粘接固定2个框体1的对置面。进而，例如，通过在框体1的开放端面1a进行螺纹口加工等，由此可以利用与螺母(screwcap)、保护帽(snap cap)同样的构造进行缔结、固定。

2室型细胞培养室Y也可以解除框体1之间的粘接。

如图11所例示的那样，2室型细胞培养室Y能够在玻璃化凝胶膜21的单面、两面对1种以上的细胞进行单层或多层培养。关于上述培养，例如与图7(B)等所例示的形态同样也包括添加悬浮有1种以上的细胞的胶原培养液的凝胶内培养。在两面培养中，在各个面接种异种细胞，并且能够在各个第1室、第2室进行培养，在各室中能够进行与1室型培养腔室同样的细胞培养。此时，还对于经由玻璃化凝胶膜21的细胞之间的相互作用进行讨论。

在图11所例示的形态中，例如可以构建在玻璃化凝胶膜21的一个面培养在胶原凝胶中分散的成纤维细胞C1及内皮细胞C2、进而在玻璃化凝胶膜21的另一个面培养上皮细胞C3的三维组织模型等。

通过在2室型细胞培养室Y内的玻璃化凝胶膜21的两面接种并培养所需的细胞，由此可以容易地构建复层化的组织模型。关于组织模型，例如与1室型细胞培养室同样以化学物质的经皮吸收模型、角膜透过性模型、肠道吸收模型、血管透过性模型、肝代谢模型、肾小球过滤排泄模型为代表包括对化学物质的毒性评价有用的各器官的模型、或者对药剂开发有用的血管新生模型或肿瘤浸润模型等。

具体而言，例如，通过在玻璃化凝胶膜21的一个面(第1室侧)培养上皮系细胞、在另一个面(第2室侧)培养间充质细胞，可以构建具有上皮间充质相互作用的经皮吸收模型、肠道吸收模型。此外，通过在一个面(第1室侧)培养血管内皮细胞、在另一个面(第2室侧)培养癌细胞，可以构建血管新生模型、肿瘤浸润模型等，能够检定各种细胞功能。进而，例如，胶原玻璃化凝胶膜由于具有与生物体接近的胶原纤维密度，因此可以再现生物体内的间充质的性质。因此，使用了厚度与角膜实质大致相等(500μm)的玻璃化凝胶膜的2室型细胞培养室Y，可以构建在一个面(第1室侧)上形成角膜上皮细胞、在另一个面(第2室侧)上形成角膜内皮细胞层的、包含上皮、实质、内皮的角膜模型。

在利用2室型细胞培养室Y进行培养时，例如，从第1室侧将细胞接种于玻璃化凝胶膜干燥体2上，进行单层或多层培养后，使2室型细胞培养室Y上下翻转，在从第2室侧将细胞接种于玻璃化凝胶膜21上，进行单层或多层培养，由此可以构建夹持玻璃化凝胶膜21而复层化的组织模型。例如，在2室型细胞培养室内的第2室的玻璃化凝胶膜干燥体上对上皮细胞进行单层或多层培养(或者将内皮细胞进行单层培养)后，使2室型细胞培养室Y上下翻转，在第1室的玻璃化凝胶膜干燥体上接种悬浮于胶原溶胶的间充质细胞，在胶原凝胶内进行培养后，再在胶原凝胶上将内皮细胞进行单层培养(或者将上皮细胞进行单层或多层培养)，由此可以容易地构建伴随化学物质的移行而进行暴露的、由上皮细胞、间充质细胞和内皮细胞3种细胞构成的“器官样平板(3种细胞)”模型。

此外，在2室型细胞培养室Y内构建组织模型后，解除框体1之间的粘接，对于腔室Y内的组织模型，可以与1室型细胞培养室同样地进行各种检定。具体而言，例如，与图5的(A)(B)所例示的方法同样，在框体1的外周缘部配设卡止部，使框体1保持于容器内，将进入到容器内的生理活性物质等从水合后的玻璃化凝胶膜向腔室内的培养细胞(组织模型)侧供给，从而可以对其作用效果进行检定。

由此，根据本发明的2室型细胞培养室，利用玻璃化凝胶的特性(高分子透过性、蛋白质等生理活性物质的缓释性、透明性、与生物体接近的纤维密度、稳定性等)，可以容易地构建反映生物体内的组织、器官单位的各种三维组织模型。具体而言，可以容易地构建例如仅由最初暴露化学物质的上皮细胞或内皮细胞构成的“组织片(1种细胞)”模型；包括紧接着上皮细胞或内皮细胞暴露化学物质的间充质细胞在内的、由上皮细胞和间充质细胞、或者内皮细胞和间充质细胞2种细胞构成的“器官样平板(2种细胞)”模型；以及伴随化学物质的移行而进行暴露的、由上皮细胞、间充质细胞和内皮细胞3种细胞构成的“器官样平板(3种细胞)”模型等。

因此，在即便不使用实验动物也将玻璃化凝胶膜作为培养载体的在腔室内构建的组织模型中，也会反映化学物质的移行路径，可以在药理学、生化学、分子生物学或组织病理学方面解析ADMET的动态。进而，在即使不使用实验动物也将玻璃化凝胶膜作为培养载体的在腔室内构建的组织模型中，在生化学的、分子生物学或组织病理学方面不仅可以解析细胞之间的相互作用，而且可以解析外来性各种生理活性物质的作用。

进而，在如图6、图7、图11所例示的组织模型中用解剖用手术刀等将形成有细胞层的玻璃化凝胶膜从框体进行分离，将其复层化在另一组织模型上，由此可以构建复层化有多个细胞层的组织模型。此外，也可以在使用腔室而构建的组织模型(组织模型A)的框体中以嵌套状插入使用更小的(比框体内径小)腔室构建的组织模型(组织模型B)，并使组织模型B复层化于组织模型A上。

接着，对于本发明的1室型细胞培养室的制造方法的第2实施方式进行说明。对于与第1实施方式通用的部分，省略对其的说明。

第2实施方式中，包括例如以下的工序：

(1)在容器内部形成内包有支撑体的水凝胶，使其干燥而除去自由水，制作玻璃化后的带支撑体的水凝胶干燥体的工序；

(2)使带支撑体的水凝胶干燥体再水合化，制作带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；

(3)使带支撑体的玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，在容器内制作玻璃化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；

(4)使带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而从容器剥离后，在夹持于磁石的状态下使其干燥，由此制作从基板脱离后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；

(5)在筒状框体的一个开放端面粘接固定从基板脱离后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；以及

(6)将带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序。

第2实施方式中，具体而言，例如，按照本发明人申请的WO2005/014774的方法，在培养皿等容器内，制作内包有作为支撑体的环状尼龙膜(以下，环状尼龙膜支撑体)的带支撑体的水凝胶干燥体，进行再水合化、再干燥，制作带环状尼龙膜支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体。干燥、再水合化等处理可以适宜采用与上述方法同样的方法。

然后，使带环状尼龙膜支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体再度再水合化而从容器剥离，在夹持于磁石的状态下使其干燥。磁石优选例如按照本发明人申请的日本特开2007-185107号公报(专利文献4)的方法能够夹持带环状尼龙膜支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的外周缘附近的表背面的磁石。具体而言，磁石的形状优选为圆环状，也可以考虑带环状尼龙膜支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的外径等而将外圆(外周缘)和内圆(内周缘)的大小(宽度)等适宜设计后使用。通过在夹持于磁石的状态下使其干燥，可以制作不附着于培养皿等容器而从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体。此外，在将带环状尼龙膜支撑体的玻璃化凝胶膜与膜一起夹持于磁石的状态下使其干燥后，除去膜，由此可以制作从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体。

而且，将从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体粘接固定于筒状框体的一个开放端面，对从框体的端面溢出的多余部分进行切断，并切断加工成与端面大致相同的形状，由此可以制造一室型细胞培养室。需要说明的是，带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体与筒状框体的粘接固定与第1实施方式同样可以适宜使用粘接剂、双面胶带、热封机等。

进而，对于本发明的一室型细胞培养室的制造方法的第3实施方式进行说明。

第3实施方式中，包括例如以下的工序：

(1)在配置于基板上的壁面铸型内部形成内包有支撑体的水凝胶，使水凝胶内的自由水的一部分从基板与壁面铸型的间隙流出的工序；

(2)从基板上除去壁面铸型的工序；

(3)使内包有支撑体的水凝胶干燥而除去所残留的自由水，制作玻璃化后的带支撑体的水凝胶干燥体的工序；

(4)使带支撑体的水凝胶干燥体再水合化，制作带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；

(5)使带支撑体的玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，在基板上制作玻璃化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；

(6)使带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而从基板剥离后，在夹持于磁石的状态下使其干燥，由此制作从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；

(7)在筒状框体的一个开放端面粘接固定从基板脱离的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；以及

(8)将带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序。

第3实施方式中，利用例如图2所例示的壁面铸型，可以将带环状尼龙膜等支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体以从基板脱离的状态进行制作。第3实施方式中，除了使用配置于基板上的壁面铸型这一点外，其他工序可以与第2实施方式同样地进行。

以下，对本发明的一室型细胞培养室的制造方法的第4实施方式进行说明。

第4实施方式中，包括例如以下的工序：

(4)使带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体再水合化而从容器剥离后，载置于膜上的工序；

(5)在筒状框体的一个开放端面粘接固定被再水合化且与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；

(6)使与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥，制作与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；

(7)将与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序；以及

(8)从带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体除去膜的工序。

第4实施方式的上述工序(1)～工序(3)，可以与第2实施方式同样地进行。

第4实施方式的工序(4)中，将被再水合化而从容器剥离的带支撑体的玻璃化凝胶膜放置于膜上。膜与第1实施方式同样可以适宜使用能够剥离使玻璃化凝胶膜干燥而得的玻璃化凝胶膜干燥体的膜。

而且，工序(5)中，将被再水合化且与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜粘接固定于筒状框体的一个开放端面。粘接固定中可以使用例如丙烯酸系双面胶带，此时，优选对应于框体的端面的形状、大小对双面胶带进行加工。

而且，工序(6)中，使与膜复层化后的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥而得到干燥体，工序(7)中，将所得的干燥体成形为与框体的开放端面大致相同的形状，之后，工序(8)中，通过除去膜，可以制作一室型细胞培养室。工序(6)中的带支撑体的玻璃化凝胶膜的干燥，可以与第1～第3实施方式同样地进行。

进而，作为制造2室型细胞培养室的方法，如下：从用第2～第4实施方式所例示的方法制作的1室型细胞培养室的带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的非粘接面侧，抵接另一筒状框体的开放端面，以在2个筒状框体之间存在带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的状态将框体之间相互连结固定，由此可以制造2室型细胞培养室。

实施例。

以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

<实施例1>吸附于石蜡膜的胶原玻璃化凝胶膜干燥体(胶原量：0.52～2.1mg/cm²)的制作

作为基板，使用直径60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)的底表面。此外，作为壁面铸型，使用外圆的直径为39mm、内圆的直径为35mm且高度为10.0mm的亚克力。石蜡膜(Pechiney Plastic Packaging公司制)切断成直径50mm的圆形后使用。需要说明的是，对于壁面铸型和石蜡膜，均喷雾70％乙醇而实施擦拭的灭菌处理后使用。具体而言，在直径60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底表面上铺设切断成直径50mm的圆形的1张石蜡膜，在其上设置1个壁面铸型，由此制作能够对铺设于基板上的石蜡膜和壁面铸型进行分离的1个容器。

在该容器内注入2.0ml、4.0ml、6.0ml或8.0ml的0.25％胶原溶胶，盖上培养皿的盖后，在5.0％CO₂/95％空气存在下的37.0℃的保湿培养箱内进行凝胶化，由此制作胶原凝胶。此时，注入的胶原溶胶发生凝胶化而不会从铺设于基板上的石蜡膜与壁面铸型的间隙流出。

移入37.0℃的保湿培养箱内后，在第4小时、第6小时及第8小时，对胶原凝胶内的自由水从铺设于基板上的石蜡膜与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流出的量进行定量，并且除去在各时间流出的自由水。需要说明的是，在第2小时使壁面铸型略微地向上下移动，由此解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。其结果如下：源自6.0ml及8.0ml胶原溶胶的胶原凝胶在到达第4小时时有1/3以上的自由水向壁面铸型的外侧流出，源自胶原溶胶4.0ml的胶原凝胶在到达第6小时时有约1/3的自由水向壁面铸型的外侧流出，并且源自2.0ml胶原溶胶的胶原凝胶在到达第8小时时有约1/4的自由水向壁面铸型的外侧流出。

在第8小时从基板上除去壁面铸型，但此时，壁面铸型与胶原凝胶处于非粘接状态，胶原凝胶完全没有附着到从铺设于基板上的石蜡膜除去的壁面铸型的内壁等周围。此外，在第8小时从37.0℃的保湿培养箱移入到10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内，然后，边在取下培养皿的盖的状态下使流出的自由水流出，边将残留在胶原凝胶内的自由水通过自然干燥而完全除去，得到胶原凝胶干燥体。

在此，从完全除去残留于胶原凝胶内的自由水的阶段起，开始玻璃化。为此，对于自然干燥进行到开始该玻璃化(完全除去残留于胶原凝胶内的自由水而成为胶原凝胶干燥体)所需的大致时间进行测量。其结果如下：在2.0ml的0.25％胶原凝胶的情况下，直到开始玻璃化为止所需的时间为20小时以内，此外在4.0ml、6.0ml及8.0ml的0.25％胶原凝胶的情况下，直到开始玻璃化为止所需的时间为20小时以上且41小时以内。

将玻璃化后第1天或第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的洁净台，在基板的培养皿内加入5.0ml的PBS而使其再水合化，以吸附于铺设在基板上的石蜡膜的状态制作胶原玻璃化凝胶膜。然后，用5.0ml的PBS进行几次冲洗，由此以吸附于石蜡膜的状态制作PBS中平衡化的胶原玻璃化凝胶膜。该胶原玻璃化凝胶膜反映壁面铸型的直径35mm的内圆(面积：9.6cm²)形状，并非具有不定形外周缘部。

进而，将吸附于该石蜡膜的状态的胶原玻璃化凝胶膜移入直径60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)中，在10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内以取下盖的状态放置1～2天左右，使其完全干燥后，移入室温下的洁净台，对培养皿盖上盖后，在室温下无菌地进行保管维持，使其进行玻璃化，由此制作吸附于石蜡膜的状态的胶原玻璃化凝胶膜干燥体。该吸附于石蜡膜的状态的胶原玻璃化凝胶膜干燥体，可以用剪刀或手术刀等容易地切断成所需的微细形状。此外，胶原玻璃化凝胶膜干燥体，还能够从石蜡膜容易地剥离。

需要说明的是，只要在上述工序中将环状尼龙膜插入胶原溶胶，即可以以吸附于石蜡膜的状态制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜干燥体。此外，通过改变壁面铸型的底平面形状和高度，能够以吸附于石蜡膜的状态制作具有任意形状和厚度的胶原玻璃化凝胶膜干燥体。

<实施例2>细胞培养室的制作

以往，以附着于培养皿的状态制作玻璃化凝胶膜干燥体，因而无法以膜状态进行处理，因此，例如尝试了通过在像PERMCELL那样的2相性容器中物理性夹持含水分的玻璃化凝胶膜，而制作固定有玻璃化凝胶膜的腔室。但是，伴随该制作的操作繁杂，难以实现大量生产。

本发明中，由于确立了上述玻璃化凝胶膜干燥体的制作方法，因此能够制作利用了玻璃化凝胶膜干燥体的以下的细胞培养室。

(1)1室型细胞培养室

在亚克力制的圆筒管的一个开放端面涂布聚氨酯系粘接剂，使与石蜡膜复层化化的胶原玻璃化凝胶膜干燥体抵接，再从圆筒管上放置重物，使两者成为密合状态。然后，将密合状态的圆筒管与胶原玻璃化凝胶膜干燥体边在室温下充分换气边静置，由此将两者粘接固定。进而，对于胶原玻璃化凝胶膜干燥体从圆筒管向外侧溢出的部分进行切断，使其与圆筒管的端面形状对应，之后，从被粘接固定的胶原玻璃化凝胶膜干燥体剥离石蜡膜，制作在底面具有胶原玻璃化凝胶膜干燥体的1室型细胞培养室。

(2)2室型细胞培养室

由上述的方法制作1室型细胞培养室，从(第1室)胶原玻璃化凝胶干燥体侧的非粘接面侧，使同径且高度低的另一圆筒管(第2室)抵接，利用石蜡膜从外侧被覆抵接部分，由此夹持胶原玻璃化凝胶干燥体而将2个框体彼此连结固定。由此，制作经由胶原玻璃化凝胶膜干燥体而形成有2室(第1室、第2室)的2室型细胞培养室。

<实施例3>玻璃化凝胶腔室的蛋白膜透过性

使用上述的1室型细胞培养室。以下，为了区别本发明的腔室和市售的腔室(后述的比较例)，将本发明的腔室简易地记载为“玻璃化凝胶腔室”(实施例4和实施例6中也同样)。

(1)实施例

以将玻璃化凝胶腔室悬挂于容器内的形态保持玻璃化凝胶腔室，在玻璃化凝胶腔室内，注入含有10mg/ml BSA的磷酸缓冲生理盐水(PBS)500μl，向容器内中注入PBS 1ml(图12)。将其在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置16小时后，用Quick Start蛋白含量测定试剂盒(BIO·RAD LABORATORIES(株)#500-0201JA)对容器内的PBS中的BSA浓度进行测定。其结果如下：BSA浓度为2.1mg/ml，BSA透过玻璃化凝胶膜。

(2)比较例

为了对市售的胶原膜腔室(高研(株)：细胞培养用透过性胶原膜#CM-24)的蛋白透过性进行调查，与上述(1)记载的玻璃化凝胶腔室进行了同样的试样。(其中，由于腔室的大小比玻璃化凝胶腔室小，因此腔室内的液量为337μl，容器内的液量为674μl，使腔室内的液体的高度及腔室内外的液量比与玻璃化凝胶腔室相同。)其结果如下：容器内的PBS中的BSA浓度为试剂盒的检测下限以下，BSA未透过市售品的胶原膜。

<实施例4>玻璃化凝胶腔室的蛋白透过性(在经由膜的NGF的作用下PC-12细胞的神经样突起的延伸)

(1)实施例

以悬挂于容器内的形态(例示于图5的(A)(B))保持玻璃化凝胶腔室，以2.5×10³个/cm²的量在玻璃化凝胶腔室内接种悬浮于培养液[含有10％非动化胎牛血清(Sigma#F2442)、20mM HEPES(GIBCO BRL#15630)、100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)(GIBCO BRL#11885-084)]的PC-12细胞。此外，在容器内只注入1.2ml培养液或者在容器内注入含有5ng/ml NGF(upstate#01-125)的培养液1.2ml(图13)。将其在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养2天后，用相位差显微镜观察细胞的形态。

其结果如下：在容器内仅注入培养液时，PC-12细胞的形态确认到球形的神经样突起的延伸。另一方面，在容器内注入添加有NGF的培养液时，确认到神经样突起的延伸(图14上栏)。即，确认到容器内的NGF作用于PC-12细胞。

(2)比较例

用市售的胶原膜腔室(高研(株)：细胞培养用透过性胶原膜#CM-24)进行同样的实验。其结果如下：无论有无NGF，PC-12细胞的形态均未确认到球形的神经样突起的延伸(图14下栏)。即，容器内的NGF未作用于PC-12细胞。

<实施例5>组织模型的构建

(1)利用了1室型细胞培养室的组织模型

图15是表示利用了1室型细胞培养室的组织模型的构建工序的概略图。在该实施例中，利用了图4的(A)(B)所例示的形态的1室型细胞培养室。此外，图16是表示所培养的角膜模型冻结切片的染色像的图。

将1室型细胞培养室利用配设于框体的卡止部保持于12孔培养用平板(微孔)的孔内，将人角膜上皮细胞6×10⁴个悬浮于培养液500μl，接种到腔室底面的胶原玻璃化凝胶干燥体上。此外，向孔内注入培养液600μl。到铺满(confluent)为止在保湿培养箱(37.0℃、5％CO₂/95％空气)内静置培养2～3天，接着，除去腔室内的培养液，在37.0℃、5％CO₂进行液相气相的界面培养7天。制作界面培养后的细胞层的断面的冻结切片，用Hoechst33342进行核染色，用荧光显微镜进行了观察，结果确认到形成5层左右的细胞层。此外，在界面培养第2天～第7天确认到表示细胞间粘附的形成的经上皮电阻(TEER)值的经时性上升。

进而，如图16所示，用针对紧密连接的标记蛋白ZO-1、Occludin)和间隙连接的标记蛋白(Connexcin-43)的抗体进行免疫染色，结果观察到这些蛋白的表达，由此确认在角膜上皮观察到的紧密连接和间隙连接的形成，并确认到利用本发明的1室型细胞培养室能够容易地构建人角膜上皮模型。

图17是表示利用人角膜上皮模型得到的眼刺激性物质的评价结果的图。在构建成的人角膜上皮模型的细胞层表面暴露眼刺激性物质，对经上皮电阻(TEER)的经时变化进行了测定，结果确认到像眼刺激性强的物质那样TEER显著减少的倾向。尤其确认到暴露眼刺激性物质10秒后的TEER减少率与使用兔作为实验动物的眼刺激性试验(眼刺激试验法(draize method))的结果(眼刺激值(draize score))之间具有相关性。由该结果得出以下启示：在1室型细胞培养室中构建的角膜模型，可以作为使用兔的动物实验的代替法而用于化合物的眼刺激性评价。

(2)利用了2室型细胞培养室的组织模型

图18是与图11的示意图所例示的形态对应的各层的细胞的照片。

为了提高组织模型的稳定性，在由上述的方法制作的2室型细胞培养室的第1室内的胶原玻璃化凝胶干燥体上设置与腔室的内径大致相等的环状尼龙膜(宽1mm)。

在第1室内11接种悬浮有真皮成纤维细胞的胶原溶胶(厚2mm)，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养2小时，使其凝胶化。进而，在该胶原凝胶表面添加培养液(200μl)，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养1天，由此使分散于胶原凝胶内的真皮成纤维细胞C1伸展。进而，在该胶原凝胶的表面接种内皮细胞，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养1天～2天，使内皮细胞铺满。

然后，使2室型细胞培养室Y上下翻转，在第2室内12接种上皮细胞(表皮角化细胞)，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养1天～2天，使上皮细胞铺满。之后，变换为促进表皮角化细胞的分化的培养液，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养2天，再除去该培养液，在液相气相的界面进行培养，使上皮细胞分化。

在观察该组织模型的剖面时，如图18所示，确认到上皮细胞、真皮成纤维细胞和内皮细胞进行三维的复层化，并确认到通过利用2室型细胞培养室Y能够容易地构建皮肤模型。

<实施例6>在玻璃化凝胶腔室上制作的角膜上皮模型的冻结切片制作

(1)实施例

将玻璃化凝胶腔室上制作的角膜上皮模型(实施例5(1))的玻璃化凝胶膜(附着有角膜上皮细胞层)用手术刀从亚克力圆筒切离。将该玻璃化凝胶膜包埋于Tissue-TekO.C.T.混合物(Sakura Finetek制)中，使其冻结。将冻结后的试样在低温恒温器(LEICA制CM3050S)内薄薄地切割成厚5μm，结果得到在玻璃化凝胶膜附着有细胞层的(正常)状态的切片。(图16中示出切片的HE染色像和免疫染色像)。

(2)比较例

在市售的PET膜腔室(微孔制)内以与玻璃化凝胶腔室相同的步骤制作角膜上皮模型。在以与玻璃化凝胶腔室相同的步骤制作冻结切片时，在PET膜的部分试样被分割，PET膜从细胞层剥离，无法得到在PET膜附着有细胞层的(正常)状态的切片(图19)。

<实施例7>利用培养皿的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜干燥体的制作

利用以下的工序A～工序C，制作未吸附有膜的玻璃化凝胶膜干燥体。需要说明的是，以下的工序中的、带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜的制作，依据本发明人申请的WO2005/014774和特开2007-185107号公报的方法进行。

工序A：在直径35mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1008)内插入1个外圆的直径为33mm、内圆的直径为24mm的环状尼龙膜支撑体，其后立即注入2.0ml的0.25％胶原溶胶，盖上培养皿的盖后，在5.0％CO₂/95％空气存在下的37.0℃的保湿培养箱内进行凝胶化，由此制作胶原凝胶。

在第2小时从37.0℃的保湿培养箱移入10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内，之后，在取下培养皿的盖的状态下，将残留于胶原凝胶内的自由水通过自然干燥完全除去，得到玻璃化后的胶原凝胶干燥体。

在此，从完全除去残留于胶原凝胶内的自由水的阶段起，开始玻璃化。将玻璃化后第1天或第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的洁净台，在培养皿内加入2.0ml的PBS，使其再水合化，从培养皿底面和壁面剥离，由此制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。然后，通过用2.0ml的PBS进行几次冲洗，由此制作出PBS中平衡化的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。

进而，将该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜在10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内以取下盖的状态放置1～2天左右，使其完全干燥后，移入室温下的洁净台，盖上培养皿的盖后，在室温下无菌地进行保管维持，使其进行玻璃化，由此制作附着于培养皿的状态的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜干燥体。

工序B：再度向培养皿内加入2.0ml的PBS，使其再水合化，再沿着培养皿的内壁的周围用尖端锋利的镊子进行描划，从培养皿底面和壁面剥离带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。

工序C：将该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜夹持于2个外圆的直径为33mm、内圆的直径为24mm且厚为1mm的环状磁石，在10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内放置一晚，使其干燥，由此制作夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体。

<实施例8>利用壁面铸型的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜干燥体的制作

利用以下的工序A～工序C，制作未吸附有膜的玻璃化凝胶膜干燥体。

工序A：作为基板，使用245×245mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底面，作为壁面铸型，使用34个外圆的直径为38mm、内圆的直径为34mm且高为30mm的亚克力。在1个基板上设置34个壁面铸型，由此制作能够分离基板和壁面铸型的34个容器。在各容器中插入1个环状尼龙膜支撑体，注入2.0ml的0.25％胶原溶胶，在基板上盖上培养皿的盖后，在5.0％CO₂/95％空气存在下的37.0℃的保湿培养箱内使其凝胶化，由此在1个基板上制作34个胶原凝胶。

在第2小时，将壁面铸型略微地向上下移动，由此解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。之后，在到达第4-6小时时，1/3左右的自由水向壁面铸型的外侧流出，因此从基板除去壁面铸型。除去所流出的自由水后，移入10.0℃ 40％湿度的条件下的洁净台内，之后，在取下培养皿的盖的状态下，将残留于胶原凝胶内的自由水通过2天的自然干燥完全除去，得到胶原凝胶干燥体。

在此，从完全除去残留于胶原凝胶内的自由水的阶段起，开始玻璃化。将玻璃化后第1天或第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的洁净台，在培养皿内加入100ml的PBS，使其再水合化，从培养皿底面和壁面剥离，由此制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。

进而，将该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜在10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内以取下盖的状态放置1～2天左右，使其完全干燥后，移入室温下的洁净台，对培养皿盖上盖后，在室温无菌地进行保管维持，使其进行玻璃化，由此制作附着于培养皿的状态的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜干燥体。

工序B：再度向培养皿内加入100ml的PBS，使其再水合化，由此从培养皿底面和壁面剥离34个带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。

工序C：将该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜各1个夹持于2个外圆的直径为33mm、内圆的直径为24mm且厚为1mm的环状磁石，在10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内放置一晚，使其干燥，由此制作34个夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体。

<实施例9>胶原玻璃化凝胶膜干燥体(实施例7、8)对筒状框体的粘接固定

利用以下的方法将实施例7、8中制作的胶原玻璃化凝胶膜干燥体粘接固定到筒状框体上。

a)使用了聚氨酯系粘接剂的粘接固定

在亚克力制的圆筒管(外径15mm、内径11mm)的一个开放端面涂布聚氨酯系粘接剂(Cemedine、No.UM700)，在其上抵接实施例7、8中制作的夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体，使其两者呈密合状态，进行粘接固定。进而，夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体，对于其从圆筒管向外侧溢出的部分进行切断，使其与圆筒管的端面形状对应，制作在底面具有胶原玻璃化凝胶膜干燥体的1室型细胞培养室。

需要说明的是，除了1室型培养室以外，也可以用同样的方法制作2室型培养室。

b)使用了双面胶带的粘接固定

在亚克力制的圆筒管(外径15mm、内径11mm)的一个开放端面贴附切割成与圆筒管的端面相同尺寸的亚克力粘接系双面胶带(日东电工No.57115B)，在其上密合实施例7、8中制作的夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体，进行粘接固定。进而，对夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体的从圆筒管向外侧溢出的部分进行切断，使其与圆筒管的端面形状对应，制作在底面具有胶原玻璃化凝胶膜干燥体的1室型细胞培养室。

c)采用热熔敷的粘接固定

在聚苯乙烯制或亚克力制的圆筒管(外径15mm、内径11mm)的一个开放端面抵接实施例7、8中制作的夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体，仅对两者接触的部分使用热封机作用以热，进行粘接固定(热熔敷)。进而，对于夹持于环状磁石的胶原玻璃化凝胶膜干燥体的从圆筒管向外侧溢出的部分进行切断，使其与圆筒管的端面形状对应，制作在底面具有胶原玻璃化凝胶膜干燥体的1室型细胞培养室。

<实施例10>通过在吸附有膜的玻璃化凝胶膜抵接于筒状框体后使玻璃化凝胶膜干燥来进行粘接固定的细胞培养室的制作

利用以下的工序A～工序D，制作在筒状框体粘接固定有玻璃化凝胶膜的细胞培养室。

需要说明的是，以下的工序中的、带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜的制作，依据本发明人申请的WO2005/014774的方法来进行。

在第2小时从37.0℃的保湿培养箱移入10.0℃ 40％湿度的条件下的洁净台内，之后，在取下培养皿的盖的状态下将残留于胶原凝胶内的自由水通过自然干燥完全除去，得到玻璃化后的胶原凝胶干燥体。

在此，从完全除去残留于胶原凝胶内的自由水的阶段起，开始玻璃化。将玻璃化后第1天或第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的洁净台，在培养皿内加入2.0ml的PBS，使其再水合化，从培养皿底面和壁面剥离，由此制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。然后，用2.0ml的PBS进行几次冲洗，制作PBS中平衡化的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。

进而，将该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜在10.0℃ 40％湿度的条件下的洁净台内以取下盖的状态放置1～2天左右，使其完全干燥后，移入室温下的洁净台，对培养皿盖上盖后，在室温无菌地进行保管维持，使其进行玻璃化，由此制作附着于培养皿的状态的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜干燥体

工序C：在直径150mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底表面上铺设1个聚乙烯片，放入再水合化后的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜。再在亚克力制的圆筒管的一个开放端面粘接切割成与圆筒管的端面相同尺寸的亚克力粘接系双面胶带(日东电工No.57115B)，在该圆筒管的开放端面抵接复层化有聚乙烯片的环状尼龙膜支撑体付胶原玻璃化凝胶膜。之后，从圆筒管上放置重物，在洁净台内放置玻璃化凝胶膜直到干燥，将两者粘接固定。

工序D：进而，将复层化有该聚乙烯片的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃化凝胶膜干燥体所粘接的圆筒管，在10.0℃40％湿度的条件下的洁净台内放置1天左右，使其完全干燥。进而，对胶原玻璃化凝胶膜干燥体的从圆筒管向外侧溢出的部分进行切断，使其与圆筒管的端面形状对应，之后，从被粘接固定的胶原玻璃化凝胶膜干燥体剥离聚乙烯片，制作在底面具有胶原玻璃化凝胶膜干燥体的1室型细胞培养室。

<实施例11>利用2室型细胞培养室的组织模型(由2张胶原玻璃化凝胶膜和3种细胞构建的器官样平板)的制作方法

工序A：在2室型细胞培养室的第2室内的胶原玻璃化凝胶膜干燥体上接种悬浮于培养液(DMEM，10％FBS，20mM HEPES，100units/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1mM l-抗坏血酸磷酸酯，镁盐n-水合物)500μl的人皮肤成纤维细胞1×10⁴个，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养8天，由此诱导成纤维细胞的胶原产生和细胞层的多层化。

工序B：按照实施例5的(1)中记载的方法，在1室型培养室内构建人角膜上皮细胞层。具体而言，在腔室底面的胶原玻璃化凝胶膜上接种悬浮于培养液(500μl)的人角膜上皮细胞6×10⁴个，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养2～3天，接着，除去腔室内的培养液，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)进行液相气相的界面培养7天。由此形成5层左右的细胞层。

工序C：在工序B中制作的1室型细胞培养室(内部构建有角膜上皮细胞层的腔室)的未粘接胶原玻璃化凝胶膜的细胞的面(腔室的外侧)，安装与腔室同径且高度低的亚克力制的圆筒的框体(外径15mm、内径11mm、高5mm)。由此，制作与2室型细胞培养室成同等形状的培养室。

使该细胞培养室上下翻转，在新形成的第2室中接种以与工序1同样的步骤制备的人皮肤成纤维细胞(500μl)，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养1天。

工序D：再次使细胞培养室上下翻转，取下用于形成第2室而暂时固定的亚克力制的框体，使用解剖用手术刀，沿着腔室的内壁切断胶原玻璃化凝胶膜。由此，制作在一面上形成人角膜上皮细胞、在另一面形成人皮肤成纤维细胞的层的胶原玻璃化凝胶膜，构建有人皮肤成纤维细胞层的面以与工序1中制作的人皮肤成纤维细胞层相接的方向复层化于工序1的细胞培养室的2室侧。在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养3天，使第1人皮肤成纤维细胞层和第2人皮肤成纤维细胞层融合。由此，制作在2室型培养室的2室内依次复层化有胶原玻璃化凝胶膜、人皮肤成纤维细胞层、胶原玻璃化凝胶膜、人角膜上皮细胞的模型。

工序E：使工序D中制作的2室型细胞培养室上下翻转，取下用于形成第2室而固定的亚克力制的框体，变更为1室型细胞培养室样的形态。利用配设于框体的卡止部将该细胞培养室保持于12孔培养平板的孔内，在相当于1室的腔室的孔底面的胶原玻璃化凝胶膜上接种悬浮于培养液(500μl)的人皮肤微小血管内皮细胞8×10⁴个，在保湿培养箱(37.0℃，5％CO₂/95％空气)内静置培养1天。

工序F：在观察该组织模型的剖面时，如图20所示，确认到人角膜上皮细胞层、胶原玻璃化凝胶膜、人皮肤成纤维细胞层、胶原玻璃化凝胶膜、人皮肤微小血管内皮细胞进行三维地复层化。由此确认到可以容易地构建模拟上皮-间充质-内皮的器官样平板。

符号说明

1 筒状框体

2 玻璃化凝胶膜干燥体

3 膜

4 卡止部

X 1室型细胞培养室

Y 2室型细胞培养室

Claims

1.一种1室型细胞培养室的制造方法，其特征在于，其包括以下的工序：

(1)在基板上铺设能够剥离玻璃化凝胶膜干燥体的膜，在配置于该膜上的壁面铸型内部形成水凝胶，使水凝胶内的自由水的一部分从基板与壁面铸型的间隙流出的工序；

(2)从基板上除去壁面铸型的工序；

(3)使水凝胶干燥而除去所残留的自由水，制作玻璃化后的水凝胶干燥体的工序；

(4)使水凝胶干燥体再水合化而制作玻璃化凝胶膜的工序；

(5)使玻璃化凝胶膜再干燥而除去自由水，制作玻璃化后的玻璃化凝胶膜干燥体的工序；

(6)将吸附于膜上的状态的玻璃化凝胶膜干燥体与膜一起从基板上剥离，在筒状框体的一个开放端面粘接固定玻璃化凝胶膜干燥体侧的工序；

(7)将玻璃化凝胶膜干燥体的形状成形为与框体的开放端面大致相同的形状的工序；以及

(8)从玻璃化凝胶膜干燥体除去膜的工序。

2.一种1室型细胞培养室的制造方法，其包括以下的工序：

(2)从基板上除去壁面铸型的工序；

(4)使带支撑体的水凝胶干燥体再水合化而制作带支撑体的玻璃化凝胶膜的工序；

3.一种2室型细胞培养室的制造方法，其特征在于，包括以下工序：

利用权利要求1或2所述的方法制造1室型细胞培养室，从粘接固定于该1室型细胞培养室的筒状框体的玻璃化凝胶膜干燥体或带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的非粘接面侧，抵接由与所述筒状框体相同的平面截面形状形成的另一筒状框体的开放端面，以2个筒状框体之间存在玻璃化凝胶膜干燥体或带支撑体的玻璃化凝胶膜干燥体的状态将框体之间相互连结固定。