CN103215290A - 抗虫融合基因、融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域；涉及一种获得高杀虫能力的抗虫融合基因的方法和一种高杀虫能力的抗虫融合基因和融合蛋白、以及用该融合蛋白构建抗虫农作物的具体应用。具体而言，本发明公开了一种抗虫融合基因，其包括从5’－3’ 依次含有编码苏云金芽孢杆菌晶体毒素Cry1Ac的核苷酸序列和编码Cry1Ie毒素的核苷酸序列；Cry1Ac和Cry1Ie核苷酸之间以XmaI酶切位点连接；上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。本发明还公开了上述抗虫融合基因所编码的融合蛋白。本发明还公开了上述抗虫融合蛋白、抗虫融合基因在转基因抗虫农作物中的应用。

Description

抗虫融合基因、融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。涉及一种获得高杀虫能力的抗虫融合基因的方法和一种高杀虫能力的抗虫融合基因和融合蛋白、以及用该融合蛋白构建抗虫农作物的具体应用。

背景技术

害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失。目前，防治害虫主要依靠使用化学农药，但是农药残留会对人体健康带来危害。因此，人们成功的选择了利用杀虫毒素转基因作物进行抗虫。目前，转基因抗虫玉米和棉花已经大量种植。

转基因作物抗虫的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质。杀虫蛋白质有多种，比较常用的是苏云金芽孢杆菌（简称Bt）晶体蛋白质，例如Cry1A，Cry1C等，它们已被大量运用于转基因抗虫作物[1]。但是，单个杀虫毒素往往杀虫谱比较窄，杀虫活性比较低。同时，长期大量使用单一的杀虫蛋白质还可能引起害虫抗性的发展[2,3]。因此，获得高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要应用价值[4]。

参考文献如下：

[1]、Crickmore, N., Zeigler, D. R., Feitelson, J., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J. & Dean, D. H. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 807-813（苏云金芽孢杆菌及杀虫晶体蛋白）；

[2]、Ferre, J. & Van Rie, J. (2002) Annu. Rev. Entomol. 47, 501-533（抗苏云金芽孢杆菌昆虫的生物化学和遗传学）；

[3]、 Gassmann， A.  J., Carrière, Y. & Tabashnik,B. E. (2009) Annu. Rev. Entomol. 54, 147-163（抗苏云金芽孢杆菌昆虫的适合度代价）；

[4]、 Chen, M., Shelton, A. & Ye, G. (2011) Annu.Rev. Entomol. 56, 81-101 (中国转基因抗虫水稻：从研究到商业化)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有高杀虫能力的融合抗虫基因，以及相应的融合蛋白及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗虫融合基因，基因包括从5’－3’ 依次含有编码苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）晶体毒素Cry1Ac的核苷酸序列和编码Cry1Ie毒素的核苷酸序列；Cry1Ac和Cry1Ie核苷酸之间以XmaI酶切位点连接；上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。

作为本发明的抗虫融合基因的改进：抗虫融合基因包括Cry1Ac的修饰基因和Cry1Ie的修饰基因，为如SEQ ID NO：2中的下划线所对应的序列。

作为本发明的抗虫融合基因的进一步改进：抗虫融合基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还同时提供了上述抗虫融合基因所编码的抗虫融合蛋白，抗虫融合蛋白从N端至C端依次为Cry1Ac晶体毒素和Cry1Ie毒素，Cry1Ac和Cry1Ie之间以一个脯氨酸（Pro）和一个甘氨酸（Gly）相连接。

作为本发明的抗虫融合蛋白的改进：其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明还同时提供了上述抗虫融合蛋白在转基因抗虫农作物中的应用。

作为本发明的抗虫融合蛋白在转基因抗虫农作物中的应用的改进：所述农作物为水稻或玉米、棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、萝卜、甘蓝等；虫为鳞翅目害虫。

本发明还提供了上述抗虫融合基因在转基因抗虫农作物中的应用。

作为本发明的抗虫融合基因在转基因抗虫农作物中的应用的改进：农作物为水稻或玉米、棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、萝卜、甘蓝等；虫为鳞翅目害虫。

本发明还提供了上述融合蛋白在转基因抗虫作物和转基因杀虫微生物方面的应用。

本行业的技术人员均知道以下理论：

1、二个Cry杀虫基因的融合并不是都能够增强杀虫能力的。例如Cry1Ab和Cry1Ca的融合蛋白质的杀虫能力比相同重量的单独Cry1Ab和Cry1Ca的混合物的杀虫能力还要低。

2、即使两个单独蛋白质组合使用具有增效作用，但也并不能得出它们的融合蛋白具有高效杀虫能力；这是因为：在蛋白质生物化学上，两个单独蛋白质的物理混和与融合是不同的，不能根据物理混和所具有的增效作用来肯定融合后所获得的增效作用；且在不同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相径庭的。

本发明所设计的以一个脯氨酸（Pro）和一个甘氨酸（Gly）作为连接肽，将Cry1Ac晶体毒素与Cry1Ie毒素融合成人工蛋白质分子。与原先的Cry1Ac和Cry1Ie晶体毒素物理混合相比，具有如下优点：杀虫活性提高，杀虫谱更广。本发明的杀虫蛋白质可以杀灭二化螟、稻纵卷叶螟、棉铃虫和玉米螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫。此外，本发明的融合蛋白质还可以有效的减缓害虫抗性的发生。本发明的杀虫融合基因使用玉米ubiquitin-1启动子和玉米的pepc终止子构建转基因植物载体。包含本发明的杀虫融合基因的转基因植物载体被使用农杆菌介导的方法转入水稻和玉米中。本发明所述融合蛋白也可以在其他转基因抗虫农作物中应用，比如棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、萝卜和甘蓝等。

具体实施方式

本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons 公司出版的Current Protocols in Molecular Biology，和J. Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 出版的Molecular Cloning: A Labortory Manual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1、cry1Ac-cry1Ie融合基因的构建：

编码Cry1Ac和Cry1Ie杀虫蛋白的基因均委托上海生工合成，其DNA序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6。cry1Ac基因被克隆到载体pET28a表达载体中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体命名为pET-1Ac，其编码一个氨基酸序列为SEQ ID NO：3的蛋白质；cry1Ie基因被克隆到载体pET28a表达载体中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体命名为pET-1Ie，其编码一个氨基酸序列为SEQ ID NO：5的蛋白质。

pET-1Ac-1Ie构建过程：cry1Ac片段由BamHI和XmaI酶切pET-1Ac获得，cry1Ie片段由XmaI和SacI酶切pET-1Ie获得。载体pET28a经过BamHI和SacI酶切以后和Cry1Ac以及Cry1I连接，得到载体pET-1Ac-1Ie。这个载体包含一个融合基因，cry1Ac-cry1Ie，DNA序列为SEQ ID NO：2，其编码一个氨基酸序列为SEQ ID NO：1的融合蛋白质。

实施例2、杀虫蛋白质的制备：

包含杀虫基因的载体pET-1Ac、pET-1Ie和pET-1Ac-1Ie分别导入BL21Star（E.coli） 细胞系，在包含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上选取单克隆。单个菌落接种到100毫升LB细菌培养液，在37℃下震动培养至OD₆₀₀=0.6，然后加IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactoside)至浓度为0.5mM， 并继续在同样的条件下培养4小时。培养液经过5000g离心10分钟沉淀大肠杆菌细胞， 然后弃上清收集沉淀。沉淀中加30毫升20mM Tris-HCl缓冲液，超声粉碎。这样获得的重组蛋白质用来进行杀虫活性的测定。

实施例3、在大肠杆菌中表达的杀虫蛋白的杀虫活性测定：

实施例2所获得的杀虫蛋白各100微升单独或者混合涂在0.5平方厘米昆虫人工饲料的表面，饲养新生一龄幼虫用来进行杀虫活性测定。阴性对照的准备方法与实施例2类同，但质粒为不含任何插入DNA的pET28a载体本身。饲养7天以后统计杀虫率，结果如表1和2所示：

表1、Cry1Ac-Cry1I杀虫率

结果表明，融合蛋白质Cry1Ac-Cry1I的杀虫活性比单独的Cry1Ac或者Cry1I明显提高，同时也比Cry1Ac和Cry1I混合的活性明显提高。

实施例4、农杆菌转化T-DNA载体的构建：

农杆菌转化T-DNA载体是基于pCambia 1300载体而构建的。编码杀虫蛋白质的合成核苷酸序列cry1Ac-cry1Ie（SEQ ID No: 2，5’端被设计上 BamHI位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI酶切片段）与玉米的pepc终止子（SEQ ID No：7，5’端被设计上 SacI位点，3’端被设计上KpnI位点， SacI-KpnI片段）连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。

玉米ubiquitin-1启动子从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：

ZmUbiF (5’GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGC AGCGTGACCCGGTCGTGC，添加了 HindIII 位点) 。

ZmUbiR(5’GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG，添加了 BamHI 位点)。

PCR扩增体系：

使用以下程序进行PCR扩增：

步骤b-d为一个循环，重复30次

e. 72℃10分钟

f. 4℃保存反应产物。

玉米ubiquitin-1启动子经过HindIII和BamHI酶切后和基因-终止子片段（BamHI-KpnI片段）共同连接到经过HindIII和KpnI酶切的pCambia1300载体中，获得T-DNA载体pCAM-1Ac-1Ie。由于玉米ubiquitin-1启动子在禾本科植物中均有启动子活性，pCAM-1Ac-1Ie可以作为多种禾本科植物的抗虫转化T-DNA载体。

实施例5、转基因水稻的获得：

转基因植物的获得方法是采用现有技术（卢雄斌 龚祖埙，1998 生命科学 10：125-131；刘凡等，2003 分子植物育种 1：108-115）。选取成熟饱满水稻种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含目的基因的农杆菌(pCAM-1Ac-1Ie)划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中（含乙酰丁香酮），让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含抗生素的筛选培养基上，筛选培养（50ng/mL潮霉素）两个月（中间继代一次）。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。

实施例6、转Cry1Ac-Cry1Ie基因玉米的获得：

取授粉后8-10天的Hi-2玉米穗。收集所有的未成熟胚（大小为1.0-1.5mm）。将含有T-DNA载体pCAM-1Ac-1Ie的农杆菌与未成熟胚共培育共培养2-3天（22℃）。　转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上（含200mg/L的Timentin杀农杆菌），28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有50ng/mL 潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。

转移所有的组织到新鲜潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全。

实施例7、转Cry1Ac-Cry1Ie基因农作物抗虫能力的测定：

利用二化螟和稻纵卷叶螟测定了通过实施例5获得的10个转基因水稻系的杀虫活性。新生二化螟和稻纵卷叶螟的一龄幼虫取食转基因水稻后，有6个转化系的致死率都是100%。

利用玉米螟和棉铃虫测定了通过实施例6获得的10个转基因玉米系的杀虫活性。新生棉铃虫一龄幼虫取食7个转基因玉米系后，全部100%死亡，新生玉米螟一龄幼虫取食7个转基因玉米系后，全部100%死亡。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.抗虫融合基因，其特征是：所述基因包括从5’－3’ 依次含有编码苏云金芽孢杆菌晶体毒素Cry1Ac的核苷酸序列和编码Cry1Ie毒素的核苷酸序列；Cry1Ac和Cry1Ie核苷酸之间以XmaI酶切位点连接；上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。

2.根据权利要求1所述的抗虫融合基因，其特征是：所述抗虫融合基因包括Cry1Ac的修饰基因和Cry1Ie的修饰基因。

3.根据权利要求1或2的抗虫融合基因，其特征是：所述抗虫融合基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

4.如权利要求1~3所述的抗虫融合基因所编码的抗虫融合蛋白，其特征是：所述抗虫融合蛋白从N端至C端依次为Cry1Ac晶体毒素和Cry1Ie毒素，Cry1Ac和Cry1Ie之间以一个脯氨酸（Pro）和一个甘氨酸（Gly）相连接。

5.根据权利要求4所述的抗虫融合蛋白，其特征是：所述抗虫融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

6.如权利要求4或5所述的抗虫融合蛋白在转基因抗虫农作物中的应用。

7.根据权利要求6所述的抗虫融合蛋白在转基因抗虫农作物中的应用，其特征是：所述农作物为水稻或玉米；所述虫为鳞翅目害虫。

8.如权利要求1~3所述的抗虫融合基因在转基因抗虫农作物中的应用。

9.根据权利要求7所述的抗虫融合基因在转基因抗虫农作物中的应用，其特征是：所述农作物为水稻或玉米；所述虫为鳞翅目害虫。