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CN103201290A - S100a4抗体及其治疗用途 - Google Patents

S100a4抗体及其治疗用途 Download PDF

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CN103201290A CN2011800393486A CN201180039348A CN103201290A CN 103201290 A CN103201290 A CN 103201290A CN 2011800393486 A CN2011800393486 A CN 2011800393486A CN 201180039348 A CN201180039348 A CN 201180039348A CN 103201290 A CN103201290 A CN 103201290A
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J·阿丹·布拉纳
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Abstract

本发明涉及针对S100A4的抗体，制备这些抗体的方法，包含这些抗体的药物组合物，以及其的治疗和诊断用途。

Description

S100A4抗体及其治疗用途
发明领域
本发明涉及分子免疫学和人类疾病的处理。特别地，其涉及针对人S100A4的抗体，包含这些抗体的药物组合物，及其治疗和预防用途。
发明背景
癌症是人类恶性肿瘤的最常见类型，癌症的致死性主要是由原发性肿瘤细胞向远端的扩散及随后的转移形成而导致。
已经通过数种途径证实了转移诱导的S100A4蛋白在肿瘤发生进行、血管发生和转移扩散中的因果关系，该S100A4蛋白是钙结合蛋白的S100家族的成员。
S100A4在肿瘤细胞和其基质（包括成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌、炎症和神经细胞）之间发生的肿瘤-基质交叉干扰中扮演关键角色，所述的肿瘤细胞和其基质之间发生的肿瘤-基质交叉干扰主要由直接的细胞-细胞接触或自分泌/旁分泌细胞因子和生长因子信号传导介导的。例如，上皮细胞生长因子，肿瘤生长因子-β1，和成纤维细胞生长因子-2都能够刺激S100A4的表达（Strutz et al.Kidney Int.2002;61(5):1714-1728）（Strutz等，《国际肾脏》2002;61(5):1714-1728）；肿瘤或基质细胞向肿瘤环境释放的S100A4引发在肿瘤细胞中的转移前级联（Grum-Schwensen et al.Cancer Res.2005;65(9):3772-3780）（Grum-Schwensen等，《癌症研究》2005;65(9):3772-3780）；肿瘤细胞或肿瘤相关成纤维细胞，与正常成纤维细胞相比，表达高水平的S100A4（Ambartsumian et al.Oncogene.1996;13(8):1621-1630）（Ambartsumian等，《致癌基因》1996;13(8):1621-1630）；其它宿主源的肿瘤基质细胞，例如淋巴细胞和巨噬细胞，活化后增加S100A4表达（Grigorian et al.Electrophoresis.1994;15(3-4):463-468）Grigorian等，《电泳》1994;15(3-4):463-468）。
S100A4也作为促血管生成因子通过刺激和重建细胞外基质（降解酶的生产）和上皮细胞的移动性而影响肿瘤的血管生成（Schmidt-Hansen et al.J.Biol.Chem.2004;279(23):24498-24504）（Schmidt-Hansen等，《生物化学杂志》2004;279(23):24498-24504）。
S100A4基因自身最初是作为在高度转移的小鼠乳腺癌中差异表达的基因被分离的（Ebralidze et al.Genes Dev.1989;3(7):1086-1093）（Ebralidze等《基因发展》1989;3(7):1086-1093）。也已证明S100A4基因引入非转移性肿瘤细胞系以及其在转移细胞系中的基因抑制改变了这些细胞的发生肿瘤和转移的命运，从而证实了其与肿瘤进行和转移形成的相关性（Lloyd et al.Oncogene.1998;17(4):465-473）（Lloyd等，《致癌基因》1998;17(4):465-473）。
临床上，S100A4表达的高水平与癌症患者的差预后之间的正相关性已经在以下癌症中得到证实：乳腺癌（Rudland PS et al.Cancer Res2000.60(6):1595-1603）（Rudland PS等，《癌症研究》2000.60(6):1595-1603），前列腺癌（Saleem M et al.PNAS2006.103(40):14825-30）（Saleem M等，《PNAS》2006.103(40):14825-30），肺癌（Tsuna M et al.Anticancer Res2009.29(7):2547-54）（Tsuna M等，《抗癌研究》2009.29(7):2547-54），结肠癌（Cho Yet al.World J Gastroent2005.11(31):4852-6）（Cho Y等，《世界肠胃炎杂志》2005.11(31):4852-6），胰腺癌（Rosty C et al.Am J Pathol2002.160(1):45-50）（Rosty C等，《美国病理学杂志》2002.160(1):45-50），肾癌（Bandiera Aet al.World J Surg2009.33(7):1414-20）（Bandiera A等，《世界外科杂志》2009.33(7):1414-20），胃癌（Yonemura Y et al.Clin Cancer Res2000.6(11):4234-42）（Yonemura Y等，《临床癌症研究》2000.6(11):4234-42），卵巢癌（Maelandsmo GM et al.Tumor Biol2009.30(1):15-25）（Maelandsmo GM等，《肿瘤生物学》2009.30(1):15-25），乳头状甲状腺癌（Min HS et al.Mod Pathol2008.21(6):748-55）（Min HS等，《现代病理学》2008.21(6):748-55），黑素瘤（Andersen K et al.Mod Pathol2004.17(8):990-997）（Andersen K等，《现代病理学》2004.17(8):990-997），肝细胞性肝癌（Cui J et al.J Can Res ClinOncol2004.130(10):615-22）（Cui J等，《癌症研究与临床肿瘤学杂志》2004.130(10):615-22），膀胱癌（Agerbaek M et al.Eur Urol2006.50(4):777-785）（Agerbaek M等，《欧洲泌尿学》2006.50(4):777-785），脂肪肉瘤浸润性癌（Pazzaglia L et al.Anticancer Res2004.24(2B):967-972）（Pazzaglia L等，《抗癌研究》2004.24(2B):967-972），成神经细胞瘤（Bjornland K et al.J Pediatr Surg2001.36(7):1040-44）（Bjornland K等，《儿科外科杂志》2001.36(7):1040-44），食管鳞状细胞癌（Ninomiya I et al.Int J Oncol2001.18(4):715-20）（NinomiyaI等，《国际肿瘤学杂志》2001.18(4):715-20），骨肉瘤（Mathisen B et al.ClinExp Metastasis2003.20(8):701-11）（Mathisen B等，《临床与实验转移》2003.20(8):701-11），胆囊癌（Nakamura T et al.Int J Oncol2002.20(5):937-41）（Nakamura T等，《国际肿瘤学杂志》2002.20(5):937-41），口腔鳞状细胞癌（Moriyama-Kita M et al.Oral Oncol2004.40(5):496-500）（Moriyama-Kita M等，《口腔肿瘤学》2004.40(5):496-500），子宫内膜癌（Xie R et al.Lab Invest2009.89(8):937-947）（Xie R等，《实验室投资》2009.89(8):937-947），和成神经管细胞瘤（Hernan R et al.Cancer Res2003.63(1):140-148）（Hernan R等，《癌症研究》2003.63(1):140-148）等等。
多个研究小组已经证实S100A4在多种非恶性病理学状态中的关联，特别是，在病理学例如自体免疫炎症和心血管、神经和肺系统的紊乱（Grigorian Met al.Current Molecular Medicine2008.8(6):492-6）（Grigorian M等，《当今分子医学》2008.8(6):492-6）。因此S100A4是临床应用的备选靶标。然而，由于S100A4的生物功能的复杂性和其未知的完整的作用机理，尚不存在封闭该蛋白的细胞内或细胞外功能的抑制剂。
基于抗体的疗法作为多种疾病的有效治疗的主要部分已经出现。在上个十年，单克隆抗体已经成为在恶性和非恶性疾病的处理中的主要治疗试剂。
迄今为止，针对S100A4引起的单克隆和多克隆抗体已经由不同的公司和研究小组所提供（Zhang et al,Calcium Binding Proteins2006.1:4,219-223（Zhang等,《钙结合蛋白》2006.1:4,219-223）；来自德国抗体在线GmbH的ABIN167355和ABIN171123；来自丹麦DakoCytomation的A5114；等等）。尽管科学和专利研究推测了这些抗体的治疗性应用，据发明人所知，尚没有公开的证据表明该领域现有的抗体已经实际地解决了治疗癌症和非恶性疾病的难题。
WO2000064475（Research Corporation Technologies，Inc.）公开了诊断恶性癌症的方法（i）通过使用针对mts-1蛋白的抗体（抗体可以缀合至毒素）抑制mts-1蛋白或（ii）通过提供编码反义mts-1核苷酸序列的核酸。
因此，本领域目前需要提供新的治疗途径用以治疗癌症，特别是治疗血管生成和转移，靶向于S100A4蛋白。
另外，在诊断水平上，S100A4被认为是正常细胞向肿瘤细胞的分化过程的良好标记，并且因此其成为肿瘤的细胞生物学检查的良好生物标记。然而，在肿瘤组织中检测S100A4的表达显示出需要患者活组织检查的缺陷。因此，本领域目前需要提供更简单和更少创伤性的方法以用于通过检测对象中S100A4的水平的途径而进行癌症的临床诊断。
发明内容
在第一方面，本发明涉及具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的片段，其中的抗体选自下述抗体组：
（i）识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4的表位的抗体，
（ii）识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4的表位的抗体，和
（iii）由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
在另一个方面，本发明涉及杂交瘤细胞系，其选自保藏编号为ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的保藏细胞系组。
在另一个方面，本发明涉及包含药物组合物，其包含药学上有效量的如本发明所述的至少一种抗体或其片段和至少一种药学上可接受的载体。
在另外一个方面，本发明涉及如本发明所述的抗体或其片段用于预防和/或治疗选自转移性疾病和与不期望的血管生成相关的疾病。
在另一方面，本发明涉及缀合物，其包含如本发明所述的抗体或其片段和第二组分，所述第二组分选以下组：
（a）抗血管生成试剂
（b）抗转移试剂
（c）细胞毒素剂
（d）抗炎症试剂
以及其在预防和/或治疗疾病的用途，所述疾病选自转移瘤、与不期望的血管生成相关的疾病和与发炎相关的疾病组。
在另一个方面，本发明涉及获取如本发明所述的抗体的方法，其包含在可以产生所述抗体的条件下培养选自以保藏编号为ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804保藏的细胞系的杂交瘤细胞系。
在另外的方面，本发明涉及包含特异性抗S100A4抗体和抗代谢物的组合物以及其在预防和/或治疗癌症或转移瘤中的用途。
在另一个方面，本发明涉及特异性结合S100A4蛋白的抗体或其能够结合抗原的片段在制备用于预防和/或治疗与炎症相关的疾病的药物中的用途。
还在另外一个方面，本发明涉及在对象中诊断癌症或与炎症相关的疾病的体外方法，其包含：
（a）检测所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平，其是通过利用选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体实现的
（b）将所述水平与对照值比较
其中，相对于对照值，S100A4蛋白或其变体的水平的增加表示该对象患有癌症或与炎症相关的疾病。
在另外一个方面，本发明涉及在样品中检测S100A4的方法，其包含：
（i）将怀疑含有S100A4的样品与本发明定义的特异性抗S100A4抗体或其片段接触
（ii）检测S100A4和抗体或其片段之间形成的免疫复合物
其中检测到S100A4和抗体之间的免疫复合物表示在样品中的存在S100A4。
在另一个方面，本发明涉及在生物流体中诊断癌症或与炎症相关的疾病的试剂盒，其包含至少一种如本发明所述的抗体或其片段。
在另一个方面，本发明涉及为诊断患有癌症的对象设计定制疗法的体外方法，其包含在用相同的单克隆抗体的疗法之前或之后，检测所述对象的生物流体样品中S100A4蛋白或其变体的水平，所述检测是通过利用选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体实现的，其中相对于S100A4或其变体的水平，疗法之后S100A4蛋白或其变体的水平的增加表示该患者需要原来施加的疗法之外的可选疗法。
本发明的一个目的是提供特异性结合人或鼠类S100A4而不结合其它S100家族蛋白的抗体。
本发明的一个目的是提供敏感地结合人或鼠类S100A4的抗体，其检测限为纳克甚至皮克。
本发明的一个重要目的是提供针对S100A4的治疗性抗体，其具有证实的针对恶性和非恶性疾病的活性。
本发明的一个重要目的是提供针对S100A4的治疗性抗体，其具有证实的针对恶性和非恶性疾病的体内活性，而在其在体内发挥效果之前不被代谢或降解。
本发明的一个重要目的是提供针对S100A4的治疗性抗体，其具有证实的针对恶性或非恶性疾病的活性，而影响最小或没有毒性作用。
本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制肿瘤生长。
本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制肿瘤发展。
本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制血管生成和肿瘤血管生成。
本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制上皮细胞转移。
本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制癌症干细胞。
本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制炎症性过程。
附图说明
图1.通过蛋白质印迹分析测定的S100A4蛋白的表达。（A）在来自不同来源的肿瘤细胞系和小鼠胚细胞成纤维细胞系NIH3T3的总提取物中，S100A4表达水平。（B）在来自源于HCT116，MiaPACA-2和PxPC3异种移植模型的肿瘤的总提取物中，S100A4表达水平。（C）在来自肿瘤细胞系MDA-MB-231和源自这些细胞系的癌症干细胞的总提取物中，S100A4表达水平。
图2.S100A4表达的免疫组织化学分析。S100A4表达和分布的比较性免疫组织化学分析，在源自两个胰腺癌细胞系Panc1和BxPC3的肿瘤中，在5C3和最常引用的针对S100A4的兔多克隆抗体（Dako）之间用于组织学分析。图像（A-D）在放大率X40下获得。图像（E-H）在放大率X120下获得。（A）该案例显示了在源自BxPC3细胞系异种移植模型的样品中，在浸润性前部中相比在肿瘤的中心S100A4有更强的表达，以小鼠单克隆抗体5C3染色。（B）该案例显示了该案例显示了在源自BxPC3细胞系异种移植模型的样品中，在浸润性前部中相比在肿瘤的中心S100A4具有更强的表达，以来自Dako的兔多克隆抗体染色。（C）在源自BxPC3细胞系异种移植模型的肿瘤中，用不相关的小鼠单克隆抗体染色作为阴性对照。（D）在源自BxPC3细胞系异种移植模型的肿瘤中，不用初级抗体染色的阴性对照。（E）在源自Panc-1细胞系的异种移植模型的肿瘤的细胞质和细胞核中的S100A4的强烈表达，以小鼠单克隆抗体5C3染色。（F）在源自Panc-1细胞系的异种移植模型的肿瘤的细胞质和细胞核中的S100A4的强烈表达，以来自Dako的兔多克隆抗体染色。（G）在源自Panc-1细胞系异种移植模型的肿瘤中用不相关的小鼠单克隆抗体抗多组氨酸染色作为阴性对照。（H）在源自Panc-1细胞系异种移植模型的肿瘤样品中，不用初级抗体染色的阴性对照。
图3.5C3使S100A4诱导的MMP9蛋白水解活性失效。在HUVEC条件培养基中MMP的蛋白水解活性。以不同的刺激处理HUVEC24小时。离心上清液以消除碎片并进行明胶酶谱分析。较清晰的条带代表MMP9和MMP2活性。（A）S100A4以剂量依赖性方式增加了MMP9的活性形式的分泌。（B）单克隆抗体5C3使由重组S100A4蛋白诱导的MMP9的活性形式的产生失效。
图4.在HUVEC转移中，数种针对S100A4的单克隆抗体的抑制效果。在转移诱导之前，抗体用S100A4蛋白在37℃下孵育2小时。HUVEC用S100A4（1μM）、VEGF（3ng/ml）、另加S100A4的VEGF的组合或这些蛋白与抗体（5C3，1E2，8B6，6B9，5A3，5H4）的组合处理24小时。（A）细胞用5C3（0.25，0.5，1，2，和4μM）和5H4（4μM）处理24小时。每个数据点用代表100%转移的阳性对照（左侧棒）校准。阳性对照对应于以EBM加补充物（EGM）和FCS（完全培养基）孵育的细胞。（B）细胞用5C3，1E2，8B6，6B9，5A3（2μM）处理24小时。每个数据点用代表100%转移的VEGF加S100A4诱导的转移校准。数据棒图显示了平均值±s-d。**p<0.005（“曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney U检验）”）。
图5.在人胰腺（MiaPACA-2）肿瘤中5C3抗体的抗肿瘤活性。在第0天，雌性无胸腺裸小鼠以0.1ml不含补充物的培养基皮下灌输5x106MiaPACA-2至小鼠的右上肋腹部。当肿瘤达到MiaPACA-2细胞65-160mm3，开始处理。处理组由10只动物。PBS（阴性对照）或5C3（25mg/kg）在一周内（1010100）腹膜内给予3次。最后制剂缓冲液作为载体对照给予。肿瘤大小每周测量3次，肿瘤体积根据以下公式计算：肿瘤大小=宽度2·长度/2。实验末尾（MiaPACA-2细胞的第30天），承受肿瘤的小鼠被处死并移除和称重肿瘤。（A，B）MiaPACA-2实验的结果。相对肿瘤体积和肿瘤质量的图表显示为平均值±s-d ns p>0.05，*p<0.05，***p<0.001（“Mann-Whitney U检验”）。
图6.裸小鼠中单克隆抗体5C3的剂量时间表。
图7.肿瘤微脉管系统的量化。来自MiaPACA-2肿瘤的微脉管系统（鼠CD31单克隆抗体）的免疫组织学分析。脉管系统的水平在实验结束（第30天）测量，比较PBS对照组和用单克隆抗体5C3处理的动物。（A）在确定的肿瘤区域的脉管密度（MVD），以每mm2的脉管剖面（v.p.）的平均值表达。（B）在肿瘤中的导管区域（Aa）的量化。
量化通过每个切片的8和39图之间的分析而得出，基于X120放大率的肿瘤大小。图像用NIH ImageJ成像软件分析。图表显示为平均值±sd*p<0.05（“Mann-Whitney U检验”）。
图8.单克隆抗体5C3显示了体内非毒性效果。在第0天，雌性无胸腺裸小鼠以0.1ml不含补充物的培养基皮下灌输5x106MiaPACA-2细胞或1x106HCT116细胞至小鼠的右上肋腹部。当肿瘤达到MiaPACA-2的65-160mm3或HCT116细胞的155-370mm3，开始处理。MiaPACA-2或HCT116细胞的处理组分别有10只或7只动物。PBS（阴性对照）或5C3（25mg/kg）在一周内（1010100）腹膜内给予3次。最后制剂缓冲液作为载体对照给予。体重随着实验每周测量3次。体重的图表显示为平均值±sd。
图9.S100A4的血浆水平的测定。在无胸腺小鼠中多个异种移植模型上（MiaPACA-2，HCT116，MDAMB-231，Colo205）S100A4蛋白的血浆水平相比于无肿瘤的动物中（Basal-02）S100A4水平通过夹心ELISA方法来测定。MiaPACA-2+5C3和HCT116+5C3条件展示了血浆中S100A4的水平，不结合5C3单克隆抗体。血浆水平在实验结束进行测量。血浆水平的图表显示为平均值±sd。
图10.吉西他宾（Gemcitabine）与单克隆抗体5C3结合在细胞生存中的协同效果。吉西他宾单独或与单克隆抗体5C3结合在细胞生存中的效果通过氨基己糖苷酶活性来测量。吉西他宾的细胞毒性剂量响应效果通过组单克隆抗体5C3的组合而得到协同性改善。MiaPACA-2细胞用化学治疗药物以不同剂量孵育，具有或不具有5C3，在40nM或100nM的恒定浓度下，持续72小时。生存能力没有化合物（吉西他宾或5C3）的细胞的阳性对照校准，该阳性对照代表100%的生存。
图11.单克隆抗体5C3对THP-1单核细胞中S100A4诱导的IL-8释放的抑制影响。（A）孵育24小时后S100A4对由THP-1单核细胞分泌的IL-8的剂量响应，对比LPS诱导的分泌（阳性对照）。（B）5C3的效果，对于用S100A4以3μM处理24小时的THP-1单核细胞中的IL-8释放。细胞总是用抗-小鼠IgG（Fc特异性）处理以避免Fc受体-诱导的IL-8释放。来自上清的IL-8用ELISA分析。数值表示为平均值±sd。
具体实施方式
发明详述
本发明的作者发现，出乎意料地，针对S100A4蛋白的单克隆抗体在体外移动性分析中能够中和S100A4诱导的内皮细胞的转移（参见实施例9）并且在异种移植肿瘤模型中中和由S100A4诱导的血管生成能力（参见实施例11）。这些结果表明抗-S100A4抗体可用于预防和/或治疗与不期望的血管生成和转移相关的疾病，例如癌症。
本发明提供了针对人和鼠类S100A4蛋白的单克隆抗体，标注为5C3，1E2，6B9，5A3和8B6，其特异性结合并阻断S100A4血管生成活性。发明人令人惊讶地发现这些抗体具有有价值的药学活性，因为它们阻断肿瘤发展、肿瘤血管生成，并且此外在体内没有或具有最小化的毒副作用。有趣的是，发明人进行的工作已经揭示了所述抗体在由S100A4诱导的内皮细胞转移中的作用的新的阻断机理。
本发明的作者另外证明了生物流体中S100A4的水平适合于癌症的早期检测的诊断标记。因此，本发明也涉及通过用所述抗体检测患者生物流体中的S100A4水平而诊断癌症的体外方法和试剂盒。
本发明抗血管生成抗体
在第一方面，本发明涉及具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的片段，其中的抗体选自如下抗体组：
（i）识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4的表位的抗体，
（ii）识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4的表位的抗体，和
（iii）由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
如本文所用的本发明的第一方面，术语“抗体”指这样的单体或多聚体蛋白，其包含至少一个具有结合确定的抗原的能力并且包含免疫球蛋白分子的轻链或重链可变区的全部或部分的多肽。术语抗体包括已知任何类型的抗体，例如，多克隆抗体，单克隆抗体和遗传工程抗体，例如嵌合抗体，人化抗体，灵长目源化抗体，人抗体和双特异性抗体。术语“抗体”的更广泛的定义可以在“定义”部分找到。
术语“多克隆抗体”和“单克隆抗体”在“定义”部分进行定义。在具体实施例，抗体是单克隆抗体。
“嵌合抗体”理解为用一个物种（通常是哺乳动物，单克隆抗体在其中产生）的抗体可变区和另一个物种（嵌合抗体要用于其中的物种）的恒定区构建的抗体。所述构建的目的是获得这样的抗体，其具有原始的单克隆抗体但是有更低免疫原性并在要治疗的对象中具有更好耐受性，具有改进的血清半衰期并且可以被免疫学效应器机制所识别，即补体，细胞毒性细胞的Fc受体或其它特异性免疫球蛋白受体，它们表现出物种特异性。在一个优选的实施方式中，嵌合蛋白由鼠类可变区和人恒定区形成。
“人源化抗体”被理解为来自非人生物体的抗体，典型地是鼠类抗体，其保留了亲代抗体的抗原结合特性，但是在人类中具有更低的免疫原性。这可以通过不同的方法获得，其包括（a）将完全的非人可变区移植至人恒定区以获得嵌合抗体；（b）将仅仅非人互补决定区（CDR）移植至人框架区和恒定区，保留或不保留关键的框架区残基；和（c）移植完全的非人可变区结构域，但是通过替换表面残基用人类可变区结构域类似的部分“隐藏它们”。
“灵长目源抗体”被理解为遗传加工的含有猴抗体（或是其他灵长类）的轻链和重链可变区的重组抗体，特别是食蟹猴抗体，并含有人恒定区的序列，优选人γ1或4免疫球蛋白的恒定区（或PE变异体）。所述抗体的制备描述于Newman et al.，Biotechnology，10:1458-1460(1992)（Newman等，《生物技术》，10:1458-1460(1992)）；和专利文件US5,658,570和US6,113,898。已经描述了这些抗体显示与人抗体具有高度的同源性，即，85-98%，其具有人效应器功能，具有较低的免疫原性，并能显示对人抗原的高亲和力。产生重组抗体的另一个非常有效的途径描述于Newman,Biotechnology,10:1455-1460(1992)（Newman,《生物技术》,10:1455-1460(1992)）。
“人抗体”理解为完整地含有人轻链和重链以及恒定区的抗体，通过任何已知的标准方法而产生。更广泛的定义可以在“定义”部分发现。
术语“双特异性抗体”或“双功能抗体”在“定义”部分定义。
本发明也包含上文提及的抗体的不同类型的片段的用途，其基本上保留了抗体的抗血管生成活性。术语“抗体片段”包括抗体片段例如Fab，F(ab’)2，Fab’，单链Fv片段（scFv），双元抗体和纳米抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，分别具有单独的抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反应了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并仍能够与抗原交叉连接。
“Fv”是含有完整的抗原结合和抗原识别位点的最小抗体片段。该区域由可变轻链和重链二聚体的可变结构域以强烈的非共价作用而组成。在该构型中每个可变结构域的三个高变区相互作用以确定VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。从整体来看，六个高变区使其具有抗体的抗原-抗体特异性。然而，即使单一的可变区（或Fv的一半，其仅仅包含了三个抗原特异性的高变区）也具有抗原识别和结合能力，尽管具有比完全结合位点更低的亲和力。
Fab片段也含有轻链的恒定区和重链的第一恒定区（CH1）。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链的CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域在单一的多肽链中存在。优选地，Fv多肽另外包含VH和VL结构域之间的接头多肽，其使scFv形成抗原结合的期望结构。对于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburgand Moore eds.，Springer-Verlag，N.Y.，pp.269-315(1994)（Pluckthun单克隆抗体药理学，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，N.Y.，pp.269-315(1994)）。
术语“双元抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含相同多肽链（VH-VL）内的重链可变区（VH）连接至轻链可变区（VL）。通过利用太短以至于不能使相同链内的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一个链的互补结构域配对并建立两个抗原结合位点。双元抗体的进一步细节描述于，例如，文献EP404,097；WO93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)（Hollinger等，《美国科学院院刊》90:6444-6448(1993)）。
术语“纳米抗体”指由免疫球蛋白的重链的抗原结合区域（VH片段）独自形成的小尺寸结构（15kDa）。所述纳米抗体主要在免疫骆驼科的动物之后产生，例如骆驼，美洲驼和单峰骆驼，主要是美洲驼；也包括鲨鱼科，其具有天然缺乏轻链并通过重链可变区识别抗原的抗体的特性。然而，来自这些来源的纳米抗体需要人源化过程处理以用于其治疗应用。另一个获得纳米抗体的潜在来源是源自不同人样品的抗体，通过分离可变区的VH和VL结构域。纳米抗体具有的优点例如相对于完全抗体的生产成本下降，更稳定和免疫原性下降。
其它抗体片段列在“定义”部分。
如本发明所述的抗体具有抗血管生成活性。如本文所用，“具有抗血管生成活性”的表达，是指抗体抑制S100A4诱导的血管生成的能力。抗血管生成活性可以在体外通过测定抗体或其片段阻断S100A4诱导的转移HUVEC细胞的转移的能力而测定得到，如本申请的实施例9所述，或者在体内通过测定抗体阻断源自植入过表达S100A4的肿瘤细胞的癌症中肿瘤脉管系统的形成而测定得到，如本申请的实施例11所述。根据本发明，如果其阻碍S100A4蛋白的至少100%，至少90%，至少80%，至少70%，至少60%，至少50%，至少40%，至少30%，至少20%，或至少10%的血管生成活性，那么抗-S100A4抗体就认为是抗血管生成的。
本发明的第一方面之中包括的抗体片段，其保留了其来源的完整抗体结合S100A4抗原的能力，并且也保留了抑制S100A4蛋白的血管生成活性的功能。
术语“保留特异性抗-S100A4蛋白的抗血管生成活性”，如本文所用，指的是抗体片段显示相比完全抗体的基本上的抗血管生成活性。抗血管生成活性可以在体外通过测定抗体或其片段阻断S100A4诱导的转移HUVEC细胞的转移的能力而测定得到，如本申请的实施例9所述，或者在体内通过测定抗体阻断源自植入过表达S100A4的肿瘤细胞的癌症中肿瘤脉管系统的形成而测定得到，如本申请的实施例11所述。肿瘤脉管系统的形成的抑制可以测量为与未使用抗体处理的动物相比微管数目的减少，或者与未使用抗体处理的动物相比微管密度的减小。如果抗体片段显示抗体的至少100%，99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，90%，85%，80%，75%，70%，65%，60%，55%或50%的活性，那么抗体片段就保留了抗体的抗血管生成活性。
本发明中可用的抗体必须是对S100A4蛋白特异性的。术语“特异性”指抗体特异性结合S100A4蛋白而不结合S100家族其它蛋白的能力。
为了鉴别具有期望特异性的抗体，可以使用免疫化学分析测定，例如免疫荧光，流式细胞仪，蛋白质印迹和ELISA分析，放射免疫分析，免疫组织化学分析，免疫沉淀或本领域已知的其它免疫化学分析测定。多种竞争性结合或免疫放射分析的方案是本领域已知的。所述免疫分析典型地涉及测量抗体和S100A4蛋白的免疫原之两者的复合物的形成。
根据本发明的第一方面的抗体或其片段选自如下抗体组：
（i）识别S100A4的包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的表位的抗体，
（ii）识别S100A4的包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:2）的表位的抗体，和
（iii）由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
表述“识别S100A4的抗原表位的抗体”表示该抗体能够表现特异性结合该抗原表位而表现基本上不结合到不包含该序列的其它抗原表位。测定抗体是否能够特异性结合抗原表位的合适方法在本发明的实施例14中显示，其中展现靶标蛋白的完整序列的肽针对抗体或其片段进行了测定。抗体被认为是特异性结合给定表位，如果其结合包含表位序列的肽上具有基本上更高的亲和力，相比结合不包含所述表位序列的肽。术语“基本上更高的亲和力”，如本文所用，指当用预期的测量仪器或方法检测时，对特定氨基酸序列的亲和力水平与对其它氨基酸序列的亲和力水平是显著不同的。优选地，抗体和包含表位的肽之间的结合的亲和力比抗体和不包含表位序列的肽之间的结合的亲和力高至少1个数量级、至少2个数量级、至少3个数量级、至少4个数量级、至少5个数量级、至少6个数量级。以基本上高亲和力结合的结合常数（Ka）是例如，至少107M-1，优选至少108M-1，并更优选至少109M-1或更低。
术语“S100A4”在“定义”部分定义。该术语也包括所有生理学相关的翻译后化学修饰形式，例如，糖基化，磷酸化或乙酰化，等等，只要蛋白的功能性被保留。所述术语包含任何哺乳动物物种的S100A4，包括但不限于家用和耕畜（奶牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫或啮齿类动物），灵长类和人。优选地，S100A4是人的。
本发明的第一方面关注S100A4的功能性等价变体的用途。如本文所用，“S100A4的功能性等价变体”被理解为与S100A4共享至少本发明描述的与S100A4相关的血管生成功能的任何分子，包括在体外和在体内，并具有氨基酸序列上的最小的同一性。S100A4的变体可以是天然的或人工的。
表述“天然变体”指在其它物种中天然存在的上文提及的人S100A4的所有这些变体，即，S100A4的直系同源体。所述天然变体包括但不限于奶牛的S100A4，对应于登记号DAA31755.1的预测序列（2010年5月21日版本）；大鼠的S100A4，对应于登记号NP_036750.1的预测序列（2011年4月10日版本）；小鼠的S100A4，对应于登记号NP_035441.1的预测序列（2011年5月29日版本）；狗的S100A4，对应于登记号NP_001003161.1的预测序列（2011年2月19日版本）。在本发明的第一方面适合用于的S100A4的天然变体也可以通过插入、取代或删除一或多个氨基酸获得的所述序列，并包括天然等位基因，天然存在的可选过程和分泌和截短形式产生的变体。
因此，用于本发明的S100A4可以是天然序列，其包含具有与自天然获得的S100A4相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列的多肽可以从天然分离或可以通过重组和/或合成途径来生产。因此，本发明的S100A4可以是通过在异源生物中表达编码S100A4的多核苷酸或其功能性等价变体而获得重组蛋白，所述在异源生物中例如在细菌，酵母或昆虫或哺乳动物细胞中。所述重组蛋白可以作为带有组氨酸氨基酸末尾的融合蛋白而获得，以利于后续的纯化。所述蛋白的表达和纯化可以根据本领域技术人员已知的方法和本领域中描述的方法来进行。
在一个优选的实施方式中中，S100A4是人来源的，优选序列SEQ ID NO:21。在另一个优选的实施方式中中，S100A4来自融合蛋白的表达，所述融合蛋白包含人S100A4序列和三个额外氨基酸的氨基端尾，其序列为SEQ ID NO:25。
SEQ ID NO:25
1GSHMACPLEK ALDVMVSTFH KYSGKEGDKF KLNKSELKEL LTRELPSFLG KRTDEAAFQK
61LMSNLDSNRD NEVDFQEYCV FLSCIAMMCN EFFEGFPDKQ PRKK
可选地，S100A4可以是S100A4的人工功能性等价变体，其可以通过重组和/或合成途径而获得。
关于术语“变体”的更多信息可以参见“定义”部分。
本发明的第一方面关注的S100A4变体显示至少S100A4的功能之一，例如，但不限于：
-激活MMP9基质金属蛋白酶活性的能力，其可以通过本发明的实施例8中描述的方法来确定。
-诱导内皮细胞转移的能力，其可以通过本发明的实施例9中描述的方法来确定。
-在裸鼠中诱导肿瘤发展肿瘤发展的能力，其可以通过本申请的实施例10中描述的方法来确定。
-血管生成能力或形成血管微脉管系统的能力，其可以通过本申请的实施例11中描述的方法来确定。
-诱导在单核细胞中通过IL8的分泌介导的炎症应答的能力，其可以通过本申请的实施例16中描述的方法来确定。
另外，本发明的第一方面关注的S100A4的功能性等价变体，包括显示与上述S100A4的不同天然变体具有至少60%，65%，70%，72%，74%，76%，78%，80%，90%，95%，97%，99%相似性或同一性。两个多肽之间同一性的程度用计算机中执行的算法和本领域技术人员已知的方法来确定。两个氨基酸序列之间的同一性优选利用BLASTP算法来确定（BLAST Manual，Altschul，S.et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul,S.，et al.，J.，1990，Mol.Biol，215:403-410）（BLAST手册，Altschul，S.等,NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.，等，1990，《分子生物学》215:403-410）。计算同一性程度的方法在“定义”部分说明。
“基本上保留所述抗体的抗血管生成活性的表达”意思是本发明的第一方面的抗体不能完全失去抗血管生成活性。
通常，本发明的抗体的氨基酸序列的修饰也是受关注的。例如期望促进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列的变体通过在编码抗体的核酸中引入合适的核苷酸改变来制备，或通过肽合成的方法。所述修饰包括，例如，抗体的氨基酸序列中残基的消除和/或插入和/或取代。进行了消除、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，使得最终的构建体具有期望的特征，即，S100A4结合特异性和所述蛋白的抗血管生成活性拮抗剂。氨基酸的改变也可以改变抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
一些氨基酸序列中的插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，使其长度从一个残基一直到含有一百或更多残基的多肽的变化，以及序列内一或多个氨基酸残基的插入。末端插入的一些实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体，或者细胞毒性多肽融合的抗体。通过插入抗体分子的其它变体包括与酶或者增加抗体血清半衰期的多肽在抗体N-或C-端融合。
变体的另一个类型是通过氨基酸取代而产生的变体。这些变体具有抗体的至少一个氨基酸残基取代为不同的残基。通过抗体取代的突变产生的主要感兴趣的位点包括高可变区，但是FR内的改变也是受关注的。
在本发明的内容中，术语“抗原”是指S100A4。
本发明的第一方面的特异性抗-S100A4抗体识别抗原S100A4的表位。发明人发现本发明的抗血管生成抗体识别包含在由S100A4的序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）或序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）确定的区域内的表位。从而，在一个优选的实施方式中，抗体识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4表位。在另一个优选的实施方式中，抗体识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4表位。
表述“识别表位”意思是抗体可以结合到如“定义”部分所定义的表位。表位可以由完整的序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）或EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）或者由所述序列的一些氨基酸形成。
本发明的第一方面的特异性抗-S100A4抗体也可以是单克隆抗体，其在之前定义和“定义”部分所定义。从而，在一个优选的实施方式，本发明的第一方面的特异性抗-S100A4抗体或其片段是单克隆抗体。
本发明提供了由不同的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。在一个优选的实施方式中，根据权利要求2所述的特异性抗-S100A4抗体或其片段由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤生产，或其片段。
在本发明的上下文中，“杂交细胞”或“杂交瘤”理解为独特干细胞的B-细胞克隆后代，与骨髓瘤细胞的融合产品。特别地，本发明的第一方面的单克隆抗体对应于在本文件的实验部分作为5C3，6B9，5A3，1E2和8B6涉及的抗-S100A4单克隆抗体，其分别从由发明人合成并鉴别为5C3-1B8-1F4，6B9-1E8-2A8，5A3-4A6-5B6，1E2-2H4-2G8和8B6-2F6-1H9-1H10的杂交瘤获得。所述杂交瘤在提交本专利申请之前已经保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，波顿当，索尔兹伯里里，SP4OJG，英国（European Collection of CellCultures(ECACC)，Porton Down，Salisbury，SP4OJG，United Kingdom），其是作为根据关于国际承认的微生物保藏的1977年4月28日布达佩斯条约的目的的合法认可的机构。保藏者是来自Leitat技术中心的Francesc Mitjans和Marc Masa，其地址为迪瑞，雷克萨奇15-21喜力士大楼，巴塞罗那，08028，西班牙（Baldiri Reixach15-21Helix Building，Barcelona，08028，Spain）。
欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）向杂交瘤5C3-1B8-1F4，6B9-1E8-2A8，5A3-4A6-5B6，1E2-2H4-2G8和8B6-2F6-1H9-1H10分别分配了保藏号ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804。使所述杂交瘤系获得本发明的抗-S100A4单克隆抗体的培养条件描述在获得本发明的单克隆抗体的方法的部分中。
在本文件中，杂交瘤5C3-1B8-1F4，6B9-1E8-2A8，5A3-4A6-5B6，1E2-2H4-2G8和8B6-2F6-1H9-1H10和由所述杂交瘤产生的抗体分别以其缩写名称5C3，6B9，5A3，1E2和8B6的方式来表示。
本发明也涵盖本发明的第一方面的所述抗-S100A4单克隆抗体的片段，其保留了结合S100A4的能力并具有抗血管生产能力。结合能力可以通过本领域技术人员已知的方法来检测，例如ELISA或蛋白质印迹，如本发明的实施例5、6和7中所描述的。保持抗血管生成能力的能力可以通过本领域技术人员已知的方法来检测，例如本发明的实施例9中描述的那些。
所述“片段”指抗体序列的片段，其对应于涉及的单克隆抗体的氨基酸序列的一或多个部分，该单克隆抗体保留了结合S100A4的能力，并因此，该多肽必须包括6个CDR区域的序列，其可用于获得本发明的第一方面的内容中定义的抗体，例如，但不限于，遗传工程抗体例如嵌合抗体，人源化抗体或双特异性抗体。所述“片段”也可以用于获得抗体片段例如Fab，F(ab’)2，Fab’，单链Fv片段（scFv），双元抗体或纳米抗体。另外，片段保留了阻断血管生成的能力。
Fab和F(ab’)2片段可以通过本发明的第一方面的完整单克隆抗体的酶学切割或化学切割获得。
对本发明的单克隆抗体进行木瓜蛋白酶消化产生了两个不同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每一个分别具有单独的抗原结合位点。反过来，具有两个抗原结合位点的“F(ab’)2”片段，通过胃蛋白酶处理而获得。
另外，“片段”可以是通过遗传工程技术的获得另一个类型的抗体片段，例如Fab’片段，单链Fv片段（scFv）或双元抗体。
在一个优选的实施方式，特异性抗-S100A4抗体或其片段由杂交瘤ECACC10022401生产的。
本发明提供了包含SEQ ID NO:1的分离的氨基酸序列。该氨基酸序列包含了针对S100A4的单克隆抗体的可变区的轻链的FR和CDR。具体来说，可变区的轻链序列以及各自的FR和CDR的序列如下所示：
Figure BDA00002832533800191
本发明提供了包含SEQ ID NO:2的分离的氨基酸序列。这个氨基酸序列包含了针对人或鼠类S100A4的单克隆抗体的可变区的重链的FR和CDR。具体来说，可变区的重链序列以及各自的FR和CDR的序列如下所示：
Figure BDA00002832533800192
Figure BDA00002832533800201
所述序列对应于由杂交瘤ECACC10022401产生的抗体。从而，在一个优选的实施方式中，抗体或其片段至少包含含有序列SEQ ID NO:1的VL区域和至少包含序列SEQ ID NO:2的VH区域或其基本上保留了抗血管生成活性的功能性等价变体。
术语“VL区”指抗体的轻链的可变区；而术语“VH区”指抗体的重链的可变区。
表述“其基本上保留了抗血管生成活性的功能性等价变体”指与本发明的抗体具有抗血管生成功能的任何分子，包括在体外和在体内，并具有氨基酸序列上的最小同一性。本发明的抗体的功能性等价变体可以由所述序列被插入、取代或删除一或多个氨基酸获得，并可以通过重组体和/或合成获得。
本发明的抗体的功能性等价变体必须保留其结合S100A4抗原的能力并抑制S100A4蛋白的血管生成功能的能力，所述功能可以通过本领域技术人员已知的方法来检测，例如通过如本申请的实施例9中所描述的VEGF和S100A4的内皮细胞转移分析的方法。
本发明的抗体的功能性等价变体包括显示与前文提及的多肽序列其至少具有60%，65%，70%，72%，74%，76%，78%，80%，90%，95%，97%，99%的同一性；优选具有至少90%的同一性。两个多肽之间的同一性程度用计算机执行的算法和本领域技术人员已知的方法确定。两个氨基酸序列之间的同一性优选用BLASTP算法确定（BLAST Manual，Altschul，S.et al.,NCBI NLMNIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.，et al.，J.，1990，Mol.Biol.215:403-410）（BLAST手册，Altschul，S.等,NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.，等，1990，《分子生物学》215:403-410）。同一性程度根据“定义”部分描述的方法来计算。
本发明提供了包含SEQ ID NO:3的分离的氨基酸序列。该氨基酸对应于人或鼠类的S100A4的表位或抗原决定簇。
SEQ ID NO:3ELPSFLGKRT
在本发明的一个实施方式中，提供了抗体或其片段，其特异性结合到包含SEQ ID NO:3的多肽。
在本发明的一个实施方式中，提供了抗体或其片段，其特异性结合到通过用包含SEQ ID NO:3的多肽免疫哺乳动物产生的人或鼠类S100A4多肽。
在本发明的一个实施方式中，抗体或其片段选自人抗体或其片段；人源化抗体或其片段；多克隆抗体或其片段；单克隆抗体或其片段；Fab抗体；和嵌合抗体或其片段。
在本发明的一个实施方式中，提供了包含含有SEQ ID NO:1的轻链多肽的单克隆抗体。
在本发明的一个实施方式中，提供了包含含有SEQ ID NO:2的重链多肽的单克隆抗体。
在本发明的一个实施方式中，提供了包含框架区（FR）和互补决定区（CDR）的单克隆抗体，其中该单克隆抗体包含含有SEQ ID NO:1的轻链和含SEQ ID NO:2的重链。
在本发明的一个实施方式中，单克隆抗体选自人抗体；人源化抗体；嵌合抗体或其片段。
在本发明的一个实施方式中，单克隆抗体：
a）仅与人或鼠类S100A4蛋白反应；或
b）阻断人或鼠类S100A4蛋白的作用机制；或
c）体外或体内阻断人或鼠类S100A4蛋白的功能活性；或
d）阻断人或鼠类S100A4蛋白诱导的或人或鼠类S100A4蛋白与上皮细胞内的VEGF联合诱导的前转移效应；或
e）阻断肿瘤生长；或
f）阻断肿瘤的发展或
g）阻断肿瘤的血管生成；或
h）阻断细胞扩散和转移的建立；或
i）阻断炎症过程；或
j）阻断癌症干细胞；或
k）上述a）至j）的任意组合。
在本发明的一个实施方式中，提供了含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或片段是单价或二价的。本发明进一步提供了杂交瘤细胞系，其能够根据本文展现的任意一个实施方式的生产单克隆抗体。
本发明进一步提供了单克隆抗体，其是可以从在欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）的保藏编号10022401下保藏的杂交瘤细胞系获得的。
在本发明的一个实施方式中，提供了包含SEQ ID NO:4的分离的多核苷酸，其编码单克隆抗体的可变区的轻链的FR和CDR。
SEQ ID NO:4
1GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCTCC CTGCCTGTCA GTCTTGGAGA TCAAGCCTCC
61ATCTCTTGCA GATCTAGTCA GAGTATTGTA CATAGTAATG GAAACACCTA TTTAGAATGG
121TACCTGCAGA AAACAGGCCA GTCTCCAGAG CTCCTGATCT ACAAAGTTTC CAACCGACTC
181TCTGGGGTCC CAGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTCAAGATC
241AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TCTGGGAGTT TATTACTGCT TTCAAGGTTC ACATGTTCCA
301TTCACGTTCG GCTCGGGGAC AAAGTTGGAA ATAAAA
在本发明的一个实施方式中，提供了包含SEQ ID NO:5的分离的多核苷酸，其编码单克隆抗体的可变区的重链的FR和CDR。
SEQ ID NO:5
1GAGGCTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCAGAG CTTGTGAAGC CAGGGGCCTC TGTCAAGTTG
61TCCTGCACAG CCTCTGGCTT CAACATTCAA GAGACCTATA TGCACTGGGT GAAGCAGAGG
121CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG ATTGATCCTG CGAATGGTAA TACCAAAGAT
181GACCCGAAGT TCCAGGGCAA GGCCTCTATA ACAGTAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC
241CTGCAGCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCGTCT ATTACTGTGC TTCAAGTTAT
301GCTATGGACT ACTGGGGTCA AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCA
在本发明的一个实施方式中，提供了包含SEQ ID NO:6的分离的多核苷酸，其编码人S100A4蛋白的表位区域。
SEQ ID NO:6GAGCTGCCCAGCTTCTTGGGGAAAAGGACA
在另一个优选的实施方式中，本发明的特异性抗-S100A4抗体或其片段由杂交瘤ECACC11051801产生。
在另一个优选的实施方式中，本发明的特异性抗-S100A4抗体或其片段由杂交瘤ECACC11051802产生。
在另一个优选的实施方式中，本发明的特异性抗-S100A4抗体或其片段由杂交瘤ECACC11051803产生。
在另一个优选的实施方式中，本发明的特异性抗-S100A4抗体或其片段是由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
已经验证发明的第一方面的单克隆抗体能够中断人内皮细胞转移的能力。因此，在一个具体的实施方式中，本发明涉及具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其够阻止人内皮细胞的转移能力。
“阻止人内皮细胞的转移能力”理解为抑制所述细胞的转移能力至少20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，99%，100%；优选至少20%；更优选至少30%；还更优选至少45%。所述转移能力的抑制或转移的停止可以通过本发明的实施例9中描述的测定方法来评价。
表述“人内皮细胞的转移能力”指所述细胞移动的能力，这是新血管系统形成的关键步骤。人内皮细胞是排列在哺乳动物生物体的所有导管内的细胞。包括在所述定义中的人内皮细胞是，但不限于，人脐静脉上皮细胞（HUVEC）。在一个优选的实施方式中，人内皮细胞是HUVEC细胞。
获得本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系和方法
在另一方面，发明涉及根据发明的第一方面获得单克隆抗体的方法，其包含在可以产生所述抗体的条件下培养选自保藏号为ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804保藏的细胞系的杂交瘤细胞系。
获得发明的第一方面的单克隆抗体的方法可以根据本领域已知的常规方法来实现。基本上，该方法包括在适合杂交瘤细胞生产抗体并将其分泌进入培养基的培养基上培养杂交瘤细胞系，和随后收集含有产生的单克隆抗体的培养基上清液。所述抗体可选地可以由常规方法纯化，例如亲和色谱，蛋白A琼脂糖，羟基磷灰石色谱，凝胶电泳或透析。
术语“单克隆抗体”已经在前面的方面所定义。
“培养”杂交瘤细胞理解为在培养瓶中在合适的培养基存在下孵育杂交瘤细胞，通过必需的时间，在合适的条件下，最终使得所述细胞的增殖和本发明的单克隆抗体的生产的结果产生。所述培养可以涉及具有不同组成的培养基的利用。优选地，在第一步中，细胞在含有血清的培养基中培养以利于其增殖，并且，在收集细胞并洗涤之后，在无血清培养基中培养以获得抗体。根据该方法适合于获得抗体的培养基是，不限于，补充L-谷氨酰胺的DMEM/F12和胎儿牛血清以利于细胞增殖，和基于补充了L-谷氨酰胺的MDEM/F12培养基但是缺少胎牛血清（“无蛋白培养基”）的混合物作为抗体收集培养基。生产抗体的培养基也可以包括合成细胞培养基组成的任何培养基或混合物，和后来的补充物不包括蛋白（“无蛋白培养基”）或者所述蛋白是以非常低的比例（“无血清培养基”或“低蛋白培养基”）并且它们不属于免疫球蛋白的组。所述培养基必须使细胞可以生长和维持，以及其在事先调整的在不存在胎牛血清下生长的杂交瘤细胞系分泌抗体。在一个优选的实施方式中，适合于培养所述细胞的培养基是包含DMEM/F12和L-谷氨酰胺的培养基。进行所述培养的条件优选在潮湿环境中在37℃的温度下并在标准大气压下或5%CO2富集的空气中。
因此，在发明的另一方面涉及杂交瘤细胞系，其是选自由保藏编号ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804保藏的细胞系组的杂交瘤细胞系。优选地，细胞系的保藏编号ECACC10022401。在另一个实施方式中，杂交瘤细胞系选自由保藏编号ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804保藏的细胞系组的杂交瘤细胞系。
表述“杂交瘤细胞系”指由前文发明的第一方面定义的杂交细胞或杂交瘤形成的细胞系。所述杂交瘤细胞系由本发明的实施例4描述的标准方法而获得。简而言之，小鼠用人重组S100A4蛋白免疫并且从免疫的小鼠的脾脏提取细胞，该细胞在融合诱导剂例如PEG-1500存在下与骨髓瘤细胞融合。在HAT培养基中筛选杂交瘤，每个筛选的克隆通过有限稀释来进行亚克隆。适合于扩展的克隆被调整以适应DMEM/F12培养基并被冷冻，形成杂交瘤细胞系ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804。
在发明的优选实施方式中，由这个方法制备的单克隆抗体可以是采用本发明的上下文中描述的杂交瘤细胞系产生的任何抗体。
本发明进一步提供了制造根据本文展现的任何一个实施方式的单克隆抗体的方法，所述方法包含：
（i）用纯化的人或鼠类S100A4蛋白或带有纯化的人或鼠类S100A4蛋白与有效诱导针对抗原的免疫应答的试剂的组合来免疫小鼠；
（ii）生产一或多个杂交瘤细胞，
（iii）筛选一或多个细胞，其上清液：
a）仅与人或鼠类S100A4蛋白反应；或
b）阻断人或鼠类S100A4蛋白的作用机制；或
c）阻断体外或体内人或鼠类S100A4蛋白的功能活性；或
d）阻断人或鼠类S100A4蛋白诱导的或人或鼠类S100A4蛋白与上皮细胞内的VEGF联合诱导的前转移效应；或
e）阻断肿瘤生长；或
f）阻断肿瘤发展；或
g）阻断肿瘤血管生成；或
h）阻断细胞扩散和转移的建立；或
i）阻断炎症过程；或
j）阻断癌症干细胞；或
k）前述a）至j）的任意组合。
（iv）从步骤iii）筛选的细胞的任意一个中生产特异性细胞系；和
（v）从所述细胞系分离单克隆抗体。
包含本发明的特异性抗-S100A4抗体的药物组合物
在另一方面，发明涉及药物组合物，其包含药学上有效量的至少一种根据发明的第一方面的抗体或其片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。
在一个优选的实施方式中，根据发明的第一方面的抗体是由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803或ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生或其片段；优选ECACC10022401。
如本发明中所用，表述“药物组合物”指将适宜于预先确定剂量的一种或数种治疗性有用试剂给药于存在S100A4蛋白的过表达的细胞、细胞组、器官、组织或动物的配方组成。
“药学上有效量”理解为能够提供治疗效果的量，其可以由本领域技术人员通过通常使用的方法来确定。
发明的组合物可以含有一或多种根据本发明的第一方面所述的抗体或其的一或多个基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的片段。
发明的组合物也可以含有一或数种其它化合物以用于病理学的预防和/或治疗S100A4蛋白的过表达，例如癌症或与炎症相关的疾病。所述其它化合物例如细胞毒素试剂、抗血管生成试剂、抗转移试剂或抗炎症试剂，它们可以作为与单克隆抗体的独立实体或者也与所述抗体形成缀合物而形成药物组合物的部分。
药物组合物通过常规方法与一或多种药学上可接受的赋形剂制备。
“药学上可接受的赋形剂”理解为用于与活性成分合并的非治疗活性物质，其在药理学/毒理学观点上对于患者是可以接受的，并且对于制备其的药剂师在物理学/化学观点上就组成、制剂、稳定性、患者的接受性和生物利用度而论也可以接受的。
药学上可接受的赋形剂的数量和性质依赖于期望的剂量形式。药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员已知的（Faulíy Trillo C.(1993)“Tratado deFarmacia Galénica”，Luzán5,S.A.Ediciones，Madrid）（Faulíy Trillo C.(1993)《盖伦药剂协议》，Luzán5,S.A版本，马德里）。所述组合物可以通过本领域已知的常规方法来制备（“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”，20th edition(2003)Genaro A.R.，ed.，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，US）（《雷明顿：药学科学与实践》，第20版(2003)Genaro A.R.，编辑，Lippincott Williams&Wilkins，费城，美国）。
发明的药物组合物可以通过合适途径的任何形式给药，例如通过口服途径，局部途径，经吸入或肠胃外途径使得对期望的剂形的制剂所需要的药学上可接受的赋形剂将包括在内。药物组合物的优选给药途径是静脉内途径。
“口服途径”被理解为药物组合物在吞咽之后并入生物体内。在一个具体的实施方式中，发明的药物组合物可以是以适合其口服途径给药的剂形，不论其是固体或液体。适合其口服途径给药的剂形可以是片剂、胶囊、糖浆或溶液，常规并可以包含本领域已知的任何常规赋形剂，例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；用于压缩的润滑剂，例如，硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉的羟基乙酸钠或微晶纤维素；或药学上可接受的湿润剂例如月桂硫酸钠。固体口服组合物可以通过混合、填充或压紧的常规工艺来制备。重复混合操作可以用于将活性试剂完全分散在这些使用大量填充试剂的组合物中。所述操作在本领域是常规的。例如，片剂可以通过湿法制粒或干法制粒来制备，并可选地根据在通常的药物实践中已知的工艺进行包衣，特别是包被肠溶衣。
在另一方面，“局部途径”理解为通过非全身途径给药，并包括发明的药物组合物外用在表皮上，在口腔中和将所述组合物滴注进耳朵、眼睛和鼻子，并且其中其不明显进入血流。“全身途径”理解为通过口服途径、静脉内途径、腹膜内途径和肌肉内途径。治疗或预防效果所需的抗体的量将根据所选的抗体、要治疗的疾病的性质和严重性、以及患者进行变化。
“吸入”理解为通过鼻内途径或通过口腔吸入来给药。适合于所述给药的剂形，例如气雾剂制剂或用仪表计量剂量的吸入器可以通过常规技术来制备。
如本文所用，术语“肠胃外给药”，包括通过静脉内途径、腹膜内途径、肌肉内途径或皮下途径给药。肠胃外给药的皮下、肌肉内和静脉内剂量形式通常是优选的。
在一个实施方式中，发明的药物组合物适合于肠胃外给药，例如以合适的单元剂量形式的无菌溶液、悬浮液或低压冻干产品。适合于其可注射用的药物组合物包括无菌水溶液（当其溶于水时），或者分散和无菌粉末用作临时制备无菌可注射溶液或分散剂。对于其静脉内途径给药，一些合适的载体包括用磷酸盐（PBS）缓冲的盐水溶液。在所有情况下，组合物必须无菌，并且必须是其易于注射的流动性的点。其必须在制剂中和储存条件下稳定，并且必须被保护免受为生物例如细菌和真菌的污染行为。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、乙醇、药学上可接受的聚醇例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇和其合适的混合物。可以维持合适的流动性，例如，通过利用包被例如卵磷脂的方法，在分散剂的情况下通过维持颗粒大小和通过利用表面活性剂的方法。微生物的行为的阻止可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂来实现，例如，对羟基苯甲酸脂类，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞，等等。在大多情况下，优选包括等渗试剂，例如，糖；多醇例如甘露醇，山梨醇；或氯化钠在组合物中。可注射组合物的延长的吸收可能由于包含延迟吸收的试剂而引起，例如，铝和明胶单硬脂酸。
可注射无菌溶液可以通过结合以需要的量在合适的溶剂中的活性化合物与前述成分的一种或其组合制备，如果需要，随后通过无菌膜而过滤灭菌。通常，分散体系通过合并在含有基本分散介质的无菌载体中的活性化合物与前面列出的其余的需要的其它组分来制备。在使用无菌粉末制备可注射无菌溶液的情况下，优选制剂工艺是真空干燥和冻干，其使得粉末具有活性成分和任何期望的来自前述过滤的无菌溶液的额外成分。抗体通常以低压冻干形式或在溶液中储存。治疗性抗体组合物通常封装在在具有无菌进口的包装中，例如，静脉内注射包或具有使制剂恢复的接合器的容器，例如塞子，其可以由皮下注射器针头穿孔。
药物组合物可以通过脉冲输注的途径而合适地给药，例如，以减少抗体的剂量。优选地，剂量通过注射的途径给药，更优选通过静脉内注射或皮下注射，部分取决于给药是急性还是慢性。
在一个实施方式中，含有发明的第一方面的抗体的药物组合物与载体一起制备，所述载体保护所述抗体免于从身体快速清除，例如控释制剂，包括植入片和微胶囊给药系统。可以使用生物可降解生物相容性聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯和聚乳酸。制备所述制剂的工艺对本领域技术人员是清楚的。材料也可以通过商业手段获自Alza Corporationand Nova Pharmaceuticals，Inc。
持续释放组合物也包括分散在合适的制剂中的抗体结晶的制备，其可以维持晶体在悬浮液中。这些制剂，当其通过皮下或腹膜内的途径注射时可以产生稳定释放效果。其它组合物可以包括抗体被收集在脂质体中。含有这样的抗体的脂质体通过已知方法来制备，例如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)82:3688-3692（Epstein等，《美国科学院院刊》，(1985)82:3688-3692）；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)77:4030-4034（Hwang等，《美国科学院院刊》，(1980)77:4030-4034）；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949。
本发明的组合物适合于给药于任何类型的哺乳动物，优选人类。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含根据本文展现的任意一个实施方式的单克隆抗体，和药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施方式中，药物组合物进一步包含化学治疗试剂。
在本发明的另一个实施方式中，药物组合物进一步包含抗炎症试剂。
包含特异性抗-S100A4抗体和抗代谢物的药物组合物
作者令人惊讶地发现特异性抗-S100A4抗体与抗代谢药物的组合在癌症治疗中的细胞毒素的作用具有协同效果（见本发明实施例15）。
从而，本发明的一方面是包含特异性抗-S100A4抗体和抗代谢物的药物组合物。
如本发明中所用的，表述“药物组合物”指将适宜于预先确定剂量的一种或数种治疗性有用试剂给药于来自癌症的细胞、细胞组、器官、组织或动物的配方组成。
术语“特异性抗-S100A4抗体”，在本发明的这方面的上下文中，指特异性识别S100A4蛋白的任何抗体，包括之前在现有技术中公开的抗体。
如本文所用的“抗代谢物”，从广义上讲，是指扰乱正常的代谢的物质和抑制电子转移系统从而防止产生富能量中间体的物质，由于其与对活体的重要的代谢物（例如维生素，辅酶，氨基酸和糖）在结构或功能上的相似性。
适合用于本发明的抗代谢物包括，但不限于，叶酸抗代谢物（氨基蝶呤，二甲叶酸，氨甲喋呤，依达曲沙，三甲曲沙，诺拉曲塞，洛美曲索，培美曲塞，雷替曲塞，吡曲克辛，蝶罗呤，亚叶酸钙，10-炔丙基-5,8-二氮杂叶酸（dideazafolate）（PDDF，CB3717）），嘌呤类似物（克拉屈滨，氯法拉滨，氟达拉滨，巯嘌呤，喷司他丁，硫鸟嘌呤），以及嘧啶类似物（卡培他滨，阿糖胞苷或ara-C，地西他滨，氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，去氧氟尿苷，氟脲嘧啶脱氧核苷和吉西他滨）。在优选的实施方式中，抗代谢物选自5-氟尿嘧啶和吉西他滨，更优选为吉西他滨。当患者患有结肠癌症时，一线的化学治疗是抗代谢物，优选5-氟尿嘧啶。当患者患有胰腺癌、膀胱癌或胆囊癌时，一线的化学治疗是抗代谢物，优选吉西他滨。
在优选的实施方式中，抗体是具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的片段，其中所述抗体选自下述抗体组：
（i）识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4的表位的抗体，
（ii）识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4的表位的抗体，和
（iii）由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
在优选的实施方式中，根据该方面的抗体是单克隆抗体，优选采用选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或其片段；更优选ECACC10022401。
作者验证了抗-S100A4抗体和抗代谢物的组合能够降低肿瘤细胞的生存能力。
从而，在优选的实施方式中，组合物能够降低肿瘤细胞的生存能力。
“降低肿瘤细胞的生存能力”理解为降低细胞生存、生长和复制的能力至少30%，40%，50%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，99%，100%；优选至少60%；更优选至少65%；最优选至少70%。所述生存能力的降低可以通过本发明的实施例15中描述的测定方法来评价。
“肿瘤细胞”被理解为恶性细胞，也称为癌性或致癌性细胞，其的生长和分裂超出了正常限度，侵入周围组织并有时候引起转移。可以用本发明的抗体处理的肿瘤细胞是过表达S100A4蛋白的细胞。所述细胞包括来自已知的肿瘤细胞和来自已确定的细胞系的肿瘤细胞以及来自患有癌症的患者的生物体中存在的肿瘤细胞。过表达S100A4的肿瘤细胞系的几种示例性非限制性实例是Colo205结肠腺癌肿瘤细胞系，MiaPACA-2人胰腺癌细胞系，Panc1人胰腺癌细胞系，HCT116结肠腺癌细胞系，源自MDA-MB-231乳腺癌细胞系的培养物的癌症干细胞。患有癌症的患者中存在的并过表达S100A4的癌细胞的示例性非限制性实例是来自以下的肿瘤细胞：乳腺癌（Rudland PS et al.Cancer Res2000.60(6):1595-1603），前列腺癌（Saleem M et al.PNAS2006.103(40):14825-30），肺癌（Tsuna M et al.Anticancer Res2009.29(7):2547-54），结肠直肠癌（Cho Y et al.World J Gastroent2005.11(31):4852-6），胰腺癌（Rosty Cet al.Am J Pathol2002.160(1):45-50），肾癌（Bandiera A et al.World J Surg2009.33(7):1414-20），胃癌（Yonemura Y et al.Clin Cancer Res2000.6(11):4234-42），卵巢癌（Maelandsmo GM et al.Tumor Biol2009.30(1):15-25），乳头状甲状腺癌（Min HS et al.Mod Pathol2008.21(6):748-55），黑素瘤（Andersen K et al.Mod Pathol2004.17(8):990-997），肝细胞性肝癌（Cui J et al.J Can Res ClinOncol2004.130(10):615-22），膀胱癌（Agerbaek M et al.Eur Urol2006.50(4):777-785），脂肪肉瘤浸润癌（Pazzaglia L et al.Anticancer Res2004.24(2B):967-972），成神经细胞瘤（Bjornland K et al.J Pediatr Surg2001.36(7):1040-44），食管鳞状细胞癌（Ninomiya I et al.Int J Oncol2001.18(4):715-20），骨肉瘤（Mathisen B et al.Clin Exp Metastasis2003.20(8):701-11），胆囊癌（Nakamura T et al.Int J Oncol2002.20(5):937-41），口腔鳞状细胞癌（Moriyama-Kita M et al.Oral Oncol2004.40(5):496-500），子宫内膜癌（Xie Ret al.Lab Invest2009.89(8):937-947），和成神经管细胞瘤（Hernan R et al.Cancer Res2003.63(1):140-148)等等。
表达S100A4蛋白的肿瘤细胞可以通过常规方法的途径来鉴别，例如ELISA或蛋白质印迹法，根据在本发明中描述的方法。
在一个实施方式中，其生存能力通过发明的所述方面的抗体而降低，肿瘤细胞是来自胰腺癌或来自结肠癌的肿瘤细胞，优选来自胰腺癌的肿瘤细胞。
在另一方面，发明涉及包含特异抗-S100A4抗体和用于预防和/或治疗癌症或转移的代谢物的药物组合物。
在另一方面，发明涉及包含特异性抗-S100A4抗体和代谢物的药物组合物在制备预防和/或治疗癌症或转移的药物中的用途。
在另一方面，发明涉及在对象中预防或治疗癌症或转移的方法，其包含向所述对象给药包含特异性抗-S100A4抗体和代谢物的药物组合物。
术语“预防”，“治疗”，“癌症”和“转移”将在本发明的抗体的治疗用途的内容中定义。
前述方面的所有具体实施方式适用于所述方面。
发明的抗体的治疗用途
血管生成与癌症
本发明进一步提供了根据本文展示的实施方式的任意一个的抗体或其片段或单克隆抗体，用作药物。
本发明也提供了根据本文展示的实施方式的任意一个的抗体或其片段或单克隆抗体，用作治疗癌症的药物。
本发明也提供了根据本文展示的实施方式的任意一个的抗体或其片段或单克隆抗体，用于制造治疗癌症的药物。
本发明也提供了治疗癌症的方法，包含向需要所述治疗的对象给予药学有效量根据本文展示的实施方式的任意一个的抗体或其片段或单克隆抗体。
能够特异性结合S100A4蛋白的抗-S100A4抗体在所述蛋白过表达的疾病中应用。
特别地，如上所述，S100A4蛋白在各种癌症中被表达。
因此，S100A4蛋白配体，并且更特别地，特异性针对这个蛋白的抗体，是用于治疗所述疾病的疗法的候选药物。
从而，在一方面发明涉及根据本发明的第一方面的抗体或其片段用于预防和/或治疗选自转移和与不期望的血管生成相关的疾病。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的第一方面的抗体或其片段在制备预防和/或治疗选自转移和与不期望的血管生成相关的疾病的药物中的应用。
在另一个方面，本发明涉及在对象中治疗或预防选自转移和与不期望的血管生成相关的疾病的的方法，其包含向所述对象给药根据本发明的第一方面的抗体或其片段。
术语“抗体”和“片段”在前文发明的第一方面的上下文中定义。
“预防”理解为在疾病的起始或早期给予根据本发明的第一方面所述的抗体或其片段，或者含有它的药物，或者也预防其发作。
术语“治疗”用于指示给予根据本发明的第一方面的抗体或其片段或者含有它的药物在临床症候出现之前或之后用于控制疾病进程。疾病进程的控制理解为出现有利的或期望的临床结果，其包括但不限于症状的减少，疾病持续时间的缩短，病理状况的稳定（特别是避免其它损害），延迟疾病的进程，促进病理学状况和减轻（包括部分和全部）。疾病进程的控制也涉及生存时间的延长，相比于未实行治疗的预期生存时间。
“药物”理解为包含根据本发明的第一方面的抗体或其片段的药物组合物。
术语“转移”理解为癌症引起的细胞在距离上的传播，基本上通过淋巴流或血流，以及在所述转移的目的位点中新肿瘤的生长。
本发明的上下文中，“血管生成”被理解为这样的生理学过程，其包含由已存在的血管形成新的血管。血管生成也被称为新血管形成。
表述“与不期望的血管生成相关的疾病”涉及所有这些疾病，其中存在致病性的血管新生，即，当所述过程是有害的或不期望的，不管是否为癌性的。从而本发明的范围将在需要的情况下血管生成的治疗排除在外，例如创伤愈合。与不期望的血管生成相关的可以用根据本发明的化合物治疗的疾病，非限制性地，是炎症疾病，特别是慢性炎症疾病例如类风湿性关节炎，牛皮癣，肉样瘤病等等；自身免疫疾病；病毒病；遗传性疾病；过敏性疾病；细菌性疾病；眼科病例如糖尿病性视网膜病，早熟性视网膜病，增值性心房视网膜病，视网膜静脉堵塞(oclusion)，斑点退化，老年性黄斑盘状变性，新生血管性青光眼，脉络膜新生血管性疾病，视网膜新生血管性疾病，发红（角新生血管），角膜移植排斥，晶状体后纤维增生症，表皮角结膜炎，维生素A缺乏症，隐形眼镜性耗尽，特应性（atopical）角膜炎，严重的边缘角膜炎，翼状胬肉干眼，
Figure BDA00002832533800341
综合征，红斑痤疮，小（水）疱病，梅毒，分支杆菌感染，脂质变性，腐蚀性物质烧伤，细菌性溃疡，霉菌性溃疡，原生动物感染，卡波济氏肉瘤，Mooren’s溃疡，Terrien边缘变性，边缘松解症，巩膜炎，慢性视网膜剥离等等；动脉粥样硬化；子宫内膜异位症；肥胖症；心功能不全；高级肾功能不全；内毒素血症；中毒性休克综合征；脑膜炎；硅诱导纤维化；石棉诱导的纤维化；中风；牙周炎；牙龈炎；大细胞性贫血；顽固性贫血；5q染色体缺失综合征；血管形成受到艾滋病毒、肝炎、出血性毛细血管扩张症或朗奥韦病感染而改变的血管形成的状况。
在一个优选的实施方式，与不期望的血管生成相关的疾病是选自以下的疾病：癌症，类风湿性关节炎，牛皮癣，肉状瘤，糖尿病性视网膜病，早熟性视网膜病，视网膜静脉堵塞，老年性黄斑盘状变性，动脉粥样硬化，子宫内膜异位和肥胖证，优选癌症。
在一个具体的实施方式中，与不期望的血管生成相关的疾病是炎症疾病。“炎症疾病”理解为导致炎症症状的过度的或改变的炎症应答的任何疾病。可以用发明的化合物治疗的所述炎症疾病包括，但不限于，阿狄森氏病，普通痤疮，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，溃疡，口疮性口炎，关节炎，动脉硬化症，骨关节炎，类风湿性关节炎，支气管哮喘，白塞氏病，伯克氏病，肠道炎性疾病，克罗恩氏病，脉络膜炎，溃疡性结肠炎，腹腔病，冷球蛋白血症，黄斑变性，皮炎，疱疹样皮炎，皮肌炎，胰岛素依赖型糖尿病，青少年糖尿病，炎症性脱髓鞘性疾病，迪皮特朗挛缩，脑脊髓炎，过敏性脑脊髓炎，眼内炎，过敏性小肠炎，自身免疫性肠病综合症，麻风结节性红斑，强直性脊柱炎，自发性面瘫，慢性疲劳综合征，风湿热，囊性性纤维化，龈炎，肾小球肾炎，肺出血-肾炎综合征，甲亢症（Graves syndrome），桥本氏病，慢性肝炎，组织细胞增生症，节段性回肠炎，虹膜炎，播散性红斑狼疮，系统性红斑狼疮，皮肤狼疮红斑，淋巴肉芽肿，传染性单核细胞增多症，重症肌无力，横贯性脊髓炎，原发性特发性粘液性水肿，肾变病，肥胖，交感性眼炎，肉芽肿性睾丸炎，胰腺炎，脂膜炎，寻常型天疱疮，牙周炎，结节性多动脉炎，慢性多关节炎，多发性肌炎，急性多神经根炎，牛皮癣，慢性阻塞性肺病，紫癜，坏疽性脓皮病，莱特尔氏综合征，糖尿病性视网膜病变，红斑痤疮，肉样瘤病，共济失调硬化症，进行性系统性硬化症，巩膜炎，硬皮病，多发性硬化症，弥漫性硬化症，急性前葡萄膜炎，白癜风，Whipple氏病，与艾滋病相关的疾病，严重联合免疫缺陷病和Epstein Barr氏病毒例如干燥综合征，骨关节结核病和寄生虫病例如利什曼病。优选的炎症性疾病是类风湿性关节炎，银屑病，肉样瘤病，糖尿病性视网膜病变，黄斑变性，动脉硬化和肥胖。
在另一个优选的实施方式中疾病是癌症。
术语“癌症”和“肿瘤”指在动物中表征为失调的细胞生长的生理学状况。发明的第一方面的特异性结合S100A4的抗体或其片段可用于治疗任意的癌症或肿瘤，例如，但不限于，乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头、颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血、胸腺、子宫、睾丸和肝的肿瘤。特别地，可以用所述抗体治疗的肿瘤包括但不限于腺瘤，血管肉瘤，星形细胞瘤，上皮细胞癌，生殖细胞瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质瘤，血管内皮瘤，血管肉瘤，血肿，肝毒细胞瘤，非白血性白血病，淋巴瘤，成神经管细胞瘤，黑色素瘤，成神经细胞瘤，骨肉瘤，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，肉瘤，畸胎瘤。特别地，肿瘤/癌症选自肢端黑色素瘤，光化性角化病腺癌，腺样囊性癌，腺瘤，腺肉瘤，腺鳞癌，星形细胞瘤，前庭大腺癌，基底细胞癌，支气管腺体癌，毛细类癌肿瘤，癌，癌肉瘤，胆管癌，囊腺瘤，内胚窦瘤，子宫内膜增生，子宫内膜间质肉瘤，子宫内膜样腺癌，室管膜瘤，Swing氏肉瘤，局灶性结节性增生，生殖系肿瘤，成胶质细胞瘤，胰高血糖素瘤，成血管细胞瘤，血管内皮细胞瘤，血管瘤，肝腺瘤，肝腺瘤病，肝细胞癌，胰岛素瘤，上皮内瘤变，内上皮层鳞状细胞瘤，浸润性鳞状细胞癌，大细胞癌，平滑肌肉瘤，黑色素瘤，恶性黑色素瘤，恶性间皮瘤，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，粘液表皮样癌，成神经细胞瘤，神经上皮腺癌，结节性黑色素瘤，骨肉瘤，乳头状浆液性腺癌，垂体瘤，浆细胞瘤，假肉瘤，肺母细胞瘤，肾细胞癌，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，肉瘤，浆液性癌，小细胞癌，软组织癌，生长抑素分泌瘤，鳞状细胞癌，鳞状上皮细胞癌，未分化癌，葡萄膜黑色素瘤，疣状癌，血管活性肠肽肿瘤，胚胎性癌肉瘤。在本发明的一个实施方式中，肿瘤选自：乳癌，前列腺癌，肺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，肾癌，胃癌，卵巢癌，甲状腺乳头状癌，黑色素瘤，肝细胞癌，膀胱癌，浸润性癌性脂肪肉瘤，成神经细胞瘤，食管鳞状细胞癌，骨肉瘤，胆囊癌，口腔鳞状细胞癌，子宫内膜癌，和成神经管细胞瘤。在另一个实施方式中，肿瘤选自直肠结肠癌，胰腺癌，和任何其它S100A4介导的肿瘤。
在发明的一个优选实施方式中，采用所述抗体预防或治疗的肿瘤/癌症选自胰腺癌和直肠结肠癌，优选胰腺癌。
术语“胰腺癌”理解为胰腺的任何恶性瘤，包括腺癌和其某些变型。
术语“直肠结肠癌”理解以在结肠、直肠或阑尾的瘤形成为特征的癌症。直肠结肠癌在临床上不同于肛门癌，后者影响肛门。
在本发明的一个实施方式，药物包含一或多种根据本发明的第一方面所述抗体作为唯一的治疗性试剂。然而，发明的药物也可以含有一或几种另外的化合物用于治疗癌症。从而，在本发明的另一个实施方式中，药物是通过将根据发明所述的抗体和一或多种可用于所述疾病的治疗的治疗性试剂进行联合给药制备的。
术语“可用于所述疾病的治疗的治疗性试剂”指适合于用于治疗癌症的试剂。
在癌症的治疗中，发明的抗体可以与另外的治疗活性化合物联合使用，例如细胞毒素试剂，抗血管生成试剂或抗转移试剂。
可以与本发明的抗体联合使用以治疗癌症的的细胞毒素试剂包括但不限于蒽环类抗生素例如阿霉素（多柔比星）和柔红霉素，紫杉烷类如TaxolTM（泰素）和多西紫杉醇，长春花生物碱例如长春新碱和长春碱，5-氟尿嘧啶（5-FU），甲酰四氢叶酸，伊立替康，伊达比星，丝裂霉素C，奥沙利铂，雷替曲塞，他莫昔芬，顺铂，卡铂，甲氨蝶呤，放线菌素D，米托蒽醌，博来霉素或光辉霉素。可以与本发明的抗体联合使用以治疗癌症的的抗血管生成试剂包括但不限于选自以下的抗血管生成试剂选自如下试剂组：紫杉醇，2-甲氧基雌二醇，普啉司他，巴马司他（batimastat），BAY12-9566，羧胺三唑，CC-1088，醋酸右美沙芬，醋酸二甲基氧杂蒽酮，内皮他丁，IM-862，马马司他，青霉胺，PTK787/ZK222584，RPI.4610，角鲨胺，SU5416,沙利度胺,考布他汀，他莫昔芬,COL-3,新伐司他,BMS-275291，SU6668，抗VEGF抗体，Medi-522（Vitaxin II），CAI，白细胞介素12，IM862，阿米洛利，血管他丁，血管他丁KL-3，血管他丁KL-5，卡托普利，DL-α-二氟甲基鸟氨酸，盐酸DL-α-二氟甲基鸟氨酸，内皮他丁，烟曲霉素，除莠霉素A，4-羟基苯基维甲酰酚胺，胡桃醌，层粘连蛋白，层粘连蛋白六肽，层粘连蛋白五肽，薰草菌素A，甲羟孕酮，米诺环素，胎盘核糖核酸酶抑制因子，苏拉明，凝血酶敏感蛋白，针对促血管形成因子的抗体（例如，阿瓦斯汀，爱必妥，维克替比，赫赛汀），促血管生成生长因子的低分子量酪氨酸激酶抑制剂（如特罗凯，多吉美，索坦，易瑞沙）；mTOR抑制剂（例如驮瑞塞尔），α，β和γ干扰素，IL-12，基质金属蛋白酶抑制剂（例如，COL3，马马司他，巴马司他）；ZD6474，SUl1248，整合素拮抗剂（vitaxin）；PDGFR抑制剂（例如格列卫）；NM3和2-ME2；环肽例如西仑吉肽。可以与发明的抗体联合使用以治疗癌症的的抗转移试剂包括但不限于能够作为抗转移试剂的任何试剂，例如烷化剂；抗代谢物例如5-氟尿嘧啶，培美曲塞（MTA），雷替曲塞（TDX）；铂的细胞毒性药物例如顺铂或奥沙利铂；拓扑异构酶抑制剂；抗微管剂；蒽环类抗生素；植物生物碱；GTP酶抑制剂；血管生成抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；细胞周期调节激酶抑制剂，例如细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白抑制剂；Wnt信号抑制剂；E2F转录因子的抑制剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；AKT激酶或ATP酶抑制剂。
“联合给药”理解为根据发明所述的抗体能够与可用于治疗癌症的治疗性试剂共同或者分别地，同时地、在相同时间内或顺序地以任何顺序给药。例如，发明的抗体的给药可以先进行，随后给予一种或多种可用于治疗所述病理学的治疗性试剂；或者发明的抗体的给药可以最后进行，在此之前给予一种或多种可用于所述病理学的治疗性试剂；或者发明的抗体的给药可以与给予一种或多种可用于所述病理学的治疗性试剂的同时进行。
本领域技术人员在本发明的文本中将理解的是，与发明所述抗体联合给药的药物和可用于癌症治疗的另外的治疗性试剂可以作为单一的剂量形式或者以分别的剂量形式来制备。
在优选的实施方式中，具有抗血管生成活性的抗-S100A4抗体是单克隆抗体，优选由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤生产的抗体；更优选由杂交瘤CEACC10022401产生。
在另一方面，本发明涉及由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804杂交瘤的杂交瘤系生产的特异性抗-S100A4抗体或其片段，其用于药物。
本发明也提供了根据本发明的任意一个实施方式所述的抗体或其片段或单克隆抗体，用作治疗任何S100A4介导的疾病的药物。
本发明也提供了根据本文展现的任意一个实施方式所述的抗体或其片段或单克隆抗体的用途，用于在制造治疗S100A4介导的疾病的药物。
本发明也提供了治疗S100A4介导的疾病的方法，包含向需要所述治疗的对象给予药学有效量的根据本文展现的任意一个实施方式所述的抗体或其片段或单克隆抗体。
炎症
发明人发现特异性抗-S100A4抗体在预防和/或治疗与炎症相关的疾病是有用的。从而，发明的一方面涉及特异性结合S100A4蛋白的抗体或其具有结合至抗原的能力的片段在制备用于预防和/或治疗与炎症相关的疾病的药物中的用途。
在另一方面，本发明涉及特异性结合S100A4蛋白的抗体或其具有结合抗原的能力的片段用于预防和/或治疗与炎症相关的疾病。
在另一方面，本发明涉及在对象中治疗或预防与炎症相关的疾病的方法，包含向所述对象给予特异性结合S100A4蛋白的抗体或具有结合抗原的能力的其片段。
表述“特异性结合S100A4蛋白的抗体”，在本发明的这方面的上下文中，指任何特异性识别S100A4蛋白而不识别S100家族的其它蛋白的抗体。所述表述包括在现有技术中之前公开的抗体。
术语“片段”指具有结合抗原的能力的抗体片段。所述片段具有抗血管生成活性是非必需的。
表述“炎症相关疾病”指病原性炎症发生的所有那些疾病，即，所述过程是伤害性或不期望的，不论是否是癌。与炎症相关的疾病包括炎症疾病，其中具有导致发炎症状的过度的或改变的炎症应答。可以被本发明的抗体治疗的所述炎症疾病包括，但不限于，阿狄森氏病，普通痤疮，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，溃疡，口疮性口炎，关节炎，动脉硬化症，骨关节炎，类风湿性关节炎，支气管哮喘，白塞氏病，伯克氏病，肠道炎性疾病，克罗恩氏病，脉络膜炎，溃疡性结肠炎，腹腔病，冷球蛋白血症，黄斑变性，皮炎，疱疹样皮炎，皮肌炎，胰岛素依赖型糖尿病，青少年糖尿病，炎症性脱髓鞘性疾病，迪皮特朗挛缩，脑脊髓炎，过敏性脑脊髓炎，眼内炎，过敏性小肠炎，自身免疫性肠病综合症，麻风结节性红斑，强直性脊柱炎，自发性面瘫，慢性疲劳综合征，风湿热，囊性纤维化，龈炎，肾小球肾炎，肺出血-肾炎综合征，甲亢症（Graves syndrome），桥本氏病，慢性肝炎，组织细胞增生症，节段性回肠炎，虹膜炎，播散性红斑狼疮，系统性红斑狼疮，皮肤狼疮红斑，淋巴肉芽肿，传染性单核细胞增多症，重症肌无力，横贯性脊髓炎，原发性特发性粘液性水肿，肾变病，肥胖，交感性眼炎，肉芽肿性睾丸炎，胰腺炎，脂膜炎，寻常型天疱疮，牙周炎，结节性多动脉炎，慢性多关节炎，多发性肌炎，急性多神经根炎，牛皮癣，慢性阻塞性肺病，紫癜，坏疽性脓皮病，莱特尔氏综合征，糖尿病性视网膜病变，红斑痤疮，肉样瘤病，共济失调硬化症，进行性系统性硬化症，巩膜炎，硬皮病，多发性硬化症，弥漫性硬化症，急性前葡萄膜炎，白癜风，Whipple氏病，与艾滋病相关的疾病，严重联合免疫缺陷病和Epstein Barr氏病毒例如
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综合征，骨关节结核和寄生虫病例如利什曼病。优选的炎症性疾病是类风湿性关节炎，动脉硬化，牛皮癣，炎症性肠疾病和移植物抗宿主病。
术语“药物”，“预防”和“治疗”在发明的抗体的治疗性用途的上下中定义。
在优选的实施方式中，特异性结合S100A4蛋白的抗体或其片段是具有抗血管生成活性的抗-S100A4抗体或基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其中抗体选自如下抗体组：
（i）识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4的表位的抗体，
（ii）识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4的表位的抗体，和
（iii）由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
在更优选的实施方式中，抗体由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804杂交瘤组的杂交瘤产生；更优选的杂交瘤是ECACC10022401。
发明的抗体的缀合物及其应用
考虑到本发明的第一方面的抗体能够结合S100A4蛋白并且在癌症过程中该蛋白被过表达，根据本发明的第一方面所述的具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其片段组成了适合于运送具有治疗活性的化合物至S100A4表达位点的试剂。
如上面所详述，S100A4蛋白在各种癌症中被表达。所述蛋白也在与炎症相关的疾病中被表达，例如类风湿性关节炎。
因此，在另一方面，发明涉及的缀合物包含根据本发明的第一方面的抗体或其片段和第二组分，所述第二组分选自：
a）抗血管生成试剂，
b）抗转移试剂，
c）细胞毒素试剂，
d）抗炎症试剂。
在优选的实施方式中，第二组分选自：a）抗血管生成试剂，b）抗转移试剂，和c）细胞毒素剂。
在本发明上下文中，“缀合物”理解为由根据本发明的第一方面所述的抗体结合、连接或联合至至少一种第二组分而形成的装配体。
根据本发明的第一方面的抗体或其片段已经在所述第一方面的文本中描述。
“第二组分”被理解为具有治疗活性的分子，其通过发明的单克隆抗体而被导向其作用位点。
S100A4蛋白在肿瘤细胞中过表达。因此，发明的抗体可以用于引导抗肿瘤药物至表达位点。
如本发明中所用的，术语“细胞毒素试剂”指能够促进细胞死亡的试剂，其具有降低生长、停止生长或破坏细胞的能力，并且，具体来说，快速增殖细胞并且，更具体地，肿瘤细胞。细胞死亡可能由任何机制引起，例如程序性细胞凋亡，尽管不限于这个起因，通过代谢抑制，细胞骨架的构成或DNA的化学修饰的干扰。术语细胞毒素试剂包含任何化学治疗试剂，包括有机小分子、肽、寡核苷酸等等；毒素；酶；细胞因子；放射性同位素或放射治疗试剂。
“化学治疗试剂”理解为化学化合物例如，但不限于，蒽环类抗生素例如阿霉素和柔红霉素，紫杉烷类如TaxolTM（泰素）和多西紫杉醇，长春花生物碱例如长春新碱和长春碱，5-氟尿嘧啶（5-FU），甲酰四氢叶酸，伊立替康，伊达比星，丝裂霉素C，奥沙利铂，雷替曲塞，他莫昔芬，顺铂，卡铂，甲氨蝶呤，放线菌素D，米托蒽醌，博来霉素或光辉霉素，抗代谢物例如吉西他滨。
“毒素”理解为毒性试剂，其与发明抗体缀合形成免疫毒素。确定毒素与抗体的缀合物降低形成体的毒性，使其能够用作治疗性试剂，因为毕竟其不会过于有毒。毒素和抗体之间的结合是化学的，保留其生物活性。其分离通常发生在由抗体识别的靶标细胞的溶酶体中，从而使得化学结合仅在封闭的由溶酶体提供的酸性细胞环境中破裂。用于本发明的上下文的毒素是植物毒素、细菌毒素、真菌毒素或动物源的和其片段，例如，但不限于，蓖麻毒素A-链，皂角苷，白喉A-链，白喉毒素的活性非结合片段，绿脓假单胞菌外毒素A-链，相思豆毒素A-链，毒素（modecin）A-链，α-八叠球菌，油桐A-蛋白（LeuritesfordiiA-蛋白），石竹素蛋白，美洲商陆（PAPI，PAPI和PAP-S）蛋白，苦瓜甾抑制剂，泻果素，巴豆毒素，肥皂草龙须菜抑制因子，白树毒素（gelonin），米托洁林，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素和单端孢霉烯族毒素类。
“酶”在本发明的上下文中理解为毒素或药物活化酶，例如，但不限于，碱性磷酸酶，其活化足叶乙甙和阿霉素；羧肽酶G2，其活化氮芥；β-内酰胺酶，其活化阿霉素、紫杉醇和丝裂霉素。
“细胞因子”理解为不同大小和分子量的肽，其合成免疫系统的细胞以调节免疫应答，它们可以是激素、生长因子、坏死因子等等。它们可以是天然来源的或来自重组细胞培养物以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。带有抗体的缀合物产生免疫细胞因子。可用于本发明的细胞因子是，但不限于，α-TNF因子，INF-γ，GM-GSF因子或IL-2。
“放射性同位素”被理解为放射性的同位素，例如，但不限于，131I，90Y，177Lu，188Re，67Cu，211At，213Bi，125I，111In。
“抗血管生成试剂”被理解为抑制或减少新血管的形成，即抗血管生成的化学物质或生物物质。可以与本发明的第一方面的抗体缀合的抗血管生成试剂的实例包括，但不限于，选自以下的抗血管试剂组：
紫杉醇，2-甲氧基雌二醇，普啉司他（prinomastat），巴马司他（batimastat），BAY12-9566，羧胺三唑，CC-1088，醋酸右美沙芬，醋酸二甲基氧杂蒽酮，内皮他丁，IM-862，马马司他（marimastat），青霉胺，PTK787/ZK222584，RPI.4610，乳酸角鲨胺，SU5416，沙利度胺，考布他汀，他莫昔芬，COL-3，新伐司他，BMS-275291，SU6668，抗VEGF抗体，Medi-522（Vitaxin II），CAI，白细胞介素12，IM862，阿米洛利，血管他丁，血管他丁KL-3，血管他丁KL-5，卡托普利，DL-α-二氟甲基鸟氨酸，盐酸DL-α-二氟甲基鸟氨酸，内皮他丁，烟曲霉素，除莠霉素A，4-羟基苯基维胺，胡桃醌，层粘连蛋白，层粘连蛋白六肽，层粘连蛋白五肽，薰草菌素A，甲羟孕酮，米诺环素，胎盘核糖核酸酶抑制剂，苏拉明，血小板凝血酶敏感蛋白，针对促血管生成因子的抗体（例如，阿瓦斯丁，爱必妥，维克替比，赫赛汀），促血管生成生长因子的低分子量酪氨酸激酶抑制剂（如特罗凯，多吉美，索坦，易瑞沙）；mTOR抑制剂（例如驮瑞塞尔），α，β和γ-干扰素，IL-12，基质金属蛋白酶抑制剂（例如，COL3，马马司他，巴马司他）；ZD6474，SUl1248，整合素拮抗剂（vitaxin）；PDGFR抑制剂（例如格列卫）；NM3和2-ME2；环肽例如西仑吉肽
“抗转移试剂”理解为抑制或减少转移的化学物质或生物物质，所述转移即，引起癌症的细胞基本上通过淋巴或血流的远端传播，以及在所述转移的目的位点的新肿瘤生长。
可以与本发明的第一方面的抗体缀合的抗转移试剂包括，但不限于，能够作为抗转移试剂的任何细胞毒素试剂，例如烷化剂；抗代谢物例如5-氟尿嘧啶，培美曲塞（MTA），雷替曲塞（TDX）；铂的细胞毒性药物例如顺铂或奥沙利铂；拓扑异构酶抑制剂；抗微管剂；蒽环类抗生素；植物生物碱；GTP酶抑制剂；血管生成抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；细胞周期调节激酶抑制剂，例如细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白抑制剂；Wnt信号抑制剂；E2F转录因子的抑制剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；AKT激酶或ATP酶抑制剂。
抗体和其它试剂的缀合物可以利用多种耦合试剂或双功能蛋白接头来建立。接头可以是“可分接头”，其允许试剂释放在细胞中，例如酸不稳定接头，肽酶敏感性接头，二甲基接头或含有二硫键的接头。
S100A4蛋白也在与炎症相关的疾病中表达。因此，发明的抗体可以用于将抗炎症药物引导至表达位点。
术语“抗炎症试剂”意思是抑制或阻断前列腺素生产的任何抗炎症药物。可用的抗炎症试剂是，但不限于，5-氨基水杨酸和含有它的药物（柳氮磺胺吡啶，美沙拉，美沙拉嗪，奥沙拉嗪）；乙酰水杨酸；皮质激素例如氢化可的松，可的松，去炎松，布地奈德，泼尼松，地夫可特，甲氨喋呤，英夫利昔单抗，阿达木单抗。
在优选的实施方式中，发明缀合物的特异性抗-S100A4抗体是单克隆抗体，优选单克隆抗体或其片段由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤或其片段产生；更优选由杂交瘤ECACC10022401产生。
从而，在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的第一方面所述的抗体或其片段的缀合物，用于药物。
在另一方面，发明涉及包含根据本发明的第一方面的具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其片段的缀合物在制备预防和/或治疗选自以下的疾病组的疾病中的用途：转移，与不期望的血管生成相关的疾病和与炎症相关的疾病；优选选自转移和与不期望的血管生成相关的疾病。
在另一个方面，本发明涉及包含根据本发明的第一方面的具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其片段的缀合物，其用于制备预防和/或治疗选自以下的疾病中的用途：转移，与不期望的血管生成相关的疾病和与炎症相关的疾病；优选选自转移和与不期望的血管生成相关的疾病。
在另一个方面，本发明涉及在患有选自转移、与不期望的血管生成相关的疾病和与炎症相关的疾病的对象中治疗或预防的方法，其包含向所述对象给药包含根据本发明的第一方面的具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其片段的缀合物。在优选的实施方式中，疾病选自转移和与不期望的血管生成相关的疾病。
在优选的实施方式中，特异性抗-S100A4抗体是单克隆抗体，优选由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或其片段；更优选由杂交瘤ECACC10022401产生的。
“药物”，在这些发明的方法的上下文中，理解为药学组合物，该药物组合物包含缀合物，所述缀合物是本发明的第一方面的抗体或其片段与可用于治疗癌症特别是治疗选自转移和与不期望的血管生成相关的疾病的化合物，或者可用于治疗与炎症相关的疾病的化合物的缀合得到的。
术语“预防”，“治疗”，“转移”，“与不期望的血管生成相关的疾病”和“与炎症相关的疾病”已经在前面本发明的治疗性用途的上下文中定义。
发明的诊断方法
由于肿瘤细胞分泌S100A4蛋白至细胞外介质，可以在多种生物流体中检测到S100A4蛋白，从而能够用于诊断癌症。所述蛋白也在患有与炎症相关的疾病例如类风湿性关节炎的患者的血浆和关节滑液中发现。
从而，一方面，本发明涉及在对象中诊断癌症或与炎症相关的疾病的体外方法，其包含：
（a）检测所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平，其是通过利用选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体实现的；
（b）将所述水平与参考值比较
其中S100A4蛋白或其变体相对于参考值的水平的增加表明该对象患有癌症或与炎症相关的疾病。
在本发明的上下文中，“诊断癌症的体外方法”理解为通过检测从患者分离的生物流体中可溶的S100A4蛋白的存在而使在对象中显示恶性肿瘤的存在的方法。也可以用于在给予S100A4选择性药物之前证明由肿瘤产生的S100A4的表达，以使合适的患者选择和确定最佳剂量。
在本发明的上下文中，“诊断与炎症相关的疾病的体外方法”理解为通过检测从患者分离的生物流体中可溶的S100A4蛋白的存在而使对象中显示炎症疾病的存在的方法。
本发明中的“对象”被理解为分类为哺乳动物的任何动物并包括但不限于家畜和耕畜，灵长类和人类，例如人，非人灵长类，奶牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫或啮齿类动物。优选地，对象是任何种族或年龄的女性或男性人类。在本发明的上下文中，对象是潜在地遭受癌症或与炎症相关的疾病的对象或者之前被诊断癌症或与炎症相关的疾病的对象。
发明的方法的第一步包含利用发明的单克隆抗体来确定研究对象的生物流体中的S100A4蛋白或其变体的水平。
在本发明的上下文中，使用的术语“生物流体”是指任何生物分泌物或流体，不论是生理的或病理的，其在对象的体内产生。这样的生物流体包括，但不限于，血液，血浆，血清，支气管肺泡清洗液，尿液，鼻分泌物，耳分泌物，尿道分泌物，脑脊髓液，胸膜液，滑液，腹膜液，腹水，心包液，羊水，胃液，淋巴液，组织间液，唾液，痰，液相沉积，泪，黏液，汗液，乳汁，精液，阴道分泌物，来自溃疡、水疱、脓肿和其他表面喷发的体液。所述样品的获得可以通过常规方法做到，利用本领域技术人员已知的方法，例如抽血，在纤维支气管镜检查期间的灌输和吸液，池，室的或腰椎穿刺，胸腔穿刺，关节或滑膜经皮穿刺，腹腔穿刺，羊膜穿刺，咳痰，腹膜经皮穿刺，心包经皮穿刺等，或通过简单的收获。
在一个优选的实施方式中，生物流体选自血液、血浆和血清，优选血清，更优选血浆。血液样品典型地通过穿刺动脉或静脉而取得，通常是肘内侧或手背部的静脉，血液样品被收集在密封瓶或注射器中。通常可以在踵部或末端趾骨进行毛细穿刺以用于微测量的分析。血清可以获自完全血液样品并在不存在抗凝血剂下通过将样品放置沉积10分钟从而其凝结并随后在1,500rpm离心10分钟以从血清（上清液）中分离细胞（沉淀）。接着，为了获得血浆样品，完全血液与抗凝血剂接触并在3,000rpm下离心20分钟。所述离心的沉淀对应于血液的有形成分，而上清对应于血浆。
获得的血清或血浆可以转移至储存管以用于通过本发明的方法的样品分析。
在另一个优选的实施方式中生物流体是关节滑液。
S100A4蛋白的表达水平可以通过常规方法来检测和定量。所述方法包括，但不限于，S100A4的检测通过测量其对其配体之一例如RAGE的亲和力，和随后定量S100A4-配体复合物来检测S100A4；或通过使用能够特异性结合S100A4蛋白的抗体（或其含有抗原决定性的片段）或所述抗体的功能性变体，其中所述的能够特异性结合S100A4蛋白的抗体是由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的。然后，对得到的抗原-抗体复合物进行定量。在本发明的优选的实施方式中所用抗体是由杂交瘤ECACC10022401产生的抗体。
本发明也考虑到了所述抗体的功能性变体的用途。发明的单克隆抗体的“功能性变体”理解为与所述单克隆抗体共享一种或多种本发明中描述的与所述单克隆抗体相关的功能，包括在体外和体内，并具有氨基酸序列上的最小同一性。发明单克隆抗体的功能性变体可以通过插入、取代或删除一个或多个氨基酸而衍生所述序列，并可以通过重组和/或合成的方法来获得。
发明的单克隆抗体的功能性变体必须保留其结合S100A4抗原的能力以及抑制S100A4蛋白的一种或多种特征性功能的能力，例如血管生成。所述功能可以由本发明的实施例中描述的方法来确定。
发明的单克隆抗体的功能性变体包括显示与所述抗体的多肽序列至少60%，65%，70%，72%，74%，76%，78%，80%，90%，95%，97%，99%的相似性或同一性。两个多肽之间的同一性程度是利用在计算机中执行的算法和本领域技术人员已知的方法来确定。两个氨基酸序列之间的同一性优选利用BLASTP算法来确定（BLAST Manual，Altschul，S.et al.，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.，et al.，J.，1990，Mol.Biol.215:403-410）（BLAST手册，Altschul，S.等,NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.，等，1990，《分子生物学》215:403-410）。
另外，用于本发明的方法的抗体可以或也可以不用可检测试剂标记。在具体的实施方式中，所用抗体缀合至可检测试剂。
在本发明的上下文中，术语“可检测试剂”和“标记”是同义词，并且它们指的是这样的试剂，其具有使其通过酶的、放射性的或荧光方法而被检测到。可检测化合物可以是酶，放射性标记的化合物或放射性同位素，荧光色素，化学发光试剂，酶底物或辅因子，或酶抑制剂，颗粒，染料，等等。
通过放射性同位素，也被称为放射同位素或放射核素，放射性标记的化合物，可以包括，但不限于，3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I。荧光标记物可以包括，但不限于，罗丹明，磷-镧系元素或FITC。酶标记物包括，但不限于，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶或碱性磷酸酶。优选的标记物包括，但不限于，荧光素，磷酸酶例如碱性磷酸酶，生物素，抗生物素蛋白，过氧化物酶例如辣根过氧化酶和涉及生物素的化合物或涉及抗生物素蛋白的化合物（例如，抗生蛋白链菌素或
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NeutrAvidin，可以获自Pierce，Rockford，IL）。
存在多种公知的分析方法可用于本发明，这些分析方法使用初级未标记抗体和次级标记的抗体：这样的技术包括蛋白质印迹或蛋白质转移，ELISA（酶联免疫吸附分析法），RIA（放射性免疫分析），竞争性EIA（竞争性酶免疫分析），DAS-ELISA（双抗体夹心ELISA），或基于使用包括特异性抗体的蛋白微阵列或生物芯片的技术，其基于胶体沉淀的分析，以例如反应性条带的形式。检测S100A4蛋白的其他方法包括亲和色谱、配体结合测定等技术。
在一个特别的实施方式中，S100A4的水平的定量是通过蛋白质印迹或ELISA来实现。
还在更具体的实施方式中，S100A4蛋白或其变体的水平通过蛋白质印迹来确定。蛋白质印迹基于在变性条件下通过凝胶电泳检测预先溶解的蛋白并且固定在膜上，通常是硝化纤维膜，并用特异性S100A4抗体孵育以及发展系统（例如化学发光）实现。
在另一个优选的实施方式中，诊断是通过ELISA来进行。所述技术基于在样品中通过抗-S100A4抗体固定在底物上进行测定，并且随后通过第二抗体检测S100A4-抗体复合物。
如本文所用的术语“蛋白”是指氨基酸的分子链，由共价或非共价键结合。该术语进一步包括所有生理学上相关的翻译后化学修饰形式。落入本发明的范围的翻译后修饰包括，例如，单独的肽的切断，糖基化，乙酰化，磷酸化，异戊二烯基化，蛋白质水解作用，肉豆蔻酰化，蛋白折叠和蛋白分解过程，等等。另外，该蛋白可以包括非天然氨基酸，该非天然氨基酸是通过翻译后修饰或通过在翻译期间引入非天然氨基酸而形成。
术语“S100A4”已经本发明的第一发明方面的上下文中定义。对于发明的诊断方法，检测的S100A4对应于被提取以用于分析的生物流体样品的来源的对象所属的物种。
如上所述，所述蛋白的变体也可以在本发明的方法中用于测量S100A4蛋白的水平。
因此，S100A4蛋白的变体可以是：（i）其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基（优选保守的氨基酸）置换并且这样的置换的氨基酸残基可以或可以不由遗传密码子编码，（ii）其中有一个或多个被修饰的氨基酸残基，例如，通过偶联取代基团而修饰的残基，（iii）该蛋白是S100A4的交替拼接的变体和/或（iv）该蛋白的片段。该片段包括原始序列通过蛋白分解过程（包括在多个位点的蛋白水解作用）而产生的蛋白。所述变体落入本发明的范围内。
根据本发明的变体包括与原始氨基酸序列至少60%，70%，80%，90%，95%或96%的相似性或同一性的氨基酸序列。正如众所周知，两个蛋白之间的“相似性”通过比较一个蛋白的氨基酸序列与第二个蛋白的序列而确定。两个蛋白之间的同一性的程度用计算机算法和本领域技术人员公知的方法来确定，优选利用BLASTP算法[BLASTManual，Altschul，S.，et.al.，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.，et.al.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]（[BLAST手册，Altschul，S.等,NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.，等，《分子生物学》215:403-410(1990)）。
在具体的实施方式中，变体是来自哺乳动物的变体，优选人类变体，更优选具有与原始氨基酸序列至少60%，70%，80%，90%，95%或96%的相似性或同一性。
本领域技术人员将认识到可以用S100A4蛋白的表达的绝对水平和相对水平两者来实施发明的方法。从而，在本发明中，表述“S100A4蛋白的水平”用于指所述蛋白的绝对水平和相对水平的两者。
表述“绝对水平”指在样品中感兴趣的蛋白的总量。所述值可以以表达的蛋白的浓度来给出，以单位体积上的质量为单位表示（例如，以ng/ml样品），以每单位体积内蛋白分子的数目（例如，以pmol蛋白/ml样品），以每单位质量的总蛋白的的S100A4蛋白的质量为单位（pg S100A4/mg总蛋白）或以每单位质量的总蛋白上S100A4分子的数目（例如，以pmol S100A4/mg的总蛋白）。
表述“相对水平”指研究对象中S100A4蛋白与参考蛋白的表达水平之间的关系，即，相对于所述参考蛋白，以标准化的形式定义为S100A4蛋白的浓度。
为了标准化不同样品之间的蛋白的值，可以比较要分析的样品中S100A4蛋白的水平与对照蛋白的表达。在本发明中“对照蛋白”被理解为这样的蛋白，其表达水平，相对于非肿瘤细胞，在肿瘤细胞中不改变或仅以有限量来改变。优选地，对照蛋白是由构成性表达的基因编码的蛋白，这些基因是活性的或恒定地转录，从而这些蛋白被构成性表达并实现必要的细胞功能。可用于本发明的优选的对照蛋白包括，但不限于，β-2-微球蛋白（B2M），泛素，18-S核糖体蛋白，亲环素，GAPDH，PSMB4，微管蛋白和肌动蛋白。
本领域技术人员理解的是S100A4蛋白的氨基酸序列中的突变不影响其表达的检测，并且，从而，由氨基酸序列的突变产生的该蛋白的变体落入本发明的范围之内。
一旦样品中S100A4的表达水平被确定，就进行发明的步骤（b），其包括对由步骤（a）获得的S100A4的水平与参考值进行比较。
“参考值”源自样品收集，优选通过来自未感染癌症的正常个体的要分析的生物流体的混合物而形成。所述参考值可以通过本领域公知的技术来确定，例如，从来自健康对象的生物流体中的S100A4蛋白水平的平均值确定。参考值也可以从来自要分析的相同对象的构成性表达的蛋白而获得。
一旦参考值被建立，在步骤（a）中获得的S100A4水平的值就可以与该参考值比较，并且，因此，可以检测对象中S100A4蛋白的水平相对于参考值的改变。更特别地，在发明的方法中，S100A4的水平相对于参考值的提高表明了对象正患有癌症或与炎症相关的疾病。
在本发明的上下文中，相对于参考值“提高的水平”被理解为S100A4的水平的变化在参考值之上至少1.1倍，1.5倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍或更多倍，相比于参考值。
因此，一旦进行了所述对比，发明的方法允许针对是否患有来自癌症或与炎症相关的疾病的对象进行诊断。在具体的实施方式中，该方法适合于诊断癌症，尤其是胰腺癌和结肠直肠癌。
在另一个具体的实施方式中，该方法适合于诊断与炎症相关的疾病，优选类风湿性关节炎。
术语“癌症”和“与炎症相关的疾病”已经在前文中定义。
检测S100A4的方法
在发明的第一方面定义的抗体也可以用于检测不同于生物流体的其他类型的生物样品中的S100A4。所述检测过程可以方便地应用于诊断和/或预测癌症或与炎症相关的疾病，其细胞是表达S100A4蛋白的细胞。
这些抗体可以通过标准技术例如免疫荧光、流式细胞计量术、亲和色谱或免疫沉淀作用而用于鉴别表达S100A4蛋白的细胞和组织。例如，发明的单克隆抗体可以容易地鉴别表达S100A4蛋白的肿瘤细胞并能够在对象中的进行癌症的诊断。
从而，在另一方面，本发明涉及在对象中诊断癌症或与炎症相关的疾病的体外方法，其包含：
（i）检测所述对象的细胞或组织中检测S100A4蛋白或其变体的水平，其是通过利用选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤细胞产生的特异性抗-S100A4单克隆抗体或所述抗体的功能性变体实现的；
（b）将所述水平与参考值比较
其中S100A4蛋白或其变体相对于参考值的水平的增加表明该对象患有癌症或与炎症相关的疾病。
术语“体外方法”意味着所述方法在从其来源的对象中分离的生物样品中进行。所述生物样品可以是细胞，例如血细胞，上皮细胞，生殖细胞，等等，或者也可以是组织的活检样本。
术语“S100A4蛋白的水平”，“变体”，“参考值”和“增加的水平”已经在本发明的诊断方法的上下文中定义。
检测可以通过偶联（即，物理结合）抗体至标记基团来进行的。
在另一方面，发明涉及在样品中检测S100A4的方法，其包含：
（i）是怀疑含有S100A4的样品与本发明的第一方面中定义的特异性抗-S100A4抗体或其片段接触，和
（ii）检测S100A4和抗体或其片段之间的免疫复合物的形成
其中，检测到S100A4和抗体之间的免疫复合物表明样品中存在S100A4。
在检测S100A4的方法的优选的实施方式中，特异性抗-S100A4抗体是选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体。
考虑到发明的单克隆抗体识别S100A4蛋白，它们可以用于从样品中纯化所述蛋白。
优选地，为了纯化S100A4，本发明的第一方面的单克隆抗体通过其与支持物或底物结合而使用。大体上说，任何类型的支持物可以用于发明的方法中，虽然聚合物类例如葡聚糖凝胶，右旋糖酐，可溶于水的多氨基酸，聚乙二醇（PEG），聚谷氨酸（PGA），聚乳酸（PLA），聚乳酸-共-羟基乙酸（PLGA），聚（D,L-丙交酯-共-乙交酯）（PLA/PLGA），聚（羟烷基甲基丙烯酰胺），聚丙三醇，聚酰胺-胺（PAMAM）和聚乙烯亚胺（PEI）的使用是优选的。
典型地，利用发明的第一方面的单克隆抗体纯化S100A4是通过包含以下过程来进行，其包括的步骤有：
（i）在适合于抗体和S100A4蛋白的结合发生的条件下，使要纯化的S100A4蛋白来源的样品与选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的并固定在支持物上的抗体或其片段接触；
（ii）洗涤在步骤（i）中形成的复合物以移除来自样品的所有的化合物，其是非特异性结合至支持物-抗体缀合物和
（iii）洗脱结合在化合物上的S100A4蛋白。
发明的纯化S100A4蛋白的方法可以用任何已知蛋白纯化方法通过亲和的方法进行，，包括，例如，亲和色谱柱，其固定相由根据本发明的第一方面的单克隆抗体缀合至固体支持物而形成。
发明的试剂盒及其应用
在另一方面，发明涉及在生物流体中诊断癌症或与炎症相关的疾病的试剂盒，其包含至少一种根据发明的第一方面的抗体或其片段。在优选的实施方式中抗体是选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的抗体或其片段。在具体的实施方式中，疾病是癌症，优选胰腺癌或结肠直肠癌。在另一优选的实施方式中，疾病是与炎症相关的疾病，优选类风湿性关节炎。
在另一个方面，发明涉及如前所定义的试剂盒在对象的生物流体中诊断癌症或与炎症相关的疾病中的用途。在一个特别的实施方式中疾病是癌症，优选胰腺癌或结肠癌。在另一个优选的实施方式中疾病是与炎症相关的疾病，优选类风湿性关节炎。
如文件中所用的术语“试剂盒”，指一系列适合于检测S100A4的水平的试剂与一或多种类型的元素或组分的组合（例如，其它类型的生化试剂，容器，适合于商业化销售的包装，试剂结合的底物，电子硬件部件，等等）。
在本发明中，“适合于检测S100A4水平的试剂”理解为有选自ECACC10022401,ECACC11051801,ECACC11051802,ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的特异性抗-S100A4单克隆抗体或其片段和，可选地，检测一种或多种构成性蛋白的试剂。
本领域技术人员将理解的是，发明的试剂盒的抗体可以用到确定蛋白水平的已知适合于分析生物流体的所有技术，例如蛋白质印迹或蛋白质转移，ELIA，RIA，竞争性EIA，DAS-ELISA，基于生物芯片的利用的技术，蛋白质微阵列，反应性条带的胶体沉淀分析法，等等。
抗体可以固定至固体支持物上，例如膜，塑料或玻璃，可选地处理以利于所述抗体固定至支持物上。所述固体支持物至少包含，一套特异性识别S100A4蛋白的抗体，其可以用于检测所述蛋白的表达水平。
发明的试剂盒另外包含检测构成性基因编码的蛋白的试剂。所述另外的试剂的存在使得能够在不同的样品中实现标准化而进行的测量（例如，要分析的样品和对照样品）以排除生物标记物由于样品中总蛋白不同的量而在表达的差距大于相对表达水平的真实差距。本发明的构成性基因是总是活性或被恒定地转录的基因，其编码的蛋白被构成性表达并实现必要的细胞功能。可用于本发明的构成性表达的蛋白包括，但不限于，β-2-微球蛋白（B2M），泛素，18-S核糖体蛋白，亲环素，GAPDH，PSMB4，微管蛋白和肌动蛋白。
本发明方法的所有具体实施方式可用于本发明的试剂盒及其用途。
定制疗法的方法
发明人发现用根据发明的单克隆抗体治疗患有癌症的对象阻断了循环的S100A4蛋白的总量，其在治疗之前更高。
从而，在另一个方面，发明涉及用于诊断为癌症的对象设计的定制疗法的体外方法，其包含：
（i）确定所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平并且
（ii）将S100A4蛋白的水平与参考值比较
其中S100A4蛋白或其变体的水平相对于参考水平的增加表明该患者需要用具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其基上保留了所述抗体的抗血管生成活性的片段来治疗，其中抗体选自包含下述的抗体组：
（a）识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4的表位的抗体，
（b）识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4的表位的抗体和
（c）由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
术语“设计的定制疗法”意思是通过所述方法获得的结果可用于决定该对象是否是用发明的单克隆抗体进行治疗的候选者。
术语“对象”意思是诊断为癌症的人或非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如灵长类和非人灵长类，绵羊，狗，兔，大鼠，小鼠，奶牛，鸡，两栖动物，和爬行动物。
术语“癌症”，“S100A4蛋白”，“所述蛋白的变体”，“生物流体”，“单克隆抗体”，“杂交瘤”，“抗体的功能性变体”已经在前文定义。
在本方面的上下文中，对象被选择以用至少一种发明的单克隆抗体处理，而相同的抗体用于监控S100A4的水平。当S100A4蛋白的水平高于参考水平时，则该对象是给予发明的单克隆抗体的治疗的候选者。
S100A4蛋白的表达水平可以通过任何常规的方法来定量化，所述常规方法是可以在来自患者的样品中检测和定量化所述蛋白。用于这些测定的抗体可以被标记或不被标记。可用的标记物的说明性的实例包括放射性同位素，酶，荧光基团，化学发光试剂，酶底物或辅助因子，酶抑制剂，颗粒，染料等等。存在各种已知的分析方法可用于本发明，其利用未标记的抗体（初级抗体））和标记的抗体（次级抗体）；这些技术包括蛋白质印迹，ELISA（酶联免疫吸附分析），RIA（放射性免疫分析），竞争性EIA（竞争性酶免疫分析），DAS-ELISA（双抗体夹心ELISA），免疫细胞化学和免疫组织化学技术，基于使用包括特异性抗体的蛋白生物芯片或微阵列的技术，或者基于胶体沉淀的例如浸渍片的形式的分析方法。
在优选的实施方式中，在步骤（i）中S100A4蛋白水平的确定是通过利用选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体来进行。
在具体的实施方式中，S100A4蛋白的水平通过蛋白质印迹、免疫组织化学或ELISA来定量化。
发明的其他方面
本发明进一步提供了根据本文展现的任意一个实施方式的的抗体或其片段或单克隆抗体的用途，在作为在对象中鉴别、定位、评价、诊断、预测或监控肿瘤或任何其它S100A4介导的疾病的标记物。
本发明进一步提供了这样的产品，其含有根据本文展现的任意一个实施方式的抗体或其片段或单克隆抗体，和抗癌剂，作为联合制剂以用于同时、分开或顺序的癌症的治疗。
本发明进一步提供了这样的产品，其含有根据本文展现的任意一个的实施方式的抗体或其片段或单克隆抗体，和治疗性试剂，作为联合制剂以用于同时、分别或顺序的S100A4介导的疾病的治疗。
特异性结合人或鼠类S100A4多肽的抗体或其片段，用作治疗癌症的药物。
定义
术语“S100A4”，“S100A4蛋白”，“S100钙结合蛋白A4”，“钙结合蛋白”，“钙血管蛋白”，“转移蛋白（metastasin）”，“鼠胎盘同源物”，“MTS1”，“CAPL”，“p9Ka”，“18A2”，“pEL98”，“42A”，“FSP1”，“特异性成纤维细胞蛋白-1”，“恶性转移抑制因子1”，“非白血性白血病多药耐药相关蛋白”，“OTTHUMP00000015469”，“OTTHUMP00000032895”，是可交换地使用，包括变体，亚型，人或鼠S100A4的种同源物，以及具有至少一个与人或鼠S100A4的共同表位的类似物。
人S100A4的完整cDNA序列在Genbank的登记号为M80563（1994年10月31日）。
鼠S100A4的完整cDNA序列在Genbank的登记号为D00208（1997年12月5日）。
人S100A4的完整蛋白序列在UniProt的登记号为P26447（1992年8月1日）。
SEQ ID NO:21
MACPLEKALDVMVSTFHKYSGKEGDKFKLNKSELKELLTRELPSFLGKRTDEAAFQKLMSNLDSNRDNEVDFQEYCVFLSCIAMMCNEFFEGFPDKQPRKK
鼠S100A4的完整蛋白序列在UniProt的登记号为P07091（1988年4月1日）。
术语“抗体”在文中以其最广泛的含义来使用，并覆盖了单克隆抗体（包括全长单克隆抗体），多克隆抗体，多特异性抗体（例如，双特异性抗体），和抗体片段，只要其展现期望的生物活性。
完整的“抗体”包括异多亚基蛋白，其包含至少两个重链（H）和两个轻链（L）由二硫键相互连接起来。典型地，每个轻链与通过一个共价二硫重链连接键，而不同免疫球蛋白同形物的重链之间的二硫键连接的数目有变化。每个重链和轻链也具有链内二硫键。每个重链在一端具有一个重链可变区（本文缩写为HCVR或VH）随后是重链恒定区。重链恒定区由三个结构域组成，CH1，CH2，和CH3。每个轻链具有轻链可变区（本文缩写为LCVR或VL）和在其另外一端的轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域组成，即CL。VH和VL区域可以进一步分为高变区，称为互补决定区（CDR），间杂以更保守的区域，被称为框架区（FR）。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原作用的接触的结构域。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但是展现各种效应器功能例如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC），通过结合至Fcγ受体的吞噬作用，通过新生儿Fc受体（FcRn）的半衰速率/清除速率和通过补体级联的C1q组分的补体依赖性细胞毒性。
术语“片段”当指抗体时，意思是抗体的抗原结合片段，其包含部分的重链或轻链可变序列，其保留结合人或鼠S100A4的能力。片段的实例包括，但不限于，（i）Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F(ab’)2片段，包含两个Fab片段通过二硫键在铰链区连接起来的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；（v）dAb片段（Ward et al.，(1989)Nature341:544-546），其由VH结构域组成；和（vi）分离的互补决定区（CDR）。片段可以通过重组技术或完整抗体的酶或化学切割而制备，例如木瓜蛋白酶消化（参见实施例，WO94/29348）。
进一步，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，由单独的基因编码，它们可以用重组方法通过合成的接头而结合起来，所述接头使其能够作为单一的蛋白链，其中VL和VH区域配对以形成单价分子（被称为单链Fv（scFv）；参见，例如，Bird et al..(1988)Science242:423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883）。这样的单链抗体通过引用术语“抗体”而包含在内。
术语“单克隆抗体”指抗体分子的同源分子组合物的制剂，即，包含群体的个体抗体是相同的，除了可能天然存在的变异，其可能以最小量存在。单克隆抗体组合物展现单一的结合特异性和对具体表位或抗原结合位点的结合力。单克隆抗体是由B细胞克隆派生的单一独特的亲代细胞与肿瘤浆细胞融合而产生的杂交细胞生产。进一步，相比于典型地包括针对不同决定位点（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂，每个单克隆抗体针对抗原上单一的确定位点。
术语“双克隆抗体”指至少两种对鼠或人S100A4的抗体的制剂。典型地，不同的抗体结合不同的表位。
术语“寡克隆抗体”指对鼠或人S100A4的3-100不同的抗体的制剂。典型地，这样的制剂中的抗体结合一系列不同的表位。
术语“多克隆抗体”指多于1（2或更多）种针对鼠或人S100A4的不同的抗体，源自不同的B细胞系，即，是免疫球蛋白的混合物的抗体，是针对特异性抗原（S100A4）分泌的。这样的制剂包括结合至一系列不同表位的抗体。
术语“双特异性抗体”指具有两种不同的结合特异性的抗体，参见例如，美国专利5,922,845和5,837,243；Zeilder(1999)J.Immunol.163:1246-1252；Somasundaram(1999)Hum.Antibodies9:47-54；Keler(1997)Cancer Res.57:4008-4014。例如，双特异性抗体可以具有一个对细胞表面抗原的结合位点，和第二个对效应细胞表面的Fc受体的结合位点。示例性的双特异性抗体可以结合B细胞表面标记的两个不同的表位。其它的所述抗体可以结合第一个B细胞标记并另外结合第二个B细胞表面标记。可选地，抗-B细胞标记的结合臂可以与结合白细胞中的触发分子的臂联合，所述触发分子例如T细胞受体分子（例如，CD2或CD3），或IgG的Fc受体（FcyR），例如FcyRI（CD64），FcyRII（CD32）和FcyRIII（CD16），使得细胞防御机制在B细胞内集中。双特异性抗体可以用于定位针对B细胞的细胞毒素试剂。这些抗体具有对白细胞的标记的结合臂和结合细胞毒素试剂的结合臂（所述细胞毒素试剂例如，皂草素，抗α-干扰素，长春花生物碱类，蓖麻蛋白A链，甲氨蝶呤或放射性半抗原同位素）。双特异性抗体可以作为完整抗体或抗体片段来制备（例如，F(ab)2双特异性抗体）。
双特异性抗体进一步包括双元抗体（diabody）。双元抗体是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单独的多肽链上，但是使用一个如此短的接头以至于其不能使同一个链上的两个结构域之间配对，从而强迫结构域与另一个链的互补结构域配对并构成两个抗原结合位点（参见，例如，Holliger，P.，et al..(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak，RJ.，et al..(1994)Structure2:1121-1123）。
术语“多特异性抗体”指具有至少三个结合位点或特异性的抗体。
术语“表位”指能够特异性结合抗体的蛋白决定子，或者抗体结合其Ag的位置，或者延伸至T细胞受体结合的MHC分子中存在的肽。表位由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成并通常具有特的三维结构特征，以及特异性的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下，结合至前者会发生消耗，但是结合到后者的不会你消耗。
术语“分离的”意思是鉴别并分离的或从其天然环境中移出的。例如，天然存在于活的生物体内的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存材料中分离出来的同样的多核苷酸或多肽是“分离的”，包括但不限于当这些多核苷酸或多肽被引入回到细胞内，即使该细胞是与所述多核苷酸或多肽分离来源的相同的种或类型。
短语“有效诱导针对抗原的免疫应答的试剂”指一种与本发明的单克隆抗体不同的物质，其作为免疫应答的刺激因子从而增加对疫苗的应答，而其自身不具有任何特异性抗原效应。该试剂在本领域也被称为佐剂。实例包括脂A，百日咳杆菌或结核分支杆菌源的蛋白，弗式不完全佐剂和完全佐剂（DifcoLaboratories，Detroit，Mich）；默克佐剂65（Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.）；铝盐例如氢氧化铝凝胶（alum）或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；乙酰化酪氨酸乙酰化的糖的不溶性混悬液；阴离子或阳离子化的多糖；聚磷腈生物可降解微球；单磷酰脂A和quil A。细胞因子，例如GM-CSF或白介素-2，白介素-7，或白介素-12，可以用作佐剂。
术语“特异性结合”当指抗体和其抗原结合片段时，意思是该抗体结合鼠或人S100A4而不或者不明显结合鼠或人的其它蛋白。然而该范围不排除这一事实，即本发明的抗体也可以与其它形式的S100A4交叉反应。术语对于结合反应的“特异性结合”在异源种群的蛋白和其它生物制剂中对蛋白的存在是决定性的。典型地，抗体以至少约1x106M-1或107M-1，或大约108M-1至109M-1，或大约1010M-1至1011M-1或更高的结合常数（Ka）结合，并其结合预定的蛋白的亲和力是其结合除了预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原（例如，BSA，酪蛋白）结合力的至少大两倍。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换地使用。
短语“特异性结合”或“特异地结合”当指肽时是指具有排他地或主要地，肽分子对靶标分子的中等或高结合亲和力。术语“特异性结合至”指在异源种群的蛋白或其它生物制剂存在下，靶标蛋白存在时结合反应是决定性的。从而，在设定的分析条件下，特异性结合部分优先结合特定的靶标蛋白而不与在测试样品中存在的以显著量的其它组分结合。在这样的条件下对靶标蛋白的特异性结合可能需要根据对特定靶标抗原的特异性而选择的结合部分。多种分析方法可以用于选择与特定蛋白特异性反应的配体。例如，固相ELISA免疫分析，免疫沉淀作用，Biacore和蛋白质印迹都可用于鉴别与人或鼠S100A4特异性反应的肽。典型地特异性或选择性反应是至少两倍的背景信号或噪音信号并且更典型地多于10倍的背景信号。
术语“阻断”贯穿本说明书所用的涉及本发明抗体和其抗原结合片段意思是人或鼠S100A4的生物活性在本发明的抗体或其抗原结合片段存在下，相比于这样的抗体和其抗原结合片段不存在的情况下人或鼠S100A4的活性要降低。阻断可以是由于但不限于一种或多种配体结合失效，防止配体活化受体，下调人或鼠S100A4或影响效应器功能。阻断的水平可以以多种方法测量，例如通过使用下文实施例中展示的方法，蛋白分解活性，细胞迁移，肿瘤发展，肿瘤血管生成和肿瘤散播（转移）。
如果抗体或其抗原结合片段能够阻断，则它表明抑制鼠或人的S100A4结合蛋白与其受体之间的作用。
术语“人或鼠S100A4蛋白的作用机理”指S100A4蛋白的细胞内和细胞外功能中的一种。S100A4蛋白的细胞内功能包括干扰细胞的生活功能例如细胞移动、入侵、细胞分裂和生存（Kriajevska MV et al.J Biol Chem1994.269(31):19679-82（Kriajevska MV等，《生物化学杂志》1994.269(31):19679-82）和Grigorian M et al.J Biol Chem2001.276(25):22699-708）（Grigorian M等，《生物化学杂志》2001.276(25):22699-708））；结合多种细胞内靶标蛋白并调节其功能，例如非肌肉肌球蛋白II的重链（Kriajevska MVet al.J Biol Chem1994.269(31):19679-82（Kriajevska MV等，《生物化学杂志》1994.269(31):19679-82）和Ford HL et al.Oncogene1995.10(8):1597-1605）（Ford HL等，《致癌基因》1995.10(8):1597-1605））；以及Liprinβ1（KriajevskaM et al.J Biol Chem2002.277(7):5229-35）（Kriajevska M等，《生物化学杂志》2002.277(7):5229-35）；与肿瘤抑制蛋白p53相互作用并调节其转激活功能，从而以细胞特异性方式差异调节p53靶标基因表达（Grigorian M et al.J BiolChem2001.276(25):22699-708）（Grigorian M等，《生物化学杂志》2001.276(25):22699-708）。S100A4蛋白的细胞外功能包括肿瘤细胞的移动性、生存和凋亡的细胞特异性调节器；作为血管生成因子（Ambartsumian N et al.Oncogene2001.20(34):4685-95（Ambartsumian N等，《原癌基因》2001.20(34):4685-95）；Pedersen MV et al.J Neurosci Res2004.77(6):777-86（PedersenMV等，《神经科学研究》2004.77(6):777-86）；Belot N et al.Biochim BiophysActa2002.1600(1-2):74-83（Belot N等，《生物化学与生物物理学行为》2002.1600(1-2):74-83）和Pedersen KB et al.BMC Cancer2004.19;452）（Pedersen KB等，《BMC癌症》2004.19;452））；转移启动因子；肿瘤血管网络的增强因子；新生血管形成刺激因子；增加上皮细胞运动性，重塑肿瘤细胞骨架；促进细胞运动性和粘附；便利通过蛋白分解活性MMP的诱导有利于细胞外基质的降解。细胞外S100A4功能也包括靶向于肿瘤上皮细胞，通过结合至受体RAGE和通过信号转导或细胞内射作用结合至受体RAGE而触发事件级联，随后与细胞内靶标蛋白相互作用（p53，非肌肉肌球蛋白等等）。结果，肿瘤细胞获得更进一步的转移表现型活性。其它的细胞外S100A4功能包括靶向于内皮细胞从而刺激其迁移，增强肿瘤血管生成，并从而提供转移扩散的途径（Schmidt-Hansen B et al.J Biol Chem2004.279(23):24498-504）（Schmidt-Hansen B等，《生物化学杂志》2004.279(23):24498-504）。
术语“高亲和力”对于IgG抗体，是指平衡缔合常数（Ka）为至少约107M-1，至少约108M-1，至少约109M-1，至少约1010M-1，至少约1011M-1，或至少约1012M-1或更大，例如，达到1013M-1或1014M-1或更大。然而，“高亲和力”结合对于其他抗体类型是可以变化。
术语“Ka”，如文所用，意在指特定抗体-抗原作用的平衡缔合常数。该常数具有单位1/M。
术语“Kd”，如本文所用，意在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。该常数具有单位M。
术语“ka”，如本文所用，意在指特定抗体-抗原相互作用的动力学结合常数。该常数具有单位1/Ms。
术语“kd”，如本文所用，意在指特定抗体-抗原相互作用的动力学解离常数。该常数具有单位1/s。
短语“特定抗体-抗原相互作用”指测量平衡常数和动力学常数的实验条件。
短语“特定抗体-抗原相互作用”指测量平衡常数和动力学常数的实验条件。
术语“类型”指抗体类别（例如，IgM或IgG1），其由重链恒定区基因编码。
术语“核酸”或“多核苷酸”意在于包括DNA分子和RNA分子。核酸可以是单链或双链的。
术语“分离的核酸”或“分离的多核苷酸”是关于编码其人或鼠S100A4结合的抗体或抗体片段（例如，VR，VL，CDR3）的核酸，意在指这样的核酸，其编码抗体或抗体部分的核苷酸序列与编码结合其他的人或鼠S100A4之外的其它抗原的抗体或抗体部分的其它核苷酸序列是分离的，其中其它序列可能在人基因组DNA中天然地侧邻连接于该核酸。
术语“稳定性”用于涉及抗体或其片段时，是指抗体或抗原结合片段的活性，当通过直接结合ELISA来确定时，可以在血清中孵育12天后在-20°C，4°C或37°C下EC50起始值具有可比性，。
术语“人抗体”包括源自人类免疫球蛋白序列的具有可变区和恒定区（如果存在）的抗体。发明的人序列抗体可以包括不是由人类免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或位点特异性体外诱变或体内体细胞突变而引入的突变）。然而，术语“人抗体”如本文所用，不意在包括这样的抗体，其中源自其他哺乳动物物种的种系的CDR序列，例如小鼠，被嫁接至人框架区序列（即，人源化抗体）。
术语“嵌合抗体”指一种工程抗体，其含有源自供体抗体的天然存在的可变区（轻链和重链）与源自受体抗体的轻链和重链恒定区的联合。
术语“人源化抗体”指一种工程抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白的CDR，而剩余的免疫球蛋白来源源自一种（或多种）人免疫球蛋白的分子部分。另外，框架区支持残基可以改变以保留结合亲和力（参见，例如，Queenet aI.，Proc.Natl Acad Sci USA，86:10029-10032(1989)，Hodgson et al.，Bio/Technology，9:421(1991)）（Queen等，《美国科学院院刊》86:10029-10032(1989)），Hodgson et al.，Bio/Technology，9:421(1991)（Hodgson等，《生物技术》，9:421(1991)））。合适的人受体抗体可以是选自常规数据库的，例如，KABAT
Figure BDA00002832533800631
数据库，Los Alamos数据库，和瑞士蛋白数据库，与通过对供体抗体的核苷酸和氨基酸序列具有同源性。由具有供体抗体的框架区的同源性特征的人抗体（以氨基酸为基础）可能适合于提供重链恒定区和/或重链可变区框架区以插入供体CDR。能够提供轻链恒定区或可变区框架区的合适的受体抗体可以由类似的方式进行选择。需要注意，受体抗体重链和轻链不需要源自相同的受体抗体。现有技术描述了产生这样的人源化抗体的多种途径——参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
术语“供体抗体”指向第一免疫球蛋白配偶体提供其氨基酸序列的可变区结构域、CDR或其它功能性片段或其类似物的抗体（单克隆抗体，和/或重组抗体），从而提供可变的免疫球蛋白编码区域并导致表达改变的抗体具有供体抗体的抗原特异性和使活性特征失效。
术语“受体抗体”指与供体抗体异源的抗体（单克隆和/或重组的），其向第一免疫球蛋白配偶体提供所有（或任何部分，但优选所有）的编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列。人抗体是受体抗体。
缩写“CDR”指抗体的互补决定区氨基酸序列，它是免疫球蛋白重链和轻链的高变结构域。参见，例如，Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987)（Kabat等，《免疫学相关蛋白序列》，第4版，美国国立卫生研究院，卫生与人类服务部（1987））。在免疫球蛋白的可变部分存在三个重链和三个轻链CDRs（或CDR区）。从而，“CDR”在本文中用于指所有三个重链CDR，或所有三个轻链CDR（或所有重链和所有轻链CDR，如果合适）。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其它残基被认为抗原结合区域的部分，并应当是本领域技术人员可以理解的。参见例如Chothiaet al.，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable domains；Nature342，p877-883（Chothia等，（1989）免疫球蛋白高变区的构型；《自然》342，p877-883）。CDRs提供了抗体与抗原或表位结合的主要的接触残基。在发明中感兴趣的CDR源自供体抗体可变区重链和轻链序列，并包括天然存在CDR的类似物，该类似物也共享或保留与其来源的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或能力失。
贯穿本说明书，抗体序列中的氨基酸残基根据Kabat方案来编号。类似地，术语“CDR”，“CDRL1”，“CDRL2”，“CDRL3”，“CDRH1”，“CDRH2”，“CDRH3”也遵从Kabat编号系统，如阐述于Kabat et al；Sequences of proteinsof Immunological Interest NIH，1987（Kabat等；免疫感兴趣的NIH蛋白的序列，1987）。对本领域技术人员而言，显然存在可选的CDR序列的定义例如在Chothia et al.(1989)中阐述的。
对本领域技术人员而言，显然术语“源自”意在定义不仅是材料的物理起源的来源，也是定义与该材料结构上相同（以初级氨基酸序列来看）但是不来源于参考来源的材料。从而，例如，“来自CDRH3来源的供体抗体的残基”不需要从供体抗体中纯化出来。
术语“VH”和“VL”分别指抗体的重链可变区和轻链可变区。
术语“效应器功能”如本文所用意指一种或多种抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性活性（CDC）介导的应答，Fc-介导的细胞吞噬和通过FcRn受体的抗体再循环。抗体的恒定区与各种Fc受体（FcR）之间的作用认为是介导了抗体的效应器功能。显著的生物学效果可以是效应器功能的结果，具体来说，抗体依赖性细胞毒性（ADCC），补体结合（补体依赖性细胞毒性或CDC），细胞吞噬（抗体依赖性细胞介导的细胞吞噬或ADCP）和抗体的半衰/清除。通常，介导效应器功能的能力需要抗体结合抗原并且不是所有抗体将介导每一效应器功能。效应器功能可以以多种途径来测量，包括例如通过FcyR1l1结合至NK细胞或通过FcyRI至单核细胞/巨噬细胞以测量ADCC效应器功能。
对抗体重链恒定区可以进行的各种修饰，依赖于期望的效应器特征。人恒定区基本上缺少a）通过传统途径活化补体；和b）介导抗体依赖性细胞介导的哦细胞毒性的功能，其包括IgG4恒定区和IgG2恒定区。含有特定变异的IgG1恒定区已经被描述了减少结合至Fc受体并从而减少ADCC和CDC（Duncan et al.Nature1988，332；563-564（Duncan等，《自然》1988，332；563-564）；Lund et al.J.Immunol.1991，1472657-2662（Lund等，《免疫学杂志》1991，1472657-2662）；Chappel et al.PNAS1991,88；9036-9040（Chappel等，《PNAS》1991,88，9036-9040）；Burton and Woof，Adv.Immunol.1992,51；1-84（Burton和Woof，《免疫学进展》1992,51；1-84）；Morgan et aI.，Immunology1995，86；319-324（Morgan等，《免疫学》1995，86；319-324）；Hezareh etal.，J.Virol.2001，75(24)；12161-12168）（Hezareh等，《病毒学杂志》2001，75(24)；12161-12168））。人IgG1恒定区含有特定变异或可变的糖基化在残基Asn297，其也被描述了增强与Fc受体的结合。在一些案例中，它们也显示了增强ADCC和CDC，（Lazar et al.PNAS2006，103；4005-4010（Lazar等，《PNAS》2006，103；4005-4010）；Shields et al.J Bioi Chem2001，276；6591-6604（Shields等，《生物化学杂志》2001，276；6591-6604）；Nechansky et al.Mollmmunol，2007，44；1815-1817）（Nechansky等，《Mollmmunol》，2007，44；1815-1817））。
对于IgG抗体，包括ADCC和ADCP的效应器功能通过重链恒定区与存在于免疫细胞表面的Fcγ受体家族相互作用而介导。在人中，这包括FcγRI（CD64），FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。结合抗原的抗体与Fc/Fcγ形成的复合物的相互作用作用诱导了一系列效果，包括细胞毒性、免疫细胞活化、细胞吞噬作用和炎症细胞因子的释放。恒定区的特定取代（包括S239D/I332E）已知是用于增强重链恒定区与某些Fc受体的亲和力，从而增强抗体的效应器功能（Lazar et al.PNAS2006）。
术语“同源性”或“序列同源性”指序列之间的相似性程度，它是取决于其共有的祖先的。存在多种本领域技术人员已知的相似性搜索工具的序列数据库，例如FASTA，BLAST，以计算同源性。
术语“同一性”或“序列同一性”意思是，对于多核苷酸和多肽作为案例，其可能利用下列（1）和（2）中提供的算法来计算的对比：
（1）多核苷酸的同一性通过以下方法来计算：给定序列的核苷酸总数目乘以定义百分比同一性的整数除以100，然后从所述序列中的所述核苷酸总数目中减去前述结果，或者：
nn≤xn-(xn·y)，
其中nn是核苷酸改变的数目，xn是给定序列中的核苷酸的总数目，y对95%是0.95，对97%是0.97，对100%是1.00，而·是乘法运算的符号，并且其中任何xn和y的非整数结果向下取整至最接近的整数，之后从xn减去它。编码多肽的多核苷酸序列的改变可以在该编码序列中建立无义、错义或移码突变，并从而在该改变之后，由多核苷酸编码的多肽进行。
（2）多肽的同一性通过以下方法来计算：氨基酸总数目乘以定义百分比同一性的整数除以100，然后从所述氨基酸总数目中减去前述结果，或者：
na≤xa-(xa·y)，
其中na是氨基酸改变的数目，xa是序列中的氨基酸总数，y对95%是0.95，对97%是0.97或对100%是1.00，而·是乘法运算的符号，并且其中任何xa和y的非整数结果向下取整至最接近的整数，之后从xa减去它。
术语“变体”指这样的多核苷酸或多肽，其分别不同于参考的多核苷酸或多肽，但是保留了基本特征。多核苷酸的典型变体在核苷酸序列上不同于另一个参考多核苷酸。变体的核苷酸序列的改变可能或可能不改变由该参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸改变可能导致由参考序列编码的多肽的氨基酸取代、添加、删除、融合蛋白和截尾，如下文所述。多肽的典型变体在氨基酸序列上不同于另一个参考多肽。通常，不同之处是有限制的，从而参考多肽和变体的序列是总体上十分相似的并且，在很多区域，是相同的。变体和参考多肽在氨基酸序列上可能的不同，以一或多个取代、添加、删除及其任何组合。取代或插入的氨基酸残基可能或也可能不是由遗传密码子编码的。本领域公知某些氨基酸取代被认为是“保守性的”。氨基酸被基于共同侧链特性而分为组，并且，在组内的取代保留了本发明的抗体或其抗原结合片段的全部或基本上全部的结合亲和力，则这样的取代被认为是保守性取代，参见下表：
侧链 成员
疏水 Met，Ala，Val，Leu，Ile
中性亲水 Cys，Ser，Thr
酸性 Asp，Glu
碱性 Asn，Gln，His，Lys，Arg
影响链方向的残基 Gly，Pro
芳香性 Trp，Tyr，Phe
在发明的一些方面包括了这样的变体，其中几个，例如5-10，1-5，1-3，1-2个氨基酸残基或1个，氨基酸残基被取代、删除或添加以其任意组合。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的例如等位基因变体，或者可以是不被认为天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可能通过突变技术，通过直接合成，和通过本领域技术人员已知的其它重组方法来制作
嵌合抗体和人源化抗体的生产
完整非人抗体在治疗人类疾病或紊乱中的应用带来目前已充分确定的免疫原性难题的潜在可能，也就是说患者的免疫系统可能将非人完整抗体识别为非自己的的并设置失效应答。这对非人抗体对人类患者的多重给药尤其显著。多年来已经发展了多种技术用于克服这些问题，并通常涉及减少完整抗体中非人氨基酸序列的组分，同时保留从免疫动物例如小鼠、大鼠或兔中获得的非人抗体中的相对自由。大体来看，有两种途径用于达到该目的。第一个是嵌合抗体，其通常包含非人（例如，啮齿类动物例如小鼠）可变结构域融合至人恒定区。由于抗体的抗原结合位点位于可变结构域，嵌合抗体保留了其抗原结合亲和力，但是获得了人恒定区的效应器功能，并从而能够展现前文所述的效应器功能。嵌合抗体用重组DNA方法来进行典型地产生。编码抗体的DNA（例如，cDNA）用常规程序进行分离并测序（例如，通过利用寡核苷酸探针，能够特异性结合至编码发明的抗体的H和L链的基因）。杂交瘤细胞作为这样的DNA的典型来源。一旦被分离，DNA被置于表达载体中，然后转染至宿主细胞例如大肠杆菌，COS细胞，CHO细胞或骨髓瘤细胞，这些细胞不另外产生免疫球蛋白，以获得抗体的合成。DNA可以通过将人L和H链的编码序列替换为对应的非人（例如，鼠类）H和L恒定区而修饰，参见例如Morrison；PNAS81，6851(1984)。
第二个途径涉及人源化抗体的产生，其中抗体的非人部分通过人源化可变结构域而减少。两种人源化技术获得流行。第一种是通过CDR嫁接来人源化。CDR在抗体的N端附近建立了环，在这里它们形成了安装在由框架区形成的支架的表面。抗体的抗原结合特异性主要由其CDR表面的结构和化学特性确定。这些特征反过来由个体CDR的构象、CDR的相对分布和组成CDR的残基的侧链的天然性质和分布来确定。免疫原性的大量降低可以通过嫁接非人（例如鼠类）抗体（“供体”抗体）的仅CDR至人框架区（“受体框架”）和恒定区而实现（参见Jones et al(1986)Nature321，522-525（Jones等(1986)《自然》321，522-525）和Verhoeyen M et al(1988)Science239，1534-1536）（Verhoeyen M等(1988)《科学》239，1534-1536））。然而，CDR嫁接自身可能不导致抗原结合特性的完整保留，并且经常发现相同的供体抗体的框架区残基（有时候指的是“逆变异”）需要被保留在人源化分子中，如果要恢复显著的抗原结合亲和力的话（参见Queen C et al(1989)PNAS86，10029-10033，Co，M et al(1991)Nature351，501-502）。在这种情况下，显示与非人供体抗体之间最大的序列同源性的人可变结构域是从数据库中选出以提供人框架区（FR）。人FR的选择可以从人共有区或个体人抗体中做出。如果需要，来自供体抗体的关键残基取代人受体框架区以保留CDR构象。抗体的计算机模型可能用于帮助鉴别这样的结构上重要的残基，参见WO99/48523。
可选地，人源化可能通过“镶盖”的方法来实现。独特的人和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变结构域的统计学分析显示了暴露残基的精确模式在人和鼠抗体中是不同的，并且大多数个体表面位置对少数不同残基具有强烈的优先选择性（参见Padlan E.A.et al；(1991)Mol.Immunol.28，489-498（Padlan E.A.等；(1991)《分子免疫学》.28，489-498）和Pedersen J.T.et al(1994)J.Mol.Biol.235；959-973）（Pedersen J.T.等(1994)《分子免疫学杂志》235；959-973））。
因此可能通过替换框架区中不同于在人抗体中通常使用的暴露残基而降低非人Fv的免疫原性。由于蛋白抗原性可能与表面可及性相关，表面残基的替换可能有效改变小鼠可变区为对人免疫系统“不可见的”（也参见Mark G.E.et al(1994)in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113：Thepharmacology of monoclonal Antibodies，Springer-Verlag，pp105-134）（Mark G.E.等(1994)《试验药理学手册》第113卷：单克隆抗体的药理学，Springer-Verlag，pp105-134）。该人源化过程被称为“镶盖”，因为仅仅抗体的表面被改变，而支持残基保持原状不变。
人抗体的产生
发明的单克隆抗体（mAb）可以通过各种技术来生产，包括常规单克隆抗体方法例如，Kohler and Milstein，Nature256:495(1975)（Kohler和Milstein，《自然》256:495(1975)）的标准化体细胞杂交技术。可以使用生产单克隆抗体的任何技术，例如，病毒或B淋巴细胞的致癌转化。制备杂交瘤的一个动物系统是鼠系统。小鼠中生产的杂交瘤是非常完善的程序。免疫过程和分离免疫的脾细胞以用于融合的技术是领域公知的。融合伴侣（例如，鼠骨髓瘤细胞）和融合过程也是已知的（参见，例如，Harlow and Lane(1988)，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring HarborNew York）（Harlow和Lane(1988)，《抗体，实验手册》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）。
针对鼠或人S100A4的人单克隆抗体可以利用带有人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因小鼠来生产。几个品种的转基因小鼠株是目前可获得的，其中这些小鼠的免疫球蛋白位点被替换为人免疫球蛋白基因节段（参见Tomizuka K，(2000)PNAS97，722-727；Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14，845-851（Fishwild D.M(1996)《自然生物技术》14，845-851），MendezMJ，1997，Nature Genetics，15，146-156）（Mendez MJ，1997，《自然遗传学》，15，146-156））。基于抗原的激发，这样的小鼠能够生产人抗体的所有组分，从中可以选择感兴趣的抗体。要特别注意的是TrimeraTM系统（参见Eren R et al，(1998)Immunology93:154-161）（Eren R等，(1998)《免疫学》93:154-161），其中人淋巴细胞被移植进辐射的小鼠；筛选淋巴细胞抗体系统（Selected Lymphocyte Antibody System）（SLAM，参见Babcook et al，PNAS(1996)93:7843-7848）（SLAM，参见Babcook et al，PNAS(1996)93:7843-7848）（Babcook等，《PNAS》(1996)93:7843-7848），其中人（或其它物种）淋巴细胞有效经历大规模汇集体外抗体产生程序接着进行去卷积，有限稀释和筛选过程；以及Xenomouse IITM（Abgenix Inc）。一种可选方法是可以利用MorphodomaTM技术从Morphotek Inc获得。
产生针对人或鼠S100A4的完全的人单克隆抗体的详细过程在下文实施例中描述。各种抗原积累的经验显示当腹膜内（IP）用完全弗氏佐剂中的抗原进行初始免疫，然后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原IP免疫（最多共6次）后，转基因小鼠会出现应答。然而，除了弗氏佐剂之外的佐剂也被发现是有效的。另外，在佐剂不存在下的整个细胞被发现是高度致免疫的。免疫应答可以在免疫过程中通过眶后获得的血浆样品来监控。血浆可以通过ELISA来筛选，具有抗-S100A4人免疫球蛋白的足够效价的小鼠可以用于融合。小鼠可以用抗原通过静脉内进行加强3天，之后处死并移出脾脏。期望每个免疫可能需要进行2-3个融合。6-24之间的小鼠被每种抗原典型地免疫。
为了纯化人抗-S100A4抗体，选择的杂交瘤在2升旋转烧瓶中生长以纯化单克隆抗体。过滤上清液并浓缩，之后进行蛋白A-琼脂糖凝胶亲和色谱（Pharmacia,Piscataway,NJ）。洗脱的IgG可以用凝胶电泳和高效液相色谱检测以确保其纯度。缓冲液可以替换为PBS，浓度可以由OD280利用1.43吸光系数来确定。将单克隆抗体分装并储存在-80℃。
为了确定选择的人抗-S100A4单克隆抗体是否结合至独特的表位，每个抗体可以使用用商业上可获得的试剂生物素化（Pierce，Rockford，IL）。利用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争性研究可以用人或鼠S100A4涂覆的ELISA平板来进行。生物素化的MAb结合可以用抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶探针。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。微量滴定板的孔中可以用1μg/ml的抗-人IgG涂覆在4℃下过夜。用1%BSA封闭之后，平板与1μg/ml或更少的单克隆抗体或纯化的同种型对照反应，反应在室温下进行1-2小时。然后孔与人IgG1或人IgM-特异性碱性磷酸酶-缀合探针反应。平板如上所述发展和分析。
为了说明单克隆抗体结合至表达人或鼠S100A4的活细胞上，可以使用流式细胞仪。简而言之，表达人或鼠S100A4的细胞系（在标准生长条件下生长）与各种浓度的单克隆抗体在含0.1%BSA和10%胎儿牛血清的PBS中混合，并在37℃下孵育1小时。洗涤之后，细胞与荧光素标记的抗-人IgG抗体在初级抗体染色的条件下反应。样品通过FACSan设备用光和单一细胞的门上的侧散射特性来分析。可以使用可选的利用荧光显微镜的分析进行（另外的或替换的）流式细胞仪分析。细胞可以如前文所述的精确染色并通过荧光显微镜检查。该方法允许个体细胞进行显像，但是可能具有较低的敏感性，其取决于抗原密度。
抗-S100A4人IgG可以进一步通过蛋白质印迹测试与人或鼠S100A4抗原的反应性。简而言之，可以制备来自表达人或鼠S100A4的细胞的细胞提取物并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，分离的抗原转移至硝化纤维膜，用10%胎儿牛血清封闭，然后用单克隆抗体探针测试。人IgG结合可以用抗-人IgG碱性磷酸酶来检测并用BCIP/NBT底物块来显示（SigmaChem.Co.，St.Louis，MO）。
噬菌体展示技术可以用于生产人抗体（及其片段），参见McCafferty；Nature，348，552-553(1990)（McCafferty；《自然》348，552-553(1990)）和Griffiths AD et al(1994)EMBO13:3245-3260（Griffiths AD等(1994)《EMBO》13:3245-3260）。根据该技术，抗体可变结构域以框架形式克隆至丝状噬菌体例如M13和fd的蛋白基因的主要和次要衣壳蛋白，并展示（通常在辅助噬菌体的帮助下）作为功能性抗原结合其片段到噬菌体颗粒的表面上。基于抗体的功能特性的筛选导致编码展现这些特性的抗体的基因的筛选。噬菌体展示技术可以用于从库中筛选抗原特异性抗体，所述库是由来自患有前文所述的疾病或紊乱的个体或可选地来自未免疫的人供体的人B细胞制作的（参见Marks；J.Mol.Bio.222，581-597，1991）。当获得的包含恒定区的完整人抗体是期望时，有需要将展示来源片段的噬菌体再克隆至包含期望的恒定区并建立稳定的表达细胞系的哺乳动物表达载体。
亲和力成熟技术（Marks；Bio/technol10，779-783(1992)）可以用于改善结合亲和力，其中初级人抗体的亲和力通过连续替换H和L链可变区为天然存在的变体来促进并基于改善的结合亲和力来筛选。该技术的变体例如“表位印迹”也是可获得的：参见WO93/06213。也参见Waterhouse；Nucl.Acids Res21，2265-2266(1993)（Waterhouse；《核酸研究》21，2265-2266(1993)）。
药物组合物
本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含单克隆抗体或其片段的一种或组合，与药学上可接受的载体一起按配方制造得到。一些组合物包括多种（例如，2或更多）发明的分离的抗体或其片段的组合。在一些组合物中，组合物的每种抗体或其片段是单克隆抗体，其结合至不同的、预先筛选的人或鼠S100A4表位。
不管选择的给药途径，本发明的化合物，其可以以合适的水合形式使用，或者本发明的药物组合物，通过本领域技术人员已知的常规方法被制剂为药学上可接受的剂量形式。
对于用抗体给药，剂量的范围从0.0001至100mg/kg，更常见地0.01至5mg/kg的宿主体重。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg范围内。编码免疫源的核酸的剂量可以在约10ng至1g，100ng至100mg，1μg至10mg，或30-300μg DNA每个患者的范围内。对于感染性病毒载体的剂量从10-100，或更多病毒体每剂量的范围内。
对于治疗性应用，药物组合物给药于患有已确定疾病的患者，其是以最够阻止或抑制进一步的发展或反转或消除疾病、其症状或生物化学标记的剂量给药的。对于预防性应用，药物组合物给药于易感或在疾病风险中的患者，其是以足以延迟、抑制或预防疾病的发展、其症状或生物化学标记的量给药的。足够实现这一点的量定义为“治疗有效剂量”或“预防有效剂量”。剂量取决于要治疗的疾病、对象大小、对象症状的严重性、选择的具体组合物或给药途径。特别地，在治疗肿瘤中，“治疗有效剂量”是相对于未治疗对象可以抑制肿瘤的生长至少约20%，至少约40%，或至少约60%，或至少约80%。化合物抑制癌症的能力可以在人肿瘤效价预测时，在动物模型系统中评价。可选地，组合物的该特性可以通过体外常规分析检测化合物的抑制能力来评价。治疗有效量的治疗性化合物可以减少肿瘤尺寸，或者另外改善在对象中的症状。
本发明的组合物可以通过本领域已知的各种方法来给药。给药途径和模式取决于期望的结果而不同。对于治疗性组合物，本发明的剂型包括适合口服、鼻内、局部（包括口腔和舌下）、直肠、阴道和肠胃外给药的那些。剂型可以通过药学领域已知的任何方法来制备，优选是完全符合美国食品药品管理局的Good Manufacturing Practice（GMP）标准的。
短语“肠胃外给药”和“肠胃外地给药”意思是除了肠道和局部给药之外的给药模式，经常通过注射，并包括，但不限于，静脉内，肌内，动脉内，鞘膜内，囊内，眼眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注。
药学上可接受的载体包括溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌试剂，等渗和吸收延缓试剂，以及生理学可配伍的类似试剂。载体可以适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药（例如，通过注射或输注）。依赖于给药途径，活性化合物，即，抗体或其片段、双特异性和多特异性分子，可以用材料包被以保护化合物免于酸和其它可能使化合物失活的天然条件。
活性化合物可以与保护化合物免于快速释放的载体制备，例如控制释放剂型，包括埋植剂，经皮粒子，和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯，和聚乳酸。制备这样的制剂的多种方法描述于例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978（《维持和控制释放药物递送系统》，J.R.Robinson编辑，MarcelDekker，Inc.，纽约，1978）。
为了通过某些给药途径给药发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被化合物或与化合物共同给药。例如，化合物可能在合适的载体中给药于对象，例如，脂质体，或稀释剂。药学上可接受的稀释剂包括盐水缓冲液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规的脂质体（Strejan et al.(1984)J.Neuroimmunol.7:27）（Strejan等(1984)《神经免疫学杂志》7:27）。当活性化合物被合适地保护时，如上所述，化合物可以口服给药，例如，与惰性稀释剂或可吸收的可吸收的载体一起。
典型的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散和无菌粉以用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂。这样的介质和试剂在药学活性物质上的应用的本领域已知的。除非任何常规介质或试剂是与活性化合物不相容的，其在本发明的药物组合物中的应用是需要考虑的。辅助性活性化合物也可以合并进组合物中。
治疗性组合物典型地必须是无菌的，基本上等渗的，和在制造和储存条件下是稳定的。它们可以是流体从而易于注射，并可以保护免于微生物例如细菌和真菌的污染作用。组合物可以制剂为溶液、微乳剂、脂质体或适合高药物浓度的其它指定结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包括例如，水，等渗缓冲盐水溶液，乙醇，多元醇（例如，甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇，等等），和其合适的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包被例如卵磷脂，通过在分散的情况下需要的颗粒大小维持，和通过使用表面活性剂。在很多情况下，在组合物中优选包括等渗试剂，例如，糖，多元醇例如甘露醇，山梨醇，或氯化钠。可注射组合物的延长的吸收可以通过在组合物中引入延迟吸收的试剂而实现，例如，单硬脂酸盐和明胶。
无菌可注射溶液可以通过将活性化合物以需要的量合并在合适的溶液与前述组分的一种或组合一起而制备，根据需要，然后进行微滤灭菌。通常，分散剂通过将活性化合物合并进无菌载体来制备，所述无菌载体包含基础分散介质和来自上述的需要的其它成分。在无菌粉用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥（冻干法）其产生活性成分和任何其它期望的来自前述无菌过滤溶液的成分的粉末。
这些组合物可能也包含辅料例如防腐剂，湿润剂，抗氧化剂，乳化剂，和分散剂。预防微生物的存在可以通过前述无菌过程来保证，以及通过包含各种抗细菌和抗真菌试剂，例如，对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸，等等。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：（1）水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等等；（2）油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基羟基茴香醚（BHA），丁基羟基甲苯（BHT），卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚，等等；和（3）金属螯合试剂，例如柠檬酸，乙二胺四乙酸（EDTA），山梨醇，酒石酸，磷酸，等等。
治疗性组合物也可以用本领域已知的医学仪器来给药。例如，在优选的实施方式中，发明的治疗性组合物可以以无针皮下注射装置给药，利用可植入的微灌输泵以可控速率分散药物，等等。
当本发明化合物作为药物来给药于人或动物，其可以单独或作为含有其的药物组合物来给药，例如0.01至99.5%（或0.1至90%）的活性成分与药学上可接受的载体组合。
本发明的方法和用途
本发明的针对人或鼠S100A4的单克隆抗体或其片段及其衍生物或其缀合物，具有体外和体内的诊断和治疗用途。例如，这些分子可以给予例如体外或体内的培养的细胞、组织、器官中的，或在对象中，例如的体内用于治疗、预防、监控或诊断各种紊乱。
术语“对象”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如灵长类和非人灵长类，绵羊，狗，兔，大鼠，小鼠，奶牛，鸡，两栖动物，和爬行动物。除非在注明情况下，术语“患者”和“对象”可互换地使用。
可以用于治疗任何种类的癌症的方法，包括但不限于，乳腺癌，前列腺癌，淋巴瘤，皮肤癌，胰腺癌，结肠癌，黑素瘤，恶性黑素瘤，卵巢癌，脑癌，原发性脑癌，头颈部癌，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，肝癌，膀胱癌，非小细胞肺癌，头部颈部癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，小细胞肺癌，肾母细胞瘤，子宫颈癌，睾丸癌，膀胱癌，胰腺癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌，泌尿生殖系统癌，甲状腺癌，食管癌，骨髓瘤，多发性骨髓瘤，肾上腺癌，肾细胞癌，子宫内膜癌，肾上皮质癌，恶性胰腺胰岛细胞瘤，恶性类癌瘤，绒毛膜癌，蕈样肉芽肿，恶性高钙血症，颈椎增生，非白血性白血病，急性淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病，慢性粒细胞性白血病，急性粒细胞白血病，毛细胞白血病，神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤，卡波济氏肉瘤，真性红细胞增多症，原发性血小板增多症，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤，原发性巨球蛋白血症，和视网膜成神经细胞瘤。在一些实施方式中，被治疗的癌细胞是转移性的。在其它实施方式中，被治疗的癌细胞是对抗癌试剂或抗血管生成试剂是耐受的。
特别地，本发明的抗体或其片段，可以用于治疗癌症，其中癌症选自乳腺癌，前列腺癌，肺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，肾癌，胃癌，卵巢癌，乳头状甲状腺癌，黑素瘤，肝细胞癌，膀胱癌，浸润性癌性脂肪肉瘤，成神经细胞瘤，食管鳞状细胞癌，骨肉瘤，胆囊癌，口腔鳞状细胞癌，子宫内膜癌，成神经管细胞瘤，和任何其它表达S100A4的癌症。
特别地，本发明的抗体或其片段可以用于治疗肾病，类风湿性关节炎，肺高血压症，牛皮癣，和任何其它S100A4介导的疾病。
以下文献提供了在发展或介导肾病中S100A4作用的证据：Inoue，T.，Okada，H.，Takenaka，T.，Watanabe，Y.&Suzuki，H.2009（A case reportsuggesting the occurrence of epithelial-mesenchymal transition in obstructivenephropathy.Clin.Exp.Nephrol13，385-388）（Inoue，T.，Okada，H.，Takenaka，T.，Watanabe，Y.&Suzuki，H.2009（一份暗示梗塞性肾病中上皮-间叶细胞转换的存在的案例报告，《临床试验神经免疫学》13，385-388））；Yamaguchi，Y.et al.2009（Epithelial-mesenchymal transition as a potential explanation forpodocyte depletion in diabetic nephropathy.Am.J.Kidney Dis54，653-664）（Yamaguchi，Y.等.2009（上皮-间叶细胞转换作为糖尿病性肾病中足细胞损耗的潜在解释。《美国肾病杂志》54，653-664））；Le Hir，M.，Hegyi，I.，Cueni-Loffing，D.，Loffing，J.&Kaissling，B.2005（Characterization of renalinterstitial fibroblast-specific protein1/S100A4-positive cells in healthy andinflamed rodent kidneys.Histochem.Cell Biol123，335-346）（Le Hir，M.，Hegyi，I.，Cueni-Loffing，D.，Loffing，J.&Kaissling，B.2005（在健康和发炎的啮齿类肾脏中肾间隙成纤维细胞-特异性蛋白1/S100A4-阳性细胞的表征。《组化学与细胞生物学》123，335-346）；等等。
以下文献提供了在发展或介导类风湿性关节炎中S100A4作用的证据：Bo，G.et al.2009（Analyses of differential proteome of human synovial fibroblastsobtained from arthritis.Clin.Rheumatol28，191-199）（Bo，G.等.2009（由关节炎获得的人滑液成纤维细胞的不同蛋白质组的分析。《临床风湿病学》28，191-199））；
Figure BDA00002832533800761
L.et al.2009（Metastasis-inducing S100A4protein isassociated with the disease activity of rheumatoid arthritis.Rheumatology（Oxford）48，1590-1594）
Figure BDA00002832533800771
L.等.2009（转移-诱导的S100A4蛋白与类风湿性关节炎的疾病活性相关。《风湿病学》（牛津）48，1590-1594））；Masuda，K.et al.2002（Molecular profile of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritisdepends on the stage of proliferation.Arthritis Res4，R8）（Masuda，K.等.2002（类风湿性关节炎中的滑液成纤维细胞的分子特征依赖于分化阶段。《关节炎研究》4，R8））；等等。
以下文献提供了在发展或介导肺高血压中S100A4作用的证据：Peng，T.et al.2009（Plasma levels of S100A4in portopulmonary hypertension.Biomarkers14，156-160）（Peng，T.等.2009（港口肺高压中的S100A4的血浆水平。《生物标记》14，156-160））；Hodge，S.et al.2009（Posttransplant bronchiolitisobliterans syndrome is associated with bronchial epithelial to mesenchymaltransition.Am.J.Transplant9，727-733）（Hodge，S.等.2009（移植后支气管炎消除综合症与支气管上皮细胞至间叶细胞的转换相关。《美国移植杂志》9，727-733））；Spiekerkoetter，E.et al.2008（Reactivation of gammaHV68inducesneointimal lesions in pulmonary arteries of S100A4/Mts1-overexpressing mice inassociation with degradation of elastin.Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol294，L276-289）（Spiekerkoetter，E.等.2008（γHV68的再活化诱导了S100A4/Mts1-过表达小鼠的肺动脉中与弹性蛋白的降解相关的新内膜损伤。《美国生理学与肺细胞分子生理学杂志》294，L276-289））；Brisset，A.C.et al.2007（Intimal smooth muscle cells of porcine and human coronary arteryexpress S100A4，a marker of the rhomboid phenotype in vitro.Circ.Res100，1055-1062）（Brisset，A.C.等.2007（猪和人冠状动脉内膜平滑肌细胞表达S100A4，一种体外菱形表型的标记。《循环研究》100，1055-1062））；Lawrie，A.et al.2005（Interdependent serotonin transporter and receptor pathways regulateS100A4/Mts1，a gene associated with pulmonary vascular disease.Circ.Res97，227-235）（Lawrie，A.等.2005（互助性五羟色胺转运分子和受体通道调节S100A4/Mts1，一种与肺血管疾病相关的基因。《循环研究》97，227-235））；Merklinger，S.L.et al.2005（Increased fibulin-5and elastin in S100A4/Mts1micewith pulmonary hypertension.Circ.Res97，596-604）（Merklinger，S.L.等.2005（患肺高压的S100A4/Mts1小鼠中增加的扣针蛋白-5和弹性蛋白。《循环研究》97，596-604））；Greenway，S.et al.2004（S100A4/Mts1produces murinepulmonary artery changes resembling plexogenic arteriopathy and is increased inhuman plexogenic arteriopathy.Am.J.Pathol164，253-262）（Greenway，S.等.2004（S100A4/Mts1产生类似致丛性动脉病的鼠肺动脉改变并在人致丛性动脉病中增加。《美国病理学杂志》164，253-262））；等等。
以下文献提供了在发展或介导牛皮癣中S100A4的作用的证据：Zibert，JR，Skov，L.Thyssen JP，Jacobsen GK，Grigorian M.2010（Significance of theS100A4protein in psoriasis.J Invest Dermatology.130（1）:150-60）（（S100A4蛋白在牛皮癣中的显著性。《皮肤病学研究杂志》130（1）:150-60））；EckertRL，Broome AM，Ruse M，Robinson N，Ryan D，Lee K.2004（J Invest Dermatol.123（1）:23-33）（J Invest Dermatol.123（1）:23-33）（Eckert RL，BroomeAM，Ruse M，Robinson N，Ryan D，Lee K.2004（《皮肤病学研究杂志》123（1）:23-33））；等等。
术语“治疗”包括给予本发明的化合物或试剂以预防或延迟症状、并发症或疾病的生物化学标记的发作，减轻症状或阻止或抑制疾病、状况或紊乱的进一步发展。治疗可以是预防性的（用以预防或延迟疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的出现）或治疗性抑制或在疾病出现之后缓解症状。
试剂盒部分
本发明进一步涉及产品，其含有抗体或其片段或者根据本文展现的任意一个实施方式中的单克隆抗体，和抗癌试剂作为联合制剂以同时、分别或顺序地用于治疗癌症。
当针对S100A4的抗体与另一个试剂一起给药时，这两者可以同时、分别或顺序地给药。从而，发明的抗体和其片段也可以以联合疗法进行给药，即，与其它试剂联合。例如，在癌症的治疗中，联合疗法可以包括本发明的抗体组合物和至少一种抗癌试剂或其它常规疗法，例如放射治疗。
这种抗癌试剂或其它常规疗法包括，但不限于，凋亡调节试剂，化学疗法抗肿瘤药，免疫疗法，抗微生物剂，抗病毒剂，抗真菌剂，抗炎症试剂，以及外科手术介入，和放射疗法。
多种合适的抗癌试剂可以考虑用于联合或共给药以治疗、预防或改善任意的前文所述疾病、病症或紊乱例如：诱导细胞程序性凋亡的试剂；多核苷酸（例如，反义，核酶，siRNA）；多肽（例如，酶和抗体）；生物拟态品（例如，棉子酚或BH3拟态品）；与S100A4结合的试剂（例如，寡聚体或复合物）；生物碱；烷化剂；抗肿瘤抗生素；抗代谢药；激素；铂化合物；单克隆或多克隆抗体（例如，与抗癌药物、毒素、防御素缀合的抗体），毒素；放射性核素；生物学反应修饰剂（例如，干扰素（例如，IFN-α）和白介素（例如，IL-2））；过继免疫疗法试剂；造血生长因子；诱导肿瘤细胞分化的试剂（例如，全反式-维甲酸）；基因疗法试剂（例如，反义疗法试剂和核苷酸）；肿瘤疫苗；血管生成抑制剂；蛋白酶体抑制剂；NF-KB调节剂；抗-CDK化合物；HDAC抑制剂；等等。
凋亡调节试剂包括，但不限于，放射（例如，X-射线，γ射线，UV）；肿瘤坏死因子（TNF）-相关因子（例如，TNF家族受体蛋白，TNF家族配体，TRAIL，TRAILR1或TRAILR2的抗体）；激酶抑制剂（例如，表皮生长因子受体（EGFR）激酶抑制剂，血管生长因子受体（VGFR）激酶抑制剂，纤维母细胞生长因子受体（FGFR）激酶抑制剂，血小板衍生生长因子受体（PDGFR）激酶抑制剂，和Bcr-Abl激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼);反义分子;抗体（例如，曲妥单抗，利妥昔单抗，替伊莫单抗，和贝伐单抗）；抗-雌激素（例如，雷洛昔芬和他莫昔芬）；抗雄性激素（例如，氟他胺，比卡鲁胺，非那雄胺，氨鲁米特，酮康唑，和皮质激素）；环氧化酶2（COX-2）抑制剂（例如，塞来考昔，美洛昔康，NS-398，和非甾体抗炎药（NSAIDs））；抗炎药（例如，苯丁唑啉，地塞米松，羟氯喹，羟基保泰松，保泰松，泼尼松龙，强的松）；和癌症的化疗药物（如伊立替康，氟达拉滨，达卡巴嗪，米托蒽醌，吉姆单抗奥佐米星，依托泊甙磷酸酯，顺铂，卡铂，奥沙利铂，氟尿嘧啶，多柔比星，吉西他滨，硼替佐米，吉非替尼，贝伐单抗，或紫杉醇）；细胞信号分子；神经酰胺和细胞因子；十字孢碱，等等。
抗肿瘤或抗过度增殖试剂包括烷化剂，抗代谢药，和天然产品（例如，药草和其它植物和动物来源的化合物）。
烷化剂包括，但不限于：1）氮芥（例如，二氯甲基二乙胺，环磷酰胺，异环磷酰胺，美法仑（L-溶肉瘤素）；和苯丁酸氮芥）；2）乙撑亚胺和甲基蜜胺（例如，六甲基蜜胺和噻替哌）；3）烷基磺酸盐（例如，白消安）；4）亚硝基脲类（例如，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，或链佐星）；和5）三氮烯类（例如，达卡巴嗪；二甲基-三氮烯-咪唑羧酰胺dimethyltriazenoimid-azolecarboxamide）。
抗代谢药包括，但不限于：1）叶酸类似物（例如，氨甲喋呤（甲基蝶啶胺））；2）嘧啶类似物（例如，氟尿嘧啶，氟尿嘧啶脱氧核苷和阿糖胞苷（阿糖胞嘧啶））；和3）嘌呤类似物（例如，巯嘌呤，硫鸟嘌呤，和喷司他丁）。
化学治疗试剂包括，但不限于：1）长春花生物碱类药物（例如，长春花碱（VLB），长春新碱）；2）表鬼臼毒素（如鬼臼乙叉甙和鬼臼噻吩甙）；3）抗生素（例如，更生霉素（放线菌素D），柔红霉素（道诺霉素；红比霉素），阿霉素，博来霉素，普卡霉素（光辉霉素）和丝裂霉素（丝裂霉素C））；4）酶（例如，L-天冬酰胺酶）；5）生物学反应修饰剂（例如，α-干扰素）；6）铂配位复合物（例如，顺铂（cis-DDP）和卡铂）；7）蒽二酮（例如，米托蒽醌）；8）取代的脲（例如，羟基脲）；9）甲基肼衍生物（例如，甲基苄肼（N-甲基肼；MIH））；10）肾上腺皮质抑制剂（例如，米托坦（o,p’-DDD）和氨鲁米特）；11）肾上腺皮质类固醇（如泼尼松）；12）孕激素类（例如，己酸羟孕酮，醋酸甲羟孕酮，醋酸甲地孕酮）；13）雌激素（例如，己烯雌酚和炔雌醇）；14）抗雌激素（例如，他莫昔芬）；15）雄激素（例如，丙酸睾酮和氟甲睾酮）；16）抗雄激素物质（例如，氟他胺）；和17）促性腺激素释放激素类似物（例如，亮丙瑞林）。
其它常规的抗癌症试剂包括，但不限于，阿霉素，5-氟尿嘧啶，足叶乙甙，喜树碱，放线菌素D，丝裂霉素C，顺铂，多西紫杉醇，吉西他滨，卡铂，奥沙利铂，硼替佐米，吉非替尼，贝伐单抗，脱甲基化剂，her-2抑制剂，IGF-IR抑制剂，血管内皮细胞生长因子（VEGF），VEGFR抑制剂，mTOR抑制剂，有丝分裂抑制剂，Smad蛋白抑制剂和紫杉烷类。这些试剂可以单独、以联合疗法组合物、在试剂盒中、或与免疫疗法试剂联合等等形式进行制备和使用。
任何形式的放射可以给予患者，只要放射的剂量是患者耐受的并不具有患者不可接受的副作用。合适的放射疗法的形式包括，例如，离子化（电磁）放射疗法（例如，X-射线或γ射线）或粒子束流放射疗法（例如，高线能量放射）。
本发明也涉及：
[1].分离的氨基酸序列，其包含选自SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQID NO:3序列组的序列。
[2].特异性结合至包含SEQ ID NO:3的多肽的抗体或其片段。
[3].特异性结合人或鼠S100A4多肽的抗体或其片段，通过包含SEQ ID NO:3的多肽免疫哺乳动物而产生。
[4].[2]或[3]的抗体或其片段，其中抗体或其片段选自人抗体或其片段；人源化抗体或其片段；多克隆抗体或其片段；单克隆抗体或其片段；Fab抗体；和嵌合抗体或其片段。
[5].单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含含SEQ ID NO:1的轻链多肽，或所述单克隆抗体包含含SEQ ID NO:2的重链多肽。
[6].单克隆抗体，包含框架区（FR）和互补决定区（CDR），其中单克隆抗体包含含SEQ ID NO:1的轻链和含SEQ ID NO:2的重链。
[7].[5]或[6]的单克隆抗体，其中单克隆抗体选自人抗体；人源化抗体；和嵌合抗体或其片段。
[8].根据[5]，[6]或[7]的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体：
a)仅与人或鼠S100A4蛋白反应；或
b)阻断人或鼠S100A4蛋白的作用机制；或
c)体外或体内阻断人或鼠S100A4蛋白的功能活性；或
d)阻断由人或鼠S100A4蛋白或者由人或鼠S100A4蛋白与内皮细胞中的血管内皮生长因子（VEGF）联合诱导的前转移效应；或
e)阻断肿瘤生长；或
f)阻断肿瘤发展；或
g)阻断肿瘤血管生成；或
h)阻断细胞扩散和转移的确立；或
i)阻断癌症干细胞；或
j)前述a）至i）的任意组合。
[9].包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或片段是单价或二价的。
[10].能够产生根据[5]，[6]，[7]，[8]或[9]所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
[11].单克隆抗体，其可以从在欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）的保藏编号10022401的杂交瘤细胞系获得。
[12].分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:4编码的单克隆抗体的可变区的轻链的FR和CDR，或者所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:5编码的单克隆抗体的可变区的重链的FR和CDR。
[13].分离的多核苷酸，包含SEQ ID NO:6编码的人S100A4蛋白的表位区。
[14].生产根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体的方法，所述方法包含：
(i)用纯化的人或鼠S100A4蛋白免疫或用纯化的人或鼠S100A4蛋白与
有效诱导针对抗原的免疫应答的试剂的组合免疫小鼠；
(ii)生产一个或多个杂交瘤细胞；
(iii)筛选一个或多个细胞，其上清液：
a)仅与人或鼠S100A4蛋白反应；或
b)阻断人或鼠S100A4蛋白的作用机制；或
c)体外或体内阻断人或鼠S100A4蛋白的功能活性；或
d)阻断由人或鼠S100A4蛋白诱导的或者由人或鼠S100A4蛋白与内皮细胞中的VEGF联合诱导的转移效应；或
e)阻断肿瘤生长；或
f)阻断肿瘤的发展；或
g)阻断肿瘤血管生成；或
h)阻断细胞扩散和转移确立；或
i)阻断癌症干细胞；或
j)前述a）至i）的任意组合。
(iv)从任意一个步骤iii）筛选的细胞生产特定的细胞系；和
(v)从所述细胞系中分离单克隆抗体。
[15].药物组合物，包含根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体，和药学上可接受的载体。
[16].根据[15]的药物组合物，进一步包含化学治疗试剂。
[17].根据[2]，[3]或[4]所述的抗体或其片段，或者根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体，用作药物。
[18].根据[2]，[3]或[4]所述的抗体或其片段，或者根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体，用作治疗肿瘤的药物。
[19].[2]，[3]或[4]所述的抗体或其片段，或者根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体的用途，用于生产治疗肿瘤的药物。
[20].治疗肿瘤的方法，包含给予需要所述治疗的对象药学有效量的根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体。
[21].根据[18]所述的抗体或其片段的或单克隆抗体，根据[19]所述的用途，或根据[20]所述的治疗肿瘤的方法，其中肿瘤选自下述肿瘤组：乳腺癌，前列腺癌，肺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，肾癌，胃癌，卵巢癌，乳头状甲状腺癌，黑素瘤，肝细胞癌，膀胱癌，浸润性脂肪肉瘤，成神经细胞瘤，食管鳞状细胞癌，骨肉瘤，胆囊癌，口腔鳞状细胞癌，子宫内膜癌，成神经管细胞瘤，和任何其它S100A4介导的肿瘤。
[22].根据[2]，[3]或[4]所述的抗体或其片段，或者根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体的用途，作为对象中鉴定、定位、评价、诊断、预后或监控肿瘤或任何其它S100A4介导的疾病的标记。
[23].产品，其含有根据[2]，[3]或[4]所述的抗体或其片段，或者根据[5]，[6]，[7]，[8]，[9]或[11]所述的单克隆抗体，和抗癌症试剂，作为同时、分别或顺序地用于治疗癌症的联合制剂。
[24].特异性结合人或鼠S100A4多肽的抗体或其片段用作治疗肿瘤的药物。
发明在下文中以下列实施例的方式描述，其解释为仅仅是示例性的而不发明进行限制。
实施例
重组人S100A4蛋白和单克隆抗体的制备
实施例1：肿瘤细胞系和培养物的来源和制备
人脐静脉内皮细胞（HUVEC，Lonza）在1%来自牛皮的B型明胶（Sigma）上在内皮细胞基础培养基EBM（Lonza）中培养，所述培养基补充了hEGF，氢化可的松，牛脑提取物和庆大霉素（EGM，Lonza），和10%FCS（Invitrogen）。使用6-9代之间的HUVEC，并且在80-85%的融合率下，使用相同批次的细胞来进行所有实验。
结肠腺癌HCT-116（ATCC，No.:CCL-247）和胰腺癌MiaPACA-2（ECACC，No.:85062806）细胞系在补充了10%FCS（Invitrogen）和2mM L-谷氨酰胺的高糖（PAA）DMEM中培养。
骨髓瘤细胞在补充了10%FCS（PAA；来自澳大利亚）和2mMGlutaMAXTM-I（Invitrogen）的RPMI1640（PAA）中培养。
所有细胞在37℃下饱和湿度、5%CO2氛围中培养，并始终保持没有支原体，通过EZ-PCR支原体检测试剂盒（Biological Industries）评价。
实施例2：动物来源和制备
用于抗体生产（雌性BALB/cAnNHsd；6周大）和肿瘤模型（“裸小鼠”：雌性无胸腺，Hsd:无胸腺裸鼠；6-7周大）的小鼠来自哈伦实验室模型，S.L.（巴塞罗那，西班牙）（Harlan Laboratories Models，S.L.（Barcelona，Spain））。裸小鼠在无菌室中的微隔离笼中抚养，并随意地给予无菌食物和水。所有操作在层流净化罩中进行。
实施例3：重组人S100A4蛋白的获得
通过RT-PCT从源自人结肠腺癌的细胞系HCT-116的mRNA获得了编码全长人S100A4的片段。在该PCR中使用的特异性引物是：
SEQ ID NO:225’-ACTCACATATGGCGTGCCCTCTGGAGAAGGCCCTGGATGTG-3’
和
SEQ ID NO:235’-ACTCATGAGCTCATCATTTCTTCCTGGGCTGCTTATCTGGGAA-3’
将S100A4cDNA克隆到细菌表达载体pET28a(+)（Novagen）的NdeI位点，筛选阳性克隆体并通过DNA测序来确认。将该构建体转化进入大肠杆菌TunerTM(DE3)感受态细胞中（Novagen），蛋白以1mM异丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷（IPTG；Sigma）诱导6小时。然后，收获细菌并通过超声在缓冲液A（100μg/mL溶菌酶，0.5M NaCl，10mM Na2HPO4·2H2O，10mMNaH2PO4·2H2O和10mM咪唑，pH7.5）中溶菌。溶菌液通过离心来澄清并通过HiTrapTM螯合亲和层析柱（Amersham）过滤。用缓冲液B（0.5M NaCl，10mM Na2HPO4·2H2O，10mM NaH2PO4·2H2O和300mM咪唑，pH7.5）洗脱蛋白。在一些实验中组氨酸标签用凝血酶蛋白酶（Novagen，识别序列为Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser，切割位点在Arg和Gly之间）切割。因此，最终的全长重组S100A4蛋白在N端具有附加的Gly-Ser-His。消化之后保留的聚组氨酸链利用聚组氨酸序列标签通过螯合亲和柱（HiTrapTM）移除，含有重组S100A4蛋白的上清液的纯度通过SDS-12%（w/v）聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测。
实施例4：针对S100A4的单克隆抗体的获得
利用标准技术进行单克隆抗体（Mab）融合、ELISA筛选和亚克隆。在潮湿环境（94%空气和6%CO2）中在37℃下进行培养物的维持、扩展和放大。
对于每种单克隆抗体，用人重组S100A4根据下述方案来免疫五只动物。50微克S100A4蛋白稀释在PBS（137mM NaCl，2.8mM KCl，8.1mMNa2HPO4，1.5mM KH2PO4；pH7.2）中的与完全弗氏佐剂（Sigma）进行乳化的乳液用于初始皮下（s.c.）免疫，和其与不完全弗氏佐剂（Sigma）进行乳化的乳液用于在第19和35天的后继注射（s.c.）。第三次注射之后的10天，获得血清并测试。在第51天最后追加的稀释在PBS中的25μg的S100A4静脉内给予具有最高效价血清的小鼠。
最后注射4天之后进行融合。获得的Mab是源自骨髓瘤细胞与来自筛选的小鼠的脾细胞以1/10的比例分别利用PEG-1500（Roche Diagnostics）作为融合诱导剂的一个融合细胞。之后，将细胞置于96微孔板中在含有HAT（Invitrogen）的培养基中以筛选杂交瘤。
将杂交瘤上清液通过ELISA筛选与重组人S100A4的反应性。50μl的S100A4蛋白（在PBS中3μg/mL）包被在MaxiSorp96微孔板（NUNC）上在4℃下过夜。用PBS洗涤之后封闭（1%脱脂牛奶在PBS中；1h；37℃），将50μl的杂交瘤上清液加入每个孔中并在37℃下孵育2小时。洗涤之后，在室温下，以无钙镁PBS-HT（274mM NaCl，2.8mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，0.1%Tween-20；pH7.2）处理5次，用四甲基联苯胺3,35,5（TBM，Sigma）作为底物使用用HRP-缀合的山羊抗-小鼠IgG/IgM（JacksonImmunoResearch）检测结合的免疫球蛋白。
筛选得到具有大于平板背景三倍的光密度的孔用于克隆。选择了对应于单克隆抗体5C3（内部编码5C3-1B8-1F4；ECACC10022401），1E2（内部编码1E2-2H4-2G8；ECACC11051803），6B9（内部编码6B9-1E8-2A8；ECACC11051801），8B6（内部编码8B6-2F6-1H9-1H10；ECACC11051804）和5A3（内部编码5A3-4A6-5B6；ECACC11051802）的克隆体用于体外和体内分析并通过有限稀释进行亚克隆。仅在每孔0.1和0.01细胞下生长的亚克隆被认为是适合于扩大培养的并被置于DMEM/F12培养基（PAA）上并冷冻。
为了大规模纯化，杂交瘤细胞在含10%胎儿牛血清（PAA，来自澳大利亚）和2mM的L-谷氨酰胺（GlutaMAXTM-I，Invitrogen）的DMEM/F12中在175cm2培养瓶中培养。当细胞浓度达到0.8x106细胞/mL（生存率超过85%），移除培养基，细胞用无血清DMEM/F12培养基洗涤两次。之后，向每个瓶中加入50ml的含80%DMEM/F12，20%CDHybridoma（Invitrogen）和2mM的L-谷氨酰胺的培养基并孵育96小时。最后，收集无血清培养基，离心并冷冻直到纯化。
获得了来自杂交瘤的6升的无血清上清液，过滤之后，用5ml HiTrapProtein G HP亲和柱（Amersham）进行纯化。浓缩洗脱得到的抗体并在PBS中以Ultra-15离心过滤设备以低结合膜（30000NMWL，Millipore）渗滤。最终条件下的抗体在280nm下定量。
实施例5：单克隆抗体5C3，1E2，6B9，8B6，5A3的交叉反应表征：单 克隆抗体仅与S100A4反应
筛选单克隆抗体5C3，1E2，6B9，8B6和5A3针对S100家族其它成员的交叉反应性：重组人S100A1，S100A2，S100A6（Abnova），重组人S100A7，S100P（分别从自MDA-MD-468乳腺癌细胞系和从HeLa子宫颈腺癌细胞系的克隆，Leitat Biomed Division），和重组鼠S100A4（从NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞腺癌细胞系克隆，Leitat Biomed Division）。针对S100A4的单克隆抗体的免疫球蛋白同种型用小鼠免疫球蛋白亚型试剂盒（Sigma）来确定。
通过ELISA对纯化的人S100A4，人S100A1，人S100A2，人S100A6，人S100A7，人S100P，和鼠S100A4进行筛选的抗体显示单克隆抗体5C3，1E2，8B6和5A3与人和鼠S100A4以相同强度的反应，然而6B9只能识别人S100A4（表1）。
表1：通过ELISA分析的5C3，1E2，6B9，8B6，5A3的特异性。
Figure BDA00002832533800871
++++阳性反应，-无反应，na未分析
实施例6：通过蛋白质印迹进行的5C3免疫表征
用PBS漂洗细胞和肿瘤样品2次并立即用冰冷的细胞裂解缓冲液（150mM NaCl，1%IGEPAL CA630，5mM EDTA，100μg/mL PMSF，1mM Na3VO4，1mM NaF和50mM Tris pH7.4）裂解。裂解产物通过离心来澄清，蛋白浓度用Bradford试剂（BioRad）定量。总提取物（50μg）在还原性条件下在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳解析，并转移至BioTraceTM PVDF膜（PALL公司）。膜加0.1%吐温-20和5%脱脂干牛奶的TBS中封闭1小时，以相应的初级抗体孵育过夜，然后用次级抗体在封闭缓冲液中孵育1小时，每次孵育之后在加0.1%吐温-20的TBS中洗涤3次10分钟。用ECLTM蛋白质印迹检测试剂（Amersham）显影信号并暴露在HyperfilmTM ECL（Amersham）。
抗体的浓度如下：单克隆小鼠抗-人S100A45C3（Leitat Biomed Division）为1μg/mL；单克隆兔抗-微管蛋白（ICN Biomedicals）为1:5000稀释；山羊抗-鼠（Jackson ImmunoResearch）为0.04μg/ml，和山羊抗-兔（Sigma）为1:25000稀释，作为次级抗体。
图1a-1b显示了S100A4蛋白在一些肿瘤细胞系中的表达模式，其在小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3和源自HCT116、MiaPACA-2和BxPC3细胞系异种移植模型的肿瘤样品中。人胰腺癌细胞系MiaPACA-2和Pancl显示了比另一种人胰腺癌细胞系BxPC3具有更高的表达水平。如我们在图1b中看到的，源自BxPC3的肿瘤显示了比BxPC3本身的培养中获得的更高的S100A4表达水平。这样的S100A4水平的提高可能标志着该蛋白在恶性浸润性肿瘤的形成中的直接作用（这也在免疫组织化学部分观察到）。这些水平的提高可能是由肿瘤细胞自身或由肿瘤基质细胞产生。乳腺癌细胞系MDA-MB-231和468显示了不显著的S100A4蛋白水平，但是我们可以从图1c中看到源自MDA-MB-231的培养物的癌症干细胞显示了S100A4表达水平的提高。结肠腺癌细胞系Colo205和源自另一种结肠腺癌细胞系HCT116的肿瘤显示了该蛋白的高水平表达。图1a显示5C3不仅与人S100A4反应，也与鼠S100A4反应（NIH-3T3小鼠成纤维细胞）。
由5C3获得的相同结果也可以延伸至除了8B6的其它mAb，其中8B6不与变性的S100A4蛋白反应（数据未显示）。
实施例7：通过免疫组织化学对5C3免疫表征
对来自肿瘤块的4微米厚度的部分脱石蜡，在梯度乙醇中再水合并处理。简而言之，在微波中在10mM柠檬酸钠pH6.0和0.05%吐温-20中进行15分钟回收抗原。内生过氧化物酶活性用3%H2O2在蒸馏水中的溶液封闭，切片在5%正常山羊血清中孵育30分钟以防止非特异性染色。然后，在4℃下与合适稀释的初级抗体孵育过夜。使用下列抗体：小鼠单克隆抗体5C3（1μg/mL），来自Dako的兔多克隆抗-S100A4抗体（dil1:200）和来自R&D系统的小鼠单克隆抗体抗-多组氨酸抗体（5μg/mL）。之后，该部分用合适地生物素化的山羊抗-小鼠IgG（H+L）（Vector Laboratories）以2μg/mL，和生物素化的山羊抗-兔IgG（H+L）（Vector Laboratories）以2μg/mL孵育60分钟，和ABC复合物（Dako）在室温下30分钟。NovaRed（Dako）用作色原体。作为阴性对照，不相关单克隆抗体（抗-多组氨酸）取代了初级抗体。
利用5C3单克隆抗体的免疫组织化学分析（图2）显示了在浸润前部比在源自Panc1或BxPC3的胰腺癌异种移植模型的肿瘤的中心有更高的S100A4表达水平。并且，高放大倍率（X120）下的分析显示该蛋白不仅存在于细胞质中也存在于肿瘤细胞的细胞核中。当我们使用最常引用的针对S100A4的抗体用于免疫组织化学分析（来自Dako的兔多克隆抗体）我们观察到相同的分布模式。
综合所有这些结果，我们确认了测试的单克隆抗体可以用作诊断分析的工具。
实施例8：5C3调节由S100A4诱导的MMP9基质金属蛋白酶活性
定量蛋白底物酶谱法被确认作为细胞外基质的破坏、生长因子的活动、表面分子的处理的指示剂，并与间质和肿瘤细胞的转移和浸润性过程有关的。在患有癌症的患者中，该标准实验室技术似乎反映出该疾病的临床程度的量度。患者血清中MMP活性的分析对癌症的识别亚类可能具有诊断价值，并确定更高的转移潜能。
HUVEC在24孔培养板上在含有补充物（EGM）和10%FCS的EBM中生长。刺激之前，细胞在无血清或其它补充物的情况下保持4小时。然后，将在EBM中的S100A4（0.3-1-3μM）加入培养物以分析其增加基质金属蛋白酶（MMP）的活性形式的分泌的能力。为了测试5C3阻断S100A4刺激的抑制效果，1-2μM的抗体与S100A4（1μM）孵育1小时，在将两者加入培养物前。37℃24小时之后，离心上清液以移除碎片。然后，将10μL的不含还原性试剂的Laemmli样品缓冲液（80mM Tris-HCl pH6.8，4%SDS，10%甘油，0.01%溴酚蓝）加入10μl的每种澄清的上清液中，其不经煮沸而上样于8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶与来自猪皮的A型明胶（Sigma）共聚，其终浓度1mg/mL。电泳之后，通过以2.5%Triton X-1的水溶液洗涤凝胶3次15分钟来移除SDS。在37℃下在50mM Tris-HCl pH7.5，10mMCaCl2和0.02%NaN3存在下，通过孵育凝胶48小时来显示激活作用。在室温下以0.1%萘酚品红（Sigma）在乙酸、甲醇和水中以1:3:6的体积比的溶液进行染色1小时。然后，用脱色溶液洗涤凝胶直到在黑色背景上观察到清洗的条带。条带用NIH ImageJ成像软件来定量。
我们试图确定S100A4在诱导内皮细胞转移的部分作用机理，分析了HUVEC在条件培养基中MMP的生产和激活。来自用S100A4（0.3-1-3μM）处理的细胞的条件培养基比来自未处理细胞包含基本上更高活性形式的MMP9蛋白。该活性是剂量依赖性的（图3A）。这些不同之处在处理的24小时检测到。当抗-S100A4抗体5C3与S100A4蛋白一起加入时，培养基中MMP9的活性完全降低（图3B）。S100A4在该细胞模型中不诱导MMP2活性的改变。
我们推测当外加S100A4的VEGF加入培养基时，用S100A4处理的HUVEC的条件培养基中检测到的增强的蛋白水解活性与转移的刺激相关。这至少部分地依赖于MMP9活性。
实施例9：S100A4和VEGF在HUVEC转移中发挥了协同效应，而单克 隆抗体5C3，1E2，6B9，8B6和5A3阻断了该活性
内皮细胞（EC）分布于任何哺乳动物有机体的所有血管。EC是对特定刺激下起始新血管形成的责任细胞，所述刺激可能由病理状况或生理状况引起。EC转移目前被接受为是这样的新脉管系统形成的关键步骤。因此，EC转移的研究是抗血管生成药物的治疗活性的全面的预示。
具有嵌入8μm孔的不透光PET膜过滤器的24孔细胞培养板（来自BectonDickinson的Transwell HTS FluoroBlokTM Multiwell Insert Systems）用于测试转移活性。Transwell膜的上和下表面在37℃下以15μg/mL的I型胶原（Upstate）包被2小时。内皮细胞（5x104HUVEC’s）悬浮于100μl的不含血清或其它补充物的EBM中，在胶原包被之后，接种在每个Transwell室的上侧并在37℃下孵育4小时。然后，S100A4（1μM），在EBM中单独或与VEGF（3ng/mL）联合被加入24孔板的下室以测试其趋向性能力。为了测试抗-S100A4（5C3，1E2，6B9，8B6，5A3）单克隆抗体（Leitat Biomed Division）的抑制租用，多个浓度（参见图4）的抗体与S100A4和VEGF或者VEGF单独孵育2小时，之后两者均加入transwell的下室中以开始转移。其它称为5H4（Leitat Biomed Division）的抗-S100A4单克隆抗体是用于比较活性。在37℃下24小时后，转移至transwell的下侧的细胞用5μM Calcein-AM（Calbiochem）在37℃下孵育25-30分钟。转移的细胞在光学显微镜下以X10的放大倍率计数。组之间的比较利用双侧非参数曼—惠特尼U检验（Mann Whitney U检验）来进行。P值小于0.05的差异认为是统计学显著性差异。
该实验首次证明了S100A4和其它血管生成因子（VEGF）的联合协同增加HUVEC的转移活性。S100A4以1μM的剂量检测，相比于对照-EBM，显示没有显著活性。HUVEC与3ng/mL的VEGF单独孵育分别相比于EBM转移增加了2.4倍。当VEGF（3ng/mL）与S100A4（1μM）联合时，观察到协同效应（图4）。具体来说，当重组S100A4（1μM）与VEGF（3ng/mL）一起加入时，相比于VEGF单独的转移效果增加了235%。
我们也用单克隆抗体抗-S100A4（5C3，1E2，6B9，8B6，5A3）来抑制S100A4的转移活性。如图4A所示，250nM的5C3消除了VEGF（3ng/mL）与S100A4（1μM）的联合对HUVEC转移的协同效应。5C3对转移的抑制是剂量依赖性的。该抗体不影响VEGF单独诱导的转移。然而，其它称为5H4的单克隆抗体抗-S100A4不显示使效应失活。图4B显示了其他针对S100A4的其他的单克隆抗体相比于5C3的抑制活性，都在2μM下工作。总而言之，结合生物化学数据，这些结果证明了5C3，1E2，6B9，8B6和5A3特异性结合S100A4并显示了对S100A4的HUVEC诱导的转移的体外活性失活。
实施例10：在裸小鼠中5C3阻断MiaPACA-2和HCT116肿瘤发展
肿瘤异种移植通常用于评价响应，其中化学疗法结果具有癌症化疗具有潜在临床关联性。肿瘤异种移植从而是异种移植数据与临床数据关联的良好模型。以不同类型的异种移植肿瘤的药物测试显示在免疫缺陷动物中获得的异种移植的应答与临床实践有可比性。另外，特定肿瘤类型的异种移植能够鉴别具有针对该疾病的已知临床活性的试剂。
在指数生长期的MiaPACA-2人胰腺癌细胞系和HCT116人结肠直肠腺癌细胞系用胰蛋白酶-EDTA（0.05%/0.02%）（Invitrogen）收获，洗涤，并通过台盼蓝染料排除来检测生存能力。生存能力大于95%。对于原发肿瘤的生长，细胞（MiaPACA-2或HCT116分别5x106或1x106细胞在0.1mL高糖DMEM中）皮下注射至裸小鼠的威、胁腹。MiaPACA-2的体积在65-160mm3之间和HCT116的体积为155-370mm3之间的肿瘤用于将小鼠分为两组，每组10只小鼠（MiaPACA-2）或七只小鼠（HCT116），使得组之间的平均肿瘤大小相等（MiaPACA-2大约100mm3或HCT116大约220mm3）。肿瘤生长随后用卡钳测量肿瘤直径，肿瘤体积用长椭球的大致公式来计算：
体积=(Dxd2)/2
其中D是肿瘤的最长轴，而d是最短轴。小鼠用载体（PBS）或抗体处理，i.p.每周3次，以25mg/Kg/100μL的无菌PBS，以定义的肿瘤体积（100mm3和220mm3）时开始处理。实验结束处死动物，通过手术移除肿瘤，称重并且将OCT化合物植入一半肿瘤以用于后来的CD31免疫染色分析，而另一半肿瘤用在甲醛中固定以用于后继分析。来自带有MiaPACA-2或HCT116肿瘤的动物的血液样品在实验结束进行收集（所有动物），利用EDTA包被的材料。随后，立即室温下5000rpm离心血清样品10分钟，储存在-20℃用于分析。
组之间的对比用双侧非参数曼—惠特尼U检验来进行。P值小于0.05的差异被认为是统计学显著性差异。
发明人研究了5C3对MiaPACA-2（图5）或HCT116肿瘤在无胸腺裸小鼠中的皮下发展的效果。在小鼠中MiaPACA-2/HCT116细胞系或由MiaPACA-2/HCT116发展的肿瘤君显示了高的S100A4蛋白表达水平和分别分泌该蛋白至培养基和血液中（数据未显示）。由于S100A4在胰腺肿瘤和结肠直肠肿瘤中的作用和由这些细胞系分泌蛋白的证据，我们决定尝试用该模型测定我们的单克隆抗体5C3的体内活性。
移植异种移植体并生长，带有肿瘤的动物随机分配并如前文所述进行处理。处理在MiaPACA-2细胞移植（第0天）的17天之后开始（每组的平均肿瘤体积大于100mm3）（第0天），处理30天之后收集肿瘤。处理在HCT116细胞移植23天之后开始（每组的平均肿瘤体积大于220mm3）（第0天）。通过腹内途径给予5C3（25mg/kb），以每周3次的给药方案给药，如图6所示（以MiaPACA-2的实例）。
图5A显示了5C3对带有MiaPACA-2肿瘤的小鼠的抗肿瘤活性随时间变化的对比分析。对照组（载体）展现了最大的肿瘤生长，其具有相对初始体积（处理前）的592%的平均相对肿瘤体积。在5C3注射的小鼠中肿瘤体积改变，展现了相对于初始体积的274%的最大平均相对肿瘤体积（第30天）。与这些数据相联系，我们观察到（图5B）用5C3处理，也诱导了在实验结束（第30天）相比于对照组，肿瘤重量的统计学显著的降低。另外，这些差异反映在肿瘤体积的T/C比例和肿瘤重量的计算；分别是46%和38%。
5C3对带有HCT116肿瘤小鼠的抗肿瘤活性的随时间变化。对照组（载体）展现了相对于初始体积（处理前）平均相对肿瘤体积557%的最大肿瘤生长。5C3注射的小鼠的肿瘤体积的改变显示了相对初始体积511%的最大平均相对肿瘤体积（第21天）。与这些数据相联系，我们观察到（数据未显示）用5C3处理，诱导了在实验结束（第21天）相比于对照组肿瘤重量的降低，在肿瘤体积评价中观察到的较高。另外，这些差异反映在肿瘤体积的T/C比例（处理组vs对照组）和肿瘤重量的计算；分别是91%和74%。
因此，我们首次证明了，对于MiaPACA-2人胰腺癌，针对S100A4的单克隆抗体的处理诱导了肿瘤生长的统计学显著的延迟，相比于未处理组（载体），和在HCT116人直肠结肠肿瘤，增加的肿瘤内坏死，从而影响了肿瘤重量。
实施例11：5C3阻断肿瘤微脉管系统形成
实验性证据表明肿瘤超过一定大小的生长需要血管生成，而这也使其可以了转移。为了研究在癌症中肿瘤血管生成如何与转移相关的，研究者对在起始浸润性癌变期间的微脉管（毛细管和微静脉）计数并将微脉管密度分级。微脉管计数和密度分级也与远端转移相关。因此，肿瘤血管生成的评价可能证明了在筛选具有早期乳腺癌的患者采用积极治疗中的价值。
来自MiaPACA-2异种移植肿瘤模型的肿瘤被OCT
Figure BDA00002832533800931
Sakura）植入并冷冻。将对应于每个肿瘤的中心部的一个冷冻切片继续你个分析（5μm）。切片在-20℃下在丙酮/氯仿（1:1）中准备5分钟，室温下过夜干燥，用PBS洗涤并在4℃下在暗室中用H2O2（0.03%）的PBS溶液处理。然后，切片用PBS洗涤并在4℃下用另加兔血清（5%）（Vector）的PBS-BSA（2%）封闭20分钟和在4℃下用抗生物素蛋白-生物素封闭溶液（Dako）每个封闭10分钟。样品在室温下用初级抗体1小时；将针对CD31的单克隆大鼠抗-小鼠抗体（dil1:200，BDPharMingen）在封闭缓冲液中稀释。孵育之后，切片用多克隆生物素化的抗-大鼠抗体作为次级抗体（dil1:500，Vector）室温下孵育30分钟，并用ABC试剂（Pierce）室温下孵育30分钟。最后，切片用NovaRed（Vector）在4℃下孵育20分钟，用苏木精Harris（Sigma）染色10秒并用DPX非水相封固剂（Sigma）封片。
血管生成定量用两个标准来衡量：
Figure BDA00002832533800941
Figure BDA00002832533800942
每个切片制作8到9张图片，取决于肿瘤的大小，并用NIH ImageJ图像软件来分析。
组之间的对比用双侧非参数曼—惠特尼U检验来进行。P值小于0.05的差异被认为是统计学显著性差异。
发明人研究了5C3是否确实在体内影响肿瘤的血管生成。肿瘤血管生产的评价基于CD31免疫染色和两个分析近似来进行：微血管密度（MicroVesselDensity）（M.V.D.）和脉管的面积分数（A.A.）。
表2显示了获得的所有数据，根据每个动物，涉及每个皮下注射的MiaPACA-2肿瘤的分析图片的数目，脉管总面积，脉管数目，肿瘤总面积，和M.V.D.和%A.A.的定量。
表2：对照组与5C3处理组之间的肿瘤血管生成情况的对比
Figure BDA00002832533800951
G1（载体对照组），G2（5C3处理组）。
M.V.D.（微脉管密度）和%A.A.（脉管的面积分数）的定量。
Figure BDA00002832533800961
来自用单克隆抗体5C3处理的动物的肿瘤，与来自对照组的动物（载体）相比，显示了微脉管密度大约降低40%和脉管占据的截面面积降低30%。如图7所示，这些在肿瘤内微脉管的差异是统计学显著性差异。
我们的实验数据揭露了5C3阻断肿瘤发展的效果可能部分地由于肿瘤血管生成的强烈减少。。
实施例12：用5C3处理不会诱导体重降低或副作用
5C3处理组和载体对照组的给药日的体重曲线在给药之前随着实验进行监控。在任何组中均未观察到体重降低，并且处理未被中止。
图8显示了随着实验的动物体重曲线。5C3在25mg/kg的每周三次的剂量方案下直到实验结束都被很好地耐受。
动物的肉眼检查分析没有证明器官的畸形。我们在实验期间在任何动物中均没有观察到副作用（行动不协调，瘫痪，共济失调，抽搐，腹泻，恶病质，红斑，体温降低，死亡）。
实施例13：在异种移植肿瘤模型中S100A4的血浆定量
进行肿瘤和转移的早期检测是必要的，这是癌症患者改善治疗的关键过程。用非浸润性样品测试例如血液基于定量方法的分子生物标记的检测是用于检测肿瘤的存在和监控癌症治疗的临床上最需要检测之一。
S100A4的血浆水平通过夹心ELISA法来定量。简而言之，96微孔板（Maxisorb，NUNC）用10μg/ml的溶于PBS的单克隆抗体5C3（100μg/ml）在4℃下包被24小时。移除包被后，用PBS洗涤板2次并在37℃下在封闭缓冲液（含1%脱脂牛奶的PBS）中孵育1小时。
以1:4稀释在稀释缓冲液（PBS-4%BSA）中的血浆样品加入到孔（100μl/孔）并在37℃下孵育2小时。板用洗涤缓冲液（PBS-0.1%的吐温-20）洗涤8次，兔多克隆抗-S100A4次级抗体（Dako）以合适的稀释度加入到孔中（100μl/孔）并在37℃下孵育1小时。
用洗涤缓冲液洗涤板8次并将山羊抗-兔-IgG-过氧化物酶缀合物（Sigma）以合适的稀释度加入每个孔中（100μl/孔）并在37℃下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤8次后，ELISA通过加入100μl的四甲基联苯胺底物（Sigma）而暴露并在室温下孵育30分钟，之后用1M的HCl终止。在450nm测量吸光度。
基础血浆样品（无肿瘤动物）的标准曲线是通过鼠重组S100A4在稀释缓冲液中的梯度稀释来获得。最终血浆样品（在实验末尾具有肿瘤的动物）的标准曲线通过人重组S100A4在梯度稀释的稀释缓冲液中来获得。
图9显示了S100A4在具有数种MiaPACA-2，Colo205，MDA-MB-231和HCT116细胞系的皮下肿瘤的动物中的血浆水平的量化。实验数据证明了在无肿瘤动物（基础-02）中S100A4蛋白的基础表达和当动物表现肿瘤时在实验末尾S100A4蛋白的表达之间的一致差异。
图9也显示了用单克隆抗体5C3处理的动物（MiaPACA-2和HCT116异种移植肿瘤模型）中S100A4蛋白水平，其表明了相应的处理（参见实施例10）阻断了在血浆中的循环S100A4蛋白的总量。
实施例14：单克隆抗体5C3，1E2，6B9，8B6和5A3的表位确定
抗体识别的表位区域的确定通过ELISA来评估。简而言之，人S100A4蛋白的全长序列分段为9个重叠的肽。96微孔板（Maxisorb，NUNC）用3μg/ml的稀释于PBS每种肽（100μl/孔）在4℃下包被24小时。抗-S100A4抗体以5μg/ml稀释于稀释缓冲液（PBS-1%的BSA）加入孔（100μl/孔）并在37℃下孵育90分钟。用洗涤缓冲液（PBS-0.1%的吐温-20）洗涤板8次，山羊抗-小鼠-IgG-过氧化物酶缀合物（Jackson Immunoresearch）以合适的稀释度加入至每个孔（100μl/孔）并在37℃下孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤8次之后，ELISA通过加入100μl的四甲基联苯胺底物（Sigma）而暴露并在室温下孵育15分钟，之后用1M的HCl终止。在450nm测量吸光度。
表3显示了由功能性5C3，1E2，6B9，8B6和5A3单克隆抗体识别的人S100A4的区域。注意8B6抗体不识别9个设计的线形肽中的任何一个，这告诉我们它识别该蛋白的构象区域的可能性。另一个针对人S100A4的单克隆抗体，称为5H4，用作转移分析的阴性对照，识别不同的区域（VMVSTFHKYSGKEGDKFKLN）（SEQ ID NO:26）。
表3：由单克隆抗体识别的S100A4的序列。
单克隆抗体 S100A4序列 保藏号
5C3 ELPSFLGKRT (SEQ ID NO: 3) 10022401
1E2 EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO: 24) 11051803
6B9 EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO: 24) 11051801
5A3 EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO: 24) 11051802
8B6 ------ 11051804
实施例15：吉西他滨和5C3的细胞毒性效果
癌症是多步骤和多因子过程，并因此针对不同的分子靶标或肿瘤位置的治疗策略通常是对抗该疾病的最佳选择。常规的化学疗法例如吉西他滨，一种对晚期胰腺癌的一线治疗，被广泛地应用，但由于化学耐药性的需要和多种副作用的存在而仅提供了适度的好处。从而，需要找到更低毒性的靶标试剂，其能够敏感化数种肿瘤位置并与标准化学疗法联合将会更有效杀死肿瘤细胞。为了促进抗肿瘤效果并找到用于胰腺癌治疗的新试剂，我们研究了单克隆抗体与吉西他滨联合对人MiaPACA-2胰腺癌细胞系的细胞增殖和生存能力的影响。
吉西他滨和单克隆抗体5C3的细胞毒性效果通过氨基己糖胺酶活性来测量。简而言之，将MiaPACA-2细胞置于96孔细胞培养板的（5x103细胞/孔）在50 μl的DMEM培养基中。24小时后，50 μl的培养基与数种浓度的吉西他滨单独地或与5C3（40 nM，100 nM）联合地加入每个孔中并孵育72小时。移除培养基之后，细胞用PBS洗涤1次。将60 μl的基质溶液（p-硝基酚-N-乙酰-β-D-葡萄糖酰胺7.5 mM，柠檬酸钠0.1 M，0.25% Triton X-100，pH 5.0）加入每个孔中，板在37℃下孵育2小时；这个孵育时间之后，出现浅黄色，板通过加入90 μl的显影溶液（甘氨酸50 mM，EDTA 5 mM，pH 10.4）来显示，通过利用多孔扫描分光光度计来测量在450nm处的吸光度。通过用阴性对照（未处理细胞）标准化结果来进行数据处理，所述阴性对照被认为是100%的存活。
曲线用S形剂量相应（变量斜率）等式来调整，EC50值由下式获得：
Y=低点+(顶点-低点)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))
其中X是浓度的对数，而Y是相应。Y从S形的低点开始并走向顶点。
为了评价吉西他滨与5C3之间的作用（协同，累加或拮抗效果）的水平使用了由Chou-Talalay提议的多种方法。简而言之，另加5C3的吉西他滨的效果由联合指数（CI）来量化：
CI=(D)1/(Dm)1
其中（Dm）1=EC50药物1浓度而（D）1=EC50(药物1+药物2)
表4.用CI指数确定的值（协同，累加，拮抗）
<0.1 非常强烈的协同 0.90-1.10 几乎是累加
0.1-0.3 强烈协同 1.20-1.45 轻微拮抗
0.3-0.7 协同 1.45-3.3 拮抗
0.7-0.85 中等协同 3.3-10 强烈拮抗
0.85-0.9 轻微协同 >10 非常强烈的拮抗
图10显示了由吉西他滨单独地或吉西他滨与两种浓度的单克隆抗体5C3联合地在MiaPACA-2细胞系中治疗而诱导的细胞生存能力的效果。吉西他滨的EC50是8.356nM。与5C3的联合显示了对于mAb为40nM和100nM的EC50分别为5.161nM和4.586nM。
CI指数的确定的吉西他滨与40nM和100nM的5C3的联合的值为0.61和0.54，证明了这两个化合物的协同效果。
该实验首次证明了针对S100A4的单克隆抗体与化学疗法药物吉西他滨的联合可以协同促进药物单独使用的效果。由于该原因，抗-S100A4单克隆抗体可以作为新候选者与化学疗法药物联合用于治疗患者的癌症。
实施例16：S100A4在THP1单核细胞中诱导IL8的分泌并且单克隆抗体 5C3阻断该效果。
慢性炎症疾病包含多种表征为单细胞核的细胞例如单核细胞和淋巴细胞的活化的紊乱。慢性炎症疾病和自免疫疾病中的特点之一是单核细胞/巨噬细胞的强烈活化和聚集。在大多数慢性炎症紊乱中，活化的单核细胞和巨噬细胞是的细胞因子最重要的来源。考虑到所有这些事实，研究了阻断S100A4是否可以用于治疗慢性炎症疾病，其中的单核细胞活化扮演关键角色。
为了评价5C3对单核细胞活化的效果；THP-1，人单核细胞细胞系暴露于S100A4，分泌的IL-8的水平被作为单核细胞活化的指标。
人单核细胞白血病细胞系THP-1（ATCC）的细胞在补充了10%FCS和1%青霉素/链霉素的PRMI1640培养基中在37℃下和5%的CO2中在加湿培养箱中生长。细胞以5.0x105细胞/孔放置。S100A4和5C3抗体一起孵育1小时，之后加入单核细胞。在所有的情况下，抗-小鼠IgG（Fc特异性）也加入以防止Fc受体应答。24小时后收集细胞培养上清液并在-20℃储存。IL-8的水平通过夹心ELISA来分析。
S100A4以剂量响应的方式活化人单核细胞诱导细胞因子释放（图11A）。该相应会被单克隆抗体5C3所阻断（图11B）。5C3和抗-小鼠IgG两者在S100A4不存在下均对对IL-8水平没有影响（数据未显示）。
这些事实表明5C3可以用于治疗所有慢性炎症疾病，例如类风湿性关节炎，牛皮癣性关节炎，牛皮癣，炎症性肠病，动脉硬化，多发性硬化症，等等，其中单核细胞的活化在其病理生理学中扮演了关键角色。
生物材料的保藏
产生5C3-1B8-1F4抗-S100A4单克隆抗体的杂交瘤保藏在符合布达佩斯条约规定的欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）（波顿当，索尔兹伯里，SP4OJG，英国）（Porton Down，Salisbury，SP4OJG，United Kingdom）。其保藏于2010年2月24日并且分配给所述保藏编号是10022401。
产生6B9-1E8-2A8抗-S100A4单克隆抗体的杂交瘤保藏在布达佩斯条约规定的欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）（波顿当，索尔兹伯里，SP4OJG，英国）（Porton Down，Salisbury，SP4OJG，United Kingdom）。其保藏于2011年5月18日并且分配给所述保藏编号是11051801。
产生5A3-4A6-5B6抗-S100A4单克隆抗体的杂交瘤保藏在布达佩斯条约规定的欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）（波顿当，索尔兹伯里，SP4OJG，英国）（Porton Down，Salisbury，SP4OJG，United Kingdom）。其保藏于2011年5月18日并且分配给所述保藏编号是11051802。
产生1E2-2H4-2G8抗-S100A4单克隆抗体的杂交瘤保藏在布达佩斯条约规定的欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）（波顿当，索尔兹伯里，SP4OJG，英国）（Porton Down，Salisbury，SP4OJG，United Kingdom）。其保藏于2011年5月18日并且分配给所述保藏编号是11051803。
产生8B6-2F6-1H9-1H10抗-S100A4单克隆抗体的杂交瘤保藏在布达佩斯条约规定的欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）（波顿当，索尔兹伯里，SP4OJG，英国）（Porton Down，Salisbury，SP4OJG，United Kingdom）。其保藏于2011年5月18日并且分配给所述保藏编号是11051804。
Figure IDA00002832534800011
Figure IDA00002832534800021
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Claims (32)

1.一种具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其中所述抗体选自如下组：
(i)识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4表位的抗体，
(ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4表位的抗体，和
(iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
2.根据权利要求1所述的特异性抗-S100A4抗体或其片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的特异性抗-S100A4抗体或其片段，由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804杂交瘤组的杂交瘤或其片段产生。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其片段，其由杂交瘤ECACC10022401产生。
5.根据权利要求4所述的抗体或其片段，其包含至少一个VL区和至少一个VH区，所述VL区包含序列SEQ ID NO:1或其功能性等价变体，所述VH区包含序列SEQ ID NO:2或其功能性等价变体。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的抗体或片段，其具备中断人内皮细胞的转移能力。
7.一种杂交瘤细胞系，其选自保藏号为ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的细胞系组的的杂交瘤系。
8.一种药物组合物，包含药学上有效量的至少一种根据权利要求1-6的任意一项所述的抗体或其片段和至少一种药学上可接受的载体。
9.根据权利要求1-6的任一项所述的抗体或其片段，用于预防和/或治疗选自以下疾病组的疾病的用途：转移，与不期望的血管生成相关的疾病，和与炎症相关的疾病。
10.抗体或其片段，在用于根据权利要求9所述的用途中，其中疾病是癌症。
11.抗体或其片段，在用于根据权利要求10所述的用途中，其中癌症选自胰腺癌和结肠直肠癌。
12.一种缀合物，包含根据权利要求1-6任一项所述的抗体或其片段和第二组分，所述第二组分选自以下的组：
(a)抗血管生成试剂
(b)抗转移试剂
(c)细胞毒素试剂
(d)抗炎症试剂
13.根据权利要求12所述的缀合物，用于预防和/或治疗选自以下疾病的用途：转移瘤，与不期望的血管生成相关的疾病，和与炎症相关的疾病。
14.一种获得权利要求2-6任意一项所述的单克隆抗体的方法，其包含在能够生产所述抗体的条件下培养选自以保藏编号ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804细胞系的杂交瘤细胞系。
15.包含特异性抗-S100A4抗体和抗代谢物的组合物。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中抗代谢物是吉西他滨。
17.根据权利要求15或16所述的组合物，其中特异性抗-S100A4抗体是具有抗血管生成活性的抗-S100A4抗体或基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其中所述抗体选自如下组：
(i)识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的的表位的抗体，
(ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4表位的抗体和
(iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
18.根据权利要去15-17的任意一项所述的组合物，其中特异性抗-S100A4抗体是由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中特异性抗-S100A4抗体是由杂交瘤ECACC10022401产生的单克隆抗体。
20.根据权利要求15-19的任一项所述的组合物，其能够降低肿瘤细胞生存能力。
21.根据权利要求15-20的任一项所述的组合物，用于预防和/或治疗癌症或转移瘤。
22.能够结合该抗原的特异性结合S100A4蛋白的抗体或其的片段在制备用于治疗和/或预防与炎症相关的疾病的药物中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中特异性结合S100A4蛋白的抗体或其片段是具有抗血管生成活性的抗-S100A4抗体或基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其中所述抗体选自如下组：
(i)识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4表位的抗体，
(ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4表位的抗体，和
(iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
24.根据权利要求23所述的用途，其中特异性结合S100A4蛋白的抗体是由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804杂交瘤组的杂交瘤产生的抗体。
25.根据权利要求24所述的用途，其中特异性结合S100A4蛋白的抗体是由杂交瘤ECACC10022401产生的抗体。
26.一种在对象中体外诊断癌症或与炎症相关的疾病的方法，其包含
(a)检测所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平，其是通过利用由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性功能性变体实现的，
(b)将所述水平与参考值比较
其中，相对于参考值，S100A4蛋白或其变体的水平的增加表示对象患有癌症或与炎症相关的疾病。
27.根据权利要求26所述的方法，其中疾病是癌症。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中生物流体选自血液、血浆和血清。
29.一种检测样品中S100A4的方法，其包含：
(i)将怀疑含有S100A4的样品与权利要求1-6任一项所定义的特异性抗-S100A4抗体或其片段接触，和
(ii)检测S100A4和抗体或其片段之间的免疫复合物的形成
其中，检测到S100A4和抗体或其片段之间的免疫复合物表示样品中存在S100A4。
30.一种在生物流体中诊断癌症或与炎症相关的疾病的试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1-6所述的抗体或其片段。
31.一种为诊断患有癌症的对象设计定制疗法的体外方法，其包含：
(i)确定所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平和
(ii)比较S100A4蛋白的水平与参考值
其中，S100A4蛋白或其变体的水平相对于参考水平的增加表示该患者需要用具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或基本上保留所述抗体的抗血管生成活性的其片段治疗，其中抗体选自如下组：
(a)识别包含序列ELPSFLGKRT（SEQ ID NO:3）的S100A4表位的抗体，
(b)识别包含序列EGFPDKQPRKK（SEQ ID NO:24）的S100A4表位的抗体和
(c)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
32.根据权利要求31中所述的方法，其中步骤（i）中水平的确定是通过利用由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803和ECACC11051804杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体来进行。
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