CN103169963A

CN103169963A - 狂犬病dna疫苗的构建及应用

Info

Publication number: CN103169963A
Application number: CN2013101259112A
Authority: CN
Inventors: 步志高; 王喜军; 葛金英
Original assignee: HARBIN WEIKE BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: HARBIN WEIKE BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2033-04-12
Also published as: CN103169963B

Abstract

本发明提供一种作为狂犬病DNA疫苗的表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白(G蛋白)基因的重组真核表达质粒。

Description

狂犬病DNA疫苗的构建及应用

技术领域

本发明涉及狂犬病疫苗领域。更具体地，本发明涉及一种作为狂犬病DNA疫苗的表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化的RV囊膜糖蛋白(G蛋白)基因的重组真核表达质粒。

背景技术

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的一种人兽共患传染病，在全球范围内流行，以急性、渐进性和致死性脑炎为特征，一旦出现神经症状病死率几乎高达100％^[1，2]。全球每年死于狂犬病的人数高达5.5万，主要发生在亚洲和非洲的发展中国家^[3，4]。自2000年以来，我国狂犬病疫情又呈现快速回升的趋势，2007年死亡人数高达3,300人^[5]，随后略有下降，但仍维持在较高水平，2011年造成1,879人死亡^[6]，已经成为一个严重的公共卫生问题。据统计，99％以上人间狂犬病死亡病例因狂犬病犬咬伤所致^[1]。人间狂犬病控制最有效的措施是通过疫苗接种，从源头上控制犬狂犬病。传统的狂犬病弱毒疫苗成本低廉，但存在毒力残留或致病性回复突变的安全隐患；灭活疫苗安全、有效，但成本昂贵^[7，8]。因此，研制安全、有效，成本低廉的动物狂犬病疫苗，仍具现实意义。

DNA疫苗免疫动物后，可同时诱导体液免疫和细胞免疫，可保护动物抵抗病原体的攻击。同时，DNA疫苗易于构建，大量制备工艺简单，生产成本低廉，便于保存，无需冷冻运输，因而引起研究人员的广泛关注^[9，10]。

狂犬病病毒(Rabies virus，RV)为弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lssavirus)成员^[11]。狂犬病病毒囊膜蛋白(RVG)是病毒的受体结合蛋白和主要毒力因子之一，决定着病毒侵入神经系统或组织的路径和致病力，也是诱导机体保护性免疫反应的主要抗原^[12]。本研究构建了表达哺乳动物密码子优化的RVG基因的重组真核表达质粒pCAGG-RVG，并对其在靶动物犬的免疫原性进行了评估。

发明内容

本发明构建了表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化的RVG蛋白(RVG)基因的重组真核表达质粒pCAGG-RVG。间接免疫荧光试验及蛋白印迹结果表明，重组RVG在pCAGG-RVG转染BHK细胞获得正确表达。将pCAGG-RVG按500μg剂量经肌肉注射途径免疫比格犬，间隔4周以相同剂量、途径加强免疫一次，并于初次免疫前、后不同时间检测血清RV中和抗体。结果，pCAGG-RVG一次免疫即可诱导显著的中和抗体反应，二次免疫中和抗体滴度表现出显著地增强效果。二次免疫后，中和抗体滴度经过短暂的下降，即保持持续的平稳，至初次免疫后第54周，7只免疫犬中和抗体滴度平均为2.88IU，且全部高于0.5IU，即全部高于对强毒攻击保护的最低中和抗体滴度要求。综上，pCAGG-RVG具有预防狂犬病的潜力，是一种有希望的狂犬病候选疫苗。

具体地，本发明提供以下各项：

1.一种狂犬病DNA疫苗，所述狂犬病DNA疫苗包含表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重组真核表达质粒。

2.根据第1项所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述按哺乳动物密码子偏嗜性优化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因具有如SEG ID No.1所示的序列。

3.根据第1项所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重组真核表达质粒具有如SEG ID No.2所示的序列。

4.具有如SEG ID No.2所示的序列的重组真核表达质粒用作狂犬病DNA疫苗的用途。

5.具有如SEG ID No.2所示的序列的重组真核表达质粒在制备狂犬病DNA疫苗中的用途。

附图说明

图1：间接免疫荧光检测RVG蛋白在pCAGG-RVG转染BHK细胞中的表达。A：pCAGG-RVG转染的BHK细胞；B：RV弱毒疫苗株ERA感染的BHK细胞；C：pCAGGS转染的BHK细胞。

图2：蛋白质印迹检测RVG蛋白在pCAGG-RVG转染BHK细胞中的表达。以2μg的pCAGG-RVG或pCAGGS转染铺于6孔板密度约为80％的BHK细胞，同时用RV弱毒疫苗株ERA按MOI为1感染转染铺于6孔板密度约为80％的BHK细胞。36小时后，收获、裂解细胞，以裂解细胞上清进行SDS-PAGE电泳，将蛋白质转印至硝酸纤维素膜上后，以鼠抗RV血清为一抗进行Western blot分析。M：蛋白质分子量标准；A：pCAGGS转染的BHK细胞；B：RV弱毒疫苗株ERA感染的BHK细胞；C：pCAGG-RVG转染的BHK细胞。

图3：狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG对犬的免疫效力。用表达RVG蛋白的重组真核表达质粒pCAGG-RVG按500μg/1mL/只的剂量经肌肉注射途径免疫7只比格犬，间隔4周以相同剂量、途径进行加强免疫。免疫前和免疫后不同时间点采集试验犬外周血，分离血清，通过中和试验检测血清中RV特异中和抗体滴度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

材料和方法

1.质粒、血清、细胞株和毒株

真核表达载体pCAGGS由Y.Kawaoka博士提供^[13](文献13中明确公开了载体pCAGGS的构建方法)；抗狂犬病病毒国际标准血清购自OIE狂犬病参考实验室(法国)；(仓鼠肾细胞)BHK-21：ATCC NO.CCL10；RV弱毒疫苗株ERA：CVCC NO.AV61*；鼠抗RV血清(RV弱毒疫苗株ERA按10⁶FFU/mL/只的剂量免疫6周龄小鼠，间隔3周，加强免疫2次，第3次免疫后2周采集小鼠血液，分离血清)；RV标准固定毒株CVS11的来源见参考文献^[14]。

2.主要试剂及实验动物

限制性内切酶、T4连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；plasmid Giga Kits购自QIAGEN公司；脂质体Lipofectamine^TM2000转染试剂购自Invitrogen公司；绿色荧光素(FITC)标记的兔抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶 (HRP)标记的兔抗小鼠IgG均购自Sigma公司。比格犬购自广州医药工业研究总院实验动物研究开发中心(国家犬类实验动物种子中心)。

实施例1、真核表达质粒pCAGG-RVG的构建与制备

按哺乳动物密码子偏嗜性优化狂犬病病毒弱毒疫苗株ERA(其完整基因组序列见GenBank号：FJ913470)囊膜糖蛋白(G蛋白)的基因序列(优化前的原始序列见SEG ID No.3)。一种氨基酸均有几个密码子，也就说这几个密码子均能翻译成一种氨基酸。哺乳动物对密码子具有偏嗜性，即在哺乳动物体内一种氨基酸的几个密码子的翻译效率有的高有的低，在本文中“优化”即将氨基酸的密码子全部改写为在哺乳动物体内翻译效率高的密码子。原始序列与优化后序列的差别在于翻译成的氨基酸序列不变，但核酸序列变化特别大。优化后的序列见SEG ID No.1，人工合成该基因，并在起始密码子前引入Kozak序列(GCCGCCACC)，两末端引入EcoRI和XhoI限制性内切酶序列(GAATTC和CTCGAG)，克隆至pUC57载体(GenScript NO.SD1176)，获得质粒pUC57-RVG。以BamH I单酶切pCAGGS，去除其中SV40 ori序列(SV40复制起始序列)，连接构成质粒pCAGGSΔSV40 ori；再以EcoRI和XhoI限制性内切酶双酶切pUC57-RVG，得到RVG基因，并亚克隆至pCAGGSΔSV40 ori相应酶切位点，RVG蛋白基因位于鸡β-actin转录启动子下游，获得表达RVG蛋白基因的真核表达质粒pCAGG-RVG(SEG ID No.2)。分别以EcoRI和XhoI单酶切进行鉴定，通过plasmid Giga Kits大量制备质粒pCAGG-RVG(具体操作详见试剂盒说明书)，用于转染及免疫试验。

EcoRI和XhoI双酶切pCAGG-RVG得到大小约为1650bp和4400bp的两个片段，与预期结果相符，表明RVG蛋白基因在真核表达质粒pCAGGS中获得重组(结果未呈现)。

实施例2、真核表达质粒pCAGG-RVG的瞬时转染及间接免疫荧光(IFA)检测

为了证实pCAGG-RVG表达RVG蛋白的抗原性，以pCAGG-RVG转染BHK细胞，转染前准备24孔板生长过夜、密度约为80％的BHK细胞，通过脂质体转染方法(具体操作详见Lipofectamine^TM2000说明书)转染0.5μg的pCAGG-RVG转染至上述细胞、转然后5％CO₂37℃培养。同时，以RV弱毒疫苗株ERA按MOI为0.1的剂量感染BHK细胞，作为阳性对照；以0.5μg的pCAGGS转染BHK细胞，作为阴性对照。转染后36小时，用PBS洗细胞3次，以预冷的3％多聚甲醛固定细胞30min；PBS洗3次后，1％BSA封闭20min；PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶100倍稀释的鼠抗RV血清为一抗，室温孵育30min；PBST洗涤后加入1∶200倍稀释FITC标记的兔抗鼠IgG二抗(Sigma NO.F9137)，室温孵育30min；PBS洗涤后，置于荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察。

结果显示，抗RV鼠血清检测pCAGG-RVG转染的BHK细胞时呈现绿色阳性荧光信号(图1A)，检测RV ERA株感染BHK细胞时也呈现绿色阳性荧光信号(图1B)，而检测pCAGGS转染的BHK细胞时则呈现阴性荧光信号(图1C)。结果表明，pCAGG-RVG表达RVG蛋白具有良好的反应原性。

实施例3、蛋白印迹法(Western blot)分析

为了分析重组真核表达质粒能否表达RVG蛋白，以2μg的pCAGG-RVG转染铺于6孔板的单层BHK细胞。在转染后36小时，收获、裂解细胞，加入等体积的2×SDS裂解缓冲液，煮沸10min，10,000×g离心10min后，取上清进行SDS-PAGE(Bio-Rad)电泳；将蛋白电转印(Bio-Rad)至尼龙膜(Ameresco)上，5％脱脂乳封闭过夜，PBST洗涤后加入1∶100倍稀释的鼠抗RV血清为一抗，室温作用1h，PBST洗涤后，加入1∶2500倍PBST稀释辣根过氧化物酶(HR)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma NO.A9044)室温作用1h，PBST洗涤后，用DAB进行显色。

蛋白质印迹显示出特异的67ku检测蛋白，与G蛋白理论预期值相符(图2)。结果表明，RVG蛋白在pCAGG-RVG转染的BHK细胞中获得表达。

实施例4、血清中和试验检测DNA免疫犬诱导中和抗体

为了进一步评价真核表达质粒pCAGG-RVG的免疫效力，以重组真核表达质粒pCAGG-RVG按500μg/1mL/条(不管体重如何都注射同样的量，用磷酸盐缓冲液PBS进行稀释)的剂量经肌肉注射途径免疫7条RV中和抗体阴性比格犬(所用比格犬12月龄，接种剂量与体重无关，注射部位为后肢股四头肌)，间隔4周再以相同剂量、途径加强免疫一次。同时，以pCAGGS为对照以相同的方法免疫5条RV中和抗体阴性比格犬，间隔4周再以相同剂量、途径加强免疫一次。分别于初次免疫前、后不同时间点经前肢静脉采集血液、分离血清，用于中和抗体检测。

RV中和抗体的检测基本参照文献^[14]在96孔板上进行。首先将采集的血清样品置于56℃水浴30min进行灭活，再分别以不完全DMEM(Gibson)9倍稀释，后连续3倍稀释，每稀释度体积为50μL，与50μL约含100TCID₅₀的标准固定毒株CVS11病毒液混合，37℃感作1h后，每孔加入约10⁵个BHK细胞，同时设阳性、阴性及细胞对照(阳性对照为国际标准血清，起始血清稀释滴度为0.5IU/mL)，血清每个稀释度做4个平行孔，5％CO₂37℃培养48h后进行IFA检测，后置于荧光显微镜下观察，并计算血清RV中和抗体滴度。

初次免疫后4周，pCAGG-RVG免疫犬血清中就能检测到RV中和抗体，而在pCAGGS免疫犬血清中检测不到RV中和抗体。初次免疫后4周，pCAGG-RVG免疫犬血清中RV中和抗体平均滴度上升到3.23IU/mL(7.9，0.38，1.14，5.92，2.6，0.29和4.5)，加强免疫后2周，免疫犬血清中RV中和抗体平均滴度上升到峰值8.21IU/mL(13.50，7.79，13.5，4.5，5.92，7.79和4.5)，随后RV中和抗体水平逐渐下降。初次免疫后27周，免疫犬血清中RV中和抗体平均滴度下降到3.99IU/mL(7.79，3.24，2.6，2.6，2.6，0.87和1.14)，然而初次免疫后第54周，免疫犬血清中RV中和抗体平均滴度仍然可达2.88IU/mL(7.79，2.6，2.6，2.6，2.6，0.87和1.14)。这些结果表明，pCAGG-RVG是一个具有良好免疫效力的犬狂犬病候选DNA疫苗(图3)。

讨论

本研究构建了表达哺乳动物密码子优化的RV囊膜糖蛋白G基因的重组真核表达质粒pCAGG-RVG。间接免疫荧光试验和蛋白质印迹结果表明，RVG蛋白在重组真核表达质粒pCAGG-RVG转染的BHK细胞中获得表达，且具有良好的反应原性。应用该重组真核表达质粒作为DNA疫苗免疫比格犬，可诱导显著而持久的RV中和抗体反应。

免疫动物血清中RV中和抗体水平是评价狂犬病疫苗免疫效力的一个重要指标。Osorio等研究结果显示，以1个剂量(100μg/条)表达RV CVS株G蛋白的DNA疫苗经肌肉注射途径免疫犬，仅能诱导低水平的RV中和抗体反应；然而将免疫剂量提高到300μg/条时，可增强RV中和抗体反应^[15]。这些研究结果提示，狂犬病DNA疫苗免疫犬可诱导剂量依赖性的RV中和抗体反应；增加免疫剂量可能会获得更高水平的RV中和抗体反应。我们的研究结果也证实这一推测，以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG按500μg/只的剂量免疫犬，可诱导显著的RV中和抗体，初次免疫后4周免疫犬血清中RV中和抗体滴度平均值可达3.23IU/mL。

另外，Perrin等研究发现：以1个剂量(100μg/只)的表达RV PV株G蛋白的DNA疫苗经肌肉注射途径免疫犬，仅能诱导低水平的RV中和抗体反应，但间隔一定时间进行加强免疫可增强RV中和抗体反应^[16]。这与本研究结果一致，我们以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG按500μg/只的剂量免疫犬，可诱导显著的RV中和抗体反应，初次免疫后4周免疫犬血清中RV中和抗体滴度平均值可达3.23IU/mL；间隔4周以相同剂量、途径进行加强免疫，可显著增强RV中和抗体反应，加强免疫后2周免疫犬血清中RV中和抗体滴度平均值高达8.21IU/mL。

尽管，本研究以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG免疫犬血清中RV中和抗体滴度峰值平均值(8.21IU/mL)远远低于我们以前的研究中分别以RVERA疫苗株(106FFU/只)、表达RV G蛋白基因的重组新城疫病毒rLa-RVG(109.3EID50/只)和表达RV G蛋白基因的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG(106TCID50/只)诱导的RV中和抗体滴度峰值平均值(分别为70.4IU/mL、96IU/mL和96.71IU/mL)^[17，18]，然而狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG免疫犬血清中RV中和抗体滴度下降地更为缓慢，初次免疫后54周免疫犬血清中RV中和抗体滴度平均值仍可达2.88IU/mL，而0.5IU/mL的RV中和抗体滴度是能保护动物免受致死剂量RV街毒株攻击的最小滴度^{[11，17，18]}。这一结果提示：pCAGG-RVG的免疫接种能为犬提供1年以上的有效保护。因此，狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG是一个有希望的狂犬病候选疫苗。

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Claims

2.根据权利要求1所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述按哺乳动物密码子偏嗜性优化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因具有如SEG ID No.1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重组真核表达质粒具有如SEG ID No.2所示的序列。