CN101289658A

CN101289658A - 表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子

Info

Publication number: CN101289658A
Application number: CNA2008100246449A
Authority: CN
Inventors: 何孔旺; 潘群兴; 温立斌; 张雪寒; 倪艳秀; 俞正玉; 郭容利; 吕立新; 茅爱华; 肖琦; 黄克和
Original assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Current assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2008-10-22

Abstract

本发明涉及表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子的构建及应用，属于基因工程疫苗领域。将猪细小病毒(PPV)VP2基因的C端基因片段克隆于人5型腺病毒穿梭载体，获得重组腺病毒rAd－ΔVP2，ΔVP2蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子[PPV:VLPs]。以PPV VP2病毒样粒子作为抗原转运载体，将2型猪圆环病毒(PCV2)核衣壳蛋白(Cap)的165－200位氨基酸(ΔCap)基因嵌合在PPV VP2的N端(ΔVP2)，获得重组腺病毒rAd－ΔCap－ΔVP2。嵌合的VP2(ΔCap－ΔVP2)蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]。本发明还涉及该重组病毒及其表达Cap基因的重组PPV VP2病毒样粒子在疫苗免疫等方面的应用。

Description

表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子

一、技术领域

本发明涉及在腺病毒表达系统中表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子的构建及应用，属于基因工程疫苗领域。

二、背景技术

PPV(Porcine Parvovirus)不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，而且能够引起多种猪病。VP2是病毒粒子主要成分，约占80％，细小病毒的外壳蛋白在自然状态下可自主装配。VP2具有良好的免疫原性，众多的科学家利用VP2的良好免疫特性构建重组疫苗来预防本病，取得了很好的效果，同时还是具有血凝活性的物质。Martinez等将PPV VP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达，表达的VP2多肽能自我装配成病毒样粒子(Virus-Like Particles，VLPs)，用其免疫母猪能诱导产生免疫应答。尽管未见有关该种疫苗进一步研究和应用的报导，但是VP2基因在体外表达的蛋白能自我包装成病毒样粒子的特性，为重组多价亚单位疫苗的研究打下了基础。Sedlik等将PPV VP2和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原决定簇区相连，然后克隆于杆状病毒表达载体PACYM，转染表达PPV:VP2-LCMV蛋白。利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的CTL反应，在体内持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的LCMV攻击。之后，Sedlik又将LCMV的CD8+T细胞抗原决定簇多肤共价结合于1μm的脂质微球上，与上述表达的PPV:VP2-LCMV蛋白一起进行了免疫小鼠的比较，结果发现二者都能诱导产生很强的CD8+T细胞反应。但是PPV:VP2-LCMV携带的抗原量比脂质体微球少100倍时，诱导的CTL活性仍比脂质体微球诱导的CTL活性高6倍，并且只有PPV:VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻击。Richard等用PPV VP2共价结合乙肝病毒HBSAg的抗原决定簇区多肽，然后免疫小鼠诱导产生了很强的针对插人的HBSAg决定簇的T细胞反应，并能抵抗乙肝病毒的致死性攻击。这些结果均说明PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原的转运载体具有很大的潜在价值，并为进行多价重组疫苗的研究创造了良好的条件。

猪圆环病毒2型(PCV2)与多种猪病相关，主要引起仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍、猪呼吸综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、也可能引起渗出性皮炎、仔猪先天性震颤等。尤其PMWS，自1991年加拿大首次报道以来，现已证实呈世界性流行，我国的一些猪场也普遍存在本病。大量报道证明易感猪单独感染PCV2后会出现典型的病理变化，但不表现或只出现轻微的临床征状，但在感染其他病原如PPV、PRRSV、各种致病菌等、饲养条件改变或外界刺激条件下表现临床征状。PCV2与PPV和PRRSV混合感染引起的PMWS很难治愈，国外研究表明在实验条件下PCV2与这两种病毒混合感染可以复制出典型的PMWS，但单独感染这三种病毒不表现临床征状，因此有人认为PCV2与其他病原可能有协同作用，但其机理还不清楚。猪一旦感染圆环病毒病，无有效治疗的药物，因此研究安全、有效的疫苗是预防本病的主要途径。已有研究表明PCV2 Cap蛋白成为疫苗研究的候选基因，PCV2抗原决定簇主要集中在Cap蛋白第47～85，165～200及C端最后4个氨基酸。

三、发明内容

技术问题

本发明目的在于1)利用腺病毒表达系统构建表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子的方法，及以该重组PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体进行多价重组疫苗的研制；2)构建了在腺病毒表达系统中表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子及其在疫苗免疫上的应用。

技术方案

1)获取ΔCap-ΔVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体

以GenBank中PCV2-js2002基因登录号为AY691679和PPV VP2重组质粒的基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物：P3，P4，P5，P6和P7，分别加入酶切位点：

P3 5′-ctggtaccatggtccaccgcccaggag-3′ KpnI

P4 5′-cagctagccgttaccgctggagaagg-3′ NheI

P5 5′-gagctagcgggggggttggtgtgt-3′ NheI

P6 5′-cggctgcagctagtataattttcttgg-3′ PstI

P7 5′-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3′ NotI

以P3，P4引物扩增PCV2 Cap蛋白的165-200位氨基酸的抗原决定簇区多肽基因108 bp的片段ΔCap，以P5，P6引物扩增PPV VP2蛋白C端1640 bp的片段ΔVP2，扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化E.coli DH₅α，碱裂解法提取质粒，分别用KpnI/NheI和NheI/PstI双酶切鉴定，获得阳性质粒pTΔCap和pTΔVP2。

利用引物上的内切酶NheI和pMD19-T Vector上的PstI将阳性质粒pTΔCap双酶切，回收2.8Kb的片段，同时利用引物上的内切酶NheI和PstI将阳性质粒pTΔVP2双酶切，回收1.64Kb的小片段，然后将回收的两片段用T4 DNA Ligase连接，转化E.coli DH₅α，碱裂解法提取质粒，KpnI/PstI双酶切鉴定，阳性质粒命名为pTΔCap-ΔVP2。

2)重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2的构建与鉴定

以P3，P7为引物，阳性质粒pTΔCap-ΔVP2为模板，PCR扩增ΔCap-ΔVP2片段，并引入内切酶Kpn I/NotI，按照pAdEasy^TM载体系统操作说明，利用双酶切位点KpnI/NotI将外源片段ΔCap-ΔVP2克隆至转移载体pShuttle-CMV中；用PCR、KpnI/NotI双酶切及测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-ΔCap-Δ VP2；

3)表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子的获得

用Pme I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与骨架载体pAdEasy^TMVector在1.8kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使rShuttle-ΔCap-ΔVP2与pAdEasy^TMVector发生同源重组，转化至DH₅α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-ΔCap-ΔVP2；

将重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2转染HEK-293A细胞，获得重组病毒rAd-ΔCap-ΔVP2；重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2表达ΔCap-ΔVP2嵌合蛋白在该重组腺病毒感染的293A细胞中自我装配成病毒样粒子PPV:VLP(PCV2)，即为获得的表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子。上述表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子在制备疫苗方面的应用可以获得一种蛋白质载体多价重组疫苗。

有益效果本发明的特点和优点如下：

1、本发明应用的腺病毒表达系统是缺失了E1和E3基因的人腺病毒血清5型(Ad5)，具有无致病性、复制效率高、克隆空间大(可容纳7.5Kb的外源片段)、能在大多数哺乳动物细胞和组织中表达重组蛋白、在同种细胞和组织中可同时表达多个基因等特点，可对外源基因进行正确的翻译和修饰，使表达的蛋白具有与天然蛋白相同的生物活性。使用该系统构建的重组病毒用于猪体，还可以避免由于猪体自身产生的腺病毒抗体影响免疫效果。

2、利用腺病毒表达系统构建表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子：将PPV VP2 C端基因片段ΔVP克隆到腺病毒表达系统中，转染HEK-293 A细胞，RT-PCR、间接免疫荧光及Western-blotting实验结果表明，ΔVP2蛋白在HEK-293 A细胞中高效表达；表达产物的粗提物用3％的磷钨酸负染后经透射电镜观察，在电镜下可以看到大量病毒样颗粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形态大小均与全病毒粒子相似。

3、利用腺病毒表达系统构建了表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子，以PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体，为重组多价亚单位疫苗的研制打下了基础。

4、本发明以PPV VP2病毒样粒子作为PCV2抗原的转运载体：将PCV2核衣壳蛋白(Cap)的165-200位氨基酸(ΔCap)基因嵌合在PPV VP2的N端(ΔVP2)，然后克隆到腺病毒表达系统中，转染HEK-293A细胞，RT-PCR、间接免疫荧光及Western-blotting实验结果表明，ΔVP2蛋白在HEK-293 A细胞中高效表达；表达产物的粗提物用3％的磷钨酸负染后经透射电镜观察，在电镜下可以看到大量病毒样颗粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形态大小均与全病毒粒子相似。

5、本发明构建的重组腺病毒表达的嵌合病毒样粒子，免疫小鼠实验结果显示：在首免后第14天实验组能检测到PCV2特异性抗体，抗体的滴度随着时间的延长而增高，在二免后35天时杭体水平达最高为1∶10000；二免后35天，实验组PPV中和抗体滴度为20，PCV2中和抗体滴度位16；二免后28至42天实验组和对照组Con A/LPS刺激指数差异极显著。说明重组的嵌合病毒样粒子具有良好的PPVVP2和PCV2 Cap的免疫原性，免疫动物后可诱导产生保护性免疫反应。

6、本发明构建的重组腺病毒表达的嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]作为一种蛋白质载体多价重组疫苗不但安全性高、价廉，而且可以有效的预防PCV2感染及由PCV2与PPV混合感染而导致的PMWS的发生，是一种新型的安全有效的候选疫苗。

四、附图说明

图1：PPVΔVP2目的基因扩增片段

图2：重组质粒rShuttle-ΔVP2 Kpn I/Not I双酶切酶切鉴定图谱

图3：重组质粒pAd-ΔVP2 PacI酶切鉴定图谱

图4：重组腺病毒rAd-ΔVP2间接免疫荧光图：重组腺病毒(a)和细胞对照(b)

图5：表达ΔVP2蛋白的免疫转印鉴定

图6：PPVVP2病毒样粒子电镜图

图7：PCV2 ΔCap目的基因扩增片段

图8：重组质粒rShuttle-ΔCap-ΔVP2 Kpn I/Not I双酶切酶切鉴定图谱

图9：重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2 PacI酶切鉴定图谱

图10：重组病毒间接免疫荧光图：猪抗PPV(a)和PCV2(b)血清的对应孔，细胞对照孔(c)

图11：表达嵌合蛋白的免疫转印鉴定：猪抗PPV(1)和PCV2(2)血清，细胞对照孔(3)

图12：嵌合病毒样粒子电镜图

图13：PCV2特异性抗体图

图14：淋巴转化实验图(ConA刺激)

图15：淋巴转化实验图(LPS刺激)

图16：嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]构建示意图

五、具体实施方式

1、表达外源基因的PPV VP2病毒样粒子的构建及应用

1)获取ΔVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体

以GenBank中NADL-2基因登录号为NC：001718基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物：分别加入KpnI和Not I酶切位点。PPV弱毒株(NADL-2)购自中国兽药监察所。

P1 5′-gaggtaccgggggggttggtgtgt-3′

P2 5′-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3′

以P1，P2引物扩增含VP2(1740bp)基因C端1640bp的片段(图1)。扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化E.coli DH₅α，碱裂解法提取质粒，KpnI和Not I双酶切鉴定，获得阳性质粒(pTΔVP2)。

2)重组质粒pAd-ΔVP2的构建与鉴定

利用双酶切位点(KpnI/NotI)将目的片段克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中；用KpnI/NotI双酶切(图2)及测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-ΔVP2；用Pmne I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与腺病毒骨架载体(pAdEasy^TMVector)在1.8kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使rShuttle-ΔVP2与pAdEasy^TMVector发生同源重组，转化至DH₅α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切(图3)鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-ΔVP2。

3)重组病毒的获得

按照脂质体转染试剂操作方法，将预先用PacI线性化的重组质粒pAd-ΔVP2转染HEK-293A细胞，5％CO₂，37℃静置培养10d以上，显微镜观察细胞病变，当细胞病变达70％时，收毒。经3次噬斑纯化实验，获得重组病毒(rAd-ΔVP2)的滴度为10^11.2TCID₅₀/mL。

4)病毒样粒子的生物学特征研究

①间接免疫荧光

将重组腺病毒稀释后接种于长满单层的HEK-293A细胞，5％CO₂、37℃培养，约24h，弃去上清，用PBS洗涤一次，37℃干燥45min，-20℃冷冻45min，再以冷的无水乙醇4℃固定45min，PBST洗涤3次；加入50μL 1∶40稀释的猪抗PPV的血清，37℃作用1h，用PBST洗涤3次；加入1∶100 FITC-SPA，37℃作用1h，洗涤3次；显微镜观察。重组腺病毒rAd-ΔVP2对应孔(a)中呈现较强的荧光，而细胞对照孔(b)没有荧光出现(图4)，说明重组腺病毒rAd-ΔVP2在细胞中表达了PPV:ΔVP2蛋白。

②蛋白质印记

用8％PEG-6000浓缩重组腺病毒HEK-293A细胞培养物，同时设定正常HEK-293A细胞培养物为对照。将上述浓缩蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印到硝纤膜后，10％脱脂乳封闭过夜；加入1∶40猪抗PPV的血清室温作用2h；洗涤3次，加入1∶20000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG，室温作用1.5h；充分洗涤后，加入化学发光法显色液(DAB)，观察特异蛋白条带。浓缩的重组腺病毒经电泳转印显色后显示，在66KD处均有一条明显的条带，而对照正常的HEK-293A细胞没有(图5)，说明重组腺病毒rAd-ΔVP2在细胞中表达了PPV:ΔVP2蛋白。

③病毒样粒子的粗纯化与电镜观察

收集病变细胞，用PBS洗两次，1000r/min 15min离心，重悬于50mmol/l NaHCO3中，超声波裂解后，24000r/min离心15min，上清液中含有表达的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸铵至终浓度20％，4℃搅拌过夜进行沉淀，然后离20000r/min离心10min，沉淀重悬于中，透析除盐即为嵌合病毒样粒子的粗提物。腺病毒野毒做同样处理后做对照。加入1∶10稀释的猪抗PPV血清37℃作用1h后再4℃过夜，以12000r/min离心90min，沉淀重悬于少量水中，用3％的磷钨酸负染后经透射电镜观察。在电镜下可以看到大量病毒样粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形态大小均与全病毒粒子相似(图6)，说明重组腺病毒rAd-ΔVP2在细胞中表达的PPV:ΔVP2蛋白能自我组装成病毒样粒子。

④红细胞凝集试验

参照《动物病毒学》，使用0.7％豚鼠红细胞的生理盐水悬液。重组腺病毒rAd-ΔVP2血凝效价为1∶64，空的腺病毒野毒没有血凝活性，说明rAd-ΔVP2表达的ΔVP2蛋白保持PPV原有的生物学活性。

2、以PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体，构建表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子(图16)

1)获取ΔCap-ΔVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体

以GenBank中PCV2-js2002基因登录号为AY691679和PPV VP2重组质粒的基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物：P3，P4，P5，P6和P7，分别加入酶切位点，PCV2 js2002由本实验室分离鉴定(公知公用，见参考文献：潘群兴等，检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法，中国病毒学，2005，20(6)603～60)。

P3 5′-ctggtaccatggtccaccgcccaggag-3′ KpnI

P4 5′-cagctagccgttaccgctggagaagg-3′ NheI

P5 5′-gagctagcgggggggttggtgtgt-3′ NheI

P6 5′-cggctgcagctagtataattttcttgg-3′ PstI

P7 5′-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3′ NotI

以P3，P4引物扩增PCV2 Cap蛋白的165-200位氨基酸基因108bp(图7)的片段ΔCap，以P5，P6引物扩增PPV VP2蛋白C端1640bp(图1)的片段ΔVP2，扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化E.coli DH₅α，碱裂解法提取质粒，分别用KpnI/NheI和NheI/PstI双酶切鉴定，获得阳性质粒(pTΔCap，pTΔVP2)。

2)重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2的构建与鉴定

以P3，P7为引物，阳性质粒pTΔCap-ΔVP2为模板，PCR扩增ΔCap-ΔVP2片段，并引入内切酶KpnI/NotI。按照pAdEasy^TMVector载体系统操作说明，利用双酶切位点(KpnI/NotI)将外源片段(ΔCap-ΔVP2)克隆至转移载体pShuttle-CMV中；用PCR、KpnI/NotI双酶切及测序分析进行鉴定(图8)，命名为rShuttle-ΔCap-ΔVP2。

用PmeI酶切该重组质粒，使其线性化，然后与pAdEasy^TMVector在1.8kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使rShuttle-ΔCap-ΔVP2与骨架载体(pAdEasy^TMVector)发生同源重组，转化至DH₅α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确(图9)，构建成重组质粒，命名为pAd-ΔCap-ΔVP2。

3)重组病毒的获得与纯化

按照脂质体转染试剂操作方法，将预先用PacI线性化的重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2转染HEK-293A细胞，5％CO₂，37℃静置培养10d以上，显微镜观察细胞病变，当细胞病变达70％时，收毒。经3次噬斑纯化实验，获得重组病毒(rAd-ΔVP2)的滴度为10^11.8TCID₅₀/mL。

4)嵌合病毒样粒子的生物学特征研究

①间接免疫荧光

将重组腺病毒稀释后接种于长满单层的HEK-293A细胞，5％CO2、37℃培养，约24h，弃去上清，用PBS洗涤一次，37℃干燥45min，-20℃冷冻45min，再以冷的无水乙醇4℃固定45min，PBST洗涤3次；分别加入50μL1∶40稀释的猪抗PCV2血清(a)和猪抗PPV的血清(b)，37℃作用1h，用PBST洗涤3次；加入1∶100 FITC-SPA，37℃作用1h，洗涤3次；显微镜观察。重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2呈现较强的荧光，而细胞对照孔(c)没有荧光出现(图10)。说明重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2在细胞中表达了PPV:ΔVP2和PCV2:ΔCap蛋白。

②蛋白质印记

用8％PEG-6000浓缩重组腺病毒HEK-293A细胞培养物，同时设定正常HEK-293A细胞培养物为对照。将上述浓缩蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印到硝纤膜后，10％脱脂乳封闭过夜；加入1∶40猪抗PCV2血清和猪抗PPV的血清室温作用2h；洗涤3次，加入1∶20000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG，室温作用1.5h；洗涤4次，加入化学发光法显色液(DAB)，观察特异蛋白条带。浓缩的重组腺病毒经电泳转印显色后显示，一抗为猪抗PPV血清或猪抗PCV2血清时，在66KD处均有一条明显的条带，而对照正常的HEK-293A细胞没有(图11)，说明重组腺病毒在细胞中表达了ΔCap-ΔVP2蛋白。

③嵌合病毒样粒子的粗纯化与电镜观察

收集病变细胞，用PBS洗两次，1000r/min离心15min，重悬于50mmol/l NaHCO3中，超声波裂解后，24000r/min离心15min，上清液中含有表达的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸铵至终浓度20％，4℃搅拌过夜进行沉淀，然后离20000r/min离心10min，沉淀重悬于中，透析除盐即为嵌合病毒样粒子的粗提物。腺病毒野毒做同样处理后做对照。加入1∶10稀释的猪抗PPV血清37℃作用1h后再4℃过夜，以12000r/min离心90min，沉淀重悬于少量水中，用3％的磷钨酸负染后经透射电镜观察。在电镜下可以看到大量病毒样粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形态大小均与全病毒粒子相似(图12)，说明重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2在细胞中表达的ΔCap-ΔVP2蛋白能自我组装成病毒样粒子。

④红细胞凝集试验

参照《动物病毒学》，使用0.7％豚鼠红细胞的生理盐水悬液。重组腺病rAd-ΔCap-ΔVP2血凝效价为1∶64，空的腺病毒野毒没有血凝活性，说明rAd-ΔCap-ΔVP2表达ΔCap-ΔVP2蛋白保持PPV原有的生物学活性。

5)小鼠免疫实验

①免疫程序

6-8周龄的雄性小鼠60只，随机分为2组，每组30只。第一组背部皮下多点注射10¹⁰TCID₅₀重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2；第二组每只小鼠皮下注射10¹⁰TCID₅₀重组腺病毒rAd-Cap；第三组每只小鼠皮下注射10¹⁰TCID₅₀没有外源基因的空的腺病毒作为阴性对照；第四组每只小鼠皮下注射适量的PBS作对照；两周后进行相同的免疫。分别在首免、首免后14，28，35，42，49和56天，采集血清测定PCV2抗体及PPV/PCV中和抗体。首免后28，42和56天，每组宰杀3只小鼠，取其脾脏，分离淋巴细胞，测定淋巴增殖能力。

②ELISA抗体的检测

PCV2 ORF2原核表达产物(本实验室制备)经His-band纯化试剂盒纯化，测定蛋白的平均浓度为1.10mg/mL。由ELISA方阵试验可以得出，当抗原包被浓度为1.8μg/mL，抗体稀释100倍，一抗37℃分别孵育1.5h，酶标二抗37℃孵育45min，加TMB-H₂O₂(四甲基联苯胺-过氧化氢)溶液显色，37℃反应10-15min。加2M H₂SO4溶液，终止反应，50μL/孔。反应条件比较合适，此时P/N值较大，且阴性血清的OD值较小，即非特异性比较小。结果判定：P^x-N^x＞0.15时实验有效。(样品OD值-N^x)/(P^x-N^x)≥0.45阳性；(样品OD值-N^x)/(P^x-N^x)＜0.45阴性。其中P^x表示：阳性对照平均值；N^x表示：阴性对照平均值。

间接ELISA抗体检测结果：rAd-ΔCap-ΔVP2免疫组小鼠在首免后第14天能检测到PCV2特异性抗体，抗体的滴度随着时间的延长而增高，在二免后35天时ELISA杭体水平达最高为1∶10000，明显高于rAd-Cap免疫组；而空的腺病毒和PBS免疫组小鼠没有产生PCV2特异性抗体(图13)，说明表达嵌合病毒样粒子的重组腺病毒具有良好的免疫原性，免疫动物后可诱导产生特异性免疫保护反应。

③中和抗体的检测

用IFA检测PCV2的中和抗体。具体方法如下：小鼠血清56℃灭活30min，12000r/min离心10min，取上清，用含2％FCS的1640培养基按1∶4，1∶8，1∶16，1∶32和1∶64倍比稀释：病毒PCV2被稀释为2000 TCID5₀/mL；上述血清和病毒的稀释液各取50μL，混合均匀，37℃水浴1h；取出后加入已长满细胞单层的PK-15细胞，每孔100μL，每个血清稀释度接种四孔，同时设定只接种病毒PCV2的阳性对照孔和正常细胞阴性对照孔，37℃静置培养72h。按常规方法进行IFA实验，以减少70％或更多荧光的血清最高稀释度的倒数为中和抗体滴度。在IFA中，所有阳性对照细胞均出现明显的荧光，阴性对照无荧光，而加入免疫小鼠血清的孔没有或仅有微弱的荧光。同一组在不同时间中和抗体滴度不同，首免后14天所有小鼠中和抗体滴度均＜4，到二免后35天rAd-ΔCap-ΔVP2免疫组的中和抗体平均滴度为16，高于rAd-Cap免疫组(12)；空的腺病毒和PBS免疫组中和抗体滴度几乎为0。

用TCID₅₀降低试验测定PPV的中和抗体。具体方法如下：小鼠血清56℃灭活30min，12000r/min离心10min，取上清，用含2％FCS的1640培养基按1∶4，1∶8，1∶16，1∶32和1∶64倍比稀释；病毒PPV被稀释为2000 TCID₅₀/mL；上述不同稀释度的血清和病毒的稀释液等体积混合，37℃水浴1h；取出接种40～50％融合的PK-15细胞，每孔100μL，每个血清稀释度接种4孔，同时设定只接种病毒的PK-15阳性对照孔和正常细胞阴性对照孔。37℃静置培养4-5天；显微镜观察。能100％抑制病变的血清最高稀释度的倒数为中和抗体滴度。所有阳性对照细胞均出现明显的细胞病变，阴性对照细胞均没有出现细胞病变rAd-ΔCap-ΔVP2免疫组PPV中和抗体滴度为20，rAd-Cap免疫组，空的腺病毒组和PBS对照组中和抗体滴度几乎为0。

④淋巴细胞转化试验

宰杀小鼠，无菌取其脾脏，剥离结缔组织，置于无菌平皿中：加入少量的无菌PBS，用针头刺脾脏，然后用弯针头挤压，挤出其中的细胞；用弯针头研磨均匀，弃去多余的结缔组织和大的组织块；在10mL的离心管中加入6mL的淋巴细胞分离液，再轻轻地加入研磨地组织匀浆液；2000r/min离心15min：取中间云雾状的白色细胞层，置于新的离心管中，加入适量的Hank′液；2000r/min离心10min；弃上清，加入适量的含10％FCS的1640营养液重悬细胞，然后进行细胞计数；根据计数结果将细胞浓度调整为5×10⁶/mL，加入96孔细胞板中，每孔100μL细胞悬液，每只小鼠铺12孔；其中4孔加入终浓度为20μg/μL的ConA，另4孔加入终浓度为15μg/μL的LPS，其余4孔作为阴性对照；37℃，5％C0₂静置培养44h；每孔加入20μL MTT(浓度5mg/mL)，培养4h；弃去上清，每孔加入100μL DMSO，使结晶溶解，振荡；测定OD₅₇₀nm，计算ConA刺激孔地平均OD₅₇₀nm/未刺激孔的平均OD₅₇₀nm(SI值)。用t检验法检验免疫组和对照组的SI值差异是否显著。二免后14天，四组的刺激指数(SI)接近，从第二次免疫后28天到42天rAd-ΔCap-ΔVP2免疫组的SI值迅速升高，而Wild Ad和对照组的SI值变化不大，经t检验分析二免后28至42天免疫组和对照组的SI值差异极显著((P＜0.01)，说明重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2能增强小鼠细胞免疫(图14)。

本发明构建的重组腺病毒表达的嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]，具有良好的免疫原性，免疫动物后可诱导产生保护性免疫反应。嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]作为一种蛋白质载体多价重组疫苗不但安全性高、价廉，而且可以有效的预防PCV2感染及由PCV2与PPV混合感染而导致的PMWS的发生，是一种新型的安全有效的候选疫苗。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子

<130>说明书

<140>00

<141>2008-03-25

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P1

<222>(1)..(24)

<223>

<400>1

gaggtaccgg gggggttggt gtgt 24

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P2

<222>(1)..(29)

<223><400>2

cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P3

<222>(1)..(27)

<223>

<400>3

ctggtaccat ggtccaccgc ccaggag 27

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P4

<222>(1)..(26)

<223><400>4

cagctagccg ttaccgctgg agaagg 26

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P5

<222>(1)..(24)

<223>

<400>5

gagctagcgg gggggttggt gtgt 24

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P6

<222>(1)..(27)

<223>

<400>6

cggctgcagc tagtataatt ttcttgg 27

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P7

<222>(1)..(29)

<223>

<400>7

cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29

Claims

1、表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子，其特征在于，是由以下方法构建而成：

1)获取ΔCap-ΔVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体

以GenBank中PCV2-js2002基因登录号为AY691679和猪细小病毒PPV VP2重组质粒的基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物：P3，P4，P5，P6和P7，分别加入酶切位点：

P35′-ctggtaccatggtccaccgcccaggag-3′KpnI

P45′-cagctagccgttaccgctggagaagg-3′NheI

P55′-gagctagcgggggggttggtgtgt-3′NheI

P65′-cggctgcagctagtataattttcttgg-3′PstI

P75′-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3′NotI

以P3，P4引物扩增PCV2Cap蛋白的165-200位氨基酸基因108bp的片段ΔCap，以P5，P6引物扩增PPV VP2蛋白C端1640bp的片段ΔVP2，扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化E.coli DH₅α，碱裂解法提取质粒，分别用KpnI/NheI和NheI/PstI双酶切鉴定，获得阳性质粒pTΔCap和pTΔVP2。

利用引物上的内切酶NheI和pMD19-TVector上的PstI将阳性质粒pTΔCap双酶切，回收2.8Kb的片段，同时利用引物上的内切酶NheI和PstI将阳性质粒pTΔVP2双酶切，回收1.64Kb的小片段，然后将回收的两片段用T4DNA Ligase连接，转化E.coli DH₅α，碱裂解法提取质粒，KpnI/PstI双酶切鉴定，阳性质粒命名为pTΔCap-ΔVP2。

2)重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2的构建与鉴定

以P3，P7为引物，阳性质粒pTΔCap-ΔVP2为模板，PCR扩增ΔCap-ΔVP2片段，并引入内切酶Kpn I/NotI，按照pAdEasy^TM载体系统操作说明，利用双酶切位点KpnI/NotI将外源片段ΔCap-ΔVP2克隆至转移载体pShuttle-CMV中；用PCR、KpnI/NotI双酶切及测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-ΔCap-ΔVP2；

用Pme I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与骨架载体pAdEasy^TMVector在1.8kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使rShuttle-ΔCap-ΔVP2与pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH₅α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-ΔCap-ΔVP2。

将重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2转染转染HEK-293A细胞，获得重组病毒rAd-ΔCap-ΔVP2；重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2表达ΔCap-ΔVP2嵌合蛋白在该重组腺病毒感染的293A细胞中自我装配成病毒样粒子PPV:VLP(PCV2)，即为获得的表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子。

2、权利要求1所述表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子在制备疫苗方面的应用。