CN101955917A - 含有猪细小病毒vp2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程疫苗领域，提供一种含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，由如下方法制备而得：获取目的基因，构建及鉴定重组转移载体pFast-SS4-VP2，构建及鉴定重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2，获得稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2，将病毒rBac-SS4-VP2感染sf-9昆虫细胞，获得目的产物。本发明所述病毒样颗粒在制备预防猪感染细小病毒、提高猪生长速度的疫苗的应用。本发明的病毒样颗粒既能预防猪感染细小病毒又能提高猪生长速度；本发明同时提供该病毒样颗粒在制备预防猪感染细小病毒、提高猪生长速度的疫苗中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种重含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，属于基因工程疫苗领域。
背景技术
生长抑素(somatostatin，SS)是一种脑肠肽，广泛分布于中枢神经系统和胃肠道组织中，是一种能够抑制生长激素(GH)释放的低分子碱性肽。Brazeau等从羊下丘脑中分离出了SS，此后人们对SS的产生、分布及生物活性做了大量研究，并测定了它的一级结构为一含14个氨基酸的多肽。哺乳动物下丘脑分泌生长激素释放因子(GHRF)和生长抑素(SS)，调节垂体生长激素(GH)的分泌，进而作用于靶器官，如肝脏，产生胰岛素样生长因子(IGFs)，从而调节组织器官的生长发育。由于GHRF刺激生长激素的释放，SS抑制GH分泌细胞的分泌，因此，在理论上，刺激GHRF或抑制SS的分泌或释放，或者同时对GHRF释放进行刺激而对SS的释放进行抑制的技术路线，就有可能提高垂体GH分泌细胞的释放，最终达到促进动物生长的目的。
猪细小病毒(PPV)基因组编码3种结构蛋白，分别是VP1、VP2、VP3。其中VP2是构成病毒粒子的主要衣壳蛋白，具有血凝活性，约占病毒衣壳蛋白总量的80％，VP2蛋白携带主要的抗原决定簇，可诱导机体产生保护性中和抗体，VP2对病毒感染、发挥其致病性方面亦起关键作用。VP2蛋白在体外表达时可自主装配，能自动形成完整的病毒样颗粒，具有良好的免疫原性，成为病毒疫苗研究的主要方向。病毒样颗粒(virus-like particles VLPs)是某种病毒的一个或多个结构蛋白装配成的空心颗粒，它既具有类似天然病毒的稳定性和免疫原性，又具备携带外源蛋白或多肽的潜能，不含有病毒的核酸没有感染性，使其有望成为构建多价疫苗的良好载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，既能预防猪感染细小病毒又能提高猪生长速度；本发明同时提供该病毒样颗粒在制备预防猪感染细小病毒、提高猪生长速度的疫苗中的应用。
本发明提供含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，由如下方法制备而得：
(1)获取目的基因：采用正向引物P1和反向引物P2扩增猪细小病毒VP2基因，采用人工合成方法获得两端分别添加了酶切位点的4拷贝的生长抑素的基因序列，所述4拷贝的生长抑素的基因序列为SS4；
所述正向引物P1的序列为：
5’-cgggatccagccggctgcaagaacttcttctggaagaccttcacctcctgcactgaattgtctgca-3’，
所述反向引物P2的序列为：
5’-cgcctcgagctagtataattttcttggtat-3’；
(2)构建及鉴定重组转移载体pFast-SS4-VP2；
(3)构建及鉴定重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2；
(4)获得稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2；
(5)将所述的病毒rBac-SS4-VP2感染sf-9昆虫细胞，获得含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒。
所述4拷贝生长抑素的基因序列5’端添加BamH I酶切位点、3’端添加Bg lII酶切位点。
步骤(2)所述重组转移载体pFast-SS4-VP2构建及鉴定方法如下：将VP2基因克隆至转移载体pFastBac HT A中，经酶切，测序，鉴定阳性质粒命名为pFast-VP2；该质粒pFast-VP2经酶切、去磷酸化后与SS4连接，再经酶切，测序，鉴定为阳性的质粒为重组转移载体pFast-SS4-VP2。
步骤(3)重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2的构建与鉴定方法为：将重组载体pFast-SS4-VP2转化进含穿梭质粒Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，经蓝白菌落筛选和PCR鉴定为阳性的质粒即为重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2；所述PCR鉴定中采用杆状病毒通用引物，上游引物为GTTTTCCCAGTCACGAC，下游引物为CAGGAAACAGCTATGAC。
步骤(4)获得稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2的方法为：重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2转染sf-9昆虫细胞，进行重组杆状病毒的扩增，提取扩增后的重组杆状病毒的基因组DNA，经PCR鉴定为阳性者即为稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2；所述PCR鉴定中的引物为引物P1和P2。
步骤(5)中将所述病毒rBac-SS4-VP2接种sf-9昆虫细胞，收集病变的sf-9昆虫细胞，将该病变细胞破碎后进行离心，获得上清液，采用硫酸铵沉淀法进行蛋白沉淀；将所述蛋白沉淀悬浮于缓冲液中，灭活病毒rBacmid-SS4-VP2后除盐，超滤，得到猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒。
本发明还提供含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒在制备预防猪感染细小病毒、提高猪生长速度的疫苗的应用。
本发明含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，既能预防猪感染细小病毒又能提高猪生长速度；以该病毒样颗粒作为抗原、以白油或铝胶作为佐剂的疫苗免疫清洁级小鼠，加强免疫后2周可以检测到较高的猪细小病毒抗体，加强免疫后4周时抗体升至最高；免疫后血清中生长激素和胰岛素样细胞因子的含量明显升高，即表达的嵌合蛋白发挥了促进机体生长的作用。本发明的病毒样颗粒能够安全有效的预防猪细小病毒、提高猪生长速度。
四 附图说明
图1是重组质粒pFast-SS4-VP2的BamH I和Xho I酶切后的电泳图，图中：M-Marker DL2000，1-酶切后重组质粒pFast-SS4-VP2。
图2是rBacmid-SS4-VP2的PCR鉴定的电泳图，图中：M-Marker DL15000，1-rBacmid-pFast；2-rBacmid-SS4-VP2。
图3是rBac-SS4-VP2基因组的PCR鉴定的电泳图，图中：1-rBac-SS4-VP2基因组，M-Marker DL2000
图4是不同感染复数条件下获得重组蛋白SS4-VP2的SDS-PAGE电泳图，图中：
1-空载体Bacmid，2-感染复数0.01，3-感染复数0.05，4-感染复数0.1，5-感染复数0.5，M-蛋白分子量标准。
图5是嵌合蛋白SS4-VP2的Western-blotting电泳图，图中：1-0.2MOI感染Sf9细胞获得蛋白、2-0.5MOI感染Sf-9细胞获得蛋白，3-野毒感染Sf9细胞获得蛋白，M-蛋白分子量标准。
图6中的A图是rBacmid-SS4-VP2感染sf-9细胞的间接免疫荧光(IFA)检测图，B图是空载体Bacmid感染sf-9细胞的IFA检测图，C图是正常sf-9细胞的IFA检测图。
图7中的A图是rBacmid-SS4-VP2感染sf-9细胞后的电镜观察图，B图是空载体Bacmid感染sf-9细胞后的电镜观察图。
图8表示不同免疫时期各试验组的血清PPV抗体水平。
图9表示不同免疫时期各试验组的血清生长抑素抗体水平。
图10表示不同时期各试验组的血清GH水平。
五 具体实施方式
实施例1 含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒的制备
1)目的基因的获得
参照GenBank公布的PPV NJ-1株的vp2基因(登录号：AY781130)，用Primer Premier 5.0生物软件设计出两条引物，用于扩增VP2全基因。
正向引物P1为：
5’-cgggatccagccggctgcaagaacttcttctggaagaccttcacctcctgcactgaattgtctgca-3’
反向引物P2为：
5’-cgcctcgagctagtataattttcttggtat-3’
分别加入BamHI和XhoI酶切位点，以PPV NJ-1株的DNA为模板，以P1，P2为引物扩增VP2全基因序列，在1％琼脂糖凝胶电泳回收，连入pMD18-T载体，转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α，碱裂解法提取质粒，酶切及测序鉴定正确，获得阳性质粒pMD18T-VP2。
4拷贝的生长抑素(SS)基因序列SS4为：AAAAAGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTCTTGT。在SS4的5’端添加BamH I酶切位点、3’端添加Bg l II酶切位点，然后采用人工合成方法制备。
2)重组转移载体pFast-SS4-VP2构建及鉴定
分别用BamH I和Xho I双酶切质粒pMD18T-VP2和转移载体pFastBac HT A，将VP2片段和转移载体pFastBac HT A纯化后，用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，碱裂解法提取质粒，BamH I和Xho I双酶切及测序鉴定，将阳性质粒命名为pFast-VP2。将4拷贝的生长抑素(SS)基因用BamH I和Bg l II酶切，将pFast-VP2用BamH I单酶切，去磷酸化后用T4DNA连接酶与4拷贝的生长抑素(SS4)基因连接，转化DH5α感受态细胞，碱裂解法提取质粒，用BamH I和Blg II双酶切，电泳图上出现大小为1900bp左右的片段，则该质粒为阳性质粒，命名为pFast-SS4-VP2，即为重组转移载体pFast-SS4-VP2(见图1中的编号1)。
3)重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2的构建与鉴定
将重组转移载体pFast-SS4-VP2转化进含穿梭质粒Bacmid的100μl DH10Bac感受态细胞，并涂布X-Gal/IPTG的筛选平板(含庆大霉素、卡那霉素及四环素抗性)，37℃温箱倒置避光培养36-48h，至蓝白菌落出现。将X-Gal/IPTG(Kan/Tet/Gen)平板置于4℃冰箱中30min，使菌落充分显色，挑选白色单菌落，接种于含有三抗的LB液体培养基中，培养过夜，涂布X-Gal/IPTG/(Kan/Tet/Gen)平板，如此进行三次蓝白斑筛选，按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书中改良的碱裂解提取重组的Bacmid，用杆状病毒通用引物对所提取的重组Bacmid进行PCR鉴定：
上游引物：GTTTTCCCAGTCACGAC
下游引物：CAGGAAACAGCTATGAC
扩增片段大小为4300bp左右的质粒，即为阳性质粒，命名为rBacmid-SS4-VP2，即为重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2(见图2中的编号2)。
4)获得稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2：
按照LipofectamineTM 2000转染试剂的说明操作，将重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2转染对数生长期的sf-9细胞，27℃静置培养3d以上，收集病变细胞，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿提取扩增后的重组杆状病毒基因组DNA，经VP2特异性引物P1、P2鉴定，扩增片段大小为1900bp左右的为稳定的重组病毒，命名为rBac-SS4-VP2，即为重组杆状病毒rBac-SS4-VP2(见图3中的编号1)；
5)获得含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒：
扩增rBac-SS4-VP2，接种sf-9昆虫细胞，培养后收集病变的sf-9昆虫细胞，超声波裂解后，10000rpm离心15min，收集上清(上清液中含有表达的嵌合蛋白SS4-VP2)，加入pH7.0饱和硫酸铵至终浓度20％，4℃搅拌过夜进行沉淀，然后18000rpm离心10min，将沉淀重悬于PBS中。加Triton X-100至浓缩物体积的1％，Tributyl phosphate(TBP即磷酸三丁酯)至浓缩物体积的0.3％，用于灭活病毒rBacmid-SS4-VP2。室温静止30min后透析除盐，再用超滤管超滤离心，去除杂蛋白，得到嵌合蛋白SS4-VP2，即得到了猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒。
6)嵌合蛋白的病毒样颗粒的鉴定
①重组蛋白SDS-PAGE鉴定及Western-Blot鉴定
用rBacmid-SS4-VP2分别以不同的感染复数(MOI)0.01、0.05、0.1、0.5来感染Sf-9细胞，96h收集病变Sf-9昆虫细胞，用PBS洗涤3次后，加上样缓冲液煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳后，考马斯亮兰染色，结果发现(见图4)，在lane2、lane3、lane4、lane5(分别对应感染复数0.01、0.05、0.1、0.5)中均出现一条大小约为64kD的特异性蛋白质带，与目的蛋白分子量基本一致，而空载体对照Bacmid(lane1)未出现该蛋白质带，几个感染比没有明显的区别，证明含有猪细小病毒VP2和生长抑素的嵌合蛋白(SS4-VP2)获得了表达。
用rBacmid-SS4-VP2以MOI为0.2、0.5感染细胞，制备含有猪细小病毒VP2和生长抑素的嵌合蛋白SS4-VP2，并进行SDS-PAGE电泳，转印到硝酸纤维素膜后，用含10％(质量浓度)脱脂乳的PBST封闭过夜；加入1∶100稀释的猪VP2蛋白阳性血清(武汉科前动物生物制品有限责任公司)室温作用2h；PBST洗涤三次，加入1∶2000倍稀释的羊抗猪IgG-HRP(北京博奥森生物技术有限公司)室温作用2h；洗三次，DAB(二氨基联苯胺)显色，观察特异蛋白条带(图5)。结果表明利用杆状病毒体外表达的SS4-VP2蛋白可与猪VP2蛋白阳性血清发生特异性免疫反应，表达的嵌合蛋白具有生物学活性。
②间接免疫荧光检测
将空载体Bacmid，rBacmid-SS4-VP2分别感染对数期生长的sf-9昆虫细胞，待细胞完全产生病变后，倒掉上清，用75％(体积浓度)的酒精固定40-60min；用含1％(质量浓度)BSA的PBS洗3次，自然风干；加入1∶100稀释的猪细小病毒VP2蛋白豚鼠阳性血清(已与野生杆状病毒蛋白作用过)，37℃湿盒孵育2h；用含1％(质量浓度)BSA的PBS洗3次，自然风干；加入1∶50稀释的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗豚鼠二抗(北京博奥森生物技术有限公司)，37℃作用30min；用含1％BSA(质量浓度)的PBS洗3次，自然风干；荧光显微镜下观察，结果显示对应于rBacmid-SS4-VP2的电镜结果可见很强的绿色荧光(对应图6中的A)，原因是重组蛋白SS4-VP2与猪细小病毒VP2蛋白豚鼠阳性血清特异性反应；而空载体Bacmid(对应图6中的B)荧光很弱，正常sf-9细胞没有荧光(对应图6中的C)。结果表明rBac-SS4-VP2在sf-9细胞中获得了表达。
③电镜观察病毒样颗粒
用rBacmid-SS4-VP2以MOI为0.05感染Sf-9细胞，120h待细胞完全病变后收毒，用PBS洗三次，2000rpm离心沉淀细胞10min，2.5％(体积浓度)戊二醛固定液(0.1mol/mL磷酸缓冲液，pH 7.4，含有2.5％的戊二醛)4℃固定过夜，做超薄切片，电镜观察。结果发现在细胞中有聚集在一起、直径为20～30nm的球形颗粒，该颗粒的形态、大小均与PPV的全病毒粒子相近(图7中的A图)，是由SS4-VP2嵌合蛋白形成的病毒样颗粒(CVLP)。空载体Bacmid感染Sf9细胞的电镜观察，未见到相同的病毒粒子(图7中的B图)。
实施例2 嵌合蛋白的病毒样颗粒的免疫原性评价
(1)免疫程序
选取清洁级小鼠60只，随机分成4组。各试验组抗原、佐剂及免疫方式如下表：
免疫两次，每次间隔2周，免疫后每周小鼠眼球采血，常规分离血清，-20℃保存待用。
(2)猪细小病毒ELISA抗体(即PPV抗体)的检测
使用猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前动物生物制品有限责任公司)检测血清中的抗体。将血清1∶40稀释后加入预包被的微孔板中，每孔加100μL。同样1∶3稀释阴、阳性对照血清(PPV抗体阴性、阳性)，阴、阳性对照各设2孔，每孔100μL。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μL稀释液。37℃温育30min；洗涤3次后，每孔加1∶20000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP 100μL，37℃温育1h；洗涤3次后，每孔加底物A液，B液(是试剂盒中的)各一滴，混匀室温避光显色10min；每孔加终止液一滴，10min内测定OD630。试验结果(见图8)表明，杆状病毒表达的SS4-VP2产生较高的ELISA抗体，铝胶佐剂的效果优于白油佐剂，全病毒灭活疫苗产生的抗体最高。
(3)生长抑素(SS)抗体ELISA检测结果
以生长抑素合成肽(5μg/mL)包被酶联板，100μL/孔，将二免后1周、3周、5周小鼠血清进行1∶100稀释，检测血清中生长抑素抗体水平。结果(见图9)为：免疫重组蛋白SS4-VP2/铝胶组，SS4-VP2/白油组在试验后期产生了特异性抗体，而PPV对照组与PBS组没有特异性抗体产生。SS4-VP2/铝胶组抗体水平最高。说明SS4-VP2抗原具有良好的免疫原性，产生较高水平的生长抑素抗体，其中铝佐剂对抗原的免疫增强作用优于白油佐剂。
(4)生长激素(GH)的检测
采用放射免疫方法(南京军区总医院检测)测定二免后2周、4周小鼠血清中GH水平。结果显示(见图10)，二免后2周时，SS4-VP2/铝胶(第Ⅱ组)、SS4-VP2/白油(第Ⅰ组)试验组血清GH水平明显高于PBS(第Ⅳ组)和PPV灭活苗(第Ⅲ组)试验组；二免4周时，SS4-VP2/铝胶(第Ⅱ组)、SS4-VP2/白油(第Ⅰ组)试验组血清GH水平略有下降，PBS(第Ⅳ组)和PPV灭活苗(第Ⅲ组)试验组略有升高。其中第Ⅱ组(SS4-VP2/铝胶)试验组血清GH水平较高，说明SS4-VP2/铝胶、SS4-VP2/白油试验组产生的抗SS特异性的抗体中和了部分内源性的SS，从而使生长激素的浓度升高，这在一定程度上有利于促进试验动物的生长，达到促生长的目的。
Claims (7)
1.含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，由如下方法制备而得：
(1)获取目的基因：采用正向引物P1和反向引物P2扩增猪细小病毒VP2基因，采用人工合成方法获得两端分别添加了酶切位点的4拷贝的生长抑素的基因序列，所述4拷贝的生长抑素的基因序列为SS4；
所述正向引物P1的序列为：
5’-cgggatccagccggctgcaagaacttcttctggaagaccttcacctcctgcactgaattgtctgca-3’，
所述反向引物P2的序列为：
5’-cgcctcgagctagtataattttcttggtat-3’；
(2)构建及鉴定重组转移载体pFast-SS4-VP2；
(3)构建及鉴定重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2；
(4)获得稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2；
(5)将所述的病毒rBac-SS4-VP2感染sf-9昆虫细胞，获得含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，其特征在于所述4拷贝生长抑素的基因序列5’端添加BamH I酶切位点、3’端添加Bg l II酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述的含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，其特征在于(2)所述重组转移载体pFast-SS4-VP2构建及鉴定方法如下：将VP2基因克隆至转移载体pFastBac HTA中，经酶切，测序，鉴定阳性质粒命名为pFast-VP2；该质粒pFast-VP2经酶切、去磷酸化后与SS4连接，再经酶切，测序，鉴定为阳性的质粒为重组转移载体pFast-SS4-VP2。
4.根据权利要求3所述的含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，其特征在于所述(3)重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2的构建与鉴定方法为：将重组载体pFast-SS4-VP2转化进含穿梭质粒Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，经蓝白菌落筛选和PCR鉴定为阳性的质粒即为重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2；所述PCR鉴定中采用杆状病毒通用引物，上游引物为GTTTTCCCAGTCACGAC，下游引物为CAGGAAACAGCTATGAC。
5.根据权利要求4所述的含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，其特征在于步骤(4)获得稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2的方法为：重组穿梭载体rBacmid-SS4-VP2转染sf-9昆虫细胞，进行重组杆状病毒的扩增，提取扩增后的重组杆状病毒的基因组DNA，经PCR鉴定为阳性者即为稳定的重组杆状病毒rBac-SS4-VP2；所述PCR鉴定中的引物为引物P1和P2。
6.根据权利要求5所述的含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒，其特征在于步骤(5)中将所述病毒rBac-SS4-VP2接种sf-9昆虫细胞，收集病变的sf-9昆虫细胞，将该病变细胞破碎后进行离心，获得上清液，采用硫酸铵沉淀法进行蛋白沉淀；将所述蛋白沉淀悬浮于缓冲液中，灭活病毒rBacmid-SS4-VP2后除盐，超滤，得到猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒。
7.一种权利要求1～6中任一项所述的含有猪细小病毒VP2和生长抑素嵌合蛋白的病毒样颗粒在制备预防猪感染细小病毒、提高猪生长速度的疫苗的应用。
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