CN103145810A

CN103145810A - 一种制备米卡芬净的方法

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Publication number: CN103145810A
Application number: CN2012105583360A
Authority: CN
Inventors: 姚志军; 刘建; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2032-12-20
Also published as: CN103145810B

Abstract

本发明涉及制备米卡芬净的固相-液相全合成方法，所述方法包括以Fmoc-P-CTC树脂为载体，采用固相多肽合成方法从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，再通过裂解、分子内反应、液相缩合，脱除保护基得到米卡芬净。本发明的方法收率高且后处理方便，为米卡芬净的工业规模生产提供了一种新的思路。

Description

一种制备米卡芬净的方法

技术领域

本发明涉及一种制备棘白菌素类抗真菌药物的方法，具体涉及一种制备米卡芬净的方法。

背景技术

棘白菌素类药物是新型的半合成抗真菌药物，其通过抑制β-1,3-葡聚糖合成酶的活性从而抑制真菌细胞壁的合成，具有低毒性和良好的动力学性质。米卡芬净（Micafungin）是其中一种表现良好的棘白菌素类抗真菌药物，由日本藤泽公司开发，于2002年12月在日本上市，商品名为Fungusrd，2005年3月通过美国FDA认证，目前被批准用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS患者中性粒细胞减少症的预防和治疗。

米卡芬净的结构如下所示：

目前，米卡芬净主要通过半合成的方法制备：通过酶反应脱除棘白菌素类抗生素Coleophoma empetri结构中环外酰胺的酰基，再通过液相反应在游离胺上连接侧链（参见US5376634、US5569646、WO9611210和WO9940108）。该方法的缺点是依赖棘白菌素类抗生素Coleophomaempetri为原料基础，需要微生物培养技术的支持。迄今为止，尚没有对米卡芬净进行全合成的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种制备米卡芬净的新方法，具体提供一种米卡芬净的固相-液相全合成方法，其包括下述步骤：

（1）由Fmoc-P-OH与2-CTC树脂反应得到Fmoc-P-CTC树脂，

其中Fmoc-P-OH代表结构如下的带有保护基的非天然氨基酸：

（2）以Fmoc-P-CTC树脂为载体，采用固相多肽合成方法从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，得到全保护肽树脂，其中带Fmoc保护基的氨基酸依次为(2S，3S，4S)-N-Fmoc-3-乙酰氧基-4-甲基-脯氨酸、(3R)-N-Fmoc-3-乙酰氧基-L-谷氨酰胺、(4S)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-4-(3’-磺酸钠-4’-乙酰氧基)苯基-L-苏氨酸、(4R)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-L-脯氨酸和(4R)-N-Fmoc-O-乙酰基-L-苏氨酸；

（3）对步骤（2）中的全保护肽树脂进行裂解，得到全保护肽；

（4）对步骤（3）中的全保护肽进行分子内反应，得到全保护环肽；

（5）脱除步骤（4）中全保护环肽中氮上的Boc保护基；

（6）将步骤（5）的产物与侧链P1进行液相缩合，得到带保护基的米卡芬净，其中P1的结构为：

（7）脱除步骤（6）的产物中羟基上的保护基得到米卡芬净；

本发明所述步骤（1）的反应在碱性条件下进行。所述碱为DIPEA或TMP，优选DIPEA。CTC树脂的替代度为0.2-1.1mmol/g，优选0.4-1.0mmol/g，更优选0.7mmol/g。

本发明所述步骤（1）中的Fmoc-P-OH是从文献已知的化合物Boc-4-烯-L-鸟氨内酰胺（Journal of Organometallic Chemistry 691(2006)5487–5496，实验部分4.3.3化合物24）出发，通过有机合成领域众所周知的不对称双羟基化反应、内酰胺水解及加乙酰基保护基的方法制备。其中内酰胺水解反应和加乙酰基保护基的方法可任选现有技术已知的能实现该目的的方法；不对称双羟基化反应优选Sharpless不对称双羟基化反应。

本发明所述步骤（2）中，所述固相多肽合成方法包括：1）脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；2）将合适量的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固体反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；3）重复1）和2）。

其中脱除Fmoc的试剂可为本领域已知的可实现该目的的任何试剂，优选20%的哌啶/DMF溶液（DBLK），即哌啶：DMF（体积比）为1:4的混合溶液。

本发明所述步骤（2）中的偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A=1.2:1.1，DIPEA:A:B=2.0:1.1:1.0。

本发明所述步骤（2）的反应在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；温度优选为室温（即20±5℃），也可在适当提高或降低的温度下进行。

本发明所述步骤（2）的反应优选将树脂在偶联之前进行溶胀，所述洗涤和溶胀的步骤本领域可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。所述反应中应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任意方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的酰胺，即酰胺氮上无保护基。

在步骤（2）中非天然氨基酸的来源为：(4S)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-4-(3’-磺酸钠-4’-乙酰氧基基)苯基-L-苏氨酸通过合成制备，其余非天然氨基酸为市售可得或通过使用本领域众所周知的上乙酰基保护的方法对市售的无保护基的氨基酸上乙酰基保护来制备。具体地，(2S，3S，4S)-N-Fmoc-3-乙酰氧基-4-甲基-脯氨酸的前体—(2S，3S，4S)-N-Fmoc-4-甲基-3-羟脯氨酸购于J&K、(3R)-N-Fmoc-3-乙酰氧基-L-谷氨酰胺通过文献已知的方法制备（Synthesis,(12)，1032-5，1986，实验部分1a）、(4R)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-L-脯氨酸的前体—(4R)-N-Fmoc-L-4-羟脯氨酸购于J&K且(4R)-Ｎ-Fmoc-O-乙酰基-L-苏氨酸的前体—(4R)-Ｎ-Fmoc-L-苏氨酸购于吉尔生化；(4S)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-4-(3’-磺酸钠-4’-乙酰氧基基)苯基-L-苏氨酸从文献已知的化合物3’-乙酰氧基-4’-苄氧基-苯甲醛(Org.Biomol.Chem.,2010,8,5199–5211实验部分化合物29）出发，通过本领域已知的醛和叶立德的缩合反应、不对称双羟基化反应、内酰胺的水解反应及加乙酰基保护基的方法制备。其中各反应可采取现有技术已知的能实现该目的的任意方法，其中不对称双羟基化反应优选Sharpless不对称双羟基化反应。

本发明所述步骤（3）是在裂解液的存在下进行的。所述裂解液为AcOH和TFE和DCM的混合溶液，其中AcOH:TFE:DCM=1:1:8（体积比）。

本发明所述步骤（4）是在偶联剂的存在下进行的。所述偶联剂的选择范围与上文提及的步骤（2）中的偶联剂选择范围相同，优选为DIPEA和PyBOP和HOAt的组合物，进一步地，DIPEA：HOAt：PyBOP=2.0:1.1:1.0（摩尔比）；使用本领域已知的检测方法判断该步骤的反应终点，优选使用薄层色谱法。

本发明所述步骤（5）中，脱除Boc保护基所用试剂为TFA或HCl与PhOMe或DCM的混合溶液，优选TFA与PhOMe的混合溶液，进一步地，TFA:PhOMe=97:3（体积比）。

本发明所述步骤（6）的环外酰胺缩合反应是在偶联剂的存在下进行的。所述偶联剂优选DIPEA和HOAt；使用本领域已知的检测方法判断该步骤的反应终点，优选使用薄层色谱法。该反应中侧链P1根据文献已知的方法制备（参见Organic Process Research & Development 2005,9,179-184）。

在本发明所述步骤（7）中脱除保护基的反应可在碱性条件下进行。所述碱性条件为NaOMe和MeOH、NaOEt和MeOH、NaOMe和EtOH、NaOEt和EtOH，优选NaOMe和MeOH，且NaOMe和MeOH的含量为每100ml MeOH含15-25g NaOMe，优选含16-19g NaOMe，更优选含17g NaOMe。

本发明优选还包括米卡芬净的纯化步骤。所述纯化步骤可采用本领域已知的任意多肽纯化技术进行，优选采用反相高压液相色谱法。进一步地，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1%醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。

术语解释

本文通篇的术语“固相多肽合成方法”是指多肽合成领域已知的Fmoc固相合成方法，例如记载于Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,W.C.Chan,Peter D.White著，March2,2000（ISBN-10:0199637245）,英国Oxford University Press。

本文通篇的术语“全保护肽树脂”是指多肽的C端连有树脂、N端为游离氨基；其余游离羟基被乙酰基保护、游离氨基被Boc保护的多肽树脂。

本文通篇的术语“全保护肽”是指上述提及的“全保护肽树脂”脱除C端树脂露出游离羧基的多肽

本文通篇的术语“全保护环肽”是指将上述提及的“全保护肽”的C端羧基和N端氨基连接，以使多肽中不含游离取代基的环形多肽。

与现有技术相比，本发明制备米卡芬净的方法收率高且后处理方便，为米卡芬净的工业规模生产提供了一种新的思路。

附图说明

图1为本发明米卡芬净制备方法的合成路线图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。

本发明中所用缩写及其含义列于下表：

实施例1：Fmoc-P-OH非天然氨基酸通过以下三步合成：

（1）通过Sharpless不对称双羟基化反应合成邻二羟基。将70g(217mmol)K₃Fe(CN)₆、29.3g(217mmol)K₂CO₃、53.2mg(0.14mmol)K₂OsO₂(OH)₄和0.56g(0.7mmol)氢化奎尼定1,4-(2,3-二氮杂萘)二醚（(DHQD)₂-PHAL）溶于350ml叔丁醇和350ml水中，室温搅拌10分钟。加入6.7g(70mmol)甲磺酸胺，在0°C下，将根据已知文献的方法制备的Boc-4-烯-L-鸟氨内酰胺（Journal of OrganometallicChemistry 691(2006)，5487–5496，实验部分4.3.3，化合物24）14.9g(70mmol)加入到体系中，保持0°C反应40h。随后加入105g(833mmol)亚硫酸钠，自然升至室温搅拌反应1小时并加入乙酸乙酯700ml。水层用乙酸乙酯萃取（3×200ml）。合并有机相并用含2mol/L NaOH的饱和食盐水洗两次。无水硫酸钠干燥2h后，减压浓缩除去溶剂。所得粗品经快速硅胶柱层析（EA/PE 2:1）纯化，得到白色固体的(1S，3R,4R)-Boc-3,4-二羟基-鸟氨内酰胺15.4g(62.3mmol，收率89%)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:5.41(m,1H),5.07(br,2H),4.53(m,1H),3.98(m,1H),2.09~1.96(m,4H),1.39(s,9H);¹³C NMR (125MHz,CDCl₃)δ:168.44(C=O),156.33(C=O),81.64(C5),79.44(Boc),75.94(C4),52.06(C2),35.35(C3),28.36(Boc);FAB-MS[M+H]⁺:246.3，计算值246.3。

（2）内酰胺水解并上Fmoc保护基。将(1S，3R,4R)-Boc-3,4-二羟基-鸟氨内酰胺15.4g(62.3mmol)、1.58g(8.4mmol)对甲苯磺酸在20ml丙酮和500ml甲苯中加热回流16h。反应液冷却后，用10%碳酸钠水溶液萃取（2×300ml）、食盐水洗涤两次。减压旋除溶剂后将所得固体溶于200ml THF和100ml水中，加入13g（310mmol）氢氧化锂，室温搅拌16h。在冰浴冷却下，加入32g(216mmol)硫酸氢钠在100ml水中的溶液，加毕搅拌10分钟。将21g(62mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺（Fmoc-OSu）加入到反应体系中，自然升至室温反应5小时。反应完毕，向体系中加入饱和柠檬酸水溶液60ml，室温搅拌16h。减压旋除THF，用乙酸乙酯萃取（3×200ml），合并有机相，用食盐水洗两次。在无水硫酸钠干燥2h后，减压浓缩除去溶剂。所得粗品经快速硅胶柱层析（EA/PE 2:1）纯化，得到白色固体(1S，3R,4R)-N-Boc-3,4-二羟基（N-Fmoc）鸟氨酸22.1g(45.5mmol，收率73%)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:10.78(br,1H),7.91~7.25(m,8H),5.41(m,1H),5.07(br,2H),4.70(d,2H),4.53(m,2H),3.98(m,1H),2.02(s,2H),1.96(m,2H),1.39(s,9H);¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:174.44(C=O),156.33(C=O),155.25(C=O),143.81(Fmoc),141.03(Fmoc),128.81(Fmoc),128.43(Fmoc),128.22(Fmoc),126.83(Fmoc),81.64(C5),79.44(Boc),72.94(C4),67.45(Fmoc),50.36(C2),47.10(Fmoc),33.35(C3),28.36(Boc);FAB-MS[M+H]⁺:486.4,计算值486.5。

（3）羟基上乙酰基保护：将22.1g(45.5mmol)(1S,3R,4R)-N-Boc-3,4-二羟基（N-Fmoc）鸟氨酸溶于400ml DCM中。加入43ml(455mmol)乙酸酐和36ml(450mmol)吡啶，室温搅拌反应2h。向反应混合物中加入400ml水，搅拌10分钟，水相用DCM萃取（2×200ml）。合并有机相，用10%柠檬酸水、饱和食盐水各洗两次。在无水硫酸钠干燥2h后减压浓缩除去溶剂。所得粗品经快速硅胶柱层析（EA/PE 1:1）纯化，得到标题化合物24.1g(42.3mmol，收率93%，总收率60%)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:10.78(br,1H),7.91~7.25(m,8H),6.63(m,1H),5.17(m,1H),5.07(br,2H),4.70(d,2H),4.53(m,2H),2.02(s,6H),1.96(m,2H),1.39(s,4H);¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:174.44(C=O),170.29(C=O of Ac),156.33(C=O),155.25(C=O),143.81(Fmoc),141.03(Fmoc),128.81(Fmoc),128.43(Fmoc),128.22(Fmoc),126.83(Fmoc),81.45(C5),79.44(Boc),72.75(C4),67.45(Fmoc),50.36(C2),47.10(Fmoc),31.23(C3),28.36(Boc),21.11(Ac),20.78(Ac);FAB-MS[M+H]⁺:570.7，计算值570.6。

实施例2：Fmoc-P-CTC树脂的合成

称取替代度为0.7mmol/g的2-CTC树脂20.0g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次。用DMF溶胀树脂30分钟后，取24.0gFmoc-P-OH用DMF溶解，冰水浴下加入14.6mL DIPEA活化3分钟，然后加入到上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-P-CTC树脂，检测替代度为0.56mmol/g。

实施例3：(4S)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-4-(3’-磺酸钠-4’-乙酰氧基)苯基-L-苏氨酸的合成：

将50g(185mmol)3’-乙酰氧基-4’-苄氧基-苯甲醛（Org.Biomol.Chem.,2010,8,5199–5211实验部分化合物29）溶于250ml新蒸DCM中，加入101.4g(185mmol)膦叶立德，室温搅拌反应4小时，反应液经硅胶快速柱层析纯化，得白色固体80.1g。将此固体溶于300ml新蒸DCM中，加入15g(277mmol)甲醇钠在2300ml无水甲醇中的溶液，室温搅拌反应30分钟后，加入1500ml 1mol/L盐酸溶液酸化，旋除有机溶剂，剩余液体用DCM萃取（3×600ml）。合并有机相，用饱和食盐水洗两次，在用无水硫酸钠干燥2h后减压浓缩除去溶剂。将残留物和152.3g(302mmol)2,3,4-三乙酰基-D-吡喃葡萄糖甲酯基-(N-苯基)-2,2,2-三氟乙酰亚胺酯（J.Org.Chem.,2005,70,8884中的化合物4）溶于700ml新蒸DCM中，加入6.38ml(51mmol)三氟化硼合乙醚，室温反应16小时。向反应液中加入1000ml水，萃取，水层再次用DCM萃取（2×300ml）。合并有机层，用饱和食盐水洗两次。有机层用500ml甲醇溶解，加入500ml1mol/L NaOH水溶液，室温搅拌反应4小时。所得粗品经反相硅胶柱层析（MeOH/H₂O 1:1）纯化。得到白色固体(S)-N-Cbz-α-氨基-3-烯-4-(3’-磺酸钠-4’-苄氧基)苯基丁酸的57.6g（108mmol,两步收率69%)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:7.19(m,10H),6.75(d,1H),6.65(d,1H),6.53(m,2H)，6.19(t,1H)，5.34(s,2H),5.20(s,2H),5.15(m,1H);¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ:174.44(C=O),156.33(NH-C=O),150.55(C-OBn),142.81(C-OSO₃Na),141.13(Bn & Cbz),129.81(C4),128.93(Bn &Cbz),128.82(Ph),127.63(Bn & Cbz),127.13(Bn & Cbz),123.31(C3),119.98(Ph),115.23(Ph),113.16(Ph),70.75(CH₂ of Bn),65.45(CH₂ of Cbz),61.36(C2)。

将108g(335mmol)K₃Fe(CN)₆、45.2g(335mmol)K₂CO₃、83.6mg(0.22mmol)K₂OsO₂(OH)₄和0.88g(1.1mmol)氢化奎尼定1,4-(2,3-二氮杂萘)二醚（(DHQD)₂-PHAL）溶于500ml叔丁醇和500ml水中，室温搅拌10分钟。加入10.3g(108mmol)甲磺酸胺，在0°C下，将上步所得中间体57.6g(108mmol)加入体系中，保持0°C反应40h。加入157g(1.245mol)亚硫酸钠，自然升至室温搅拌反应1小时。所得粗品经反相硅胶柱层析（MeOH/H₂O 1:1）纯化。得到白色固体41.2g(72.4mmol，收率67%)。将此固体用500甲醇和500ml水溶解，加入5g 5%钯碳，在压力釜中通氢气氢化16小时。反应结束后滤除钯碳。滤液加27.1g(80mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺（Fmoc-OSu）和7.6g(90mmol)碳酸氢钠，室温搅拌反应5h。所得粗品经反相硅胶柱层析（MeOH/H₂O 1:1）纯化。得到白色固体(4S)-N-Fmoc-4-羟基-4-(3’-磺酸钠-4’-羟基)苯基-L-苏氨酸37.8g(66.6mmol，两步收率92%)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:8.37(s,1H),7.89-7.32(m,8H),6.57(d,1H),6.49(d,1H),6.43(s,1H)，4.70(d,2H),4.63~4.46(m,4H),2.02(br,2H);¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆)δ:174.83(C=O),156.06(NH-C=O),144.68(Ph(C)-OH),143.76(C-OSO₃Na),143.53(Fmoc),141.03(Fmoc),132.61(Ph),128.83(Fmoc),128.43(Fmoc),128.22(Fmoc),126.63(Fmoc),122.23(Ph),117.38(Ph),115.23(Ph),77.75(C3),73.83(C4),67.36(CH₂of Fmoc),53.82(C2),47.0(CH of Fmoc)。

将上述固体溶于400ml DMF中。加入43ml(455mmol)乙酸酐和36ml(450mmol)吡啶，室温搅拌反应2h。反应液减压浓缩除去溶剂。所得粗品经反相硅胶柱层析（MeOH/H₂O 1:1）纯化。得到标题化合物27.9g(40.2mmol，收率95%，总收率21.7%)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:8.37(s,1H),7.89-7.32(m,8H),6.87(d,1H),6.72(d,1H),6.63(s,1H)，5.88(t,1H),5.83(d,1H),5.05(m,1H),4.72(d,2H),4.46(t,1H),2.09(s,3H),2.01(s,6H);¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ:174.83(C=O),170.31(C=O of Ac),169.02(C=O of Ac),156.05(NH-C=O),149.64(C-OSO₃Na),143.53(Fmoc),141.03(Fmoc),137.71(Ph),136.83(Ph),128.83(Fmoc),128.43(Fmoc),128.22(Fmoc),126.63(Fmoc),123.23(Ph),121.18(Ph),114.23(Ph),77.75(C3),71.73(C4),67.36(CH₂of Fmoc),50.81(C2),47.0(CH of Fmoc),21.02(Ac),20.05(Ac)。

实施例4：其他非天然氨基酸的合成。从市售可得的不带保护基的氨基酸出发，用与实施例1和实施例3中上乙酰基保护的方法相似的方法分别制备羟基上带乙酰基保护的氨基酸。

实施例5：全保护肽树脂的制备

称取替代度为0.56mmol/g的Fmoc-P-CTC树脂17.86克（合成规模10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF（V/V）溶液脱除Fmoc两次，每次时间分别为5分钟和10分钟，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取12.3克(30mmol)(2S，3S，4S)-N-Fmoc-3-乙酰氧基-4-甲基-脯氨酸，4.5克(33mmol)HOBt，用25mlDMF溶解，冰水浴下加入6.1ml(36mmol)DIPCDI活化5分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点（如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时，下同）。

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK溶液脱除Fmoc两次，每次时间分别为5分钟和10分钟，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取12.8克(30mmol)(3R)-Fmoc-3-乙酰氧基-L-谷氨酰胺，4.5克(33mmol)HOBt，用25ml DMF溶解，冰水浴下加入6.1ml(36mmol)DIPCDI活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。

按照同样的方法依次将事先制备好的(4S)-Fmoc-4-乙酰氧基-4-(3’-磺酸钠-4’-乙酰氧基)苯基-L-苏氨酸、(4R)-4-乙酰氧基-L-脯氨酸和(4R)-Fmoc-O-乙酰基-L-苏氨酸进行偶联反应，偶联结束，用DBLK脱除Fmoc保护树脂，收缩抽干，得到全保护肽树脂25.99克，树脂增重率91.9%。

实施例6：全保护肽的制备

将实施例5得到的全保护肽树脂25.99克加入到500ml单口瓶中，加入预先配置好的AcOH:TFE:DCM=1:1:8（V:V）250ml，室温反应40分钟，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。减压浓缩到50ml，将浓缩液缓慢加入500ml冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到全保护肽12.15克，用HPLC检测纯度为91.3%。ESI，m/z，([M+Na]⁺)1477.4（计算值为1477.4）。

实施例7：液相合成全保护环肽

将实施例6得到的全保护肽12.15克加入到250ml单口瓶中，加入160ml DCM搅拌溶解，再加入5.2克PyBOP和1.5克HOAt。冰水浴冷却至体系内5℃，滴加DIPEA溶液（1.74ml DIPEA+10ml DCM），滴毕，撤除冰水浴，自然升至室温搅拌反应3小时，薄层色谱监测反应终点。用150ml 10%柠檬酸溶液萃取2次，饱和食盐水萃取3次，有机相无水硫酸钠干燥2小时。过滤，旋掉DCM，得到反应结束后得到全保护环肽11.81克，收率96.6%。ESI，m/z，([M+Na]⁺)1436.4（计算值为1436.3）。

实施例8：脱除Boc保护基

将实施例7得到的11.81克全保护环肽加入到250ml单口瓶中，加入预先配置好的TFA+PhOMe（97ml+3ml），室温反应2.5小时。旋除TFA，所的固体用50ml乙醚洗涤3次，真空蒸除溶剂，得到白色固体10.76g，收率97.9%。ESI，m/z，([M+Na]⁺)1359.4（计算值为1359.3）。

实施例9：液相合成环外酰胺

将实施例8得到的白色固体10.76g和1.2g HOAt，加入到250ml单口瓶中，加入100ml DCM搅拌溶解，再加入侧链P17.5g，冰水浴冷却至体系内5℃，滴加DIPEA溶液（2.74ml DIPEA+10ml DCM），滴毕，撤除冰水浴，自然升至室温搅拌反应3小时，薄层色谱监测反应终点。用150ml 10%柠檬酸溶液萃取2次，饱和食盐水萃取3次，有机相无水硫酸钠干燥2小时。过滤，旋掉DCM，得到环外酰胺中间体10.92克，收率81.3%。ESI，m/z，([M+Na]⁺)1950.7（计算值为1950.6）。

实施例10：米卡芬净粗肽的制备

将实施例9所得环外酰胺中间体10.92克，用150ml MeOH溶解，再室温滴加150ml 28%NaOMe/MeOH溶液，滴加完毕继续搅拌反应20分钟。用醋酸调节pH至8，旋除溶剂。固体用50ml去离子水洗涤3次，50ml乙醚洗涤3次，收集固体为粗品米卡芬净。滤液合并，100mlDCM萃取3次，合并DCM，饱和食盐水萃取3次，有机相无水硫酸钠干燥2小时。过滤，旋掉DCM，所的固体为米卡芬净粗肽。两部分米卡芬净粗肽合并共7.98克，收率94.4%。ESI，m/z，([M+Na]⁺)1314.5（计算值为1314.4）。

实施例11：纯化米卡芬净经粗肽得到米卡芬净纯肽

将实施例10所得7.98g米卡芬净粗肽用800ml去离子水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，以0.1%TFA水溶液为A相，乙腈为B相进行纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%的精肽。馏分合并，旋转浓缩，冻干得到米卡芬净精肽6.93g，HPLC纯度99.0%，总收率53%。

虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。

Claims

1.一种制备米卡芬净的方法，该方法包括下述步骤：

（1）由Fmoc-P-OH与2-CTC树脂反应得到Fmoc-P-CTC树脂，

其中Fmoc-P-OH代表结构如下的带有保护基的非天然氨基酸：

（2）以Fmoc-P-CTC树脂为载体，采用固相多肽合成方法从C端到

N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，得到全保护肽树脂，其中带Fmoc保护基的氨基酸依次为(2S，3S，4S)-N-Fmoc-3-乙酰氧基-4-甲基-脯氨酸、(3R)-N-Fmoc-3-乙酰氧基-L-谷氨酰胺、(4S)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-4-(3’-磺酸钠-4’-乙酰氧基)苯基-L-苏氨酸、(4R)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-L-脯氨酸和(4R)-N-Fmoc-O-乙酰基-L-苏氨酸；

（4）对步骤（3）中产物进行分子内反应，得到全保护环肽；

（5）脱除步骤（4）中全保护环肽中氮上的Boc保护基；

（7）脱除步骤（6）的产物中羟基上的保护基得到米卡芬净。

2.权利要求1的方法，其中步骤（1）中的Fmoc-P-CTC树脂是在碱性条件下将Fmoc-P-OH与替代度为0.2-1.1mmol/g，优选0.4-1.0mmol/g，更优选0.7mmol/g的2-CTC树脂反应制备的；其中所述碱为DIPEA或TMP，优选DIPEA。

3.权利要求1的方法，其中Fmoc-P-OH是从化合物Boc-4-烯-L-鸟氨内酰胺出发，通过Sharpless不对称双羟基化反应、内酰胺水解反应以及加乙酰基保护基的方法制备。

4.权利要求1的方法，其中步骤（2）和步骤（4）在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；步骤（2）中的偶联剂为DIPCDI和A的组合物，其中偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A=1.2:1.1；步骤（4）中的偶联剂为DIPEA和PyBOP和HOAt的组合物，其中偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPEA：PyBOP：HOAt=2.0:1.1:1.0。

5.权利要求1的方法，其中在步骤（2）中的非天然氨基酸(4S)-N-Fmoc-4-乙酰氧基-4-(3’-磺酸钠-4’-乙酰氧基基)苯基-L-苏氨酸从化合物3’-乙酰氧基-4’-苄氧基-苯甲醛出发通过醛和叶立德的缩合反应、Sharpless不对称双羟基化反应、内酰胺水解反应以及加乙酰基保护基的方法制备。

6.权利要求1的方法，其中步骤（3）在裂解液的存在下进行，所述裂解液为AcOH和TFE和DCM的混合溶液，其中各成分的比例以体积比计为AcOH:TFE:DCM=1:1:8。

7.权利要求1的方法，其中在步骤（5）中，脱除Boc保护基所用试剂为TFA或HCl与PhOMe或DCM的混合溶液，优选TFA与PhOMe的混合溶液，其中各成分的比例以体积比计为TFA:PhOMe=97:3。

8.权利要求1的方法，其中步骤（7）中脱除保护基的反应可在碱性条件下进行，所述碱性条件为NaOMe和MeOH、NaOEt和MeOH、NaOMe和EtOH、NaOEt和EtOH，优选NaOMe和MeOH，其中NaOMe和MeOH的含量为每100ml MeOH含15-25g NaOMe，优选含16-19gNaOMe，更优选含17g NaOMe。

9.权利要求1-8中任一项的方法，还包括米卡芬净的纯化步骤。

10.权利要求9的方法，其中纯化步骤采用反相高压液相色谱法，包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1%醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。