CN1031379A

CN1031379A - 新型的聚肽及其制造方法

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Publication number: CN1031379A
Application number: CN88106207A
Authority: CN
Inventors: 中村隆; 岩永贞昭; 大野素德; 宫崎匡輔
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1987-08-21
Filing date: 1988-08-20
Publication date: 1989-03-01
Anticipated expiration: 2003-08-20
Also published as: NO175372B; FI92708C; FI92708B; DE3880481T2; NO940078D0; AU2311388A; DK193589D0; NO178663C; EP0343248A1; KR890701624A; FI891873A; NO175372C; ATE88480T1; NO178663B; AU642089B2; CA1337781C; US5416194A; JP2710653B2; NO891572D0; CA1337782C

Abstract

本发明涉及一种新型的聚肽及其制造方法，更具体地说是涉及一种能对类脂多糖显示出较强亲和性的新型聚肽及其制造方法。

Description

类脂多糖也可被称为内毒素，它是存在于古拉姆（Guramu）阴性菌之菌体的毒素的总称，其成份为类脂多糖（以下称为LPS）。

以前，作为类脂多糖除去法已知的有热分解法、超过滤法、通过多粘菌素（polymyxin）B进行的亲和色谱法等。

然而，热分解法是通过250℃以上的干热处理对LPS进行热分解、并把LPS从玻璃容器等分解并除去的方法，但该法不能利用于把LPS从对热不稳定的物质中的分离。超过滤法，对把LPS从低分子量的物质中分离是有效的，但从原理上说则不适用于从高分子物质中分离类脂多糖通过多粘菌素B进行的亲和色谱法，如果从利用多粘菌素B所具有的对于LPS的亲和力这一观点来说，可期待其实用化，但是从多粘菌素B所具有的毒性来看，其用途受到了限制，现在实际上没有得到应用。

因此，作为从高分子量的生理活性物质中有效且安全地分离LPS的方法，在实用上有效的至今尚未被发现。

因此，本发明者为开发出对LPS显示出亲合性的新物质（在发明中，该物质称为LPS-粘合聚肽（有时简称为LBP））而专心致志不断进行研究，结果从胄蟹血细胞中提取和分离新型聚肽的，同时，用诸如固相聚肽合成方法等合成方法对该聚肽的合成已获得成功，进而又发现该聚肽能对LPS显示出较强的亲和性，而且具有生物学活性，诸如抗菌性及芽生抑制作用等。

本发明涉及下式（Ⅰ）所表示的聚肽：

（式中，Lys表示赖氨酸、Trp表示色氨酸、Cys表示胱氨酸、Phe表示苯基丙氨酸、Arg表示精氨酸、Val表示缬氨酸、Tyr表示酪氨酸、Gly表示甘氨酸、Ile表示异白氨酸;X表示羟基或氨基）及其类绿体和该聚肽的制造方法。

本发明的化合物是由17个氨基酸构成的肽，在已提取分离的状态下，作为C末端氨基酸的精氨酸的羧基虽已被氨基化，但即使通过水解而转化成酸，也不会对与LPS的亲和性产生任何影响。

本发明的聚肽，例如可按如下方法从胄蟹血球（Tachypleus trideufatus，Tachypleusgigas以及Limulus polyphmus）中提取和分离。

即，对残留物（对胄蟹的血球进行了低渗的（hypotonic）提取而得到的）在酸性条件下例如盐酸、硝酸、硫酸等无机酸的稀酸;因稀酯酸等低级脂肪酸的存在而产生的有机酸条件下进行提取，并把所得到的提取液，通过通常的方法例如凝胶过滤、色谱分离法等精制手段进行精制，从而加以分离。

本发明的聚肽可通过多种合成法进行，诸如肽合成法，例如，固相肽合成法，液相肽合成法。

例如，用固相合成法，即为，将N-保护精氨酸的羰基被连结至一个具有氨基的不溶性树脂（有时通过一个既含有羰基又含有可与羰基结合的官能基团的间隔基），使如分子：

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg

（其中符号与上相同）

所示肽序列中相应于16至1位的保护氨基酸与结合在不溶性树脂上的精氨酸结合，根据固相肽合成法可成功地得到保护的多肽，消除该不溶性树脂及这些氨基酸的保护基团而获得由分子式（Ⅱ）表示的多肽：

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-

（式中的记号与前述同义）

然后使其第3位与第16位，以及第7位与第12位的光胺酸分别通过它们的氢硫基（mercapto）进行结合，进而形成二硫化物结合从而制成。

作为具有前述不溶性氨基的不溶性树脂可以是这样一些物质，只要它们满足以下条件：即通过其氨基能与N-保护精氨酸的羧基或有时能与之结合在一起的间隔基的羧基进行结合，并且在这之后能够进行脱离。

作为这种不溶性树脂可例举如：氨甲基树脂（氨甲基-聚（苯乙烯-CO-二乙烯基苯），二苯甲基（benzhydryl）胺树脂、甲基二苯甲基胺树脂、4-（氨甲基）苯氧基树脂等。如果使用二苯甲基胺树脂、甲基二苯甲基胺树脂、4-（氨甲基）苯氧基树脂，那么就可通过开裂作用直接提供氨基，但是从收率的观点来看还是以氨甲基树脂较为理想。

作为具有官能团（能与上述场合下存在的羧基进行结合的）和羧基的间隔基，可以例举如：能把精氨酸的羧基变换成P-羧基甲基苄酯的物质，但并无特别的限制。

这种间隔基与保护精氨酸结合的4-（t-丁氧基羧基-G-甲苯磺酰（tosyl）-L-精氨酸氧甲基）苯基酯酸可用J.R.Tam等人（synthesis（1979）P.955～957）的方法进行调制。

所谓的保护氨基酸是按照公知的方法用保护基对官能团进行保护了的氨基酸，已有各种保护氨基酸在市场上出售。对本发明的聚肽进行合成时，最好选择以下所示的任何一种保护基。首先，氨基酸的α-氨基的保护基为Boc（t-丁基氧羧基）或Fmoc（9-基（fluorenly）甲基氧羧基）。Arg胍基（guanidino）基的保护基为Tos甲苯磺酰（tosyl）、-NO₂（硝基）、Mtr（4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰）。作为Cys的氢硫基的保护基，可例举为Bzl（苄基）、M·Bzl（4-甲氧基苄基）、4-Me Mzl（4-甲基苄基）、Acm（乙酰胺甲基）、Trt（三苯甲基）（trityl）、Npys（3-硝基吡啶对氨基苯磺酸、t-Bu（t-丁基）t-Bus（t-丁基氢硫基，但是以4-Me Bzl、Acm、Npys为最佳。Tyr的羟基的保护基为Bzl、 Cl₂·Bzl（2，6-二氯苄基）、t-Bu，或者也可以不保护。Lys的ε-氨基保持基为Z（苄基氧代羧基）、Cl·Z（2-氯苄基氧代羧基）、Boc、Npys。各保护基必须根据聚肽的合成条件进行适当的选择。

保护氨基酸的结合可采用通常的缩合法，例如DCC（双环己基碳酰亚胺）法，活性酯法、混合或对称酸酐法、羧基二甘恶林法、DCC-HOBt（1-羟苄川三唑）法、二苯基磷酰迭氮法等方法进行，但是DCC法、DCC-HOBt法、对称酸酐法为较理想。它们的缩合反应通常是在二氯甲烷、二甲基甲酰胺等有机溶剂或这些溶剂的混合溶剂中进行。作为α-氨基之保护基的脱离试剂的可使用三氟醋酸/二氯甲烷、HCl/噁烷、哌啶/二甲基甲酰胺等，并根据该保护基的种类进行适当地选择。另外，合成的各个阶段的缩合反应之进行程度可通过易·凯查等人的方法[Anal.Biochem.，34，595（1970）]（茚三酮反应法）进行检查。

按照如上所述的方法，可以获得具有所需氨基酸排列的保护肽树脂。

在把氨甲基树脂用作不溶性树脂的情况下，例如可在适当的溶剂中通过氨处理使该树脂脱离。接着，通过用氟化氢进行处理，就可获得前式（Ⅱ）所表示的其保护基完全脱离的聚肽。作为不溶性树脂而使用二苯甲基胺树脂、甲基二苯甲基胺树脂、4-（氨甲基）苯氧基甲基树脂时，可通过用氟化氢进行处理进而使该树脂及其保护基同时脱离。

以后，最好通过用2-氢硫基乙醇等进行还原以使光氨酸的氢硫基已转化成还原型这一过程加以确实化，然后就可通过氧化处理，把所需的产物即环状聚肽（Ⅰ）作为氨基而获取。

这时的氧化处理可采用公知的方法，通常是使用大气中的氧、（ferricyansate）（例如Potassium ferricyanate）这类氧化剂。

如此获得的聚肽可通过聚肽经常所使用的手段，例如提取、再结晶、各种色谱分离法（凝胶过滤、离子交换、分配、吸收、逆相）、电泳、逆流分布等加以分离精制，然而，以逆相高速液体色谱分离法为最有效。

以下，将通过实施例对本发明作更详细的说明，但这些实施例并不对本发明的范围有任何限制。

实施例1

A.本发明聚肽的提取·精制

在大约50克的胄蟹（Tachypleus tridentatus）血球中加入150毫升的20mM tris盐酸/50mM氯化钠/pH＝8.0的缓冲溶液，用高速均质（化）器（日本精密工业株式会社制造）进行3分钟的均质化作用后，然后离心（800rpm，30分钟，4℃）。关于沉淀的组分可以重复2次上述操作把血球内的不溶性成份充分提取出之后，于是获得残留物。

在残留物中加入20mM的盐酸150ml，用高速均质（化）器进行3分钟的均质化作用，离心分离后，获得酸性提取液的上浮清澈物。该操作反复进行3次，进而获得总量大约为400ml的提取液。再通过冻结干燥使该上浮清澈物浓缩干燥固化。

用20mM的盐酸对浓缩干固化了的酸性提取物进行再溶解，然后添加在葡聚糖G-50（3.0×90.0cm）柱（用20mM的盐酸预先进行了平衡）中，进行凝胶过滤。收集对LPS（使用来自E.coli olllB₄株的物质）所产生的C因子（胄蟹血液凝固丝氨酸朊酶前驱体;本发明者所起名的LPS感受性因子，Nakamura，et al.，Eur.J.Biochem.，154，511（1986））之活性化有阻碍作用的溶出组份，把抽取出的组份之pH用氢氧化钠水溶液调节至6。

在预先用20mM的醋酸缓冲溶液（pH＝6.0）平衡化了的CM 葡聚糖（L-6β柱中加入上述样品，用含有0～0.3M的氯化钠的20mM醋酸缓冲溶液（pH＝6.0）的分层液进行溶出操作。收集对C因子活性化有阻碍的组份，作为LPS组合物质的最终精制样品（本发明的新的聚肽）。所得的量为：从约50g血球中约30mg。

B.纯度测定

（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

在还原剂（β-氢硫基乙醇）不存在或存在的条件下，对LPS的化合聚肽施行含有8M尿素的12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（Weber-Osborn系），并用考马斯亮蓝R-250进行染色，其结果均显示出分子量约为2000的单一区域（光谱带）。其结果如图1所示。在图1中，左侧的区域表示不存在还原剂的情况，中央的区域表示还原剂存在的情况，右侧的区域表示由标准蛋白质[SDS.PAGEMarker Ⅲ.Fluka AG（瑞士）]所产生的肌动朊（myoglobin）（16.9KDa）、肌动朊Ⅰ+Ⅱ（14.4KDa）、肌动朊（8.2KDa）、肌动朊Ⅲ（2.5KDa）的区域。

（2）逆相高速液体色谱分析

采用逆相高速液体色谱分析法（分离柱为Cosmoil 5C₁₈P、肽的溶出则使用0.1%。三氟（trifluoro）醋酸/乙腈0～98%的分层液）对本发明的聚肽进行了分析，其结果显示出单一的峰值。

C.氨基酸组成值

在110℃的温度下，分别用24、48、72小时且5.7M的盐酸对样品进行水解，后再用日立835氨基酸分析计进行了分析。至于半胱氨酸（cystine），对样品进行过甲酸（pertormic）氧化后，在110℃的温度下用5.7M的盐酸进行24小时的水解，此外，关于色氨酸（trypto-han）将试样在110℃的温度下用3M的氢硫基乙磺酸进行24小时的水解，接着分别用氨基酸分析计进行分析。此后根据用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量，从而判明：该聚肽是由17个氨基酸构成的纯碱性聚肽。氨基酸的分析结果如下表示：

表1

氨基酸残基/分子

Gly 1.2（1）

Cys/2 3.8（4）

Val 1.0（1）

Ile 0.9（1）

Tyr 1.8（2）

Phe 1.0（1）

Lys 0.9（1）

Trp 1.0（1）

Arg 4.8（5）

合计 17

D.氨基酸排列的确定与C末端精氨酸氨基的鉴别

使用原封标准样品约23微克，从氨基末端，采用Beckman 8900程序，对氨基酸的排列可一直鉴别到15号残基（半胱氨酸除外）。另外，使用还原烷基化的样品[用M.A.Hermodson，et.al.，Biochemistry，12，3146（1973）的方法对本发明的聚肽进行了S-Pyridyl乙基化了的物质）约36微克，可一直鉴别到16号残基（包括半胱氨酸）。进而可根据“氨基酸的分析值推断出，剩下的第17个氨基酸残基（C末端残基）为精氨酸。但是，对于C末端的精氨酸，即使使用原封的标准样品己吡啶乙基化的标准样品、羧肽酶（以下称为Cpase）以及进行消化，也全然测不出。于是，先用30mM的盐酸在110℃的温度下，用10个小时在和缓的条件下对样品加以水解后，用Cpase进行了处理。其结果可确认：本发明聚肽的每1摩尔左右约有0.5摩尔的游离精氨酸，也可判断出：C末端的精氨酸的羧基，其氨基化的可能性很大。该氨基化合物的理论分子量（计算值MW＝2264）与质量分析所测得的值完全一致，根据这一事实可以确认：C末端精氨酸的羧基已被氨基化。

E.二硫化物（S-S）结合的鉴定

本发明的聚肽内有4个半胱氨酸已得到了鉴定，这些全都是二硫化物的结合。这一点也通过比较实验[在还原剂的存在或不存在下的S-吡啶乙基化）而弄清楚了。于是，为了鉴定二硫化物的结合位置，在二硫化物结合的交换反应不发生的条件下（酸性条件下，PH＝6.5）对原封的标准样品进行胰朊酶消化，然后用上述逆相高速液体色谱分析法（分离柱为Cosmosil 5，肽的溶出则使用0.1%。三氟醋酸/乙腈系）对消化物进行分离。对所得的肽的氨基酸组成进行测定结果判明：从氨基末端起，第3个与第16个、第7个与第12个分别为二硫化物结合。

F.本发明的聚肽的LPS结合之活性

本发明的聚肽对0.1毫克/毫升的LPS（使用来自E.coliolll B株的物质）产生的因子之活化性（以[C因子]表示）以0.05μM（0.12毫克/毫升）的浓度阻碍了50%，以1μM（2.3毫克/毫升）的浓度则产生完全阻碍。此外，本发明的聚肽在使用1%agarose凝胶的二重扩散试验中已观察到它与LPS形成了高分子复合体，并形成了沉降线。

本发明的聚肽对LPS产生的因子之活化性所带来的阻碍效果，其试验结果显示在图2及图3。图2及图3分别显示了氯化钠不存在及存在（1M）时的结果。作为对照，还使用了能显示与LPS（本发明者首次明确了的）进行电结合性质的高分子碱性物质、聚赖氨酸。在图2及图3中（○）及（●）的记号分别表示本发明的聚肽以聚赖氨酸的结果。

根据这些结果可以判断出：本发明的新聚肽与LPS并不是单纯的电结合，而是具有不受盐浓度影响的较强的亲和性。

G.吸光度的测定

本发明聚肽的99.2微克/毫克水溶液之紫外部分吸收光谱显示在图4。

在276nm处具有吸收峰值。因为280nm处的吸光度为0.3842，所以可算出：1%水溶液在280nm处的吸光度为38.7。

实施例2

A.氨基甲基树脂中导入精氨酸

（1）4-（溴甲基）苯基醋酸苯酰甲基的酯类的合成

室温下，在75ml乙腈中加入3.98g（20mmol）α-溴乙酰苯及3.49g（60mmol）氟化钾，形成悬浊液，搅拌下，将4.58g（20mmol）4-（溴甲基）苯基醋酸分成6等份，间隔30分钟添加一份，连续搅拌2小时。反应终了后，滤去不溶物，蒸馏去除滤液中的溶剂，残留物用醋酸乙酯再溶解，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次，分别用蒸馏水、柠檬酸、蒸馏水洗涤1次，用硫酸钠干燥。蒸馏除去醋酸乙酯，从石油醚中结晶而得到5.5g目的产物（熔点84～85℃）。使该目的产物再结晶而得到5.2g熔点为85～86℃的结晶物（收率为75%）。

（2）4-（叔丁氧基羰基-G-对甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基）苯基醋酸的合成

将叔丁氧基羰基-G-对甲苯磺酰基-L-精氨酸4.71g（11mmol）、4-（溴甲基）苯基醋酸苯酰甲基酯3.47g（10mmol）、氟化钾1.28g（22mmol）、水0.8ml（44mmol）、乙腈50ml及二甲基甲酰胺10ml组成的混合物在室温下激烈搅拌24小时。将生成的不溶物自然滤去，蒸发滤液，浓缩至15～20ml为止。添加80ml醋酸乙酯后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，用蒸馏水洗涤1次，用饱和柠檬酸洗涤2次，再用蒸馏水洗涤1次，用硫酸钠干燥。蒸馏除去溶剂，用石油醚处理残留物，得到半固态的4-（叔丁氧基羰基-G-对甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基）苯基醋酸苯酰甲基酯。

使之溶解于105ml醋酸中，加入水19ml及锌13.1g，室温下激烈搅拌5.5小时。用高速流动超网眼（ハィフロス-パ-セル）及醋酸乙酯将锌滤去，滤液中加入醋酸乙酯400ml及水300ml，分离醋酸乙酯层，用水洗涤10次，用硫酸钠干燥后，蒸馏除去溶剂，在石油醚中将残留物磨细，得到4.77g4-（叔丁氧基羰基-G-对甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基）苯基醋酸。该物质经薄层色谱分析法而得到一斑近乎纯品的目的物。

（3）4-（叔丁氧羰基-G-对甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基）苯乙酰氨甲基树脂的合成。

将4-（叔丁基氧基羰基-G-对甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基）苯基醋酸577mg（1.0mmol）、氨甲基树脂（株式会社肽研究所出售、1%交联）2.00g及DCC206mg（1.0mmol）在二氯甲烷中用常规方法使发生耦合，经确认每1g树脂中有0.284mmol的耦合存在。

B.第16位光胺酸的引入

对1.0克4-（t-丁氧基羧基-G-甲苯磺酰-L-精氨基氧甲基）苯基乙酰胺树脂（0.284摩尔Arg（Tos）/g树脂）用25毫升的二氯甲烷进行4次洗涤，每次为1分钟，然后过滤。接着在该树脂中加入25毫升30%的三氟醋酸溶液（溶剂：二氯甲烷），搅拌30分钟，从而使Boc基团脱离。接着用下列溶剂各25毫升依次对所得到的树脂进行处理，并在各次处理后进行了过滤。

二氯甲烷（1次，1分钟）

二噁烷（1次，1分钟）

二氯甲烷（1次，1分钟）

二噁烷（1次，1分钟）

二氯甲烷（2次，每次2分钟）

10%的三乙胺（二氯甲烷溶液）（1次，2分钟）、（1次，5分钟）二氯甲烷（4次，每次1分钟）

接着，把上述树脂与相对于25毫升二氯甲烷、以及总精氨酸量而为3.5当量的保护氨基酸即Boc-Cys（4-Me Bzl）310毫克（0.994摩尔）一起搅拌1分钟。加入DCC205毫克（0.994摩尔）的二氯甲烷溶液25毫升并进行2小时搅拌。接着再用下列溶剂各25毫升依次对所得的树脂进行处理，每次处理后再进行过滤。

二氯甲烷（1次，1分钟）

异丙醇（1次，1分钟）

二氯甲烷（1次，1分钟）

异丙醇（1次，1分钟）

二氯甲烷（3次，各1分钟）

C.第15～1位氨基酸的引入

与步骤B同样地，在先前得到的树脂中依次耦接上与前述（Ⅱ）所表示的聚肽15位到1位的各种结构的氨基酸相对应的保护氨基酸。表2中显示了各反应阶段所使用的保护氨基酸。保护氨基酸的使用量均为相对于总精氨酸量的3.5当量。

此外，Boc-Arg（Tos）的耦接是通过DCC-HOB法相对DCC而使用了二倍摩尔的HOB进行的。

表2

氨基酸的位置保护氨基酸

15 Boc-Arg（Tos）

14 Boc-Arg（Tos）

13 Boc-Tyr（Bzl）

12 Boc-Cys（4-Me Bzl）

11 Boc-Ile

10 Boc-Gly

9 Boc-Arg（Tos）

8 Boc-Tyr（Bzl）

7 Boc-Cys（4-Me Bzl）

6 Boc-Val

5 Boc-Arg（Tos）

4 Boc-Phe

3 Boc-Cys（4-Me Bzl）

2 Boc-Trp

1 Boc-Lys（Cl·Z）

1位的氨基酸引入后，利用二氯甲烷把树脂肽回收到玻璃过滤器中，然后加以减压干燥，从而获得1.781克的干燥树脂肽。

D.树脂的脱离

在甲醇以及二甲基甲酰胺中用氨（无水）对步骤C中获得的干燥树脂肽进行处理，以使树脂脱离。从而获得0.765克（0.196摩尔）的用下式：

H-Lys（Cl Z）-Trp-Cys（4-Me Bzl）-Phe-Arg（Tos）-Val-Cys（4-Me Bzl）-Tyr（Bzl）-Arg（Tos）-Gly-Ile-Cys（4-Me Bzl）-Tyr（Bzl）-Arg（Tos）-Arg（Tos）-Cys（4-Me Bzl）-Arg（Tos）-NH₂所表示的保护聚肽。

E.保护基的脱离

通过在苯甲醚中于乙烷ジチオ-ル的存在下用氟化氢对步骤D中所得到的保护聚肽加以处理，接着再用阴离子交换树脂（G-型）及冷冻干燥处理，从而得到了470毫克（0.186摩尔）由下式：

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Cys-Arg-NH₂·7HCl所表示的聚肽盐酸盐。

F.聚肽的环化

将30毫克步骤E中得到的聚肽盐聚盐于含有200倍摩尔的过剩的2-氢硫基乙醇的0.1M的Tris-HCl（PH＝8.5）中在室温下放置一夜。然后用已被1%的醋酸平衡了的Sephadex G-10反应柱进行处理，从而获得8.5毫克的氧化型聚肽。

通过逆相高速液体色谱法（使用分离柱为TSK-凝胶ODS120 T（0.46×25cm）肽的溶出为0.01M义酸-三乙氨（PH＝4.5）（A）-A20%的乙腈（B））对上述氧化型聚肽进行分析，从而可确证它与实施例1中所获得的天然聚肽的峰值是一致的，进而对两者加以混合所得的产物，其峰值就变成2倍，确认此两者为同一物质。

试验例1本发明聚肽的生物活性

A.材料方法

（1）LRS S型采用了Salmonella minnesota 1114 W.E.coli 0111：B4.E.coli 0113，Re型采用了Salmonella minnesota R595.E.coli J5的精制LPS

（2）LPS感受（Sensifization）红血球在主要为人O型红血球的1毫升2.5%的浮游液中加入0.5毫升浓度为1毫克/毫升的LPS，在3.7℃的温度下进行1小时的混合搅拌，再用生理盐水加以洗涤。

（3）溶血活性把0.5的LPS敏感红血球50微升与本发明之0.5%聚肽的2倍系例的稀释液50微升及Tris-生理盐水的缓冲液（PH7.2）100微升，放在37℃下保温1小时，再加入生理盐水2.3毫升，然后加以离心分离，500rpm二分钟，用412nm的吸收对上清液的血红朊进行定量。再用微型底片头（corona MPT-100）将0.5%的LPS感受血球50微升与本发明之0.5%聚肽的2倍系例稀释液50微升在37℃下保温1小时后对微型底片上的溶血类型进行630nm测定。

（4）抗菌活性在Penassay培养基或Jarvis合成培养基160微升中加入本发明的0.5%聚肽的2倍系列稀释液20微升、菌液（10⁶～10⁷/ml）20微升，在37℃下经过18小时后用微型底片头对其浓度加以550nm测定，也测定了一部分生菌数和阻止园。

（5）凝胶内的沉降反应用溶解在PH为7.2的Tris-HCl生理盐水缓冲溶液pH为8.6的沸罗那（veronal）缓冲溶液，pH为4.6的醋酸盐缓冲溶液中的1%琼脂糖（加入0.1%NaN₃）中对LPS与本发明聚肽或抗LPS因子（从胄蟹血球的溶胞产物提取液得到由具有102残基的氨基酸组成的，分子量11，600的碱性蛋白质：以下称为ALF）之间所形成的沉降线进行氨基黑色染色。使用了PH为7.2的Tris HCl 50mM-Na Cl 0.15M。

B，结果

（1）溶血活性即使对于用Salmonlla minnesota 1114W、R595、E.coli 0113的任何LPS感受（sensifization）的红血球，本发明的聚肽也能以2～3毫克/毫升的浓度而引起溶血，在高浓度的情况下，即使是室温下也能迅速发生溶血，另外，因游离LPS而使溶血受到阻碍这一事实与ALF相同，然后在3.13毫克/毫升的浓度以上时也观察到了非感受（sensifizafion）红血球。总之，溶液活性比ALF弱。

（2）抗菌活性本发明的聚肽对Salmonelia typhimurium LT2（S）、1102（Re）、Salmonella minnesota 1114 W（S）、R595（Re）的任何一种都能显示抗菌活性，最小抗菌量对于LT2为3.13微克/毫升，对于1102为1.56毫克/毫升。此外，即使对Staphylococcus aureus这类古拉姆阳性菌也能显示抗菌活性。在含菌琼脂上则产生了与浓度相对应的阻止园。一般说来，比ALF的抗菌活性强。

（3）凝胶内沉降反应本发明的聚肽对Salmonella minnesota 1114W、R595、E.coli 0111：B4、0113、J5的任何一种LPS，均能因凝胶内的沉降反应而产生陡峭的沉降线，不同种类的LPS的沉降线相互间产生了融合。

发明的效果本发明的聚肽对LPS显示了很强的亲和性，作为菌体内毒素的除去手段十分有效，此外，即使作为细菌感染症的治疗剂也很有效。

图面的简单说明

图1显示了本发明聚肽的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。图2及图3显示了本发明的聚肽对LPS所产生之因子的活化性所带来的阻碍效果，并展示其试验结果。图4为本发明聚肽的紫外部吸收光谱。

Claims

1、由下式：

I-Lys-Trp-Cys--Cys-Arg-X

(式中Lys表示赖氨酸、Trp表示色氨酸。Cys表示胱氨酸、Phe表示苯丙氨酸、Arg表示精氨酸、Val表示缬氨酸、Tyr表示酪氨酸、Gly表示甘氨酸、Ile表示异亮氨酸；X表示羟基或氨基)所表示的聚肽。

2、由下式：

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tys-Arg-Arg-Cys-Arg-X

（式中的记号与前述记号的意义相同）所表示聚肽。

3、由下式：

（式中X表示氨基，其它记号与前述记号的意义相同）所表示的聚肽的制造方法，其特征是：

通过具有官能团（有时能与羧基结合的）和羧基的间隔基，使N-保护精氨酸与具有氨基的不溶性树脂相结合，然后根据固相合成法，对由下式：

H-Lys-Trp-Cys-Phe-A⁵rg-Val-Cys-Tyr-A¹⁰rg-Gly-Ile-Cys-Tyr-A¹⁵rg-Arg-Cys-Arg

（式中的记号与前述同义）

所表示的聚肽第16位至第1位的保护氨基酸依次进行结合，然后使该不溶性树脂及其氨基酸的保护基脱离，从而获得由下式：

H-Lys-Trp-Cys-Phe-A⁵rg-Val-Cys-Tyr-A¹⁰rg-Gly-Ile-Cys-Tyr-A¹⁵rg-Arg-Cys-Arg-NH₂

（式中的记号与前述同义）

所表示的聚肽，并使其第3位与第16位，以及第7位与第12位的胱氨酸分别通过它们的氢硫基进行结合，进而形成二硫化合物。

4、由17个氨基酸组成的类脂多糖亲和性的聚肽的制造方法，其特征是用低渗抽提对胄蟹血球进行提取，对低渗抽提残留物在酸性条件下进行提取，然后对提取液中的某种物质进行提纯。

5、根据权利要求4所述的制造方法，其特征是胄蟹至少为Tachypleus tridentatus，Tachypleus gigas或Limulus polyphemus中的一种。