CN1031193C

CN1031193C - 新型多肽的制造方法

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Publication number: CN1031193C
Application number: CN88106207A
Authority: CN
Inventors: 中村隆范; 岩永贞昭; 大野素德; 宫崎匡辅
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1987-08-21
Filing date: 1988-08-20
Publication date: 1996-03-06
Anticipated expiration: 2003-08-20
Also published as: NO175372B; FI92708C; FI92708B; DE3880481T2; NO940078D0; AU2311388A; DK193589D0; NO178663C; EP0343248A1; KR890701624A; FI891873A; NO175372C; ATE88480T1; CN1031379A; NO178663B; AU642089B2; CA1337781C; US5416194A; JP2710653B2; NO891572D0

Abstract

本发明涉及一种新型的多肽及其制造方法，更具体地说是涉及一种能对脂多糖显示出较强亲和性的新型多肽及其制造方法。

Description

新型多肽的制造方法

本发明涉及一种新型的多肽及其制造方法，更具体地说是涉及一种能对脂多糖(内毒素)显示出较强亲和性的新型多肽及其制造方法。

内毒素，是存在于革兰氏(Guramu)阴性菌菌体的毒素的总称，其成份为脂多糖(以下称为LPS)。

以前，作为内毒素除去法已知的有热分解法、超过滤法、通过多粘菌素(Polymyxin)B进行的亲和色谱法等。

然而，热分解法是通过250℃以上的干热处理对LPS进行热分解、并把LPS从玻璃容器等分解并除去的方法，但该法不能利用于把LPS从对热不稳定的物质中的分离。超过滤法对把LPS从低分子量的物质中分离是有效的，但从原理上说则不适用于从高分子物质中分离内毒素。通过多粘菌素B进行的亲和色谱法，如果从利用多粘菌素B所具有的对于LPS的亲和力这一观点来说，可期待其实用化，但是从多粘菌素B所具有的毒性来看，其用途受到了限制，现在实际上没有得到应用。

因此，作为从高分子量的生理活性物质中有效且安全地分离LPS的方法，在实用上有效的至今尚未被发现。

因此，本发明者为开发出对LPS显示出亲合性的新物质(在本发明中，该物质称为LPS—结合多肽，有时简称为LBP)而专心致志不断进行研究，结果从鲎(胄蟹)血球中提取和分离出新型多肽，同时，用诸如固相多肽合成法等合成方法对该多肽的合成已获得成功，进而又发现该多肽能对LPS显示出较强的亲和性，而且具有生物学活性，诸如抗菌性及芽生抑制作用等。由此完成本发明。

本发明涉及下式(I)所表示的多肽：

(式中，Lys表示赖氨酸、Trp表示色氨酸、Cys表示半胱氨酸、Phe表示苯基丙氨酸、Arg表示精氨酸、Val表示缬氨酸、Tyr表示酪氨酸、Gly表示甘氨酸、Ile表示异亮氨酸；X表示羟基或氨基)及其类似物和该多肽的制造方法。

本发明的化合物是由17个氨基酸构成的多肽，在已提取分离的状态下，作为C末端氨基酸的精氨酸的羧基虽已被酰胺化，但即使通过水解而转化成酸，也不会对多肽与LPS的亲和性产生任何影响。

本发明的多肽，可按例如如下方法从鲎(Tachypleus tridenta-tus，Tachypleus gigas及Limulus polyphmus)的血球中提取和分离。

即，对鲎的血球进行低渗(hypotonic)提取之后，将残留物在酸性条件下例如盐酸、硝酸、硫酸等无机酸的稀酸，或在如醋酸等低级脂肪酸的存在而产生的有机酸条件下进行提取。所得到的提取液，通过通常的方法例如凝胶过滤、色谱分离法等分离手段进行纯化，从而分离出多肽。

本发明的多肽可通过固相肽合成法，液相肽合成法等多种合成法进行。

更具体地，例如，在固相合成法中，将N—保护的精氨酸的羧基连结至一个具有氨基的不溶性树脂(有时通过一个既含有羧基又含有可与羧基结合的官能基团的间隔基)之后，使由下式表示的肽序列中的16至1位的保护氨基酸：

1 5 10

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-

15Arg-Arg-Cys-Arg(其中符号与上相同)依次与结合在不溶性树脂上的精氨酸结合，可成功得到保护多肽，然后脱去该不溶性树脂及这些氨基酸的保护基团而获得由式(II)表示的多肽：

1 5 10H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-

15Arg-Arg-Cys-Arg-NH₂(式中的记号与前述同义)

然后使其第3位与第16位，以及第7位与第12位的半胱氨酸分别通过它们的氢硫基(mercapto)进行结合，进而形成二硫键，从而制成本发明的多肽。

作为前述具有氨基的不溶性树脂可以是满足以下条件的任何东西：即通过其氨基能与N-保护的精氨酸的羧基或(根据情况)与之结合的间隔基的羧基进行结合，并且在这之后能够除去。

作为这种不溶性树脂可例举如：氨甲基树脂(氨甲基-聚(苯乙烯-CO-二乙烯基苯)]，二苯甲基(benzhydryl)胺树脂、甲基二苯甲基胺树脂、4-(氨甲基)苯氧基甲基树脂等。如果使用二苯甲基胺树脂、甲基二苯甲基胺树脂、4-(氨甲基)苯氧基甲基树脂，那么就可通过开裂直接得到酰胺，但是从收率的观点来看还是以氨甲基树脂较为理想。

作为具有能与上述场合下存在的羧基进行结合的官能团和羧基的间隔基，必须能把精氨酸的羧基变换成对-羧甲基苄酯的物质，此外并无特别的限制。

这种间隔基与保护精氨酸结合产生的4-(叔丁氧羰基-G-甲苯磺酰基(tosyl)-L-精氨酰氧甲基)苯基乙酸可用J.P.Tam等人[synthesis(1979)P.955～957]的方法进行调制。

所谓的保护氨基酸是按照公知的方法用保护基对官能团进行保护了的氨基酸，已有各种保护氨基酸在市场上出售。对本发明的多肽进行合成时，最好选择以下所示的任何一种保护基。首先，氨基酸的α-氨基的保护基为Boc(叔丁氧羰基)或Fmoc(9-芴基(flourenyl)甲氧羰基)。Arg的胍基(guanidino)的保护基为Tos(甲苯磺酰基)、-NO₂(硝基)、或Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)。作为Cys的氢硫基的保护基，可例举为Bzl(苄基)、M·Bzl(4-甲氧基苄基)、4-Me Bzl(4-甲基苄基)、Acm(乙酰胺甲基)、Trt(三苯甲基)(frityl)、Npys(3-硝基吡啶次磺酰基、t-Bu(叔丁基)或t-BuS(叔—丁基氢硫基)，但是以4-MeBzl、Acm、Npys为最佳。Tyr的羟基的保护基为Bzl、Cl₂·Bzl(2，6-二氯苄基)、t-Bu，或者也可以不保护。Lys的ε-氨基的保护基为Z(苄氧羰基)、Cl·Z(2-氯苄氧羰基)、Boc、或Npys。各保护基必须根据多肽的合成条件进行适当的选择。

保护氨基酸的结合可采用通常的缩合法，例如DCC(二环己基碳化二亚胺)法，活性酯法、混合或对称酸酐法、羰基二咪唑法、DCC-HOBt(1-羟基苯并三唑)法、二苯基磷酰迭氮法等方法进行，但是DCC法、DCC-HOBt法、对称酸酐法为较理想。这些缩合反应通常是在二氯甲烷、二甲基甲酰胺等有机溶剂或这些溶剂的混合溶剂中进行。作为α-氨基之保护基的脱离试剂，可使用三氟醋酸/二氯甲烷、HCl/二噁烷、哌啶/二甲基甲酰胺等，并根据该保护基的种类进行适当地选择。另外，合成的各个阶段的缩合反应之进行程度可通过易·凯查(E·Kaiser)等人的方法[Anal.Biochem.，34，595(1970)](茚三酮反应法)进行检查。

按照如上所述的方法，可以获得具有所需氨基酸序列的保护肽树脂。

在把氨甲基树脂用作不溶性树脂的情况下，例如可在适当的溶剂中通过氨水处理使该树脂脱离。接着，通过用氟化氢进行处理，就可获得前式(II)所表示的其保护基完全脱离的多肽。作为不溶性树脂而使用二苯甲基胺树脂、甲基二苯甲基胺树脂、4-(氨甲基)苯氧基甲基树脂时，可通过用氟化氢进行处理进而使该树脂及其保护基同时脱离。

接着，最好通过用2-氢硫基乙醇等进行还原以使半胱氨酸的氢硫基转化成还原型并加以确认，然后通过氧化处理，可得到所需的产物即酰胺型的环状多肽(I)。

这时的氧化处理可采用公知的方法，通常是使用大气中的氧、或氰铁酸盐(例如氰铁酸钾)之类氧化剂。

如此获得的多肽可通过多肽经常所使用的手段，例如提取、重结晶、各种色谱分离法(凝胶过滤、离子交换、分配、吸收、逆相)、电泳、逆流分布等加以分离纯化，其中，以反相高速液相色谱分离法为最有效。

以下，通过实施例对本发明作更详细的说明，但这些实施例并不对本发明的范围有任何限制。

实施例1

A.本发明的多肽的提取·纯化

在大约50克的鲎(Tachypleus tridentatus)血球中加入150毫升的20mM tris-盐酸/50mM氯化钠/pH8.0的缓冲溶液，用高速均化器(Hiscotron_，日本精密工业株式会社制造)进行3分钟的均化，然后离心(800°rpm，30分钟，4℃)。对沉淀物重复2次上述操作，把血球内的可溶性成分充分提取出之后，获得残留物。

在残留物中加入20mM的盐酸150ml，用高速均化器进行3分钟的均化，离心分离后，获得酸性提取液的上清液。该操作反复进行3次，获得总量大约为400ml的提取液。再通过冷冻干燥使该上清液浓缩干燥。

用20mM的盐酸水溶液对浓缩干固化了的酸性提取物进行再溶解，然后添加在交联葡聚糖G-50(3.0×90.0cm)柱(用20mM的盐酸水溶液预先进行了平衡)中，进行凝胶过滤。收集对LPS(使用来自E.coli 0111B₄菌株的东西)所产生的C因子[鲎血液凝固丝氨酸蛋白酶前驱体；由本发明者起名的LPS敏感性因子，Nakamura，et al.，Eur.J.Biochem.，154,511(1986)]的活化有抑制作用的洗脱部分，把收集部分的pH用氢氧化钠水溶液调节至6。

在预先用20mM的醋酸缓冲溶液(pH＝6.0)平衡了的CM—琼脂糖CL-6B柱中加入上述样品，用含有0～0.3M的氯化钠的20mM醋酸缓冲溶液(pH6.0)进行梯度洗脱。收集对C因子活化有抑制作用的部分，作为LPS结合物质的最终纯化样品(本发明的新型多肽)。所得的量为：从约50g血球中得约30mg。

B.纯度检定

(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

在还原剂(β-氢硫基乙醇)不存在或存在的条件下，对LPS结合多肽进行含有8M尿素的12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(Weber-Os-born系)，并用考马斯亮蓝R-250进行染色，其结果均显示出分子量约为2000的单一色带。其结果如图1所示。在图1中，左侧的色带表示不存在还原剂时的多肽，中央的色带表示还原剂存在时的多肽，右侧的色带表示肌红蛋白标准蛋白质[SDS.PAGE标记物III.FlukaAG(瑞士)]产生的肌红蛋白(16.9KDa)、肌红蛋白I＋II(14.4KDa)、肌红蛋白(8.2KDa)、肌红蛋白III(2.5KDa)的位置。

(2)反相高速液相色谱

用反相高速液相色谱分析法(分离柱为Cosmoil 5C₁₈P、肽的洗脱使用0.1％三氟醋酸/乙腈0～98％的梯度系统)对本发明的多肽进行了分析，其结果显示出单峰。

C.氨基酸组成值

在110℃的温度下，用5.7M的盐酸水溶液对样品分别进行24、48、72小时水解，然后用日立835氨基酸分析仪进行了分析。对半胱氨酸(cysteine)，将样品进行过甲酸氧化后，在110℃的温度下用5.7M的盐酸水溶液进行24小时的水解，此外，关于色氨酸，将试样在110℃的温度下用3M的氢硫基乙磺酸进行24小时的水解，接着分别用氨基酸分析仪进行分析。根据用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量，判明：该多肽是由17个氨基酸构成的纯碱性多肽。氨基酸的分析结果如下表示：

表1

氨基酸残基/分子

Gly 1.2(1)

Cys/2 3.8(4)

Val 1.0(1)

Ile 0.9(1)

Tyr 1.8(2)

Phe 1.0(1)

Lys 0.9(1)

Trp 1.0(1)

Arg 4.8(5)

合计 17

D.氨基酸序列的确定与C末端精氨酸酰胺的鉴定

使用原样品约23微克，采用Beckman 890D序列分析仪，对氨基酸的序列可从氨基末端，一直鉴别到15号残基(半胱氨酸除外)。另外，使用还原烷基化样品[用M.A.Hermodson，et.al.，Bio-chemistry，12，3146(1973)的方法对本发明的多肽进行S-吡啶乙基化了的物质]约36微克，可一直鉴定到16位残基(包括半胱氨酸)。进而根据氨基酸的分析值推断出剩下的第17个氨基酸残基(C末端残基)为精氨酸。但是，对于C末端的精氨酸，即使使用原样品、吡啶乙基化了的样品、用羧肽酶(以下称为在CPase)Y和B进行消化，也全然测不出。于是，先用30mM的盐酸在110℃的温度下，在温和的条件下对样品水解10个小时后，再用CPaseB进行处理。其结果，发现：每1摩尔的本发明的多肽约有0.5摩尔的游离精氨酸，也可判断出：C末端的精氨酸的羧基被酰胺化的可能性很大。该酰胺化合物的理论分子量(计算值MW＝2264)与质量分析所测得的值完全一致，根据这一事实可以确认：C末端精氨酸的羧基已被酰胺化。

E.二硫(S—S)键的鉴定

本发明的多肽中的4个半胱氨酸得到了鉴定，它们都以二硫键结合。这一点也通过比较实验[在还原剂(二硫苏糖醇)的存在或不存在下的S—吡啶乙基化]而弄清楚了。于是，为了鉴定二硫键的位置，在不发生二硫键的交换反应的条件下(酸性条件下，PH6.5)对原样品进行胰蛋白酶消化，然后用上述反相高速液相色谱(分离柱为Cosmosil 5C₁₈P，肽的洗脱使用0.1％三氟醋酸/乙腈系)对消化物进行分离。对所得的肽的氨基酸组成进行测定结果判明：从氨基末端起的第3个与第16个、第7个与第12个分别形成为二硫键。

F.本发明的多肽的LPS结合活性

本发明的多肽对0.1微克/毫升的LPS(使用来自E.coli0111B4菌株的东西)产生的C因子的活化(以[C因子]表示的抑制作用在0.05μM(0.12微克/毫升)的浓度时为50％，1μM(2.3微克/毫升)的浓度时则完全抑制。此外，本发明的多肽在使用1％琼脂糖(agarose)凝胶的二重扩散试验中已观察到它与LPS形成了高分子复合体并形成了沉降线。

本发明的多肽对LPS产生的C因子的活化抑制效果的试验结果显示在图2及图3。图2及图3分别显示了氯化钠不存在及存在(1M)时的结果。作为对照，使用了显示(本发明者首次明确了的)与LPS进行电结合性质的高分子碱性物质聚赖氨酸。在图2及图3中(○)及(●)的记号分别表示本发明的多肽以及赖氨酸的结果。

根据这些结果可以判断出：本发明的新多肽与LPS并不仅是单纯的电结合，还具有不受盐浓度影响的较强的亲和性。

G.吸光度的测度

本发明多肽的99.2微克/毫克水溶液的紫外部分吸收光谱显示在图4。在276nm处具有吸收峰值。因为280nm处的吸光度为0.3842，所以可算出：1％水溶液在280nm处的吸光度为38.7。

实施例2

A.氨甲基树脂中导入精氨酸

(1)4—(溴甲基)苯乙酸苯乙酮酯的合成

室温下，在75ml乙腈中加入3.98g(20mmol)α—溴乙酰苯及3.49g(60mmol)氟化钾，形成悬浊液，搅拌下，将4.58g(20mmol)4-(溴甲基)苯乙酸分成6等份，每30分钟添加一份，添加结束后，再连续搅拌2小时。反应结束后，滤去不溶物，蒸去液中的溶剂，残留物用醋酸乙酯再溶解，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次，再用蒸馏水、柠檬酸、蒸馏水洗涤1次，用硫酸钠干燥。蒸馏除去醋酸乙酯，从石油醚中结晶，得到5.5g目的产物(熔点84～85℃)。使该目的产物重结晶，得到5.2g熔点为85～86℃的结晶物(收率为75％)。

(2)4-(叔丁氧羰基-G-甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基)苯乙酸的合成

将由叔丁氧羰基-G-甲苯磺酰基-L-精氨酸4.71g(11mmol)、4-(溴甲基)苯乙酸苯乙酮酯3.47g(10mmol)、氟化钾1.28g(22mmol)、水0.8ml(44mmol)、乙腈50ml及二甲基甲酰胺10ml组成的混合物在室温下激烈搅拌24小时。自然滤去生成的不溶物，蒸发滤液，浓缩至15～20ml。添加80ml醋酸乙酯后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，用蒸馏水洗涤1次，用饱和柠檬酸洗涤2次，再用蒸馏水洗涤1次，用硫酸钠干燥。蒸馏除去溶剂，用石油醚处理残留物，得到半固态的4-(叔丁氧羰基-G-甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基)苯乙酸苯乙酮酯。

使之溶解于105ml醋酸中，加入水19ml及锌13.1g，室温下激烈搅拌5.5小时。用硅藻土(ハイフ口ス—パ—セル)及醋酸乙酯将锌滤去，滤液中加入醋酸乙酯400ml及水300ml，分出醋酸乙酯层，用水洗涤10次，用硫酸钠干燥后，蒸馏除去溶剂，在石油醚中将残留物磨细，得到4.77g4-(叔丁氧羰基-G-甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基)苯乙酸。该物质经薄层层析得到一个斑点的近乎纯品的目的物。

(3)4-(叔丁氧羰基-G-甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基)苯乙酰氨基甲基树脂的合成。

将4-(叔丁氧羰基-G-甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基)苯乙酸577mg(1.0mmol)、氨甲基树脂(株式会社肽研究所出售、1％交联)2.00g及DCC206mg(1.0mmol)在二氯甲烷中用常规方法使发生偶合，经确认每1g树脂中有0.284mmol的偶合存在。

B.第16位半胱氨酸的引入

对1.0克4-(叔-丁氧羰基-G-甲苯磺酰基-L-精氨酰氧甲基)苯期乙酰氨基树脂1.0g[0.284mmolArg(Tos)/g树脂]用25毫升的二氯甲烷进行4次洗涤，每次为1分钟，然后过滤。接着在该树脂中加入25毫升30％的三氟醋酸溶液(溶剂：二氯甲烷)、搅拌30分钟，从而使Boc基团脱离。接着用下列溶剂各25毫升依次对所得到的树脂进行处理，并在各次处理后进行了过滤。

二氯甲烷 (1次，1分钟)

二噁烷 (1次，1分钟)

二氯甲烷 (1次，1分钟)

二噁烷 (1次，1分钟)

二氯甲烷 (2次，每次2分钟)

10％三乙胺(二氯甲烷溶液) (1次，2分钟)

(1次，5分钟)

二氯甲烷 (4次，每次1分钟)

接着，把上述树脂与25毫升二氯甲烷，以及3.5倍于总精氨酸量的当量的保护氨基酸即Boc-Cys(4-MeBzl)310毫克(0.994毫摩尔)一起搅拌1分钟。加入DCC205毫克(0.994毫摩尔)的二氯甲烷溶液25毫升并进行2小时搅拌。接着再用下列溶剂25毫升依次对所得的树脂进行处理，每次处理后再进行过滤。

二氯甲烷 (1次，1分钟)

异丙醇 (1次，1分钟)

二氯甲烷 (1次，1分钟)

异丙醇 (1次，1分钟)

二氯甲烷 (3次，各1分钟)

C.第15～1位氨基酸的引入

与步骤B同样地，在先前得到的树脂中依次偶合上与前述式(II)所表示的多肽的15位到1位的组成氨基酸相对应的保护氨基酸。表2中显示了各反应阶段中所使用的保护氨基酸。保护氨基酸的使用量均为相对于总精氨酸量的3.5当量。

此外，Boc-Arg(Tos)的偶合是通过DCC-HOBt法，使用相对于DCC的二倍摩尔的HOBt进行的。

表2

氨基酸的位置保护氨基酸

15 Boc-Arg(Tos)

14 Boc-Arg(Tos)

13 Boc-Tyr(Bzl)

12 Boc-Cys(4-MeBzl)

11 Boc-Ile

10 Boc-Gly

9 Boc-Arg(Tos)

8 Boc-Tyr(Bzl)

7 Boc-Cys(4-MeBzl)

6 Boc-Val

5 Boc-Arg(Tos)

4 Boc-Phe

3 Boc-Cys(4-MeBzl)

2 Boc-Trp

1 Boc-Lys(Cl·Z)

1位的氨基酸引入后，用二氯甲烷把树脂肽回收到玻璃过滤器中，然后减压干燥，得到1.781克的干燥树脂肽。

D.树脂的脱离

在甲醇以及二甲基甲酰胺中用氨(无水)对步骤C中得到的干燥树脂肽进行处理，脱去树脂。得到0.765克(0.196毫摩尔)的用下式：

H-Lys(Cl·Z)-Trp-Cys(4-MeBzl)-Phe-Arg(Tos)-Val-Cys(4-MeBzl)-Tyr(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Ile-Cys(4-MeBzl)-Tyr(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-NH₂所表示的保护多肽。其分子量为3904。

E.保护基的脱离

在苯甲醚中于1，2-乙二硫醇的存在下用氟化氢对在步骤D中所得到的保护多肽加以处理，接着再用阴离子交换树脂(Cl^-型)及冷冻干燥处理，得到470毫克(0.186毫摩尔)由下式：

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-NH₂7HCl所表示的多肽盐酸盐。其分子量为2523。

F.多肽的环化

将30毫克在步骤E中得到的多肽盐酸盐于含有200倍摩尔的过剩的2-氢硫基乙醇的0.1M的Tris-HCl(PH8.5)中在室温下放置一夜。然后用已用1％醋酸平衡了的Sephadex G-10柱进行处理得到8.5毫克的氧化型多肽。

通过反相高速液相色谱[使用的分离柱为TSK-凝胶ODS-120T(0.46×25cm)，肽的洗脱液为0.01M甲酸-三乙胺(PH4.5)(A)-含20％(A)的乙腈(B)]对上述氧化型多肽进行分析，结果显示它与实施例中所获得的天然多肽的峰值是一致的，此外将两者加以混合，所得的产物的峰值变成2倍，由此确认两者为同一物质。

试验例1本发明多肽的生物活性

A.材料及方法

(1)LPS S型采用了Salmonella minnesota 1114 W、E.coli0111：B4、E.coli 0113，Re型采用了Salmonella minnesota R595、E.Coli J5的纯化了的LPS。

(2)LPS致敏的红血球

在主要为2.5％人O型红血球的1毫升悬浮液中加入0.5毫升浓度为1毫克/毫升的LPS，在3.7℃的温度下进行1小时的混合搅拌，再用生理盐水加以洗涤。

(3)溶血活性

将0.5％LPS致敏红血球50微升与0.5％本发明的多肽的2倍系例稀释液50微升及Tris-HCl食盐的缓冲液(PH7.2)100微升，在37℃下保持1小时，再加入生理盐水2.3毫升，然后离心分离(2500rpm2分钟)，用412nm的吸收对上清液中的血红蛋白进行定量。再将0.5％的LPS致敏红血球50微升与0.5％本发明的多肽的2倍系列稀释液50微升在37℃下保温1小时后用微型培养皿读数器(Corona MPT-100)对其在微型培养皿上的溶血类型进行630nm测定。

(4)抗菌活性

在Penassay培养基或Jarvis合成培养基160微升上加入0.5％本发明的多肽的2倍系列稀释液20微升、菌液(10⁶～10⁷/ml)20微升进行培养，在37℃下经过18小时后用微型培养皿读数器对其浊度加以55nm测定，也测定了一部分存活菌数和抑菌圈。

(5)凝胶内的沉降反应

在溶解于pH7.2的Tris-HCl-食盐缓冲溶液、pH8.6的佛罗那(Veronal)缓冲溶液、pH4.6的醋酸盐缓冲溶液中的1％琼脂糖(加入0.1％NaN₃)中的LPS与本发明的多肽或抗LPS因子(从鲎血球的提取液(溶胞产物)得到的由具有102个氨基酸残基组成的、分子量11,600的碱性蛋白质，以下称为ALF)之间所形成的沉降线进行酰胺染色。本发明的多肽的稀释使用了pH7.2的Tris HCl 50mM-NaCl 0.15M。

B.结果

(1)溶血活性

对于用Slmonella minnesota 1114 W、R595、E.coli 0113的任何LPS致敏的红血球，本发明的多肽在2～3微克/毫升的浓度时可引起溶血，在高浓度的情况下，即使是室温下也能迅速发生溶血，另外，因游离LPS而使溶血受到抑制这一点与ALF相同，然而，在3.13微克/毫升的浓度以上时也观察到了非致敏红血球的溶血。总之，溶血活性比ALF弱。

(2)抗菌活性

本发明的多肽对Salmonella typhimurium LT 2(S)、1102(Re)、Salmonella minnesota 1114 W(S)、R595(Re)的任何一种都显示抗菌活性，抗菌量对于LT2为3.13微克/毫升，对于1102为1.56微克/毫升。此外，即使对Staphylococcus aureus这类革兰氏阳性菌也显示抗菌活性。在含菌琼脂下则产生了与浓度相对应的抑菌圈。一般说来，比ALF的抗菌活性强。

(3)凝胶内沉降反应

本发明的多肽对Salmonella minnesota 1114 W、R595、E.coli0111：B4、0113、J5的任何一种LPS，均能因凝胶内的沉降反应而产生陡峭的沉降线，对不同种类的LPS的沉降线相互间产生了融合。

发明的效果

本发明的多肽对LPS显示了很强的亲和性，作为内毒素的除去段十分有效，此外，作为细菌感染症的治疗剂也很有效。

图面的简单说明

图1显示了本发明多肽的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。图2及图3显示了本发明的多肽对LPS所产生的C因子的活性所带来的抑制效果。并展示其试验结果。图4为本发明的多肽的紫外部分吸收光谱。

Claims

1.一种由下式表示的多肽的制备方法；

式中Lys表示赖氨酸，Trp表示色氨酸，Cys表示半胱氨酸，Phe表示苯丙氨酸，Arg表示精氨酸，Val表示缬氨酸，Tyr表示酪氨酸，Gly表示甘氨酸，Ile表示异亮氨酸；X表示氨基。

其特征是：

所述方法包括，使N—保护的精氨酸的羧基直接与具有氨基的不溶性树脂相结合，或通过一间隔基，该间隔基即具有一个羧基，又具有一个可结合至N保护的精氨酸的羧基的官能团，使N保护的精氨酸的羧基与具有氨基的不溶性树脂相结合，然后，根据固相合成法，将由下式：

1 5 10

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-

15Arg-Arg-Cys-Arg

(式中的记号与前述同义)

所表示的多肽第16位至第1位的保护氨基酸依次与结合在不溶性树脂上的精氨酸进行结合，得到保护多肽，然后使该不溶性树脂及其氨基酸的保护基脱离，从而获得由下式：

1 5 10

H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-

15Arg-Arg-Cys-Arg-NH₂

(式中的记号与前述同义)

所表示的多肽，并使其第3位与第16位，以及第7位与第12位的半胱氨酸分别通过它们的氢硫基进行结合，形成二硫键。

2.一种具有分子量约为2000的、具有抗菌活性和脂多糖亲和性

的；特别是具有下述结构式的多肽的制造方法：

式中Lys表示赖氨酸，Trp表示色氨酸，Cys表示半胱氨酸，Phe表示苯丙氨酸，Arg表示精氨酸，Val表示缬氨酸，Tyr表示酪氨酸，Gly表示甘氨酸，Ile表示异亮氨酸，X表示氨基，其特征在于对鲎血球进行低渗提取，以获得一低渗提取残留物，在足以使该低渗提取残留物释放出多肽的酸性条件下萃取该低渗提取残留物，以获得一低渗提取残留物的提取物；纯化该提取物中的多肽。

3.如权利要求2所述的制造方法，其特征是鲎至少为Tachy-pleus tidentatus，Tachypleus gigas或Limulus polyphemus中的一种。