CN103130889A - 一种Exendin-4类似物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程制备活性肽领域，公开一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽及其制备方法和应用。利用本实验室的融合表达制备技术平台，构建在大肠杆菌细胞内融合表达Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽的工程菌。酸切割融合蛋白可获得目的肽Pro-Pro-Exendin-4-Asp，通过镍柱亲和层析分离获得目的肽。对正常雄性ICR小鼠口服葡萄糖负荷后具有显著的降血糖作用而不引起低血糖，显著促进胰岛素的分泌；对小鼠空腹血糖无显著性影响；能够显著性抑制半固体食糜在肠道中的蠕动，对于二型糖尿病具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程制备活性肽领域，公开一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽及肽的融合表达工程菌的构建、融合蛋白酸水解、镍柱亲和层析制备Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽的方法及体内动物实验检测其对正常雄性ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖和血清胰岛素水平，空腹血糖及肠蠕动的影响。
技术背景
2005年，美国FDA批准化学合成的Exendin-4用于治疗二甲双胍及磺酰脲类药物血糖控制不理想的2型糖尿病患者(商品名Byta)，做为首个批准上市的肠降糖素类似物，Exendin-4受到了广泛的关注。其具备的多种生理功能正是针对糖尿病患者中普遍存在的异常，其生理功能主要包括：(1)促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，不会使患者出现低血糖甚至休克的副作用；(2)刺激胰岛β细胞再生；(3)抑制餐后胰高血糖素的分泌；(4)延缓胃排空以及食物在肠道中的蠕动；(5)通过作用于中枢神经系统抑制食欲。
Exendin-4的生理功能决定了它可以对糖尿病起到综合治疗作用，但化学合成方法存在成本较高，价格昂贵，步骤多，收率低，过程涉及有害化学物质等缺点，因此我们尝试以基因工程方法来制备Exendin-4类似物，以提高产量，降低成本。本发明旨在通过构建Exendin-4类似物的高效表达载体，分离纯化出目的肽，为Exendin-4类似物的基因工程生产提供依据。
由于Pro-Pro-Exendin-4-Asp分子量较小，在基因工程方法合成过程中常常容易被细菌胞内的酶所降解，基因工程中通常都将这种小肽与分子量稍大的融合伴侣连接实现共表达，表达后用凝血酶或肠激酶将融合伙伴与目的肽分离，但这种切割酶价格较为昂贵，不适合进行大规模的生产制备。本专利在融合伙伴与目的肽之间添加酸水解位点Asp-Pro-Pro，只需在50mmol/L盐酸中48℃水解48h就可以将两者水解开，大大降低了生产成本，适用于工业生产。Pro-Pro-Exendin-4-Asp进入体内后Pro-Pro-即可被二肽基肽酶IV及PPCE酶水解释放为Exendin-4(1-35)-Asp发挥降糖作用。
发明内容
本发明的目的是公开一种融合表达且可酸水解释放Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供相应的编码序列，载体和宿主菌。
本发明的另一个目的是Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽具有显著的葡萄糖浓度依赖性降糖及促进胰岛素分泌，不致于引起空腹血糖降低，抑制食物在肠道中的蠕动的活性。
在本发明的另一方面，提供了一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽，它是在天然Exendin-4(1-39)N端添加了二肽基肽酶(DPP IV)切割位点及PPCE酶切位点，同时C端接加1个Asp。
在本发明的第二方面，提供了一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4，5所述的质粒载体及其工程菌。
(b)从培养物中分离出SEQ NO：1所示氨基酸序列的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽。
(c)纯化出Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽。
(d)进入体内后Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽被二肽基肽酶(DPP IV)及PPCE酶酶切，形成Exendin-4-Asp肽。
在一优选例中，本发明的方法中，所述的步骤(b)包括：
通过溶菌，洗涤，镍柱亲和层析等方法分离出Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽与融合伙伴C末端组成的融合蛋白；酸水解的方法从所述融合蛋白中切下融合伙伴，得到Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽。
在另一优选例中，所述的步骤(c)包括通过反向镍柱亲和层析分离出Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽，透析除盐并冻干。
在本发明的第二方面，对正常ICR小鼠(5-7周龄)皮下注射Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽后，一次性灌胃给予高浓度葡萄糖，测定在不同时间点的血糖变化及20min时血浆中胰岛素分泌水平；对正常ICR小鼠(5-7周龄)皮下注射Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽后测定在不同时间点的血糖变化；对正常ICR小鼠(5-7周龄)皮下注射Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽后，灌胃给予黑色半固体糊，15min后将小鼠脱臼处死测定半固体食糜在肠道中的推进率。
附图说明
图1重组质粒构建原理示意图。
DPP为酸水解位点，D代表Asp，P代表Pro。
图2PCR获得Pro-Pro-Exendin-4-Asp基因的凝胶电泳检测结果。
图3Pro-Pro-Exendin-4-Asp的基因测序图。
图415％SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白结果。
图515％SDS-PAGE电泳检测重组菌经镍柱亲和层析纯化融合蛋白结果。
图6小肽电泳检测融合蛋白酸水解情况。
Lan1：融合蛋白酸水解0h，Lan2：融合蛋白水解12h，Lan3：融合蛋白水解36h，Lan4：融合蛋白水解48h。
图7小肽电泳检测Pro-Pro-Exendin-4-Asp纯化结果。
Lan1：等电点沉淀上清，Lan2：反向镍柱亲和层析获得的Pro-Pro-Exendin-4-Asp。
图8反向高效液相分析Pro-Pro-Exendin-4-Asp纯度。
图9Pro-Pro-Exendin-4-Asp的电喷雾质谱图。
图10单次皮下注射Pro-Pro-Exendin-4-Asp对健康小鼠糖负荷后血糖的影响。
图11单次皮下注射Pro-Pro-Exendin-4-Asp对健康小鼠糖负荷后血清胰岛素水平的影响。
图12单次皮下注射Pro-Pro-Exendin-4-Asp对健康小鼠空腹血糖的影响。
图13单次皮下注射Pro-Pro-Exendin-4-Asp对健康小鼠肠道蠕动的影响。
具体实施方式
以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。
本说明书中所提到的材料中：
(1)宿主菌和质粒
宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工程菌种，基因工程研究相关的实验室一般都有保存。hispED载体为本实验室构建并保存。
(2)酶和试剂
分子克隆工具酶为Fermentas公司；质粒抽提试剂盒为南京天为生物科有限公司；PCR胶回收试剂盒为Takara公司的产品；血糖试纸及血糖仪均购自台湾博士珑，胰岛素含量测定试剂盒购自美国R&D公司。
黑色半固体糊的配制：称取2g羧甲基纤维素钠，加入50ml蒸馏水中，完全湿化，再依次加入3.2g全脂奶粉、1.6g葡萄糖、1.6g淀粉、1.0g活性炭，每加入一种搅拌2min，冷藏36h，使其中的气体释放，4℃保存，用前在37℃水浴中，剧烈搅拌。
(3)培养基
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989。
玉米浆培养基配方：玉米浆40g/L，牛肉浸膏21g/L，谷氨酸钠14g/L。
Ni-fast flow为美国GE公司产品。
本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
实施例1Pro-Pro-Exendin-4-Asp基因的克隆
本实验利用重叠PCR技术，采用具有互补末端的4条引物M1、M2、M3、M4，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，形成Pro-Pro-Exendin-4-Asp的基因序列。四条引物序列如下：
M1：5′-ATAGGATCCACCACATGGCGAAGGCACCTTTACCAGCGATCTGAGCAAA CAG-3′
M2：5′-CAAT AAACAGACGCACCGCTTCTTCTTCCATCTGTTTGCTCAGATCGCTG-3′
M3：5′-GCT TGGACCACCGTTTTTCAGCCATTCAATAAACAGACGCACCGC-3′
M4：5′-TATA AGCTTAATCGCTTGGTGGTGGTGCACCGCTGCTTGGACCACCGTTTTTC-3′
引物由捷瑞测序公司合成。PCR反应在eppendorfPCR扩增仪上进行。其中M1、M2、M3、M4按1∶1∶1∶1浓度比例混合，于94℃，30s；56℃，30s；72℃，1min；共30个循环。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图2)，条带位置与预期的146bp一致。
PCR产物经凝胶回收获得的目的基因片段和hisPED载体质粒分别经BamH I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用T4DNA连接酶16℃连接，转化至E.coli BL21感受态细胞后涂布到含50mg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，PCR方法初筛阳性克隆，将阳性克隆送至捷瑞测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(参见附图3)。
实施例2Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽基因在大肠杆菌中的表达及培养
重组表达菌以1％接种量在液体LB培养基中37℃振荡过夜，8％的接种量转接于玉米浆发酵液中，培养4h后加入终浓度为5mmol/L乳糖诱导表达，12h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析(参见附图4)。融合蛋白在诱导后12h达到稳定的最大表达量，并在胞内以可溶形式表达。
实施例3融合蛋白的分离纯化
挑选高表达量菌株，接种于LB培养中，37℃过夜培养；过夜培养液转接入玉米浆培养基，37℃扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。12000r/min离心15min，上清及沉淀均留样。pH7.4，50mmol/L的Tris·HCl漂洗2次菌体沉淀；向收集的菌体中加入配制好的菌体裂解液(4ml/g菌体)，放置于37℃摇床恒温剧烈振荡过夜，以充分裂解菌体；裂解至溶液不粘滞时取出裂解液，12000r/min离心15min，收集沉淀，称重，上清及沉淀均留样标记。
菌体裂解液的上清液用0.45μm滤膜过滤确保澄清、无颗粒物，以免堵塞柱子、缩短其使用寿命，用镍亲和层析柱纯化，同时样品及Binding buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争，影响柱效。相关操作过程参照GE公司提供的操作指南进行。具体过程如下：转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用双蒸水洗涤镍亲和层析柱，以除尽基质中的乙醇和空气，并防止下一步Ni2+沉淀；用ddH2O洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；10×柱体积的Binding buffer平衡→上样(手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定)→10×柱体积的Binding buffer洗涤，收集流出液→Elution Buffer洗脱→得到融合蛋白(参见附图5)。
实施例4融合蛋白的酸水解
将融合蛋白加入50mmol/L盐酸溶液(融合蛋白终浓度为5％)置于48℃水浴锅中进行酸水解，水解48h(参见附图6)。将酸水解后的溶液pH分别调至5.5进行等电点沉淀，4℃冰箱中放置2h，离心去除沉淀的杂蛋白，留Pro-Pro-Exendin-4-Asp及融合伴侣含量丰富的上清。
实施例5Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽的分离纯化
将实施例4得到的等电点沉淀离心后的上清液透析冻干后，溶于Bindingbuffer中，收集样品流出液，得到Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽，透析后冻干，进行Tris-Tricine-PAGE电泳鉴定，见图7。
实施例6Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽的反向高效液相分析
RP-HPLC鉴定：分析条件如下：
流动相A：1/1000三氟乙酸(TFA)，流动相B：99.9％乙腈，1/1000三氟乙酸(TFA)，从A到B进行线性梯度洗脱，40min，流速1.0ml/min，室温检测，波长为：215nm。
待测样品：1.0mg/ml溶解于1/1000TFA。
结果如附图8，通过计算得到样品纯度为94.01％。
实施例7Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽的质谱分析
由中国药科大学完成。
方法为：电喷雾质谱。
通过电喷雾质谱分析Exendin-4类似物2的分子量为4494.2Da，与理论分子量4494.14Da基本一致(附图9)。
实施例8Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽的小鼠口服葡萄糖耐量实验
正常5-7周龄雄性ICR小鼠，按体重随机分为5组(n＝6)，称量体重并用苦味酸溶液标记，每组6只。实验前一天禁食过夜(10:00pm-8:00am)，仅给予饮水。Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽给药组皮下注射分别给予0.125μg/kg、0.5μg/kg、2
μg/kg样品；阳性药组给予Exendin-40.5μg/kg；空白对照组小鼠皮下给予等量磷酸盐缓冲液。各组小鼠分别于给药15min后立即灌胃2.0g/kg葡萄糖，并于葡萄糖负荷后0min、30min、60min、120min、180min、240min对小鼠进行尾静脉取血，血糖仪测定血糖浓度。
如图10所示，与空白对照组相比，Exendin-4标准品及Pro-Pro-Exendin-4-Asp高、中、低剂量组，在30min时显示出极为显著性的降糖作用(P＜0.01)，并且随着剂量的增加，降糖作用逐渐增强，60min时，与空白对照组相比，各组仍然具有较为显著的降糖作用(P＜0.05)，120min-240min降糖作用于空白对照组相比无显著性差异，血糖能够平稳恢复至正常水平。在30min、60min两个时间点，随着剂量的增加血糖降低百分率也在相应升高，说明Pro-Pro-Exendin-4-Asp对葡萄糖负荷后血糖升高的影响量效关系明显；相同剂量的Pro-Pro-Exendin-4-Asp与Exendin-4标准品作用相近。
实施例9Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽的促胰岛素分泌作用
正常ICR小鼠，雄性，5-7周，实验前一天禁食(10:00pm-8:00am)，仅给予饮水。Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽给药组皮下注射分别给予0.125μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg样品；阳性药组给予Exendin-40.5μg/kg；空白对照组小鼠皮下给予等量磷酸盐缓冲液。各组小鼠分别于皮下给药后灌胃2.0g/kg葡萄糖，20min后小鼠尾静脉取血100μl，快速吹入离心管中(预加20μl 0.1mol/L EDTA)，4℃4000r/min离心3min，取上清，保存于-20℃，小鼠胰岛素检测试剂盒测定胰岛素浓度。
空白对照组、阳性药组、Pro-Pro-Exendin-4-Asp低、中、高剂量三个给药组促进胰岛素分泌的结果如图9所示，Pro-Pro-Exendin-4-Asp低、中、高剂量三个给药组与空白组相比，促进胰岛素分泌作用具有极显著差异(P＜0.01)，说明Pro-Pro-Exendin-4-Asp具有较好的促胰岛素分泌作用并且相同剂量的Pro-Pro-Exendin-4-Asp与Exendin-4标准品作用相近。
实施例10Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽对正常小鼠空腹血糖无降低作用
正常雄性ICR小鼠，雄性，5-7周，实验前一天禁食(10:00pm-8:00am)，仅给予饮水。Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽给药组皮下注射分别给予0.125μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg样品；阳性Exendin-4组皮下注射给予0.5μg/kg样品；空白对照组小鼠皮下给予等量磷酸盐缓冲液；各组小鼠分别于皮下给药后测定各时间点血糖。
与各药物0min血糖相比，Exendin-4及Pro-Pro-Exendin-4-Asp在给药后血糖有稍有降低，无统计学差异；30min时各组血糖均上升，这可能是由于在捉持给药时使小鼠产生了应激性高血糖，此后动物血糖均保持在正常范围(5.3mmol/L)，动物状态良好，说明两种类似物并不会引起空腹小鼠的血糖低于正常水平，说明这种降糖作用是血糖依赖性的；与空白对照组血糖相比并无显著性差异；相同剂量的Pro-Pro-Exendin-4-Asp与Exendin-4标准品作用相近，见图12。
实施例11Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽的抑制胃肠蠕动作用
正常雄性ICR小鼠5-7周，实验前一天禁食过夜(10:00pm-8:00am)，仅给予饮水。Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽给药组皮下注射分别给予0.125μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg样品；阳性Exendin-4组皮下注射给予0.5μg/kg样品；空白对照组小鼠皮下给予等量磷酸盐缓冲液。给药15min后各组灌胃黑色半固体糊(0.5mi/只)，于给半固体糊15min后脱颈椎处死动物。立即打开腹腔，快速游离出胃贲门至回盲部的全部小肠，测量小肠全长以及黑色糊自幽门下移的距离。计算碳墨推进百分率(％)″＝(墨汁下移距离÷小肠全长)×100％″。
结果显示Pro-Pro-Exendin-4-Asp多肽可使半固体食糜在小肠中的推进速率明显减缓，呈剂量依赖关系，最高剂量组约为对照组的35％，相同剂量的Pro-Pro-Exendin-4-Asp与Exendin-4标准品作用相近，见图13。
除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp，其中Pro-Pro-Exendin-4-Asp的氨基酸序列为：
Pro-Pro-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Asp(SEQ ID NO：1)。
2.根据权利要求1所述的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp，其特征在于，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp，其特征在于：该类似物分子量为4494.2Da，Pro-Pro-Exendin-4-Asp N端添加的2个脯氨酸(Pro)可以与融合伙伴的C端天冬氨酸(Asp)形成酸水解位点，在盐酸作用下可以断开；Pro-Pro-Exendin-4-Asp的C端添加一个Asp，形成的Pro-Pro-Exendin-4-Asp类似物依然能保持显著的生物活性，能够有效降低血糖而不引起低血糖，促进胰岛β细胞分泌胰岛素，不会使空腹血糖降低，及抑制半固体食糜在肠道中的蠕动的能力。
4.一种载体，其特征在于：它含权利要求2所述的核苷酸序列及权利要求3所述的重组方法：将Pro-Pro-Exendin-4-Asp基因与本实验室构建的hisPED载体上的融合伙伴的DNA片段连接，构成新的融合蛋白基因。该融合蛋白基因位于hisPED载体T7启动子的下游。这个重组的融合表达质粒称hisPED-Pro-Pro-Exendin-4-Asp。
5.一种基因工程菌，其特征在于：含有权利要求4所述的载体。
6.包括权利要求4所述的该类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp的重组方法，其特征在于：该融合伙伴与活性多肽之间以Asp-Pro-Pro-连接，这种连接对酸敏感。
7.一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：
(I)在适合的表达条件下，权利要求5所述的宿主菌。
(II)通过溶菌，镍柱亲和层析方法，分离出Pro-Pro-Exendin-4-Asp与融合伙伴C末端组成的融合蛋白；用酸水解方法切割融合蛋白，形成权利要求1所示的Pro-Pro-Exendin-4-Asp的氨基酸序列。
(III)通过镍柱亲和层析分离出Pro-Pro-Exendin-4-Asp。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的步骤(III)中的Pro-Pro-Exendin-4-Asp肽进入体内后，被体内丰富的二肽基肽酶IV及PPCE酶迅速切掉Pro-Pro-Exendin-4-Asp N端的Pro-Pro-，形成Exendin-4-Asp，这对于研制抗二肽基肽酶IV降解的长效激素是有益的。
9.根据权利要求1所述的Exendin-4类似物的活性，其特征在于：所述的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4-Asp依然具有以葡萄糖浓度依赖方式降低血糖而不引起低血糖，促进胰岛素分泌，不会降低空腹血糖，抑制食物在肠道中的蠕动的作用，且作用效果显著，有望用于治疗二型糖尿病。
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