CN103114062B - 一株具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌及其应用，该菌株命名为假产碱假单胞菌CL-1，Pseudomonas pseudoalcaligenes CL-1，属于假产碱假单胞菌，已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M2012225。该菌株为革兰氏阳性，短杆菌，菌落圆形乳白色、中凸、有光泽、边缘光滑透明。该菌生长周期长，前24h氮磷去除率分别为56.93%、43.56%，整个生长周期氮磷去除率分别为75.6%和57.5%。该菌株具有完全的反硝化能力，能将硝氮、亚硝氮等无机氮直接还原为无害的氮气排出水体。使用其处理含氮磷废水工艺简单，处理效果高效稳定，节约运行成本，且不产生NO、N₂O等温室气体，不造成空气污染。

Description

一株具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有完全反硝化酶系的兼性厌氧反硝化聚磷菌的培养及其应用，属于环境微生物领域。

背景技术

随着我国经济的快速发展，水环境污染已成为社会各界关注的主要问题。目前国内水环境的主要污染物包括有机物和总氮、总磷等无机污染物，其中对水体危害最大的为总氮和总磷，大量的氮磷进入水体会造成水环境的急剧恶化，其主要危害在于水体的富营养化，近十年来我国富营养化水体的比例从50％增长到了55％，而贫营养化的水体比例由3.2％减少到0.53％。水体富营养化促使藻类的大量繁殖，藻类在过度繁殖之后，又大量衰败死亡，为异养微生物的生长提供了丰富的基质，好氧微生物的大量繁殖，很快耗尽了水体中的溶解氧，严重影响鱼类的生长繁殖；藻类大量繁殖还能造成供水系统瘫痪和自来水水质恶化，近年来太湖水华最为典型，其造成了饮用水的短缺；同时许多藻类还能产生毒素，严重影响了人类健康生活；另外水体的富营养化将加速湖泊的衰亡，促进其向沼泽生态演变。因此，如何高效、经济的脱氮除磷已经成为目前水污染防治领域的热点研究方向。

水环境中的氮磷污染主要因素归结为人类社会活动，其主要来源包括城市生活污水、工业废水以及农业灌溉残留废水等。氮在水体中主要有有机氮和无机氮两种存在形态：有机氮有蛋白质、多肤、氨基酸和尿素等，这一形态的氮主要来源于生活污水、农业废弃物(植物秸秆、牲畜粪便等)和某些工业废水(如羊毛加工、制革、印染、食品加工等)；无机氮形态主要为氨氮、硝态氮、亚硝态氮(统称氮化合物)，其主要来源为工业废水，以及无机氮之间的形态转换。磷在水体中存在的主要形态为磷酸盐(简称磷或总磷)，据其物理特性分为溶解性和颗粒性两类，按化学特性则可分成正磷酸盐、聚合磷酸盐和有机磷酸盐，其主要来源为生活污水和农业废水。

污水生物脱氮的基本原理就是在将有机氮转化为氨态氮的基础上，先利用好氧段经硝化作用，由硝化细菌和亚硝化细菌的协同作用，将NH₃转化为和在缺氧条件下通过反硝化作用将将（经反亚硝化）和（经反硝化）还原为氮气，溢出水面释放到大气，参与自然界氮的循环。水中含氮物质大量减少，降低出水的潜在危险性，达到从废水中脱氮的目的。废水在生物处理中,在厌氧条件下,聚磷菌的生长受到抑制,为了自身的生长便释放出其细胞中的聚磷酸盐,同时产生利用废水中简单的溶解性有机基质所需的能量,称该过程为磷的释放。进入好氧环境后,活力得到充分恢复,在充分利用基质的同时,从废水中摄取大量溶解态的正磷酸盐,从而完成聚磷的过程。将这些摄取大量磷的微生物从废水中去除,即可达到除磷的目的。

由于聚磷菌和反硝化细菌对有机碳源的竞争，目前很多脱氮除磷工艺不能同时达到脱氮与除磷的最佳效果，为此，许多研究者开发了各种新材料、新技术、新设备，衍生出许多新的生物脱氮除磷工艺以期同时实现最大程度的脱氮与除磷，然而始终不能从根本上解决这一难题。因此，要同时实现脱氮与除磷的最佳效果，必须转变思路，不仅只是从研发工艺以及调整运行参数等方面研究，还必须从微生物学的角度研究探讨生物脱氮除磷的机理和效能。

目前已有研究者发现了具有同时脱氮与除磷效能的微生物菌群，统称为反硝化聚磷菌(DPB)，确定了这是一类能够在厌氧条件下，分解体内聚磷，并吸收易降解有机物以聚-β-羟丁酸(PHB)形式储存在菌体内，在缺氧条件下，分解体内PHB，并以硝酸盐氮为电子受体进行摄磷的微生物菌群，利用DPB的生物特性，成功地解决了传统生物脱氮除磷工艺中脱氮菌与聚磷菌竞争碳源的问题。然而此类菌及其特性研究都处于初级阶段，没有系统的鉴定方法，也没有方便快捷的培养驯化方式。探明反硝化聚磷细菌的种属及特性，明确它们的营养条件和环境条件，将有助于废水生物脱氮除磷工艺的研究、开发和应用。

细菌的反硝化聚磷作用是在各种还原酶的催化作用下完成的，各反应酶系的活性高低受温度、pH值等条件的影响。废水生物处理中的反应温度，对微生物的生长、繁殖关系密切，温度支配着酶反应动力学、微生物生长速度以及化合物的溶解度等，因而对污染物的降解转化起着关键作用。考察温度、pH比等因素对反硝化菌株发挥高效反硝化活性的影响，进而获得高效反硝化聚磷菌株，实现废水高效经济的脱氮除磷，对解决日益严重的水环境氮磷污染问题具有重要意义。

许多细菌具有将硝酸盐还原为亚硝酸盐的酶，可实现第一步转化，但要完成彻底脱氮，则要求细菌必须具有完整的反硝化酶系。探明反硝化聚磷细菌是否具有完整又高效的反硝化酶系是采用生物反硝化工艺脱氮除磷的先决条件。研究发现本发明细菌具有完整的反硝化酶系，能高效去除水体中的氮素，将硝态氮还原为氮气排出水体，实现废水的高效脱氮除磷，为解决日益严重的含氮磷废水对环境的污染问题作出贡献。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是提供一株具有完整反硝化酶系的高效兼性厌氧反硝化聚磷细菌。该细菌具有完全的反硝化酶系，能够彻底脱除水体中的氮磷的同时，不产生NO、N₂O等有害气体。

本发明的另一个目的是提供该反硝化聚磷菌的应用及应用方法，使该细菌表现出完全的反硝化除磷活性。

本发明通过以下技术方案实现：

一株具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌，该菌株命名为假产碱假单胞菌CL-1，Pseudomonas pseudoalcaligenes CL-1，属于假产碱假单胞菌，已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012225，保藏地址：中国武汉武汉大学。其菌学特征为：细胞呈短杆状，革兰氏阳性菌，菌落圆形、乳白色、中凸、有光泽、边缘光滑透明。其最佳脱氮条件为：温度25～30℃，pH7.0～8.0。在此条件下脱氮，无亚硝酸盐积累。

具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌在废水处理中的应用。具体应用时，方法为：

（1）使用前用LB培养基活化菌株：将斜面培养基上保存的假产碱假单胞菌CL-1用接种环刮取1环菌苔，接种入装有100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，30℃摇床震荡培养培养12h，即可获得菌液（OD₆₀₀=1.0±0.01）；

（2）将活化后的菌液接种于待处理的含氮磷废水中，投加量为受处理废水体积的10%，pH值范围在7.0～9.0之间，室温静置培养192h以上。

前24h每隔8h取样一次，之后每隔24h定时取样检测水样中硝氮、总磷去除情况及亚硝酸盐的积累情况。

检测方法

TP：钼酸盐-紫外分光光度法；

NO₃ ^--N：紫外分光光度法；

本发明的菌株是利用双泥法SBR对氧化沟活性污泥进行培养驯化，筛选得到的一种具有高效脱氮除磷活性的反硝化聚磷细菌，可以通过反硝化作用脱除水体中的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，同时分解体内聚磷，并吸收易降解有机物以PHB形式储存在菌体内，在缺氧条件下，分解体内PHB，并以硝酸盐氮为电子受体进行摄磷。该菌株具有完全的反硝化能力，能够将硝态氮逐步还原为氮气排出水体，适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮彻底，效果稳定，节约运行成本。

本发明中的脱氮是指水体中无机氮的去除，无机氮是指NO₃ ^--N和NO₂ ^--N。

本发明的菌株具有以下优点：

（1）本发明菌株具有完全的反硝化酶系，能够将硝态氮直接还原为氮气，实现彻底脱氮且不污染空气。

（2）本发明菌株具有非常高的反硝化活性，可用于处理适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理。

(3)本发明菌株具有非常高的除磷活性，可用于处理适用于较高浓度含磷废水的处理。附图说明

图1：假产碱假单胞菌CL-1菌体的扫描电镜照片。

图2：假产碱假单胞菌CL-1的生长曲线。

图3：假产碱假单胞菌CL-1的脱氮除磷曲线。

图4：假产碱假单胞菌CL-1的脱氮除磷效率与温度变化关系。

图5：假产碱假单胞菌CL-1的脱氮除磷曲线与pH变化关系。

图6：假产碱假单胞菌CL-1的产气图谱。

具体实施方式

实施例1本发明菌株的分离鉴定：

（1）培养基：

A、菌株分离、纯化、保藏培养基（/L）：

CH₃COONa，2g；蛋白胨，15g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；琼脂，12g；KNO₃，1.5g；pH控制在7.0～7.2。

B、菌株筛选、脱氮培养基（DM：Denitrifying Medium）（/L）：

CH₃COONa，2g；KH₂PO₄，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.6g；CaCl₂·2H₂O，0.07g；KNO₃，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。

C、LB培养基（/L）：

蛋白胨，10g；酵母膏，5g；氯化钠，10g；pH控制在7.5。

（2）假单胞菌CL-1菌株的分离、纯化：

采用稀释涂布法和平板划线法进行分离纯化。首先用无菌移液管取SBR缺氧结束时的污泥混合液10mL，置于装有数粒玻璃珠的无菌三角瓶中，加入无菌水90mL，制成10^-1浓度的菌悬液，在磁力搅拌器上搅拌20min打散菌胶团。

用移液枪分别吸取0.5ml样品于装有4.5mL无菌水的试管中，混匀，依此类推，最后吸取稀释度为10^-4的稀释液，以每块平板0.2mL的量，涂布四块专性培养基，用无菌三角玻璃刮刀在培养基表面均匀涂布。之后将平板倒置，放入30℃恒温培养箱，培养至长出明显菌落。

挑取单菌株，在平板上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，此时可认为菌株已纯化完毕。分离出的菌株在含有硝酸盐的固体培养基上生长良好，具有潜在的反硝化特性，异染颗粒染色后菌体内有黑色物质的即本发明中的假产碱假单胞菌CL-1，接种至斜面培养基保存备用。

（3）假产碱假单胞菌CL-1的硝酸盐还原产气试验

为了解本发明菌株的反硝化能力和特性，对本发明菌株进行硝酸盐还原产气试验。

接种于小试管（规格：15mm×100mm）中加入10mL灭菌的反硝化液体培养基，用接种环挑取纯化后的菌落1环至小试管中，搅拌混匀。之后加入1mL的灭菌后的液体石蜡封口。以未接种菌株的试管作为空白对照。制作完毕后将所有试管一同置入30℃恒温培养箱静置培养。培养一段时间后，观察发现石蜡与培养基之间有气泡生成，证明本发明菌株具有反硝化能力。

（4）假产碱假单胞菌CL-1的菌落形态特征：

在培养基A上培养2天后，长出圆形菌落、乳白色、中凸、有光泽、边缘光滑透明。

（5）假产碱假单胞菌CL-1的菌体形态特征：

扫描电镜观察表明菌体呈短杆状，182nm～260nm×1145nm～1458nm。

（6）16S rDNA的PCR扩增与测序：

实验仪器：小型离心机（Eppendorf，转速>12000r/min）；电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR热循环扩增仪（Eppendorf）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

实验方法：从菌株CL-1的新鲜斜面上直接挑取菌体，加入至含100μL双蒸水的离心管中，旋涡混匀后，热裂解菌悬液，以基因组DNA为模板扩增16S rDNA，扩增引物为一对通用引物。

正向引物为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

反向引物为1492R：5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。

PCR反应在50μL体系中进行。反应体系的组成为：模板DNA(50ng/μL)2μL；dNTP混合物4μL；Taq DNA聚合酶0.25μL；正向引物2μL；反向引物2μL；双蒸水34.75μL。

PCR扩增条件：95℃变性5min；95℃30s,55℃45s,72℃1min30s，循环30次；72℃延伸10min，4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶对菌株的16S rDNA扩增产物做电泳检测，验证后切下胶条，用DNA凝胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司）纯化PCR产物。回收后的PCR扩增产物委托山东省农科院高新技术中心进行测序。

（7）16S rDNA序列分析与系统发育分析：

测序后得到CL-1菌株的16S rDNA长度为1430bp的序列，提交到Genbank与其他菌株进行比对，发现菌株CL-1与Pseudomonas sp.的进化距离最为接近，确定其属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.CL-1。

实施例2本发明菌株的培养

（1）所使用的培养基

A、菌株保藏培养基（/L）：蛋白胨，5g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；琼脂，12g；KNO₃，1.5g；pH控制在7.0～7.2。

B、菌株反硝化培养基（DM：Denitrifying Medium）（/L）：CH₃COONa，2g；KH₂PO₄，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.6g；CaCl₂·2H₂O，0.07g；KNO₃，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。

上述培养基使用前，121℃，灭菌20分钟。

（2）培养条件

将在保藏培养基斜面上保存的假产碱假单胞菌CL-1用接种环刮取1环菌苔，接种入装有100mL已灭菌的LB培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温振荡培养12h，即可获得种子液。实验时，按10%的接种量将种子液接种于反硝化培养基或是废水中。

实施例3本发明菌株的最佳脱氮除磷条件

将100mL已灭菌的反硝化培养基装入250mL三角瓶中，按照10%的接种量接入种子菌液，静置培养。其最佳脱氮温度在25-30℃之间，最适温度是25℃，最适pH值为7～8。该菌的生长周期长，48h以后进入对数生长期，96h以后进入稳定期，96～120h基本处于稳定期，120h后进入衰亡期。该菌株前24h氮磷去除率分别为56.93%、43.56%，整个实验过程氮磷去除率分别为75.6%和57.5%。

实施例4本发明菌株具有完全的反硝化酶系

在1L的三角瓶中装满接种了10%种子液的反硝化培养基，密封瓶口，室温下静置培养。用气体收集袋收集实验过程中释放的气体，然后通过气象色谱质谱联用分析仪(GC-MS)分析气体成分。结果显示该气体分子量为28，且与氮气的相似度最高，推断该气体为N₂，无其他气体。证明本发明菌株具有完全的反硝化酶系，能够将硝态氮直接还原为N₂，能够发挥完全的反硝化活性，没有NO、N₂O等有毒有害中间产物气体的生成。因此，本菌株更适宜于工程应用。

Claims (3)

1.一株具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌，其特征在于：该菌株命名为假产碱假单胞菌CL-1，Pseudomonas pseudoalcaligenes CL-1，属于假产碱假单胞菌，已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012225。

2.权利要求1所述的具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌在废水处理中的应用。

3.权利要求2所述的具有脱氮除磷双重能力的反硝化聚磷菌在废水处理中的应用方法，其特征是，包括步骤如下：

（1）使用前用LB培养基活化菌株：将斜面培养基上保存的上述假单胞菌CL-1用接种环刮取1环菌苔，接种入装有100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，30℃摇床震荡培养培养12h，即可获得菌液，OD₆₀₀=1.0±0.01；

（2）将活化后的菌液接种于待处理的含氮磷废水中，投加量为受处理废水体积的10%，pH值范围在7.0～9.0之间，室温静置192h以上。