CN103103135A - 一种米曲霉菌株及其液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种米曲霉菌株MFA-AO-3，其保藏编号为CGMCC No.6834，以及以此米曲霉菌株为菌种的液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法。本发明米曲霉菌株，可高产真菌α-淀粉酶；本发明所述液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法，以上述米曲霉菌株为菌种，在通风量以每分钟料液体积：空气体积计为1:（1.5～2）、溶氧量为20～25%的条件下，以500～1000rpm的搅拌速率进行发酵培养，制得真菌α-淀粉酶。本发明所述生产真菌α-淀粉酶的方法产酶水平高，具有很好的产业效益。

Description

一种米曲霉菌株及其液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种米曲霉菌株及其液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法。

背景技术

α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，它作用于淀粉内部切开α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。面粉中的α-淀粉酶对发酵面制品的质量有明显的影响。正常季节收获的小麦加工的面粉中α-淀粉酶的含量普遍不足，为改善和提高面粉类食品的质量可在面粉加工过程中添加α-淀粉酶。

常见的α-淀粉酶有三种：细菌α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶和麦芽α-淀粉酶。细菌α-淀粉酶是由细菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等产生的，细菌α-淀粉酶的热稳定性较强，在面食品的加工过程中容易造成淀粉过度水解，使面团心发粘；麦芽α-淀粉酶活性低，添加量大，且粘性较大，在实际应用中较难混合均匀；真菌α-淀粉酶是由真菌如黑曲霉、米曲霉或根霉等产生的，真菌α-淀粉酶的热稳定性较差，65℃以下就已失活，不会造成面团心发粘的质量问题。

真菌α-淀粉酶最早于1896年由日本的高峰让吉从米曲霉中提取，并作为消化剂使用。50年代以来，真菌α-淀粉酶的应用范围逐渐扩大，开始应用于淀粉制糖、酿造、面包、果蔬饮料、医药和饲料等领域。用于淀粉制糖可以生产出以麦芽三糖为主的新型糖浆；与葡萄糖苷转移酶合用，可以制备异麦芽低聚糖；在传统的饴糖、黄酒生产中使用此酶，可以简化生产工艺，提高原料利用率，节省粮食，降低生产成本；用于面包制作可以缩短发酵周期，制成的面包气孔分布均匀，体积大，保鲜期长，还可替代以往常用的面包添加剂溴酸钾；用于医药可作为消化剂，代替动物中提取的酶；用于果蔬饮料可以消除浑浊，提高收率；用于饲料可以提高饲料利用率。因此，真菌α-淀粉酶的应用具有广阔的市场前景。

目前，国内真菌α-淀粉酶的生产瓶颈是高产菌株的获得和昂贵的工业化生产成本。因此，研制开发出一种较高产率生产真菌α-淀粉酶的方法，降低产业成本，尽快实现大规模国产化生产，对于满足市场需求具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种可高产真菌α-淀粉酶的米曲霉菌株MFA-AO-3，其保藏编号为CGMCC No.6834，以及以此米曲霉菌株为菌种的液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法。

具体地，本发明提供了一种米曲霉菌株MFA-AO-3，其拉丁文学名为Aspergillus oryzae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏日期为2012年11月16日，保藏编号为CGMCCNo.6834。

发明人以保藏编号为CGMCC1.1923的米曲霉菌株为原始菌株，在紫外辐射30s的诱变剂量下，经初步筛选、发酵试验筛选，挑选出可高产真菌α-淀粉酶的诱变菌株，即得本发明米曲霉菌株MFA-AO-3。

本发明米曲霉菌株菌落生长快，菌丝质地疏松，初白色、黄色，后形成孢子变为墨绿色。

本发明的另一个目的在于提供一种液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法，包括如下步骤：

（1）预处理：将权利要求1所述米曲霉菌株接入种子培养基中，常规培养24-72小时后，将菌液分散均匀；

（2）生产发酵：将步骤（1）所得米曲霉菌液按0.5-5%（v/v）接种量接入发酵培养基，于通风量以每分钟料液体积：空气体积计为1:（1.5～2），溶氧量为20～25%的条件下，以500-1000rpm的搅拌速率进行发酵培养，培养时间为150-230小时。

上述方法中，步骤（1）所述常规培养为：在29-32℃，转速为100-500rpm的摇床震荡培养至菌液粘稠；所述“将菌液分散均匀”，是将培养过程中所形成的菌丝球机械打散，以形成更细小菌丝，使其在下一级培养基中分布更均匀，有助于菌体生长。

作为优选，以重量体积百分比（g/ml）计，所述发酵培养基的组成为：1～6%马铃薯淀粉、0.1～2%酵母粉、0.1～0.5%磷酸氢二钾、0.1～0.5%七水合硫酸镁，0.01～0.05%消泡剂，余量为水，pH为5.5-6.5；该发酵培养基配方因营养价值较高使得发酵效果较好，但其成本也高，在实际应用中可用于小规模的菌种发酵，如300升发酵罐以下规模的生产发酵。

作为优选，以重量体积百分比（g/ml）计，所述发酵培养基的组成为：1～6%马铃薯淀粉、1～6%大豆粉、0.1～1%硫酸铵、0.1～0.5%磷酸氢二钾、0.1～0.5%七水合硫酸镁，0.01～0.05%消泡剂，余量为水，pH为5.5-6.5；该发酵培养基的配方成本低，可用于大规模的菌种发酵，如10吨发酵罐的生产发酵。

所述消泡剂为大豆油。

上述方法中，步骤（1）所述预处理还包括将破碎后的米曲霉菌进行种子发酵的过程。

所述种子发酵过程为：将破碎后的米曲霉菌按0.5-5%接种量接入种子培养基中，于通风量以每分钟料液体积：空气体积计为1:（1.5～2），溶氧量为20～25%的条件下，以100-1000rpm的搅拌速率进行种子发酵培养，培养时间为24-72小时。

上述方法中，以重量体积百分比（g/ml）计，所述种子培养基为1～6%马铃薯淀粉、0.1～2%酵母粉、0.1～0.5%磷酸氢二钾、0.1～0.5%七水合硫酸镁，余量为水，pH为5.5-6.5。

上述方法中，在步骤（2）所述生产发酵期间，通过流加碱溶液调节发酵液的pH值为5.5-7.5；优选地，所述碱溶液为重量体积比为10-40%的氢氧化钠水溶液。

上述方法中，在步骤（2）所述生产发酵期间，当发酵罐中淀粉含量小于10g/L时，开始流加马铃薯淀粉水溶液，至发酵结束；优选地，所述马铃薯淀粉水溶液的重量体积百分浓度为20-50%，流加速度为10-40ml/h/L发酵液。

上述方法中，步骤（2）所述生产发酵后期，菌体自溶，发酵液粘度降低，待发酵液粘度不再变化时，指示着发酵过程的结束；所述生产发酵培养时间为150-230小时。

本发明所述液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法，产率较高，所得发酵液中真菌α-淀粉酶的酶含量为10000-15000U/ml，具有很好的产业效益，且工艺简单、成本较低，适合大规模的工业化生产。

保藏信息

用于保藏的微生物（株）：MFA-AO-3;

建议的分类命名：米曲霉Aspergillus oryzae；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；

保藏日期：2012年11月16日；

保藏编号：CGMCC No.6834。

附图说明

图1为不同紫外辐射时间与菌株致死率的关系曲线。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1本发明米曲霉菌株的诱变筛选

其诱变筛选步骤如下：

（1）单孢子悬液的处理：取涂布有原始菌株（保藏编号为CGMCC1.1923的米曲霉菌株）的新鲜斜面（平板）加10ml无菌生理盐水，用接种针轻轻将斜面上的孢子刮下，倒入无菌的装有玻璃珠的小三角瓶中，振荡使抱子分散，脱脂棉过滤；用显微镜计数，并将孢子浓度稀释至n×10⁶个/ml；

（2）诱变剂量的选择：吸取分散孢子悬液5mL于无菌的平皿中，置于紫外诱变箱内，分别设置5s、10s、15s、20s、25s、30s的时间剂量进行诱变。诱变完毕，倍数稀释后涂布，以未紫外诱变处理的稀释菌液作对照。培养2d后计数，并计算致死率【致死率=（未经诱变的菌落数-经诱变的菌落数）/未经诱变的菌落数×100%】。不同紫外辐射时间与菌株致死率的关系曲线如图1所示；为防止光复活，全部操作过程采用红光操作。选择致死率在90%左右的时间剂量作为诱变剂量，本实验选择紫外辐射30s的诱变剂量用于后续诱变育种；

（3）初步筛选：吸取分散孢子悬液5mL于无菌的平皿中，置于紫外诱变箱内，设置30s的时间剂量进行诱变；诱变处理后，将菌液涂布在淀粉鉴定平板上，30℃，暗室，培养48h待长出小菌落，后观察透明圈，挑出透明圈比对照大而清晰的单菌落，纯化培养后，再接种于斜面培养基上，直至长出成熟孢子；以重量体积百分比（g/ml）计，初步筛选培养基为：2%马铃薯淀粉、2%酵母粉、0.3%磷酸氢二钾、0.3%七水合硫酸镁、1.5%琼脂粉，pH为6.5。

（4）突变菌株发酵试验筛选：将诱变菌株进行液态发酵试验：将诱变菌株接种入液体发酵培养基[以重量体积百分比（g/ml）计，其组成为：6%马铃薯淀粉、2%酵母粉、0.3%磷酸氢二钾、0.3%七水合硫酸镁，pH为6.5]中，30℃，搅拌转速200rpm，发酵培养48小时后检测真菌α-淀粉酶的产量；挑选出可高产真菌α-淀粉酶的诱变菌株，即得本发明米曲霉菌株MFA-AO-3。

本发明米曲霉菌株MFA-AO-3菌落生长快，菌丝质地疏松，初白色、黄色，后形成孢子变为墨绿色。

实施例2本发明所述方法生产真菌α-淀粉酶（50升发酵罐）

一、培养基[按重量体积百分比（g/ml）计]：

1、种子培养基：6%马铃薯淀粉、2%酵母粉、0.3%磷酸氢二钾、0.3%七水合硫酸镁，余量为水，pH为6.5；

2、50升罐发酵培养基：6%马铃薯淀粉、2%酵母粉、0.3%磷酸氢二钾、0.3%七水合硫酸镁，0.01%大豆油，余量为水，pH为6.5。

二、预处理

菌种培养：

取适量保藏编号为CGMCC No.6834的米曲霉菌株，分别接入4只500mL三角瓶中，每瓶内装种子培养基100ml；培养条件：30℃，转速200rpm摇床震荡，培养48小时，至菌液粘稠；用便携式全不锈钢粉碎机打散培养过程中所形成的菌丝球，使菌体由聚集状变为分散状。

三、生产发酵：

1、在50升发酵罐中投入30L的发酵培养基，蒸汽121℃/30min灭菌，冷却到30℃左右；

2、取已破碎的米曲霉菌种按1.3%的接种量在无菌条件下接入发酵罐；

（1）发酵生产：温度为30℃，生长期（0～48h）搅拌速率1000rpm，通风量1:2（料液体积：空气体积每分钟）；产酶期（48～168h）搅拌速率800rpm，通风量1:1.6，将溶氧量控制在20～25%。

（2）流加氢氧化钠：随着发酵的进行，根据发酵液pH值的变化流加20%的氢氧化钠水溶液，以控制发酵液pH值在6.0～6.5之间；

（3）流加马铃薯淀粉：发酵培养60h后，发酵罐中淀粉的量降至1%，开始流加经过灭菌处理的30%马铃薯淀粉水溶液，流加速度以40mL/h/L的流速（以基础发酵培养基体积为基准计）,流加马铃薯淀粉至全程。

3、发酵过程结束：

发酵168h小时，菌体自溶，发酵液粘度降低至不再变化，发酵结束。发酵液中真菌α-淀粉酶的酶含量为12688U/ml。

实施例3本发明所述方法生产真菌α-淀粉酶（10吨发酵罐）

一、培养基[按重量体积百分比（g/ml）计]：

1、种子培养基：6%马铃薯淀粉、2%酵母粉、0.3%磷酸氢二钾、0.3%七水合硫酸镁，余量为水，pH为6.5；

2、发酵培养基：4%马铃薯淀粉、6%大豆粉、1%硫酸铵、0.3%磷酸氢二钾、0.3%七水合硫酸镁，0.03%大豆油，余量为水，pH为6.5

二、预处理

1、菌种培养：

取适量保藏编号为CGMCC No.6834的米曲霉菌株，分别接入5只1000mL三角瓶中，每只三角瓶内装种子培养基200ml；培养条件：30℃，转速200rpm摇床培养，培养48小时，至菌液粘稠；用便携式全不锈钢粉碎机打散培养过程中所形成的菌丝球，使菌体由聚集状变为分散状。

2、种子发酵：

（1）在200L种子罐中装入种子培养基100L，蒸汽灭菌121℃/30min，冷却至30℃；

（2）取上述制备好的菌种按1%的接种量无菌接入种子罐中，温度为30℃；搅拌速率1000rpm；通风量1:2（料液体积：空气体积每分钟）；将溶氧量控制在20～25%。生长48小时。

三、生产发酵：

1、在10吨发酵罐中投入6吨的发酵培养基，蒸汽121℃/30min灭菌，冷却到30℃左右；

2、取上述种子发酵后的米曲霉种子液按1.5%的接种量无菌接入发酵罐；

（1）发酵生产：温度为30℃，生长期（0～48h）搅拌速率1000rpm，通风量1:2（料液体积：空气体积每分钟）；产酶期（48～168h）搅拌速率800rpm，通风量1:1.8，将溶氧量控制在20～25%；

（2）流加氢氧化钠：随着发酵的进行，根据发酵液pH值的变化流加20%的氢氧化钠水溶液，以控制发酵液pH值在6.0～6.5之间；

（3）流加马铃薯淀粉：发酵培养72h后，发酵罐中淀粉的量降至1%以下，开始流加经过灭菌处理的30%马铃薯淀粉水溶液，流加速度以40mL/h/L的流速（以基础发酵培养基体积为基准计）,流加马铃薯淀粉至全程。

3、发酵过程结束：

发酵192h小时，菌体自溶，发酵液粘度降低至不再变化，发酵结束。发酵液中真菌α-淀粉酶的酶含量为13886U/ml。

实施例4本发明所述方法生产真菌α-淀粉酶（10吨发酵罐）

一、培养基[按重量体积百分比（g/ml）计]：

1、种子培养基：1%马铃薯淀粉、0.1%酵母粉、0.1%磷酸氢二钾、0.1%七水合硫酸镁，余量为水，pH为6.5；

2、发酵培养基：1%马铃薯淀粉、1%大豆粉、0.1%硫酸铵、0.3%磷酸氢二钾、0.3%七水合硫酸镁，0.05%大豆油，余量为水，pH为6.5

二、预处理

1、菌种培养：

取适量保藏编号为CGMCC No.6834的米曲霉菌株，分别接入5只1000mL三角瓶中，每只三角瓶内装种子培养基200ml；培养条件：30℃，转速200rpm摇床培养，培养72小时，至菌液粘稠；用便携式全不锈钢粉碎机打散培养过程中所形成的菌丝球，使菌体由聚集状变为分散状。

2、种子发酵：

（1）在200L种子罐中装入种子培养基100L，蒸汽灭菌121℃/30min，冷却至30℃；

（2）取上述制备好的菌种按1%的接种量无菌接入种子罐中，温度为30℃；搅拌速率1000rpm；通风量1∶1.5（料液体积：空气体积每分钟）；将溶氧量控制在20～25%。生长72小时。

四、生产发酵：

1、在10吨发酵罐中投入6吨的发酵培养基，蒸汽121℃/30min灭菌，冷却到30℃左右；

2、取上述种子发酵后的米曲霉种子液按1.5%的接种量无菌接入发酵罐；

（1）发酵生产：温度为30℃，生长期（0～48h）搅拌速率1000rpm，通风量1:1.8（料液体积：空气体积每分钟）；产酶期（48～168h）搅拌速率800rpm，通风量1:1.5，将溶氧量控制在20～25%；

（2）流加氢氧化钠：随着发酵的进行，根据发酵液pH值的变化流加20%的氢氧化钠水溶液，以控制发酵液pH值在6.0～6.5之间；

（3）流加马铃薯淀粉：发酵培养72h后，发酵罐中淀粉的量降至1%以下，开始流加经过灭菌处理的30%马铃薯淀粉水溶液，流加速度以40mL/h/L的流速（以基础发酵培养基体积为基准计）,流加马铃薯淀粉至全程。

3、发酵过程结束：

发酵230h小时，菌体自溶，发酵液粘度降低至不再变化，发酵结束。发酵液中真菌α-淀粉酶的酶含量为15000U/ml。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种米曲霉菌株MFA-AO-3，其拉丁文学名为Aspergillusoryzae，保藏编号为CGMCC No.6834。

2.一种液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）预处理：将权利要求1所述米曲霉菌株接入种子培养基中，常规培养24-72小时后，将菌液分散均匀；

（2）生产发酵：将步骤（1）所得米曲霉菌液按0.5-5%接种量接入发酵培养基，于通风量以每分钟料液体积：空气体积计为1:（1.5～2），溶氧量为20～25%的条件下，以500-1000rpm的搅拌速率进行发酵培养，培养时间为150-230小时。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以重量体积百分比计，所述发酵培养基的组成为：1～6%马铃薯淀粉、0.1～2%酵母粉、0.1～0.5%磷酸氢二钾、0.1～0.5%七水合硫酸镁，0.01～0.05%消泡剂，余量为水，pH为5.5-6.5。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以重量体积百分比计，所述发酵培养基的组成为：1～6%马铃薯淀粉、1～6%大豆粉、0.1～1%硫酸铵、0.1～0.5%磷酸氢二钾、0.1～0.5%七水合硫酸镁，0.01～0.05%消泡剂，余量为水，pH为5.5-6.5。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述消泡剂为大豆油。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述预处理还包括将破碎后的米曲霉菌进行种子发酵的过程。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子发酵过程为：将破碎后的米曲霉菌按0.5-5%接种量接入种子培养基中，于通风量以每分钟料液体积：空气体积计为1:（1.5～2），溶氧量为20～25%的条件下，以100-1000rpm的搅拌速率进行种子发酵培养，培养时间为24-72小时。

8.如权利要求2或7所述的方法，其特征在于，以重量体积百分比计，所述种子培养基为1～6%马铃薯淀粉、0.1～2%酵母粉、0.1～0.5%磷酸氢二钾、0.1～0.5%七水合硫酸镁，余量为水，pH为5.5-6.5。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）所述生产发酵期间，通过流加碱溶液调节发酵液的pH值为5.5-7.5。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述碱溶液为重量体积比为10-40%的氢氧化钠水溶液。

11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）所述生产发酵期间，当发酵罐中淀粉含量小于10g/L时，开始流加马铃薯淀粉水溶液，至发酵结束。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述马铃薯淀粉水溶液的重量体积百分浓度为20-50%，流加速度为10-40ml/h/L发酵液。