CN103097532B

CN103097532B - 高产量分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法

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Publication number: CN103097532B
Application number: CN201180042364.0A
Authority: CN
Inventors: V·霍兰德; G·克里斯托夫; M·施卢姆贝格尔
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2010-09-02
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2031-09-02
Also published as: EP2611916A1; US20130164825A1; WO2012028737A1; DK2611916T3; EP2611916B1; CN103097532A; US11542494B2; ES2617778T3; JP6096660B2; JP2013539366A

Abstract

本发明涉及从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤a)通过将所述样品经过柱来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述柱中含有的核酸结合固相，b)在靶核酸结合所述固相时对核酸结合固相进行酶和/或化学处理，c)收集所述步骤b)处理中从所述固相释放的至少一部分小靶核酸作为流出物，d)将含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接触核酸结合固相，用以将所含小靶核酸结合所述核酸结合固相，e)可选进行洗脱。本发明引起分离靶核酸中的小靶核酸产量显著增加，因为其能有效捕获和回收小靶核酸。

Description

高产量分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法

本发明涉及从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，且特定提供从样品中以高产量有效分离小靶核酸的方式。

研究来自各种组织、体液和生物体的1000或500核苷酸或更小范围的小核酸是引起极大兴趣的领域且将来仍会保持。小核酸特定包括但不限于小RNA如微RNA（miRNA）和小干扰RNA分子等，二者都对基因表达有显著效果。此外，对参与mRNA和rRNA加工的其他小核RNA和小核仁RNA（如snRNA和snoRNA）以及小DNA分子也感兴趣。此外，长度为1000或500核苷酸或更小的核酸通常还作为降解产物包含在特定样品中，所述样品如福尔马林固定和石蜡包埋的样品（FFPE样品），因为各保存措施可能破坏DNA和/或RNA完整性。

随着对各小核酸的兴趣不断增大，已改良标准分离过程以促进分离小核酸并特定提高小核酸产量。所述用作分离DNA或RNA标准的已知操作通常对于分离小核酸不理想，因为小核酸通常不能在分离过程中用标准方法有效捕获和洗脱。因此，用标准过程从样品中分离靶核酸一般不包括足够量的小靶核酸并从而提供可接受的产量，这是因为小核酸在核酸分离过程中不结合或丧失。因此，需要改善的技术用于有效分离小靶核酸，单独或作为已分离总靶核酸如总RNA或总DNA的一部分。

就分离小核酸优化的方法通常依赖于苯酚和氯仿提取以及逐步醇分级分离。根据一个实施方式，RNA在水相中浓缩并随后从中分离，例如通过加入至少一种醇和使RNA结合膜。在此，有效捕获已分离总RNA中的小RNA也很重要。

此外，开发了分离小核酸如小RNA的方法，所述方法包括使用离液剂、高浓度醇和核酸结合柱，所述柱包含例如核酸结合膜如二氧化硅膜。如果各小RNA包含在样品中，用这些操作分离的总RNA包括小RNA。各基于膜的分离操作特别适于从各种样品中分离小核酸，单独或作为总靶核酸的一部分。

然而，使用基于固相的柱以结合核酸（例如柱包括核酸结合膜）的许多核酸分离方法在靶核酸结合核酸结合相（也称为如“膜上”或“柱上”处理步骤）时涉及一种或多种水溶液的一个或多个处理步骤。所述核酸结合核酸结合固相时进行的各处理步骤示例包括但不限于蛋白消化步骤和核酸酶消化步骤如DNA酶或RNA酶处理。发现运行各处理步骤减少靶核酸产量且特定减少小靶核酸产量，因为所述处理具有以下效果：至少一部分已结合靶核酸且特定是小靶核酸在所述处理步骤中从所述核酸结合固相中释放。因此，为防止释放的核酸在随后洗涤或加工步骤中丧失，现有技术已知应用例如在进行处理后恢复合适结合条件的离液溶液（例如离液洗涤液）以恢复可能释放的靶核酸与核酸结合相的结合。各恢复步骤例如描述于WO98/59076且还用于许多市售可得的核酸分离试剂盒。

然而，发现尽管进行各恢复步骤以恢复可能释放的靶核酸与核酸结合固相的结合，小靶核酸在分离工艺中最终仍丧失。用基于柱的固相以结合所述核酸来分离核酸时，例如用含核酸结合膜的柱时，尤其如此。因此，仍需要改善以增加已分离靶核酸中的小核酸产量。

因此，本发明目的是提供分离至少一种靶核酸的方法，所述靶核酸包括小靶核酸或可由其组成，其中所述小靶核酸产量增加。

发明内容

本发明是基于以下发现：如果使用基于柱的核酸结合固相，核酸结合核酸结合固相时在进行例如酶处理后应用恢复缓冲液或促结合洗涤缓冲液不足以用于重捕获并因而以可接受产量分离所述处理中释放的小靶核酸。随后，会根据优选实施方式解释，其中核酸结合膜用作固相。不受理论约束，推断膜上处理中释放的至少一部分小靶核酸位于膜下方和/或膜孔下深处。各“逃逸”小靶核酸不能通过应用恢复缓冲液（或促结合洗涤缓冲液）而有效重结合，因为其不接触所述膜的核酸结合区域，并因此在随后加工步骤中丧失。用其他基于柱的核酸结合固相时，特别是如果核酸结合固相仅形成例如柱中的薄层，发生类似问题。本发明教授收集这些“逃逸”小靶核酸并使其结合核酸结合固相。因此，这些“逃逸”小靶核酸（进行现有技术方法时丧失）还能在靶核酸分离工艺中有效捕获，从而增加已分离靶核酸中小靶核酸的产量。因此，根据本发明的方法能以提高的产量分离小靶核酸并从而提供相对现有技术已知方法显著的优势。

因此，根据第一方面，提供从样品分离至少一种包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤

a)通过将样品经过柱来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述柱中所含核酸结合固相，

b)在靶核酸结合所述固相时对核酸结合固相进行酶和/或化学处理，

c)收集所述步骤b)处理中从固相释放的至少一部分小靶核酸作为流出物，

d)将含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接触所述核酸结合固相，用以将所含小靶核酸结合核酸结合固相，

e)可选进行洗脱。

根据一方面，提供从样品分离至少一种包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤

a)通过将样品经过核酸结合膜来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述膜，

b)在靶核酸结合所述膜时对膜进行涉及水溶液的处理，

c)使回收溶液通过所述膜并收集含小靶核酸的流出物，

d)使所述流出物通过步骤a)的膜以将所含小靶核酸重结合所述膜，

e)可选从所述膜洗脱包括小核酸在内的靶核酸。

此外，本发明涉及应用能使小核酸结合柱中所含核酸结合固相的回收溶液，用于在核酸结合所述固相时重结合在先前进行的处理中从所述核酸结合固相释放并优选收集为流出物的小核酸。

此外，本发明涉及运行本发明所述方法的试剂盒，包括：

a)柱中所含的核酸结合固相，优选膜；

b)含有离液剂和醇的结合缓冲液，用于使包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述核酸结合固相；

c)回收溶液，包含浓度为0,5M-多至饱和极限的离液剂和浓度为至少50%的醇；和

d)运行本发明所述方法的说明书。

遵循下列描述和所附权利要求，本应用的其他目的、特征、优势和方面对本领域技术人员显而易见。然而，应理解阐述所述应用的优选实施方式时，下列描述、所附权利要求、和特定实施例仅通过说明方式给出。在所公开发明精神和范围内的各种变化和修改通过阅读下列内容会对本领域技术人员显而易见。

附图简要说明

图1-3显示用安捷伦（Agilent）生物分析仪从肾组织分离的RNA大小分布。“+”鉴定用本发明所述方法分离的RNA且“-”鉴定用参考方法分离的RNA。小RNA部分用箭头标记。

图4显示RNA分离后的miR16检测试验结果，用不同回收溶液或参考方法进行本发明所述方法，其中不使用各回收溶液。可见用本发明所述回收溶液，Ct值显著下降，从而证明小RNA分离改善。

图5显示用5个不同试剂盒纯化的RNA加样的琼脂糖凝胶照片（参见实施例7）。右侧箭头标记小RNA。

图6的图表显示用Cjun mRNA的实时PCR结果（参见实施例7）。从获自3种不同大鼠组织的FFPE样品纯化RNA：1.肝（包埋2个月），2.肾（包埋19个月）和3.肺（包埋8个月）。

图7的图表显示用miR29a的微RNA分析结果（参见实施例7）。

图8a和8b描述用不同供应商试剂盒纯化的DNA的实时PCR分析结果（参见实施例7）。从获自3种不同大鼠组织的FFPE样品纯化DNA：1.肝（包埋2个月），2.肾（包埋19个月）和3.肺（包埋8个月）。图8a中，就所有样品而言模板体积相同，图8b中，使用相同模板浓度。

图9a和9b的图表显示实时PCR实验结果以分析Madh7RNA（参见实施例7）。从获自3种不同大鼠组织的FFPE样品纯化RNA：1.肝（包埋2个月），2.肾（包埋19个月）和3.肺（包埋8个月）。图9a中，就所有样品而言模板体积相同，图9b中，使用相同模板浓度。

发明详述

意外发现进行至少下列步骤时，小靶核酸产量能在从样品分离至少一种包括小靶核酸在内的靶核酸的方法中显著增加：

e)可选进行洗脱。

根据本发明的单独步骤会在下面进一步详细解释。

步骤a)中，当样品通过所述柱时，样品所含包括小靶核酸在内的靶核酸结合柱中所含核酸结合固相。核酸结合膜优选用作固相。使包括小靶核酸在内的靶核酸结合核酸结合固相如膜的合适结合条件为现有技术已知并进一步详细描述于下。所述结合条件还取决于待分离的靶核酸（如RNA或DNA或两者）。优选采用能使包括小靶核酸在内的靶核酸较强并因而有效结合核酸结合固相的结合条件，从而能以高产量分离包括小靶核酸在内的靶核酸。为实现步骤a)的合适结合条件，所述样品能混合适当结合溶液，如建立所需结合条件的结合缓冲液。通常，步骤a)会在加工需要裂解的样品情况中于样品初始裂解后进行。此外，其他预处理步骤也能在步骤a)前进行，如用于使裂解物澄清、移除非靶核酸或其他污染物、浓缩靶核酸和/或预纯化靶核酸。这些情况中，各预处理或加工样品作为样品通过步骤a)中的柱且至少包括小靶核酸在内的靶核酸结合核酸结合固相。在化学裂解液用于裂解的情况中，所述裂解液也能作用于建立合适结合条件。

步骤b)中，包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述固相时，对固相进行酶和/或化学处理，如在膜用作核酸结合固相情况中的膜上处理。各处理通常在核酸分离过程中进行且包括但不限于选自下组的处理：核酸酶消化步骤，如DNA酶或RNA酶处理、蛋白消化步骤，如用蛋白裂解酶处理以降解结合步骤a)中结合例如膜的蛋白污染物（参见例如WO2009/016110，通过引用纳入本文）、脂酶处理和靶核酸修饰步骤。各处理通常涉及使用一种或多种具有允许或促进所需处理性能的组合物的水溶液。然而，所述水溶液通常不具有允许或促进靶核酸且特定是小靶核酸结合所述核酸结合固相的组合物。其在进行例如膜上或柱上酶处理时特定应用，因为必须确立能使酶活化的条件。因此，步骤b)中进行的酶和/或化学处理常涉及引起至少部分小靶核酸从核酸结合固相释放的条件。因此，在步骤b)进行的处理期间加入水溶液引起步骤a)中结合核酸结合固相的靶核酸部分释放。靶核酸越小，所述靶核酸在步骤b)进行的处理期间完全从核酸结合固相解离的风险越高。如上所讨论，各释放靶核酸（通常是小尺寸）能定位于膜（分别为柱中所含核酸结合固相）之上方、之中或之下方。所释放靶核酸位于例如膜下方或膜孔下深处的情况中，其不能通过应用恢复溶液或使用促结合洗涤缓冲液来有效重捕获。因此，其在样品进一步加工中丧失，如同根据现有技术的方法中的情况。

为捕获并因而分离不能通过恢复合适结合条件而重结合的各“逃逸”小靶核酸，本发明教授了在步骤c)中从核酸结合固相移出“逃逸”小靶核酸。因此，步骤c)中，在所述步骤b)处理中从核酸结合固相释放的至少一部分小靶核酸收集为流出物。优选分别收集大部分或所有“逃逸”小靶核酸。进行所述步骤c)收集是重要的，因为其显著增加所分离靶核酸中小靶核酸的产量，这也由示例所证明。当然，因而还能有效收集步骤b)中可能释放的较大靶核酸。然而，如上所讨论，用较大靶核酸不太发生此问题，因为较大靶核酸通常与核酸结合固相的结合强于较小靶核酸。然而，如果释放，其也可由本发明所述方法有效重捕获。

步骤d)中，含小靶核酸的混合有回收溶液（且可选其他溶液/化学物）的所述流出物接触核酸结合固相，以使所含小靶核酸结合所述固相。通过根据本发明混合小靶核酸与回收溶液，确立能使所收集小靶核酸结合固相的结合条件。步骤d)中用于结合小靶核酸的核酸结合固相优选是与步骤a)所用相同的核酸结合固相。此实施方式中，含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物再应用于步骤a)所用核酸结合固相，从而使小靶核酸重结合所述固相并连接小靶核酸与步骤b)未释放的靶核酸。如上所讨论，优选膜作为核酸结合固相用于步骤a)。然而，在步骤d)中使用与步骤a)所用不同的核酸结合固相如磁性硅粒子、基于柱的不同核酸结合固相或相同膜类型也在本发明范围内。步骤d)中进行的所述“逃逸”小靶核酸回收能显著降低小靶核酸损失并因而增加所分离靶核酸中小靶核酸的产量。

可选步骤e)中，进行一个或多个洗脱步骤。替代地或另外，根据预期下游应用、各靶核酸预期用途，靶核酸结合固相时还可进行加工。需要进行洗脱步骤的情况中，能进行洗脱例如通过使用经典洗脱液如水、洗脱缓冲液、低盐缓冲液且特定是生物缓冲液。优选使用不干扰预期下游应用的洗脱液。然而，如果需要通过其他洗脱方式如加热来释放并因此的洗脱靶核酸也在本发明范围内。用于步骤d)的固相不同于步骤a)所用核酸结合固相的情况中，从步骤a)所用固相洗脱靶核酸和分开洗脱结合步骤d)所用固相的小靶核酸且合并各洗脱物在本发明范围内。进行洗脱步骤前组合所述固相也在本发明范围内。此外，重复洗脱步骤以确保所有靶核酸从核酸结合固相有效释放也在本发明范围内。

如示例所示，使用基于柱的核酸分离过程显著增加所分离靶核酸中小靶核酸的产量时，与现有技术相反的本发明所述方法额外进行步骤c)和d)。

有数种进行步骤c)和d)用于捕获并因而分离“逃逸”小靶核酸的选择。一些非限制性实施方式进一步描述于下。

根据一个实施方式，步骤c)中，确立适于使小核酸结合步骤a)所用核酸结合固相的条件的回收溶液通过柱且收集含“逃逸”小靶核酸的流出物。已混合回收溶液（且可选混合其他成分）的所述流出物在步骤d)应用于步骤a)所用相同核酸结合固相。因此，流出物所含“逃逸”小靶核酸结合步骤a)所用固相（步骤b)进行膜上处理中未释放的靶核酸仍结合其上）。优选此实施方式，因为其具有数个优势。首先，使回收溶液通过所述柱并因而通过所含核酸结合固相建立、分别重新建立适于使小核酸结合核酸结合固相的条件。因而，能确保靶核酸且特定是步骤b)处理中至少部分释放但仍重结合固相的小靶核酸有效重结合所述固相，这是因为回收溶液重新建立合适结合条件。第二，不能通过重新建立合适结合条件而重结合固相的“逃逸”小靶核酸被有效移出并因而收集为回收溶液中的流出物。第三，步骤c)中直接使用回收溶液以收集“逃逸”小靶核酸具有以下优势：小靶核酸直接在某一溶液中提供，所述溶液提供使“逃逸”小靶核酸重结合步骤a)所用固相的合适结合条件以结合包括小靶核酸在内的靶核酸。因此，“逃逸”小靶核酸能与仍结合所述固相的靶核酸重连接，因而所有靶核酸能在随后制备步骤中一起加工。

根据收集逃逸靶核酸的另一实施方式，步骤b)进行的酶和/或化学处理包括使用水溶液且“逃逸”小靶核酸通过收集流出物来保存，所述流出物含小靶核酸和用于步骤b)处理的水溶液。在此实施方式中，回收溶液能在步骤c)收集后加入流出物，且可选混合有其他添加物的所得混合物在步骤d)中接触核酸结合固相，所述固相优选是上述步骤a)所用核酸结合固相。

根据一个实施方式，应用水溶液如反应缓冲液、水或洗脱缓冲液并通过含核酸结合固相的柱，所述固相优选是膜。然后，所释放小靶核酸在所述水溶液中收集。如需要，能对分别收集的小靶核酸进行酶和/或化学处理且添加其他组合物/物质到所收集小靶核酸也在本发明范围内。此外，能对仍结合步骤a)所用固相的靶核酸进行酶和/或化学处理。此实施方式具有以下优势：能处理已结合（通常较大）靶核酸，不同于预洗脱和收集的小靶核酸。

根据一方面，提供从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤：

b)在靶核酸结合所述膜时对膜进行涉及水溶液的处理，

c)使回收溶液通过所述膜并收集含小靶核酸的流出物，

e)可选从所述膜洗脱包括小核酸在内的靶核酸。包括小核酸在内的靶核酸优选从膜中洗脱。

任何合适的方法能用于步骤c)以收集至少一部分小靶核酸作为流出物。进行基于柱的核酸分离过程时，采用的合适收集方法包括但不限于进行离心步骤，应用正或负压以挤压和/或吸取小靶核酸，所述核酸优选包含在上述回收溶液或水溶液中，以任一方向通过柱所含的核酸结合固相，其中所述固相优选是膜。

用于重结合“逃逸”小靶核酸的回收溶液应分别建立适于使小核酸结合步骤d)所用核酸结合固相的条件。回收溶液还可通过混合一种或多种溶液和/或成分来获得。回收溶液可提供适于使包括小核酸在内的总核酸结合步骤d)所用核酸结合固相的条件。在分离特定靶核酸的情况中，回收溶液可提供适于使所需靶核酸类型（如包括小RNA在内的总RNA）优选结合步骤d)所用核酸结合固相的条件。在DNA是所需靶核酸的情况中，其还可提供使包括小DNA在内的DNA（如总DNA、基因组DNA、片段化DNA和/或低分子量DNA如质粒DNA）结合步骤d)所用核酸结合固相的条件。由回收溶液和/或回收溶液与步骤c)所收集流出物的混合物提供的结合条件可与步骤a)所用条件相同或类似，以使包括小靶核酸在内的靶核酸结合柱所含核酸结合固相。然而，优选回收溶液分别提供的步骤d)所用结合条件强于步骤a)所用条件。

还可通过混合一种或多种溶液或化学剂所获得的回收溶液优选包括至少一种离液剂和/或至少一种醇。

能使用任何离液剂以用于通过例如但不限于改变蛋白或核酸二级、三级、或四级结构而同时保持一级结构完整来引起蛋白或核酸紊乱。优选所述离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和尿素。优选使用离液盐。特定地，盐酸胍和/或硫氰酸胍能用作离液剂。

步骤d)所用回收溶液和/或结合混合物中至少一种离液剂浓度可在0,05M多至饱和极限范围。优选浓度范围根据所用离液剂为约0,1M-6M、约0,2M-4M、约0,5-3M，且优选范围为约0,8-2M。

此外，用于使所收集小靶核酸结合核酸结合固相的步骤d)所用回收溶液和/或结合混合物可包括至少一种醇。作为醇，优选使用短支链或直链醇，优选1-5个碳原子。示例是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。还能使用醇混合物。所述醇优选选自异丙醇和乙醇，当分离RNA为靶核酸时特别适合的是异丙醇。根据一个实施方式，本发明所述方法不涉及使用苯酚和/或氯仿以结合核酸。然而，苯酚和氯仿能例如用于样品制备和/或样品裂解，如用于获得含靶核酸的水相，所述核酸特定是RNA。例如，所述水相还能用作步骤a)的样品，优选混合有醇，以使靶核酸结合膜，这也由示例所证明。

醇可以浓度10%v/v-90%v/v包含在步骤d)所用回收溶液和/或结合混合物中。对于分离包括小靶核酸在内的靶核酸，使用≥30%v/v、≥40%v/v、≥50%v/v，优选≥60%v/v、≥70%的醇浓度有益。优选醇浓度范围为约30%v/v-90%v/v/或约40%v/v-85%，更优选范围为约60%v/v-80%v/v。

步骤a)中，能在与上述步骤d)相同或相似条件下进行结合。因此，步骤a)所用结合条件可具有一种或多种下列特征：

a)适于使包括小核酸在内的总核酸结合柱所含核酸结合固相的条件；

b)适于使包括小RNA在内的总RNA结合柱所含核酸结合固相的条件；

c)适于使包括小DNA在内的DNA结合柱所含核酸结合固相的条件；

d)在至少一种离液剂和至少一种醇存在下发生结合；

e)在至少一种离液剂存在下发生结合，所述离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和尿素；

f)在包含于结合混合物的至少一种离液剂存在下发生结合，浓度选自0,1M多至饱和极限浓度，优选0,5-6M，更优选0,5-4M；和/或

g)在至少一种醇存在下发生结合，所述醇选自上述用于结合步骤d)的醇。

其他添加剂还能用于步骤a)和/或步骤d)的结合混合物。例如，能使用支持样品裂解、蛋白降解和/或保护结合混合物中靶核酸的添加剂。示例包括但不限于螯合剂、抑制剂、去污剂、缓冲剂、稳定剂、碱剂、核酸酶抑制剂和β-巯基乙醇，特定是EDTA、EGTA，盐如氯化钠、硫酸铵、氯化铵、LiCl或其他促进核酸结合和/或沉淀的物质。各添加剂能包括例如在回收溶液和/或结合溶液中，但还可分开添加。此外，生物缓冲液能在步骤a)和/或步骤d)中使用，并因此还可包括在回收溶液中。各缓冲液示例包括但不限于HEPES、MES、MOPS、TRIS、柠檬酸钠、乙酸钠和BIS-TRIS丙烷。

步骤a)和/或d)的结合中使用的pH值优选位于范围4-11，就RNA而言优选范围为约5-8，更优选6-7,5。就DNA而言，pH值优选位于约5-11范围内，更优选约6-10范围。分离2种核酸类型为靶核酸时，pH优选位于约6-8范围内。回收溶液优选包括使pH在上述范围缓冲的缓冲液。根据一个实施方式，回收溶液的pH位于约pH5-11范围，优选约5,5-8范围；最优选回收溶液具有约5-7,5或约7的pH。各pH值特别适于分离RNA为靶核酸。

根据一个实施方式，在步骤a)与b)之间和/或步骤d)之后进行一个或多个洗涤步骤，同时靶核酸结合所述固相。为此，可使用普通洗涤液。推荐使用不引起包括小靶核酸在内的靶核酸从核酸结合固相释放的洗涤液。根据一个实施方式，用于洗涤的溶液包括至少一种离液剂、至少一种醇和/或至少一种缓冲组分。其还可包括去污剂。能用于洗涤液的离液剂包括但不限于盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍和碘化钠。此外，能使用离液盐，所述离液盐包含选自三氯乙酸盐、高氯酸盐和三氟乙酸盐的离液序列高的阴离子。各离液盐示例是碱盐如高氯酸钠、三氯乙酸钠和三氟乙酸钠。作为醇，能使用优选有1-5个碳原子的短支链或直链醇以分别在洗涤液中清洗。示例是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。优选使用异丙醇和/或乙醇。

根据一个实施方式，所述洗涤液包含至少30%醇和至少0,5M离液盐，优选至少2M离液盐。此外，所述洗涤液可包含去污剂。离子和/或非离子型去污剂优选用作去污剂。非离子型去污剂优选以至少0,1%浓度使用。例如，各洗涤液适于清洗RNA。

能替代或补充（优选随后）上述洗涤液使用的其他合适洗涤液包含醇和生物缓冲液。合适醇和生物缓冲液如上描述。就第二洗涤步骤优选使用异丙醇或乙醇，最优选乙醇。乙醇优选以至少30%v/v浓度使用，优选至少50%v/v。生物缓冲液优选是pH约7-8的Tris。然而，根据所分离靶核酸和加工样品，还能使用其他缓冲液如柠檬酸钠以及其他pH值。

能替代或补充（优选随后）上述洗涤液使用的其他合适洗涤液还包含一种或多种醇和可选的缓冲液。合适醇和生物缓冲液如上描述。就替代洗涤步骤优选使用异丙醇或乙醇，最优选乙醇。乙醇优选以至少50%v/v浓度使用，优选至少70%v/v或更高。

术语“样品”在本文中以广义使用并意在包括多种含核酸的来源和组合物。所述样品可以是生物样品，但所述术语还包括其他，例如包含核酸如PCR产物或组合物的人工样品，所述组合物含有例如假定进一步浓缩和/或进一步纯化的已纯化核酸。示例性样品包括但不限于全血；血液制品；红血球；白血球；血沉棕黄色层；拭子，包括但不限于口腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子、尿道拭子、子宫颈拭子、咽喉拭子、直肠拭子、病损拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等；尿；痰；唾液；精液；淋巴液；羊水；脑脊液；腹膜渗出；胸膜积液；囊肿液；滑液；玻璃体液；房水；囊液；洗眼液；眼抽出物；血浆；血清；肺灌洗液；肺抽吸；动物，包括人或植物组织，包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心、肌肉、胰脏、细胞培养物以及裂解物、提取物或获自上述样品的材料和部分或者可存在于样品之上或之中的任何细胞和微生物和病毒等。获自临床或法医环境、包含核酸的材料也在术语“样品”的预期意义内。样品优选是从人、动物、植物、细菌或真菌获得的生物样品。样品优选选自细胞、组织、细菌、病毒和体液如血液、血液制品如血沉棕黄色层、血浆和血清、尿、液剂、痰、粪便,CSF和精子、上皮拭子、活检、骨髓样品和组织样品，优选器官组织样品如肺、肾或肝。此外，技术人员应理解获自任何上面示例性样品的裂解物、提取物或加工材料或部分也在术语“样品”范围内。这特定包括但不限于样品裂解物、澄清裂解物、预提取样品部分、假定进一步纯化和/或浓缩的已纯化核酸等，所述预提取样品部分例如就某一靶核酸类型富集，这是例如苯酚/氯仿提取中的情况，其中核酸如RNA在水相中浓缩。术语“样品”还包括加工样品如保存、固定和/或稳定的样品。作为固定剂，能使用交联以及非交联固定剂（非限制性市售示例包括PAXgene组织固定剂或卡诺伊溶液）。能用于稳定样品的市售可得稳定剂示例包括但不限于RNAlater、AllprotectTissue（组织）、RNAprotect Cell（细胞）、RNAprotect Saliva（唾液）、RNAprotectBacteria（细菌）、PAXgene Blood RNA（血液RNA）、PAXgene Blood DNA（血液DNA）、PAXgeneBone Marrow RNA（骨髓RNA）和QIAsafe。

特定地，根据本发明的方法用于从含已降解和破坏核酸如降解RNA或降解DNA的样品分离靶核酸。这类样品的非限制性示例包括细胞，所述细胞含有已保存样品例如福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE样品）或用交联固定剂如戊二醛处理的其他样品。例如，来自肿瘤的活检样品在FFPE的手术过程后进行常规保存，其可能破坏DNA和/或RNA完整性。各经降解的核酸通常具有小尺寸并因而是小核酸。所公开方法宜用于分离由小靶核酸组成或包括其的靶核酸。例如，所述样品可以是包括小核酸如非编码RNA（例如snoRNA或miRNA）或小DNA的样品。此外，靶核酸可由经修饰或降解的核酸组成或可包括它们。所述修饰或降解能是例如由于用防腐剂处理。

本文所用的术语“核酸”特定指含通常由亚基间磷酸二酯键共价结合的核糖核苷和/或脱氧核糖核苷的聚合物，但一些情况中由硫代磷酸、甲基膦酸酯等共价结合。核酸包括但不限于gDNA；环状DNA；低分子量DNA、质粒DNA；循环DNA；hnRNA；mRNA；非编码RNA(ncRNA)，包括但不限于rRNA、tRNA、miRNA(微RNA)、siRNA(小干扰RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、snRNA(小核RNA)和stRNA(小时序RNA)；片段化或经降解的核酸；PNA；获自亚细胞器如线粒体或叶绿体的核酸；和获自微生物、寄生虫的核酸，或可存在于生物样品中的DNA或RNA病毒。可包括或不包括加入或“掺入”生物样品的核苷酸类似物的合成核酸序列也在本发明范围内。

术语“小核酸”和“多种小核酸”特定指长度小于1000nt、小于750nt、小于500nt、小于400nt、小于300nt、小于250nt、小于200nt、小于100nt或小于70nt的核酸且包括但不限于miRNA、siRNA和其他短干扰核酸、snoRNA、snRNA、tRNA、piRNA、tnRNA、小rRNA、hnRNA、循环核酸、基因组DNA或RNA片段、经降解的核酸、核酶、病毒RNA或DNA、感染源核酸、扩增产物、修饰核酸、质粒或细胞器核酸和人工核酸如寡核苷酸。

根据本发明的方法涉及分离至少一种靶核酸的方法。术语“靶核酸”和“多种靶核酸”在本文中同义使用。从能根据本发明方法加工的所述样品示例显而易见的是，样品可包含多于一种类型的核酸。根据预期用途，需要从样品分离所有核酸类型（如随后都由术语靶核酸或多种靶核酸涵盖的DNA和RNA）或仅某些或某一核酸类型（如仅RNA而非DNA，或反之亦然）或平行的RNA和DNA，即来自一个样品，但彼此分开。所有这些变体在本发明范围内。术语“小靶核酸”或“多种小靶核酸”（这些术语也同义使用）特定指具有所需靶标类型的小核酸，例如小RNA或小DNA、或小RNA和小DNA。此外，表述“包括小靶核酸在内的靶核酸”不仅指含小靶核酸部分的靶核酸（如总RNA或总DNA），还指并涵盖由小靶核酸组成的靶核酸，且因而其不包括较大核酸。

样品可在进行结合步骤a)前加工。例如，样品能被破坏和/或裂解以释放该样品所含核酸。所用过程取决于样品，靶核酸假定从中分离且包括但不限于机械破坏、化学破坏、添加蛋白裂解酶、去污剂等以实现破坏、分别裂解样品。裂解物还可在进行结合步骤a)前澄清或另外加工。合适裂解/破坏方法和裂解缓冲液为现有技术已知，因而在此不需要描述。此外，能进行额外加工步骤，例如一种或多种耗尽以移出非靶核酸或其他不需要组分和/或核酸或其他样品所含生物分子可在步骤a)使靶核酸结合基于柱的核酸结合固相前进行修饰。

此外，如果特定样品如包埋样品根据本发明方法加工，优选包括步骤以从包埋基质（如从石蜡）释放核酸和/或样品。另外，在特定样品如固定和交联样品根据本发明方法加工的情况中，优选还包括步骤以从固定样品释放核酸并因而例如逆转固定步骤引起的修饰，特定用于移出交联。例如，在样品所含核酸是例如交联的如FFPE样品情况中，能进行额外步骤如加热步骤。实现所述结果和获得能分离靶核酸的样品的合适方法和加工步骤为现有技术已知且还例如描述于EP10001995.9、PCT/EP2011/000920和WO2007/068764，所述专利通过引用纳入本文。

根据一个实施方式，样品包含至少一种非靶核酸和至少一种靶核酸。根据一个实施方式，本发明所述方法包含移出至少一部分非靶核酸的步骤。例如，移出非靶核酸能通过使至少一部分非靶核酸在合适条件下结合固相和随后分开结合固相的非靶核酸与含靶核酸的剩余样品。这能通过例如在合适条件下添加适当固相来实现，其中非靶核酸主要结合固相。从靶核酸中选择性移出非靶核酸的合适方法例如描述于EP0880537和WO95/21849，所述专利通过引用纳入本文。其他方法包括例如苯酚和/或氯仿提取，如用于浓缩随后使用的水相中的RNA，优选混合有醇，用于使RNA结合步骤a)的膜。从固定样品如FFPE样品分离靶核酸（或平行的RNA和DNA）时，适于分开靶核酸与非靶核酸（特定用于分开DNA与RNA）的其他方法描述于EP10001995.9和PCT/EP2011/000920，所述专利通过引用纳入本文。

意在分离（仅）RNA为靶核酸时，非靶核酸通常是DNA。在此实施方式中，DNA酶消化优选在步骤b)中进行以移除、分别减少DNA污染。此外，意在分离DNA为靶核酸时，RNA酶消化能如步骤b)所进行以移除、分别减少RNA污染。膜用作核酸结合固相时，各膜上处理引起显著量的靶核酸且特定是小靶核酸释放。如上面和示例所述，其他非靶核酸还能平行分离。

根据一个实施方式，样品包含至少一种靶核酸和至少一种非靶标生物分子，如蛋白、脂质、碳水化合物或代谢物。根据一个实施方式，本发明所述方法包含移出至少一部分非靶标生物分子的步骤。例如，移出非靶标生物分子能通过使至少一部分非靶标生物分子在合适条件下结合固相和随后分开结合固相的非靶标生物分子与含靶核酸的剩余样品。这能通过例如在合适条件下添加适当固相来实现，其中非靶标生物分子主要结合固相。适于分开靶核酸与非靶标生物分子的其他方法包括通过化学或酶反应移出非靶标生物分子，其也能在例如步骤b)中于膜上完成（参见例如DE 10 2007 035 250）。

影响例如非靶标生物分子的合适DNA酶和RNA酶以及能用于进行步骤b)中各酶反应的缓冲液和溶液为现有技术已知并因而不需要详细描述。

本发明涉及步骤a)中应用柱所含核酸结合固相。本文所用的术语“柱”特定描述具有至少2个开口的容器。因此，溶液和/或样品能通过所述柱。术语“柱”具体不指示涉及容器形状的任何限制，所述容器能为例如圆形或角形，优选圆柱形。然而，还能使用其他形状，特别是在使用多柱时。柱包含核酸结合固相。所述柱包含的所述固相应允许溶液在应用于柱时分别通过样品。这意味着如果例如将离心力应用于柱，溶液和/或样品能以离心力方向通过柱。如上所讨论，用各基于柱的核酸分离过程时，所述样品常例如由离心或真空辅助通过柱，核酸在所述通过中结合所含核酸固相。柱能采用单一模式或多模式。所述具有与多孔板类似形式且包含核酸结合固相如膜的多柱为现有技术熟知。柱优选是离心柱。

作为核酸结合固相，能使用通常用于基于柱的核酸分离过程的任何固相。优选地，步骤a)使用核酸结合膜和因而能结合核酸的膜。合适膜包括但不限于亲水膜、疏水膜和经离子交换结合核酸的膜。示例包括但不限于二氧化硅膜、玻璃纤维膜、尼龙膜、纤维素膜如硝酸纤维素膜、改性纤维素膜（如乙酰-或羟基）、纸膜，特定是改性纸。所述膜优选为多孔。此外，优选使用包含硅石或由其组成的膜。柱所含其他普通核酸结合固相填充有核酸结合颗粒如硅粒子或核酸结合材料层（如硅胶）。例如，硅粒子能排列成惰性滤器或膜上的层，从而形成核酸结合固相。核酸结合固相越薄，关于靶核酸损失且特定是小靶核酸损失的上述问题越突出。这是因为柱所含薄层核酸结合固相（类似核酸结合膜）增加所释放小靶核酸能迅速逃逸并因而在核酸分离过程中丧失的风险。如上所述，本发明提供该问题的解决方案并从而能以高产量分离包括小靶核酸在内的靶核酸。因此，根据一个实施方式，柱所含核酸结合固相具有等于或小于其宽度的总高度。例如，核酸结合固相可由核酸结合材料层和/或各核酸结合颗粒优选硅粒子填充层构成，其作为小层应用于膜或滤器上。合适核酸结合材料和颗粒详述于下。

为缓和样品通过柱所含核酸结合固相，能使用合适方式如离心或应用压差产生装置，所述装置例如挤压样品通过柱、各核酸结合固相或通过应用真空吸取样品通过核酸结合固相。各方式为现有技术熟知并因而不需要在此进一步描述。

作为可用于步骤的d)的核酸结合固相，可使用能结合核酸且特定是小靶核酸的任何材料，包括多种能在合适条件下结合核酸的材料。所述用于步骤的d)固相不需基于柱，尽管这就便于操作而言优选。能与本发明联用的示例性固相包括但不限于：含硅石的化合物，包括但不限于硅粒子、二氧化硅、硅藻土、玻璃、烷基硅、硅酸铝、和硼硅酸盐;硝酸纤维素;重氮化纸;羟磷灰石（也称为羟基磷灰石）;尼龙;金属氧化物;氧化锆;氧化铝;聚合物支持体、二乙氨乙基-和三乙氨乙基-衍生支持物、疏水色谱树脂（如苯基-或辛基-琼脂糖凝胶)等。术语固相不意在指涉及其形式或设计的任何限制。因此，术语固相涵盖的合适材料为多孔或无孔；透性或不透性；包括但不限于膜、滤器、片、颗粒、磁性颗粒、珠、凝胶、粉末、纤维等。根据一个实施方式，固相如用于步骤d)的硅固相或用于步骤a)的核酸结合固相的表面不修饰且例如不用官能团修饰。如上所述，优选核酸结合膜用于步骤d)。所述膜可具有与上述步骤a)所用核酸结合膜相同的特性。特别优选与步骤a)所用相同的核酸结合膜用于使“逃逸”小靶核酸重结合步骤d)的所述膜。

进行本文所述以外的额外中间步骤也在本发明范围内。然而，根据某些实施方式，没有进行本文所述以外的额外步骤。

此外，本发明涉及应用能使小核酸结合膜的回收溶液，以重结合膜上处理中从所述核酸结合膜释放的所收集小核酸。如上所讨论，核酸优选收集为流出物以确保例如膜下滑动的小核酸也被有效收集并因而回收。引起小靶核酸释放的回收溶液和条件细节如上描述，参考上面的公开内容。

此外，本发明涉及运行本发明所述方法的试剂盒，包括：

a)柱中所含的核酸结合固相，优选膜；

c)回收溶液，包含浓度为0,1M多至饱和极限，优选0,5M多至饱和极限的离液剂和浓度为至少50%的醇；和

d)运行本发明所述方法的说明书。

回收溶液、核酸结合固相（优选膜）和结合缓冲液以及相关优势的详细说明如上描述，参考上面的公开内容。

实施例

实施例1：根据本发明或参考方法分离小核酸

使用来自大鼠肾的FFPE样品（样品在固定后保存并室温包埋2个月）和获自大鼠肺的FFPE样品（样品在固定后保存并室温包埋27个月）。用切片机（Microtom）获得大小为10μm厚的切片。每个样品使用一个切片。所有样品加工2次。对于所得FFPE切片的后续RNA分离，使用RNeasy FFPE试剂盒（恰根（QIAGEN））和QIAamp FFPE试剂盒（恰根）组分。

为从样品中移除石蜡，样品在1ml庚烷中孵育1小时。加入50μl甲醇，混合，离心样品，收集上清，样品在室温干燥5分钟。

分别获得的去石蜡样品团与150μl蛋白酶K消化缓冲液（缓冲液PKD，恰根公司）混合，此外混合10μl蛋白酶K溶液（>600mAU/ml）。混合物在1400rpm振荡下56℃孵育15分钟。样品在冰上冷却3分钟并离心30分钟以移除未溶解组分。弃去含团块的DNA（如需要，含团块的所述DNA能可选用于分离DNA）且收集上清以分离所含RNA为靶核酸。为排除归因于所用样品材料的变异，合并所收集上清、混合并分成150μl等分样品。

随后，这些等分样品在80℃孵育15分钟以移除RNA中的交联（由FFPE保存产生）。之后，加入300μl离液裂解缓冲液（缓冲液RLT，恰根公司），得到的混合物与1050μl乙醇混合。得到的混合物应用于二氧化硅膜（RNeasy MinElute柱，恰根）并以10.000rpm离心15秒来通过膜。通过使含离液剂和乙醇的洗涤缓冲液(RWT，恰根)通过膜，洗涤结合靶核酸的膜。之后，将含10μl DNA酶I和70μl DNA酶反应缓冲液（缓冲液RDD，恰根）的80μl混合物应用于膜并室温孵育15分钟以移除剩余基因组DNA。

对于根据现有技术已知参考方法分离RNA，在进行膜上DNA酶消化以移除DNA酶反应溶液后再次加入含离液剂和乙醇的洗涤缓冲液（缓冲液RWT，恰根）。由于所含离液剂和醇，洗涤缓冲液RWT增强RNA与膜的结合。之后，通过2次加入500μl含醇的洗涤缓冲液（RPE，恰根）并通过膜，洗涤所述膜。膜通过14.000rpm离心5分钟来干燥。应用30μl水并进行孵育步骤1分钟后，由离心洗脱RNA。

对于根据本发明方法分离RNA，进行膜上DNA酶消化后，应用含1-1,5MGTC、75%异丙醇、柠檬酸钠,pH7的回收溶液并由离心通过膜。收集流出物且重应用并由离心通过膜。因此，膜上DNA酶消化中从膜释放的特定小靶核酸再次结合所述膜并因而回收。之后，通过2次加入500μl含醇的洗涤缓冲液（RPE，恰根）并通过膜，洗涤所述膜。膜通过在14.000rpm持续5分钟的离心步骤来干燥。应用30μl水并进行孵育步骤1分钟后，由离心洗脱RNA。

用安捷伦生物分析仪分析从肾组织分离的RNA大小分布以证明用本发明所述方法实现的改进。应用相同量的RNA（以ng计）（由OD测量测定）。结果示于图1，其中“+”鉴定用本发明所述方法分离的RNA且其中“-”鉴定用参考方法分离的RNA。可见根据本发明方法进行必要收集和重应用步骤c)及d)引起所分离RNA中小靶标RNA显著增加。这可从根据本发明方法分离的RNA中能检测的小RNA范围内的显著较深条带得到（这些条带由图1的箭头标记）。因此，用本发明所述方法分离的RNA中的小RNA量相较参考方法显著增加。用参考方法分离的RNA仅包含少量小RNA，因此更多大RNA分子能以应用RNA量检测。因此，此示例显示根据本发明的方法显著增加所分离RNA中的小RNA产量。为避免产生疑问，强调进行本发明所述方法或参考方法时，较大RNA分子总量基本相同，由检测较大mRNA扩增子的RT-PCR所证实。

还用定量实时RT-PCR分析经分离RNA以分析本发明所述方法对特定小RNA产量的有利影响。

为此，采用经分离RNA测定微RNA miR29a和miR30b的扩增子，根据厂商说明书用ABI TaqMan微RNA试验（应用生物系统公司（Applied Biosystems））。逆转录反应使用20ng RNA，根据厂商说明书用TaqMan微RNA逆转录试剂盒和相应引物has-miR30a及has-miR29b（应用生物系统公司）。用上述系统进行miRNA扩增子的扩增，在实时扩增系统（ABIPRISM7900HT序列检测系统，ABI公司（ABI））中使用2μl cDNA（1:20稀释）。测定所测ct值的平均值（由一式两份得到）并概括于表1。

表1：根据本发明或参考方法进行RNA分离的miRNA检测

		miR29a	miR30b
				肾	有重结合	24,45	24,14

无重结合	26,61	26,06
			肺	有重结合	24,5	25,08
无重结合	26,52	26,83

结果显示用本发明所述方法产生的ct值显著低于用参考方法所得对应样品得到的ct值。用本发明所述方法获得的较低ct值归因于以下事实：各分离RNA包含较大量的检测miRNA。这显示根据本发明方法所分离RNA包含的小核酸多于用参考方法分离的RNA。根据本发明的方法显著改善从生物样品分离小核酸，因为小靶核酸产量增加。如参考实施例所示，单一加入含离液剂和乙醇、增强潜在释放靶核酸与膜结合的洗涤缓冲液（如现有技术中的那些）不足以有效重捕获小靶核酸。如上所讨论，这最可能是由于以下事实：所释放小靶核酸从膜的核酸结合表面逃逸，因此不能由根据现有技术的方法重捕获。

实施例2：不同浓度的离液剂在回收溶液中的应用

此实施例中，使用大鼠肾的FFPE样品。FFPE样品在固定后保存并室温包埋约2个月。用切片机（Microtom）从所述FFPE样品获得10μm厚的切片。每个样品使用一个切片。所有样品加工2次。对于各FFPE切片的后续RNA分离，使用RNeasy FFPE试剂盒（恰根）和QIAampFFPE试剂盒（恰根）组分。

如实施例1所述完成根据本发明方法和参考方法的RNA分离。对于在进行膜上DNA酶消化后重结合“逃逸”小RNA，3种不同组合物用作回收溶液。所测试回收溶液包含70%乙醇、柠檬酸钠,pH7和

A)1,16M GTC

B)1,5M GTC

C)1,8M GTC。

用安捷伦生物分析仪分析从肾组织分离的RNA大小分布。与图1所示结果类似，再次发现用参考方法分离的总RNA中的小RNA比例显著低于用本发明所述方法分离的RNA。因此，根据本发明方法分离的RNA包含较高产量的小RNA。也由图2所证明，所有测试的回收溶液A)-C)适于有效重捕获小靶核酸，其中参考方法“-”仅产生少量小RNA。

为分析不同测试回收溶液对小RNA分离的效果，通过如实施例1所述进行定量实时RT-PCR来分析RNA。为此，采用经分离RNA测定微RNA miR29a和miR16的扩增子，根据厂商说明书用ABI TaqMan微RNA试验（应用生物系统公司）。

测定所测ct值的平均值（由一式两份得到）并概括于表2。

表2：用本发明所述方法或参考方法分离RNA后的miRNA检测

	组合物	miR16	miR29a
				无重结合	-	28,56	27,78
有重结合	A	26,46	26,06
				有重结合	B	25,64	25,60
有重结合	C	26,71	25,90

结果显示相较用参考方法分离的RNA，用根据本发明分离的RNA时ct值显著更低。这是由于以下事实：根据本发明的方法显著增加所分离RNA中的小RNA产量。如结果所示，不同浓度的离液剂能成功用于回收溶液。

实施例3：不同醇和不同醇浓度在回收溶液中的适用性

此实施例中，使用来自大鼠肾的FFPE样品（样品在固定后保存并室温包埋2个月）和来自大鼠肺的FFPE样品（样品在固定后保存并室温包埋约27个月）。用切片机（Microtom）获得10μm厚的切片；每个样品使用一个切片。所有样品加工2次。对于FFPE切片的后续RNA分离，使用RNeasy FFPE试剂盒（恰根）和QIAamp FFPE试剂盒（恰根）组分。

如实施例1所述用本发明所述方法和参考方法进行RNA分离。对于在进行膜上DNA酶消化后捕获“逃逸”小RNA，测试有4种不同组合物的回收溶液。回收溶液包含1,5M GTC、柠檬酸钠,pH7和

A)70%乙醇

B)75%乙醇

C)70%异丙醇

D)75%异丙醇。

用安捷伦生物分析仪分析从肾组织分离的RNA大小分布。与图1和图2所示结果类似，发现（参见图3）用本发明所述方法时所分离总RNA中的小RNA部分大幅增加。所有测试的回收溶液就有效重捕获小RNA而言基本等效，其中参考方法“-”仅产生少量小RNA。

为分析不同回收溶液对特定小RNA分离的效果，用实施例1所述定量实时RT-PCR分析经分离RNA。采用经分离RNA测定微RNA miR29a的扩增子，根据厂商说明书用ABI TaqMan微RNA试验（应用生物系统公司）。

测定所测ct值的平均值（由一式两份得到）并概括于表3。

表3：用本发明所述方法或参考方法分离RNA后的miR29a检测

	组合物	肾	肺
				无重结合	-	26,61	26,42
有重结合	A	25,41	25,40
				有重结合	B	24,66	25,15
有重结合	C	24,74	25,22
				有重结合	D	24,45	24,50

再次，结果显示用本发明所述方法显著提高所分离RNA中的小RNA产量，如能从较低ct值得到。不同醇和不同醇浓度能用于回收溶液。

实施例4：根据本发明或参考方法从非固定样品分离小核酸

大鼠肺的组织样品（样品在RNAlater中切除后于-80℃保存）用于RNA分离，用含离液剂的裂解缓冲液。所有样品加工2次。对于后续RNA分离，使用RNeasy试剂盒（恰根）和miRNeasy试剂盒（恰根）组分。

基于苯酚-氯仿的裂解

各10mg大鼠肺在700μl基于苯酚的裂解缓冲液（缓冲液QIAzol，恰根）中用5mm钢珠以25Hz匀化5分钟，使用玻珠研磨机（TissueLyzer，恰根）。之后，样品室温孵育5分钟，然后加入140μl氯仿。室温孵育2分钟后，裂解物以12000xg在4℃离心15分钟。移出上相并与525μl乙醇混合。所得混合物应用于二氧化硅膜（RNeasy迷你柱，恰根）并由13.000rpm离心15秒来通过膜。通过使含离液剂和乙醇的洗涤缓冲液(RWT，恰根)通过膜，洗涤结合靶核酸的膜。

基于离液剂的裂解

各10mg大鼠肺在350μl裂解缓冲液（包括β-巯基乙醇的缓冲液RLT，恰根）中用5mm钢珠以25Hz匀化5分钟，使用玻珠研磨机（TissueLyzer，恰根）。之后，样品在14000rpm孵育4分钟且上清与525μl乙醇混合。所得混合物应用于二氧化硅膜（RNeasy迷你柱，恰根）并由10.000rpm离心15秒来通过膜。

通过使含离液剂和乙醇的洗涤缓冲液(RWT，恰根)通过膜，洗涤结合靶核酸的膜。

所有样品的进一步加工

将含10μl DNA酶I和70μl DNA酶反应缓冲液（缓冲液RDD，恰根）的80μl混合物应用于膜并室温孵育15分钟以移除剩余基因组DNA。

对于根据参考方法或根据本发明方法分离RNA，所有其他步骤如实施例1所述完成。应用50μl水（基于苯酚的裂解）或40μl水（基于离液剂的裂解）和进行孵育步骤1分钟后由离心洗脱RNA2次。

洗脱物的分析

用实施例1所述定量实时RT-PCR分析经分离RNA。采用经分离RNA测定微RNAmiR29a的扩增子，根据厂商说明书用ABI TaqMan微RNA试验（应用生物系统公司）。

测定所测ct值的平均值（由一式两份得来）并概括于表4。

表4：用本发明所述方法或参考方法从非固定样品分离RNA后的miR29a检测

	裂解	ct值
			有重结合	基于苯酚的裂解	23,36
有重结合	基于苯酚的裂解	22,16
			没有重结合	基于离液剂的裂解	26,38
有重结合	基于离液剂的裂解	23,69

再次，结果显示用本发明所述方法显著提高所分离RNA以及非固定样品中的小RNA产量，如能从较低ct值得到。

实施例5：用本发明所述方法分离小DNA

作为DNA样品，使用10bp DNA梯度和50bp DNA梯度。对于后续分离，使用QIAampMinElute试剂盒（恰根）组分。2μg10bp DNA梯度和5μg50bp DNA梯度与180μl裂解缓冲液（缓冲液ATL，恰根）混合。DNA用参考方法（有或没有膜上DNA处理）或本发明所述方法从所述混合物中纯化。

对于没有膜上DNA处理的参考方法（样品(a)），裂解-DNA混合物与4μl RNA（100mg/ml）混合并室温孵育2分钟。随后，加入200μl含离液剂的结合缓冲液（缓冲液AL，恰根）和200μl乙醇。应用得到的混合物并由离心（1分钟，8000rpm）通过二氧化硅膜（QIAamp MinElute柱，恰根）。通过使500μl含醇和离液剂的洗涤缓冲液（AW1，恰根）和500μl含醇的洗涤缓冲液（AW2）穿过膜来洗涤该膜。膜通过离心（1分钟，14000rpm）干燥。DNA在应用洗脱缓冲液（30μl，ATE，恰根）和孵育1分钟后由离心洗脱。

在进行膜上DNA处理的参考方法（样品b、c、e、f）和本发明所述方法（样品d、g）中，含裂解缓冲液和DNA样品的混合物与200μl含离液剂的结合缓冲液（缓冲液AL，恰根）和200μl乙醇混合。应用得到的混合物并由离心（1分钟，8000rpm）通过二氧化硅膜（QIAampMinElute柱，恰根）。

之后，进行不同膜上处理，同时DNA结合膜。一些样品用RNA酶处理（样品b、c、d）且其他用蛋白酶处理（样品e、f、g）。

对于进行膜上RNA酶处理，将80μl RNA酶混合物应用于膜并室温孵育5分钟，所述混合物由4μl RNA酶A（100mg/ml）和76μl RNA酶反应缓冲液（缓冲液RDD，恰根）组成。

对于进行膜上蛋白酶处理，将80μl蛋白酶混合物应用于膜并56℃孵育15分钟，所述混合物由20μl蛋白酶K（>600mAU/ml）和60μl蛋白酶反应缓冲液（缓冲液RDD，恰根）组成。

对于根据参考方法加工的样品（样品b、c、e、f），500μl含离液剂和乙醇的缓冲液（缓冲液AW1，恰根（样品b、e）或缓冲液RWT，恰根（样品c、f））和500μl含醇的洗涤缓冲液AW2（恰根）通过膜。膜通过离心干燥（1分钟，14000rpm）。DNA在应用洗脱缓冲液（30μl，ATE，恰根）和孵育1分钟后由离心洗脱。

对于根据本发明所述方法加工的样品（样品d和g），应用回收溶液（含1-1,5MGTC、75%异丙醇、柠檬酸钠pH7）并由离心通过膜。重应用流出物并由离心通过膜以重结合逃逸的小DNA分子。之后，通过使500μl含醇的洗涤缓冲液（AW2）穿过膜来洗涤该膜。DNA在应用洗脱缓冲液（30μl，ATE，恰根）和孵育1分钟后由离心洗脱。

由实施例5测试的不同方法分离的DNA产量在260nm测定。表5显示一式两份的平均值。

表5：有和没有膜上DNA处理时用本发明所述方法或参考方法分离DNA后的DNA产量

如表5所证明，根据本发明的方法显著提高核酸分离方法中的小DNA产量，其中进行膜上处理。

实施例6：不同离液剂和不同缓冲剂在回收溶液中的适用性

大鼠肺的组织样品（样品在RNAlater中切除后于-80℃保存）用于RNA分离，用含离液剂的裂解缓冲液。对于后续RNA分离，使用RNeasy试剂盒（恰根）和miRNeasy试剂盒（恰根）组分。

为提供均匀起始材料以比较不同回收溶液，从大鼠肺组织制备裂解物库。就各10mg组织加入350μl裂解缓冲液（包括β-巯基乙醇的缓冲液RLT，恰根），材料用转子定子式匀浆器匀化。匀化后，裂解物库分成350μl裂解物的等分样品并用于所有后续RNA纯化。裂解物与525μl96-100%乙醇混合，应用于二氧化硅膜（RNeasy迷你柱，恰根）并由10.000rpm离心15秒通过膜。

作为没有重结合的参考（参见图4的参考），通过使含离液剂和乙醇的洗涤缓冲液（RWT，恰根）通过膜来洗涤结合靶核酸的膜。将含10μl DNA酶I和70μl DNA酶反应缓冲液（缓冲液RDD，恰根）的80μl混合物应用于膜并室温孵育15分钟以移除剩余基因组DNA。然后，通过使含离液剂和乙醇的洗涤缓冲液（RWT，恰根）穿过膜来再次洗涤该膜。之后，通过2次加入500μl含醇的洗涤缓冲液（RPE，恰根）并通过膜，洗涤所述膜。膜通过14.000rpm离心3分钟来干燥。应用40μl水并进行孵育步骤1分钟后，由离心洗脱RNA2次。

对于根据本发明方法分离RNA，通过使含不同组成的离液剂、缓冲液组分和异丙醇的回收溶液（表6）穿过膜来洗涤结合靶核酸的膜。弃去流出物。将含10μlDNA酶I和70μl DNA酶反应缓冲液（缓冲液RDD，恰根）的80μl混合物应用于膜并室温孵育15分钟以移除剩余基因组DNA。进行柱上DNA酶消化步骤后，应用相同类型的回收溶液并由离心通过膜。收集流出物，重应用并由离心通过膜。因此，膜上DNA酶消化中从膜释放的特定小靶核酸再次结合膜并因而回收。之后，如上面参考方法所述从膜洗脱RNA。（所有样品加工2次。）

表6：不同回收溶液的组成

用实施例1所述定量实时RT-PCR方法分析经分离RNA。采用经分离RNA测定微RNAmiR16的扩增子，根据厂商说明书用miScript系统（恰根）。

测定所测ct值的平均值（由一式两份得到）并示于图4。再次，结果显示用本发明所述方法显著提高所分离RNA中的小RNA产量，如能从较低ct值得到。不同离液剂和不同缓冲液组分能用于回收溶液。

实施例7：用本发明方法或用基于现有技术操作的方法分离RNA和DNA

使用获自大鼠肝（样品在固定后保存并石蜡室温包埋约2个月）、大鼠肾（保存并相应包埋约19个月）和大鼠肺（保存并相应包埋约8个月）的FFPE样品。用切片机（Microtom）获得大小为10μm厚的组织切片。每个样品使用2个切片。所有样品进行一式三份。对于后续RNA和DNA分离，通过本发明方法使用试剂盒RNeasy FFPE（恰根）和试剂盒Allprep DNA RNAFFPE（恰根）组分。

或者，基于现有技术试剂盒操作的方法用于比较。使用来自不同供应商的下列试剂盒：

-FFPE RNA/DNA纯化试剂盒（诺冠公司（NORGEN））

-就FFPE样品优化的RecoverAll^TM总核酸分离试剂盒（安碧公司（Ambion））

-QuickExtract^TM FFPE RNA提取试剂盒（艾比森得公司（EPICENTRE））

-FFPE样品的RNA和DNA分离（MN公司（Macherey-Nagel)））

根据本发明的方法

为从样品中移除石蜡，样品通过涡旋10秒与1ml二甲苯混合并离心（2分钟20.000rpm）。完全移出上清。然后，样品补充有1ml96%乙醇，如上涡旋10秒混合并离心。完全移出上清，样品团在37℃干燥10分钟。

这些去石蜡样品团与150μl蛋白酶K消化缓冲液（缓冲液PKD，恰根）、10μl蛋白酶K溶液（>600mAU/ml）混合。混合物在56℃孵育15分钟，以450rpm恒定振荡。样品在冰上冷却3分钟并以20.000g室温离心15分钟。含DNA的团块用于分离DNA并收集上清以分离所含RNA。

随后，这些含RNA的上清以450rpm在恒温混匀仪上80℃孵育15分钟。之后，各情况中加入320μl离液裂解缓冲液（缓冲液RLT，恰根），得到的混合物补充有1120μl96%乙醇。试剂通过上下抽吸混合且将700μl应用于二氧化硅膜（(RNeasy MinElute柱，恰根）。样品通过10.000rpm离心15秒来穿过膜并弃去流出物。剩余样品因而应用于膜。通过使350μl回收溶液穿过膜（10.000rpm离心15秒）来洗涤结合靶核酸的膜，所述溶液由1份5M GTC（+25mM柠檬酸钠）和3份异丙醇组成（下文称为回收溶液）。之后，将含10μl DNA酶I和70μl DNA酶反应缓冲液（缓冲液RDD，恰根）的80μl混合物应用于膜并室温孵育15分钟。

进行所述膜上DNA酶消化后，应用500μl回收溶液并由离心（15秒10.000rpm）通过膜。收集流出物，如上所述重应用并由离心通过膜。因此，膜上DNA酶消化中从膜释放的特定小靶核酸重结合膜并因而回收。随后，通过加入500μl含醇的洗涤缓冲液（RPE，恰根）并如上由离心穿过膜来洗涤膜2次。膜通过在14.000rpm持续5分钟的离心步骤干燥。通过在应用30μl不含RNA酶的水和孵育1分钟后全速离心1分钟来洗脱总RNA。

对于DNA分离，向各样品团加入180μl缓冲液ATL（恰根）和40μl蛋白酶K。涡旋后，样品在56℃恒定振荡孵育1小时。然后，样品在无振荡情况下90℃孵育2小时。向混合物中加入4μl RNA酶A（100mg/ml），混合并室温孵育2分钟。样品补充有200μl缓冲液AL（恰根）并混合。添加200μl96%乙醇并立即混合。将混合物应用于QIAamp MinElute柱且8,000g离心1分钟。弃去流出物。样品补充有700μl缓冲液AW1（恰根）且8,000g离心1分钟。弃去流出物。样品补充有700μl缓冲液AW2（恰根）且如上离心。弃去流出物。样品补充有700μl96%乙醇且如上离心。弃去流出物。对于膜干燥，柱在开盖情况下14,000rpm离心5分钟。用移液管直接吸取30μl缓冲液ATE（恰根）到柱的膜上，然后室温孵育并8000g离心1分钟。30μl洗脱物在-20℃保存直到下一步程序。

基于现有技术操作的方法

FFPE RNA/DNA纯化试剂盒（诺冠公司）用于根据厂商说明书分离总RNA和DNA。就RNA和DNA而言，样品分别用蛋白酶K在50℃孵育约2小时和24小时-样品完全裂解。仅在RNA情况中，每ml结合溶液加入10μl β-巯基乙醇。用10单位DNA酶I（恰根）进行其他DNA消化。将溶于相应孵育缓冲液的DNA酶应用于柱和随之离心后，重应用流出物并孵育15分钟。

就FFPE样品优化的RecoverAll^TM总核酸分离试剂盒（安碧公司）、QuickExtract^TMFFPE RNA提取试剂盒（艾比森得公司）以及FFPE样品的RNA和DNA分离试剂盒（MN公司）用于总RNA和DNA分离-包括DNA消化-根据厂商说明书。

之后，用不同操作分离的核酸在质量、数量、分离RNA中的DNA污染方面且特定是分离小核酸产量方面等进行分析。结果示于图5-9。

结果显示根据本发明的方法能从同一样品平行但分开分离DNA和RNA。在此，分离RNA和DNA共花费约6小时。因此，其能在一个工作日中进行。分离的核酸具有高质量。分离RNA中的DNA污染比现有技术方法低许多且分离小核酸产量显著较高。

艾比森得的实验方案很迅速（就RNA和DNA而言共约1:10小时）且简单。然而，所得“洗脱物”为奶白色、微黄和浑浊。此外，分离RNA的质量不能接受且小核酸含量极低。MN公司的实验方案能从同一样品平行分离DNA和RNA。然而，所分离RNA降解更多，导致此实施例7内所研究RNA的实时PCR ct值比本发明所述方法更高。使用此操作时，分离RNA和DNA共花费约8:30小时。诺冠公司的实验方案很耗时（测试形式中就RNA为约5:20小时且就DNA为约26小时），这时由于极长的蛋白酶K消化步骤（分别为约2小时和24小时）。此外，结果显示分离RNA中的DNA污染相对较高。另外，小RNA产量显著较低。安碧公司的实验方案很耗时，因为DNA回收需要与常规实验室流程冲突的16小时蛋白酶消化步骤。此外，分离RNA中的DNA污染高于本发明所述方法且小RNA含量较低。

微RNA分析

用安捷伦生物分析仪分析从不同组织分离的RNA大小分布以证明用本发明所述方法实现的改进。应用相同量的RNA（以ng计）（由OD测量测定）。肺组织样品（进行一式三份）的结果示于图5。可见进行本发明所述方法与基于现有技术试剂盒操作的方法相比，产生所分离RNA中高且可靠的小靶标RNA产量。这能从小RNA范围内的条带得到。这些条带由图5的箭头标记。

另外，应强调迄今为止本发明所述方法产生最高纯度的分离RNA。图6显示用cjunmRNA获得的结果，由实时PCR量化，分别有（+）和没有（-）逆转录（RT）已分离RNA。对于所有研究的组织，在本发明所述方法（恰根）的情况中，所得ct值差异（δ）迄今为止代表最高值，表明基因组DNA的污染最低。

分离RNA进行定量实时RT-PCR以分析本发明所述方法对特定小RNA产量的有利影响。为此，20ng各分离RNA根据实施例1所述过程和装置用于检测微RNA miR29a的扩增子。测定所测ct值的平均值（由一式三份得到）且结果示于图7。结果显示用本发明所述方法产生的ct值显著低于用基于现有技术试剂盒操作的方法所得样品的ct值。用本发明所述方法获得的较低ct值归因于以下事实：相应分离的总RNA包含较大量的微RNA miR29a。再次，这些结果证明根据本发明方法分离的总RNA包含更多小核酸，即来自生物样品的小核酸产量增加。基于现有技术试剂盒操作的方法在重结合小靶核酸上效率低于本发明所述方法。

分离DNA进行定量实时RT-PCR。对于朊病毒78bp，测定所测ct值的平均值（由一式三份得到）并概括于图8a和b，分别对应等体积和等浓度的所用DNA样品。同样对于朊病毒78bp，用本发明所述方法的ct值显著较低。

分离DNA进一步进行定量实时RT-PCR。对于Madh7，测定所测ct值的平均值（由一式三份得到）并概括于图9a和b，分别对应等体积和等浓度的所用RNA样品。用本发明所述方法的，用本发明所述方法的Madh7的ct值显著较低。

Claims

1.一种从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述小靶核酸长度小于1000nt，所述方法包括至少下列步骤：

a)通过将所述样品经过柱来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述柱中含有的核酸结合固相，

b)在所述靶核酸结合所述固相时对核酸结合固相进行酶和/或化学处理，

c)收集所述步骤b)处理中从所述固相释放的至少一部分小靶核酸作为流出物，

d)回收溶液通过所述柱并收集含小靶核酸和所述回收溶液的流出物；或在步骤c)中收集流出物后向其中加入回收溶液；或回收溶液通过所述柱并收集含小靶核酸和所述回收溶液的流出物，并且在步骤c)中收集流出物后向其中加入回收溶液，

e)将含小靶核酸的混合有回收溶液的所述收集的流出物接触核酸结合固相，用以将所含小靶核酸结合所述核酸结合固相，

f)可选进行洗脱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于步骤a)的所述核酸结合固相是膜。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤d)用于使流出物所含的小靶核酸重结合步骤a)所用的核酸结合固相。

4.一种从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述小靶核酸长度小于1000nt，所述方法包括至少下列步骤：

a)通过将所述样品经过核酸结合膜来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述膜，

b)在所述靶核酸结合所述膜时对膜进行涉及水溶液的处理，

c)使回收溶液通过所述膜，

d)收集步骤c)的含小靶核酸的流出物，

e)使所述流出物通过步骤a)的膜以将所含小靶核酸重结合所述膜，

f)可选从所述膜洗脱包括小核酸在内的靶核酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中进行酶和/或化学处理，包含使用水溶液且选自核酸酶消化步骤、蛋白消化步骤、脂酶消化步骤或靶核酸修饰步骤。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中进行的处理涉及引起至少部分靶核酸从所述核酸结合固相释放的条件。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述靶核酸是小靶核酸。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述回收溶液具有一种或多种下列特征：

a)提供适于使小核酸结合步骤e)所用的核酸结合固相或膜的条件；

b)就结合小核酸而言，提供比步骤a)所用的结合条件更强的结合条件；

c)提供适于使小RNA结合步骤e)所用的核酸结合固相或膜的条件；

d)提供适于使小DNA结合步骤e)所用的核酸结合固相或膜的条件；

e)包含至少一种离液剂和/或至少一种醇；和/或

f)包含至少一种浓度为0.1-6M的离液剂和/或至少一种浓度为至少50% v/v的选自乙醇或异丙醇的醇，

和/或

其中用于步骤e)的结合条件具有一种或多种下列特征：

a)适于使小核酸结合步骤e)所用的核酸结合固相或膜；

c)适于使小RNA结合步骤e)所用的核酸结合固相或膜；

d)适于使小DNA结合步骤e)所用的核酸结合固相或膜；

e)包含至少一种离液剂和/或至少一种醇；和/或

f)包含至少一种浓度为0.1-6M的离液剂和/或至少一种浓度为至少50% v/v的选自乙醇或异丙醇的醇。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，若所述靶核酸是RNA则进行DNA酶消化，若所述靶核酸是DNA则进行RNA酶消化。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中的结合在具有一种或多种下列特征的条件下进行：

a)所述条件适于使总核酸结合所述核酸结合固相或膜；

b)所述条件适于使包括小RNA在内的总RNA结合所述核酸结合固相或膜；

c)所述条件适于使包括小DNA在内的总DNA结合所述核酸结合固相或膜；和/或

d)在至少一种离液剂和/或至少一种醇存在下发生结合。

11.如前述权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品在步骤a)之前或之中裂解或加工。

12.如前述权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含小核酸和/或经降解的核酸。

13.如前述权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品选自下组的样品和/或衍生自选自下组的样品：细胞、临床样品、体液、组织、血液制品、植物、细菌、病毒、真菌、人或动物样品材料、环境样品、分离核酸、裂解物、洗脱物、固定样品或交联样品。

14.如前述权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品选自下组的样品和/或衍生自选自下组的样品：血液或FFPE样品。

15.一种能使小核酸结合至膜的回收溶液的应用，其用于重结合在膜上处理中从核酸结合膜释放所收集的小核酸，所述小核酸长度小于1000 nt。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述小核酸的至少一部分在从所述膜释放后定位于该膜下方。

17.如权利要求15或16所述的应用，其特征在于，所述回收溶液具有权利要求8所定义的一种或多种特征。