CN103088097A

CN103088097A - 一种鲐鱼活性肽的制备方法

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Publication number: CN103088097A
Application number: CN2013100020994A
Authority: CN
Inventors: 李鹏程; 王雪芹; 邢荣娥; 刘松; 于华华; 李克成; 李冰; 秦玉坤; 李荣锋
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-01-04
Filing date: 2013-01-04
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明属于海洋化学领域，具体涉及一种鲐鱼活性肽的制备方法。以鲐鱼作为原材料经绞碎，加入去离子水置于恒温水浴中经搅拌保温5~10min，再调节pH值；调节pH值后加入蛋白酶进行酶解反应5h~8h，反应完毕后，酶灭活，离心，收集上清液，冷冻干燥，即得鲐鱼活性肽；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1000U~2000U酶活力单位的蛋白酶。本发明的制备方法反应条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、且设备简单安全。制得的多肽粉外观呈淡黄色粉末，易溶于水，氨基酸组成全面，含量丰富，是一种无色素、无添加剂的营养食品。

Description

一种鲐鱼活性肽的制备方法

技术领域

本发明属于海洋化学领域，具体涉及一种鲐鱼活性肽的制备方法。

背景技术

生物活性肽因其具有特殊的生理活性，主要体现在免疫活性、抗高血压、抗血脂、抗氧化、促生长活性、肿瘤抑制活性等，从而广泛应用于食品及化妆品行业、农业及畜牧业、医药领域。鲐鱼，又名青鲇鱼，是海洋中上层低值鱼类，在我国各海域均有分布，尤以东海产量最多。鲐鱼是我国重要的加工鱼种，每年加工成各类冷冻鱼片和鱼罐头数量达数万吨。然而，鲐鱼的经济价值未得到充分利用，如何高值利用鲐鱼成为亟待解决的问题，已引起高度关注。酶解法制备蛋白的研究一直是热点，其水解效率高，水解条件温和可控，在营养成分的保留上具有化学法无可比拟的优点，适于生产鱼类水解蛋白。以往发明均以水解度为指标，本发明以多肽含量为指标，采用酶法水解制备高含量的鲐鱼活性肽，并研究其生理活性，对于鲐鱼的高值化利用是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的是提供一种鲐鱼活性肽的制备方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种鲐鱼活性肽的制备方法，以鲐鱼作为原材料经绞碎，加入去离子水置于恒温水浴中经搅拌保温5~10min，再调节pH值；调节pH值后加入蛋白酶进行酶解反应5h~8h，反应完毕后，酶灭活，离心，收集上清液，冷冻干燥，即得鲐鱼活性肽；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1000U~2000U酶活力单位的蛋白酶。

取以经绞碎的鲐鱼鱼糜按照物料重量比为1:10~1:20的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度后，保温5~10min，再加NaOH或HCL调节pH值，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应4h~8h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10~15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用。

所述蛋白酶为风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或酸性蛋白酶（湖北康宝泰精细化工有限公司）。

取以经绞碎的鲐鱼肉鱼糜按照物料重量比为1:10~1:25的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度为30~50℃后，保温5~10min，再用NaOH或HCL调节pH值至6~8，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应4h~7h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10-15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1400U~1800U酶活力单位的蛋白酶。

取以经绞碎的鲐鱼内脏鱼糜按照物料重量比为1:10~1:25的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度为30~50℃后，保温5~10min，再用NaOH或HCL调节pH值至6~8，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应4h~7h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10~15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1400U~1800U酶活力单位的蛋白酶。

取以经绞碎的鲐鱼头尾的鱼糜按照物料重量比为1:10~1:20的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度为30~50℃后，保温5~10min，再用NaOH或HCL调节pH值至7~9，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应5~8h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10~15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1000~1400U酶活力单位的蛋白酶。

将上述所得鲐鱼活性肽采用双缩脲法进行检测，或凝胶树脂Superdex75柱纯化分离，采用含有浓度为0.15-0.5M NaCl的pH7.820mMTris-HCl缓冲液洗脱，流速为0.2-0.5mL min-1，收集洗脱液。

本发明具有以下优点：

1.以往发明均以水解度为指标制备活性肽，实际上水解度高的酶解液其多肽含量并不一定高。本发明以多肽含量为指标，采用酶法水解制备高含量的鲐鱼活性肽。

2.本发明采用Superdex75分离鲐鱼各组分酶解液，具有流速快、分辨率高的特点。

3.本发明制备所得鲐鱼活性肽具有清除羟自由基、清除超氧阴离子、还原能力、清除DPPH和抗脂质过氧化反应的活性，可作为潜在的抗氧化剂来应用到医疗行业。

4.本发明的制备方法反应条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、且设备简单安全。制得的多肽粉外观呈淡黄色粉末，易溶于水，氨基酸组成全面，含量丰富，是一种无色素、无添加剂的营养食品。

附图说明

图1为本发明实例提供的蛋白酶水解制备鲐鱼活性肽的技术路线图。

图2为本发明实例提供的采用水提法和蛋白酶水解法处理鲐鱼肉蛋白后分子量变化的差异图。其中标线采用的标准品为细胞色素C（12400Da），抑肽酶（6511.4Da），维生素B₁₂（1355.38Da）,谷胱甘肽（612.63Da），胞嘧啶核苷酸（242.2Da）。

图3为本发明实例提供的鲐鱼鱼肉、内脏、头尾三组分最优酶解液冻干品清除羟基自由基的能力图。

图4为本发明实例提供的鲐鱼鱼肉、内脏、头尾三组分最优酶解液冻干品抗脂质过氧化的能力图。

具体实施例

下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。

鲐鱼活性肽的制备：分别取鲐鱼鱼肉，内脏，鱼头鱼尾三组分为原材料，洗净、绞碎，加入一定体积去离子水，在适当的恒温水浴中不断搅拌达到蛋白酶的最适酶解温度后，保温5min左右，用1mol的NaOH或HCL分别调节pH至各蛋白酶的最适值。加入一定量的蛋白酶，水解一段时间，反应完毕后，酶灭活，离心，收集上清液，冷冻干燥，即得鲐鱼活性肽。

上述鲐鱼活性肽的制备方法，加入去离子水比例为1:10~1:20，所述蛋白酶分别为风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶。上述各蛋白酶均购于湖北康宝泰精细化工有限公司。

实施例1

称取鲐鱼鱼肉100g，将鲐鱼鱼肉用去离子水洗净，用高速搅碎机捣碎，所得鱼糜与水混合，按照质量比鱼糜：水=1:20的比例加入去离子水，即使底物质量分数为5%，在35℃的恒温水浴中不断搅拌，达到中性蛋白酶的最适酶解温度后，保温5min左右，用1mol的NaOH或HCL调节pH为7.0，并不断搅拌，以每克鱼糜加入1746.4U/g酶活力单位加入中性蛋白酶反应5.5h。酶解结束后，停止搅拌，并将温度迅速升温到95~100℃加热10min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温离心（7000r/min，20min），上清液-20℃保藏备用。

将上述所得鲐鱼活性肽采用双缩脲法进行检测。双缩脲试剂配制方法：溶解1.5g硫酸铜和6.0g酒石酸钾钠于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml。测定时，吸取1ml酶解液，加入4ml双缩脲试剂，摇匀，37℃水浴20min后用分光光度计于540nm波长处比色，以空白管调零点，牛血清蛋白为标准蛋白溶液。测得的鱼肉酶解液中蛋白多肽含量为109.8mg/g，可溶性肽含量占到了91.3%。

实施例2

称取两份鲐鱼鱼肉各10g，分别将鲐鱼鱼肉用去离子水洗净，用高速搅碎机捣碎，所得鱼糜与水混合，按照质量比鱼糜：水=1:20的比例加入去离子水，即底物质量分数为5%，在35℃的恒温水浴中不断搅拌，保温一段时间后，其中一份用1mol的NaOH或HCL调节pH为7.0，并不断搅拌，以每克鱼糜加入1746.4U/g酶活力单位加入中性蛋白酶反应5.5h。反应结束后，分别停止搅拌，并将温度迅速升温到95-100℃加热10min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温离心（7000r/min，20min），上清液冷冻干燥，备用。

将冻干品10mg上凝胶柱Superdex75(2.6×60cm)，分别以含有浓度为0.5M的NaCl的pH7.820mM Tris-HCl依次洗脱，流速0.5mLmin^-1，紫外检测器同步检测并收集各洗脱峰，与水提液相比较，鱼肉蛋白水解液的分子量大多数降到了3000Da以下。

实施例3

与上述实施例记载，在不同的酶解条件下，可以得到不同多肽含量的酶解液，上述内容同样适用于实施例1。

实施例4

清除羟基自由基能力

向试管中依次加入1.0mL不同质量浓度的上述实施例鲐鱼活性肽，0.5mL EDTA-Fe溶液（2mmol/L），1mL磷酸缓冲液（150mmol/L，pH7.4），1mL番花红（360μg/mL），最后加入1mL H₂O₂（3%），混匀，37℃水浴30min，于520nm比色。空白组用磷酸缓冲液来代替上述实施例鲐鱼活性肽，对照组用磷酸缓冲液代替上述实施例鲐鱼活性肽和过氧化氢，同时用VC作对照。每个浓度做平行，实验结果用清除率E（%）来表示：

测试结果，见附图3，其中鱼肉酶解液EC₅₀=0.2778mg/mL，内脏酶解液EC₅₀=0.5484mg/mL，头尾酶解液EC₅₀=0.7051mg/mL，均高于对照VC。

实施例5

抗脂质过氧化能力

取上述实施例中分别由鲐鱼鱼肉、内脏、头尾三组分酶解所得鲐鱼活性肽的冻干品各5mg，分别溶于10ml50mM磷酸缓冲液（pH7.4），加入0.13ml亚油酸，10ml99.5%乙醇，用水定容于25ml，40±1℃黑暗条件下培养24h后取反应液0.1ml，硫氰酸铁法反应，连续培养8d。空白用磷酸缓冲液代替酶解液。

测试结果，见附图4，与空白相比，鲐鱼鱼肉、内脏、头尾均有较强的抗脂质过氧化能力。

Claims

1.一种鲐鱼活性肽的制备方法，其特征在于：以鲐鱼作为原材料经绞碎，加入去离子水置于恒温水浴中经搅拌保温5~10min，再调节pH值；调节pH值后加入蛋白酶进行酶解反应5h~8h，反应完毕后，酶灭活，离心，收集上清液，冷冻干燥，即得鲐鱼活性肽；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1000U~2000U酶活力单位的蛋白酶。

2.按权利要求1所述的鲐鱼活性肽的制备方法，其特征在于：取以经绞碎的鲐鱼鱼糜按照物料重量比为1:10~1:20的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度后，保温5~10min，再加NaOH或HCl调节pH值，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应4h~8h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10~15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用。

3.按权利要求1或2所述的鲐鱼活性肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶为风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或酸性蛋白酶。

4.按权利要求1或2所述的鲐鱼活性肽的制备方法，其特征在于：取以经绞碎的鲐鱼肉鱼糜按照物料重量比为1:10~1:25的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度为30~50℃后，保温5~10min，再用NaOH或HCL调节pH值至6~8，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应4h~7h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10-15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1400U~1800U酶活力单位的蛋白酶。

5.按权利要求1或2所述的鲐鱼活性肽的制备方法，其特征在于：取以经绞碎的鲐鱼内脏鱼糜按照物料重量比为1:10~1:25的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度为30~50℃后，保温5~10min，再用NaOH或HCL调节pH值至6~8，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应4h~7h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10~15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1400U~1800U酶活力单位的蛋白酶。

6.按权利要求1或2所述的鲐鱼活性肽的制备方法，其特征在于：取以经绞碎的鲐鱼头尾的鱼糜按照物料重量比为1:10~1:20的比例加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌至酶解温度为30~50℃后，保温5~10min，再用NaOH或HCL调节pH值至7~9，调节pH值后在搅拌条件下加入蛋白酶进行酶解反应5~8h，反应完毕后，并将温度迅速升温到95℃~100℃加热10~15min钝化灭酶，再用酸或碱调节浆液pH至中性，4℃低温下以10000r/min，离心15~30min，收集上清液-20℃保藏备用；其中每克经绞碎的原材料鲐鱼中加入1000~1400U酶活力单位的蛋白酶。