CN103087131A - 可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 - Google Patents
可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103087131A CN103087131A CN2013100152353A CN201310015235A CN103087131A CN 103087131 A CN103087131 A CN 103087131A CN 2013100152353 A CN2013100152353 A CN 2013100152353A CN 201310015235 A CN201310015235 A CN 201310015235A CN 103087131 A CN103087131 A CN 103087131A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- synthesis
- reaction
- reversible terminal
- molar ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 158
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 157
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 title claims abstract description 128
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 144
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 279
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 154
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 130
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 68
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 57
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 31
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 31
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 20
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 16
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 15
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- WJFREWBMJPXLBS-UHFFFAOYSA-N n,n-dibutylbutan-1-amine;phosphono dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O.CCCCN(CCCC)CCCC WJFREWBMJPXLBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims description 13
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 10
- VMVNZNXAVJHNDJ-UHFFFAOYSA-N methyl 2,2,2-trifluoroacetate Chemical compound COC(=O)C(F)(F)F VMVNZNXAVJHNDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N tert-butyldimethylsilyl chloride Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)Cl BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- JKANAVGODYYCQF-UHFFFAOYSA-N prop-2-yn-1-amine Chemical compound NCC#C JKANAVGODYYCQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LDLCZOVUSADOIV-UHFFFAOYSA-N 2-bromoethanol Chemical compound OCCBr LDLCZOVUSADOIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 claims description 7
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 6
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 6
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 2,2'-dithiodiethanol Chemical compound OCCSSCCO KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DZUMFNGQHXQAFZ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-1-bromoethanol Chemical compound NCC(O)Br DZUMFNGQHXQAFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethanethiol;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCCS OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229940097265 cysteamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 3
- MQUNPMBEKMVOHA-UHFFFAOYSA-N (sodiodiselanyl)sodium Chemical compound [Na][Se][Se][Na] MQUNPMBEKMVOHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 13
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 8
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 60
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 33
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 33
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 31
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 22
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 17
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229910021595 Copper(I) iodide Inorganic materials 0.000 description 7
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 7
- 0 C1C2=C*CC12 Chemical compound C1C2=C*CC12 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- ISWPADPOGZPZMU-UHFFFAOYSA-N 2-(2,2-dihydroxyethyldiselanyl)ethane-1,1-diol Chemical compound OC(C[Se][Se]CC(O)O)O ISWPADPOGZPZMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 4
- LNVWRBNPXCUYJI-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethyl-1h-pyrazol-4-amine Chemical compound CC1=NNC(C)=C1N LNVWRBNPXCUYJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- LSXDOTMGLUJQCM-UHFFFAOYSA-M copper(i) iodide Chemical compound I[Cu] LSXDOTMGLUJQCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N zearalenone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N bis(2-methylpropyl)aluminum Chemical compound CC(C)C[Al]CC(C)C SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N palladium;triphenylphosphane Chemical compound [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N (3S,8S,10R,13S,14S,17S)-17-isoquinolin-7-yl-N,N,10,13-tetramethyl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine Chemical compound CN(C)[C@H]1CC[C@]2(C)C3CC[C@@]4(C)[C@@H](CC[C@@H]4c4ccc5ccncc5c4)[C@@H]3CC=C2C1 IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- GAUSMJHDHCSZOX-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n-prop-2-ynylacetamide Chemical compound FC(F)(F)C(=O)NCC#C GAUSMJHDHCSZOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 22 mg (85 μmol) of N Chemical compound 0.000 description 1
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-SPDVFEMOSA-N CC(C(N1)=O)=CN([C@@H](C2)O[C@H](CO)C2O)C1=O Chemical compound CC(C(N1)=O)=CN([C@@H](C2)O[C@H](CO)C2O)C1=O IQFYYKKMVGJFEH-SPDVFEMOSA-N 0.000 description 1
- FLSMDPAOEYMUHJ-UHFFFAOYSA-N CN(C)c(cc1)cc(O2)c1C(c(cc(cc1)C(NCCOC3OC(COC(NCC#CC(C(N4)=O)=CN(C(C5)OC(COP(O)(OP(O)(OC([O-])P(O)=O)=O)=O)C5O)C4=O)=O)CC3)=O)c1C(O)=O)=C(C=C1)C2=CC1=[N+](C)C Chemical compound CN(C)c(cc1)cc(O2)c1C(c(cc(cc1)C(NCCOC3OC(COC(NCC#CC(C(N4)=O)=CN(C(C5)OC(COP(O)(OP(O)(OC([O-])P(O)=O)=O)=O)C5O)C4=O)=O)CC3)=O)c1C(O)=O)=C(C=C1)C2=CC1=[N+](C)C FLSMDPAOEYMUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJLJMEJHUUYSSY-UHFFFAOYSA-L Copper hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Cu+2] JJLJMEJHUUYSSY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- XCHARIIIZLLEBL-UHFFFAOYSA-N Medicagenic acid 3-O-beta-D-glucoside Chemical compound C12CC(C)(C)CCC2(C(O)=O)CCC(C2(CCC3C4(C)C(O)=O)C)(C)C1=CCC2C3(C)CC(O)C4OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O XCHARIIIZLLEBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004523 catalytic cracking Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N copper;hydrate Chemical compound O.[Cu].[Cu] LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- XIMIGUBYDJDCKI-UHFFFAOYSA-N diselenium Chemical compound [Se]=[Se] XIMIGUBYDJDCKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N methanol-d1 Chemical compound [2H]OC OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 229940048102 triphosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- LDHWPRMNOXDSQG-UHFFFAOYSA-K trisodium 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O LDHWPRMNOXDSQG-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种可逆终端及其合成和在DNA合成测序中的用途。所述可逆终端的结构式如式(I)所示：
其中R1为荧光素，R2为连接单元。本发明的可裂解该可逆终端可用于DNA合成测序；同时，本发明的可逆终端的合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用，并且生物学评价结果表明该类可逆终端能完全满足高通量测序的生化反应要求，具备较好的实用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一类可逆终端及其合成和在DNA合成测序中的用途。
背景技术
DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制四种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。
在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸衍生物必须有一个可裂解的连接单元把核苷酸和荧光素连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使该连接单元断裂，以便下一个可逆终端可以顺利并入，从而依次读出DNA碱基序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率都有重要影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有光裂解、Pd催化裂解、氟化物可裂解等，但是这些连接单元目前仅限于基础研究，并不能实际应用(Accounts ofChemical Research 2010，43，551-563.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可逆终端及其合成和在DNA合成测序中的用途。该可逆终端具有还原敏感或酸敏感性。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种可逆终端，其结构式如式(I)所示：
其中R1为荧光素，R2为连接单元。该连接单元为两端均为活性官能团的可完全断裂的连接单元。
优选地，所述可逆终端的结构式如式(II)所示：
优选地，所述可逆终端是通过如下步骤合成的(如图2所示)：
A、化合物F2的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0∶(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F2 
B、化合物F3的合成：在CuI、Pd(PPh3)4(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，化合物F2和F1 反应，得化合物F3 
所述F1、F2、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；
C、化合物dUTP-NH2的合成：化合物F3与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dUTP-NH2 所述E-4、E-3和F3的摩尔比为2∶2∶1；
D、化合物dUTP-SPDP的合成：在TEA存在的条件下，化合物dUTP-NH2在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中，与以无水乙腈为溶剂的SPDP反应，得化合物dUTP-SPDP
所述的dUTP-NH2(即核苷酸U)和SPDP的摩尔比为1∶(1.5～3)；
E、化合物RDM-SH的合成：在DTT(二硫苏糖醇)存在的条件下，半胱胺在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中与化合物TAMRA(5/6)
避光反应，得化合物RDM-SH
所述TAMRA(5/6)、半胱胺和DTT的摩尔比为1∶(10～50)∶(40～70)；
F、化合物dUTP-T的合成：以Na3PO4-EDTA缓冲液(磷酸钠-乙二胺四乙酸缓冲液)和乙腈为溶剂，化合物dUTP-SPDP与RDM-SH反应，得化合物dUTP-T；所述RDM-SH、dUTP-SPDP的摩尔比为1∶(1～2)；所述化合物dUTP-T即具有式(II)所示结式的可裂解连接单元。
优选地，所述可逆终端(II)是通过如下步骤合成的(如图5所示)：
A、化合物F2的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0∶(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F2 
B、化合物F3的合成：在CuI、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，化合物F1 
和F2反应，得化合物F3 所述F1、F2、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；
C、化合物G1的合成：以甲醇为溶剂，化合物F3与浓氨水反应，得化合物
所述F3和氨水的摩尔比为1∶(50～100)；
D、化合物G2的合成：以甲醇和无水乙腈作溶剂，化合物G1与SPDP
反应，得化合物
所述G1和SPDP的摩尔比为1∶(1～2)；
E、化合物RDM-SH的合成：在DTT存在的条件下，半胱胺在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中与化合物TAMRA(5/6)
避光反应，得化合物RDM-SH
所述TAMRA(5/6)、半胱胺和DTT的摩尔比为1∶(10～50)∶(40～70)；
F、化合物G3的合成：以甲醇和乙腈作为溶剂，化合物RDM-SH在铝箔包裹氮气保护下与G2反应，得化合物G3 
所述RDM-SH和G2的摩尔比为1∶(1.2～2)；
G、化合物dUTP-T的合成：化合物G3与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dUTP-T；所述E-4、E-3和G3的摩尔比为2∶2∶1；所述化合物dUTP-T即具有式(II)所示结式的可裂解连接单元。
优选地，当所述可逆终端的结构式如式(III)所示：
优选地，所述可逆终端是通过如下步骤合成的(如图7所示)：
A、化合物N-1的合成：以甲醇为溶剂，在TEA存在的条件下，半胱胺盐酸盐在冰浴搅拌条件下与2-羟乙基二硫化物
反应，得化合物N-1
所述半胱胺盐酸盐、2-羟乙基二硫化物和TEA的摩尔比为1∶(1～2)∶(2～3)；
B、化合物N-2的合成：以无水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物N-1与TAMRA(5/6)
避光反应，得化合物N-2所述TAMRA(5/6)、N-1和TEA的摩尔比为1∶(1～4)∶(10～15)；
C、化合物N-3的合成：以无水乙腈为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物N-2在氮气保护条件下与DSC(N，N-琥珀酰亚胺基碳酸酯)反应，得化合物N-3
所述N-2、DSC和TEA的摩尔比为1∶(4～6)∶(5～15)；
D、化合物N-4的合成：以NaHCO3/Na2CO3(pH为8.73)的缓冲溶液为溶剂，化合物dUTP-NH2 
与N-3反应，得化合物N-4；所述N-3和dUTP-NH2的摩尔比为1∶(1～2)；所述化合物N-4即具有式(III)所示结式的可逆终端。
优选地，所述可逆终端的结构式如式(IV)所示：
优选地，所述可逆终端是通过如下步骤合成的(如图9所示)：
A、化合物T-1的合成：在盐酸存在的条件下，L-谷氨酸在冰浴搅拌条件下与亚硝酸钠反应，得化合物
所述L-谷氨酸、盐酸和亚硝酸钠的摩尔比为1∶(1.5～2)∶(1.5～2)；
B、化合物T-2的合成：以无水四氢呋喃做溶剂，化合物T-1在氮气保护及冰水浴下与溶于二甲硫醚的硼烷反应，得化合物T-2
所述T-1和硼烷的摩尔比为1∶(1.5～5)；
C、化合物T-3的合成：以二氯甲烷做溶剂，在咪唑存在的条件下，化合物T-2在氮气保护下和TBSCl(二甲基叔丁基氯硅烷)反应，得化合物T-3
所述T-2和TBSCl的摩尔比为1∶(1.5～2.5)；
D、化合物T-4的合成：以二氯甲烷做溶剂，化合物T-3在氮气保护及冰盐浴下和DIBAL-H(二异丁基氢化铝)反应，得化合物T-4
所述T-3和DIBAL-H的摩尔比为1∶(1.5～2.5)；
E、化合物T-6的合成：在A-15(A-15型强酸性阳离子交换树脂)催化剂存在的条件下，化合物T-4与溴乙醇胺反应，得化合物T-6
所述T-4和溴乙醇胺的摩尔比为1∶(1.5～3)；
F、化合物T-7的合成：在四丁基氟化胺(TBAF)存在的条件下，化合物T-6在室温下脱羟基保护，得化合物T-7
所述T-6和TBAF的摩尔比为1∶(1.5～2)；
G、化合物T-8的合成：化合物T-7与过量的氨水反应，得化合物T-8
所述T-7和氨水的摩尔比为1∶(50～100)；
H、化合物T-9的合成：以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物T-8与TAMRA(5/6)
反应，得化合物T-9
所述TAMRA(5/6)、T-8和TEA的摩尔比为1∶(3～6)∶(5～20)；
I、化合物T-10的合成：化合物T-9在DSC存在的条件下得化合物T-10所述T-9和DSC的摩尔比为1∶(5～8)；
J、化合物T-11的合成：化合物T-10与dUTP-NH2(核苷酸U)
反应，得化合物T-11；所述T-10和dUTP-NH2的摩尔比为1∶(1.5～3)；所述化合物T-11即结构式(IV)所示的可逆终端。
优选地，所述可逆终端的结构式如式(V)所示：
优选地，所述可逆终端是通过如下步骤合成的(如图7所示)：
A、Na2Se2碱性水溶液的制备：冰浴冷却下，将NaBH4固体加水溶解形成NaBH4溶液；将NaOH固体溶于水后加入硒粉和十六烷基三甲基溴化铵，在N2保护下，再加入所述NaBH4溶液，室温反应0.5～1.5h后在85～95℃下反应0.5～1h，得Na2Se2碱性水溶液；所述NaBH4、硒粉和NaOH的摩尔比为1∶(7～8)∶(8～9)；
B、化合物D-1的合成：以THF为溶剂，氮气保护下溴乙醇与Na2Se2碱性水溶液油浴45～55℃搅拌反应，得化合物D-1所述的溴乙醇和Na2Se2的摩尔比为1∶(1～2)；
C、化合物D-2的合成：以二甲苯为溶剂，化合物D-1与HBr反应，得化合物D-2
所述D-1和HBr的摩尔比为1∶(4～6)；
D、化合物D-3的合成：化合物D-2与浓氨水反应，得化合物D-3所述D-2和氨水的摩尔比为1∶(50～100)；
E、化合物D-4的合成：以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物D-3与TAMRA(5/6)
避光反应，得化合物D-4
所述TAMRA(5/6)、D-3和TEA的摩尔比为1∶(1～4)∶(10～15)；
F、化合物D-5的合成：以无水乙腈为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物D-4在氮气保护下与DSC反应，得化合物D-5
所述D-4、DSC和TEA的摩尔比为1∶(4～6)∶(5～15)；
G、化合物D-6的合成：以NaHCO3/Na2CO3(pH为8.73)的缓冲溶液为溶剂，化合物dUTP-NH2 
和D-5反应，得化合物D-6；所述D-5和dUTP-NH2的摩尔比为1∶(1～2)；所述化合物D-6即结构式(V)所示的可逆终端。
本发明还涉及一种前述的可裂解连接单元在DNA合成测序中的用途。
本发明具有如下有益效果：本发明合成了一类新的可逆终端；该类可逆终端可用于DNA合成测序；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的可逆终端的总合成过程示意图，其中R1为荧光素，R2为连接单元(linker)；
图2为实施例1的可逆终端的合成过程示意图；
图3为实施例1中化合物dUTP-NH2的合成过程示意图；
图4为实施例1中TAMRA(5/6)硫醇化的过程示意图；
图5为实施例2的可逆终端的合成过程示意图；
图6为实施例2中化合物dUTP-T的合成过程示意图；
图7为实施例3的可逆终端的合成过程示意图；
图8为实施例5的可逆终端的合成过程示意图；
图9为实施例4的可逆终端的合成过程示意图；
图10为实施例6中6.1的测试结果，其中(a)为DNA链延伸反应PAGE电泳图，(b)为断裂反应荧光扫描结果示意图，其中，M为DNA marker，1为对照模板，2为DNA链延伸反应阳性对照，3为含可逆终端的链延伸产物pH 2.0的断裂，4为含可逆终端的链延伸产物pH2.2的断裂；
图11为实施例6中6.2的测试结果，其中(a)为DNA链延伸反应PAGE电泳图，(b)为断裂反应荧光扫描结果示意图，其中，M为DNA marker，1为对照模板，2为DNA链延伸反应阳性对照，3为含可逆终端的链延伸产物pH1.7的断裂，4为含可逆终端的链延伸产物pH1.5的断裂；
图12为实施例6中6.3的测试结果，其中(a)为DNA链延伸反应PAGE电泳图，(b)为断裂反应荧光扫描结果示意图，其中，M为DNA marker，1为对照模板，2为DNA链延伸反应阳性对照，3为含可逆终端的链延伸产物pH1.9的断裂，4为含可逆终端的链延伸产物pH1.5的断裂；
图13为实施例6中6.4的测试结果，其中(a)为DNA链延伸反应PAGE电泳图，(b)为断裂反应荧光扫描结果示意图，其中，M为DNA marker，1为对照模板，2为DNA链延伸反应阳性对照，3为含可逆终端的链延伸产物10uM DTT室温作用2h的断裂，4为含可逆终端的链延伸产物8mM DTT室温作用2h的断裂，5-9分别为含可逆终端的链延伸产物10mM DTT室温作用10min、20min、30min、1h和2h的断裂；
图14为实施例6中6.5的含有二硫键可逆终端的DNA链延伸产物在10mM DTT不同作用时间下的断裂测试结果，其中(a)为DNA链延伸反应PAGE电泳图，(b)为断裂反应荧光扫描结果示意图，其中，M为DNA marker，1为对照模板，2为DNA链延伸反应阳性对照，3-7分别为含有二硫键可逆终端链延伸产物10mM DTT分别处理3min、5min、8min、10min和15min的断裂；
图15为实施例6中6.5的含有二硫键可逆终端的DNA链延伸产物分别在20、30mMDTT不同作用时间下的断裂测试结果，其中，M为DNA marker，4为对照模板，6为DNA链延伸反应阳性对照，1-3分别为含有二硫键可逆终端链延伸产物20mM DTT分别处理8min、5min和3min的断裂，7-8分别为含有二硫键可逆终端链延伸产物30mM DTT分别处理3min和5min的断裂。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征；本发明的可逆终端的总合成过程示意图如图1所示；是采用四种不同的荧光素分别标记含四种不同核苷酸(A，G，C，U)的可逆终端。
实施例1
本实施例的可逆终端的结构式如下式(II)所示：
其对应的合成路线如图2所示；具体包括如下步骤：
1.1 化合物F2的合成
三氟乙酸甲酯与丙炔胺在有机溶剂中反应得到化合物F2，具体为：向一单口瓶中加入60ml甲醇，冰水浴下搅拌，加入丙炔胺(60mmol，3.3042g)，搅拌15分钟后缓慢加入三氟乙酸甲酯(86.7mmol，11.0957g)，10分钟后撤去冰水浴，室温下反应24小时。反应用TLC板进行监测，PE∶EA＝8∶1，烤板，Rf＝0.5产生新点为产物F2。减压蒸馏(51℃，280Pa)，得3.53g，产率39％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ2.32(t，J＝4.0Hz，1H)，4.13-4.15(m，2H)，6.92(s，1H)。
在上述合成中，加入的三氟乙酸甲酯可以为72～120mmol中的任一值。
1.2 化合物F3的合成
向单口瓶中加入F1(0.7mmol，247mg)，再称取9.7mgCuI和20.3mg Pd(PPh3)4加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入2.3ml DMF，搅拌溶解，加入0.2mlTEA，称取F2(254mg，1.7mmol)用DMF溶解后加入上述反应瓶中，室温搅拌，反应过夜。TLC板监测，EA为展开剂，Rf＝0.35为原料F1，Rf＝0.32为产物F3，两点位置非常接近。待反应结束后，减压蒸干溶剂，直接柱层析分离，20∶1 DCM∶MeOH为淋洗剂，得214mg，产率61％。
1H NMR(DMSO-D6，300MHz)：δ2.11(t，J＝5.1Hz，2H)，3.56-3.58(m，2H)，3.78(m，1H)，4.21(d，J＝5.1Hz，3H)，5.08(t，J＝5.1Hz，1H)，5.23(d，J＝4.2Hz，1H)，6.09(t，J＝6.6Hz，1H)，8.18(s，1H)，10.05(t，J＝4.8Hz，1H)，11.63(s，1H).
在上述合成中，加入的F2可以为1.4～2.1mmol中的任一值，TEA可以为1.05～1.4mmol中的任值。
1.3 化合物dUTP-NH2的合成
化合物dUTP-NH2的合成具体如图3所示，图3中各步骤对应的反应条件为：i)DMF，tributylamine ii)DMF，F3 iii)I2，Py，H2O iV)NH3。
在手套箱中分别称取化合物F3 60mg(0.16mmol)、三正丁胺焦磷酸盐150mg(0.32mmol)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮66mg(0.32mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.5mL无水DMF中，再加入0.6mL新蒸的三正丁胺，搅拌半小时。把2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.5mL无水DMF中，激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液，搅拌半小时。然后将该混合液注入到F3中，搅拌1.5h。加入5mL 3％碘(9∶1 Py/H2O)溶液。15min后加入4mL水，搅拌2h。加入0.5mL 3M NaCl溶液，再加入30mL无水乙醇，-20℃冷冻过夜，离心(3200r/min，25℃)20min。倾去上清液，得沉淀，抽干溶剂。再依次加入TEAB溶液和浓氨水，室温搅拌过夜。减压蒸干溶剂，出现白色固体，得dUTP-NH2。用分析型HPLC进行分析，条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAAc和CH3CH2OH，梯度洗涤，0％-20％CH3CH2OH(35min)；紫外检测器：254nm。在t＝13.5min时有产物峰生成。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ2.34-2.48(m，2H)，4.03(s，2H)，4.20-4.29(m，3H)，4.61-4.64(m，1H)，6.27(t，J＝6.4Hz，1H)，8.38(s，1H)。
31P NMR(D2O，161MHz)：δ-22.22，-11.45，-9.90。
HRMS：calc for C12H19N3O14P3 [M+H]+ 522.0080，found 522.0070；calc forC12H18N3O14P3 Na[M+Na]+ 543.9899，found 543.9883。
1.4 化合物dUTP-SPDP的合成
在10mL的单口瓶中加入dUTP(AP3)(即dUTP-NH2)24.4mg(0.026mmol)，再加入600μl Na2CO3/NaHCO3缓冲液，室温搅拌，把SPDP12.3mg(0.039mmol)溶于400μl无水CH3CN，加入上述溶液，加入3μl Et3N。室温搅拌反应，分析型HPLC跟踪至原料消失。条件：柱子：C18，10μm，4.6×250m；流速：1mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，100％TEAA(5min)，梯度洗涤0％～10％ CH3CN(5min)，10％～50％CH3CN(50min)；紫外检测器：293nm；在27.55min时候有产物峰生成。8小时后，停止反应，制备型HPLC分离纯化产物，得5mg。条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，100％TEAA(5min)，梯度洗涤0％～5％ CH3CN(5min)，5％-30％CH3CN(50min)；紫外检测器：293nm。
1H NMR(MeOH，400MHz)：δ1.61(q，J＝7.6Hz，J＝15.2Hz，1H)，2.89-2.34(m，3H)，2.64(dd，J＝2.8Hz，J＝9.6Hz，2H)，4.05(s，2H)，4.13(s，3H)，4.53(d，J＝0.8Hz，1H)，6.18(t，J＝6.4Hz，1H)，7.23(s，1H)，7.79(d，J＝6.8Hz，2H)，8.07(d，J＝4.0Hz，1H)，8.32-8.37(m，1H).
在上述合成中，加入的SPDP可以为0.039～0.078mmol中的任一值。
1.5 荧光素(罗丹明TAMRA(5/6))硫醇化
荧光素(罗丹明TAMRA(5/6))硫醇化得化合物RDM-SH如图4所示，具体如下：
取半胱胺(73.5mg，0.95mmol)于10mL单口瓶，加入400μl Na2CO3/NaHCO3缓冲液搅拌溶解，铝箔包裹；取TAMRA(5/6)(10mg，0.019mmol)，用0.95mL无水DMF溶解后加入上述反应瓶中，避光室温搅拌1h后，加入1.33mL 1M DTT，室温搅拌2.5h。TLC板监测：DCM∶MeOH＝5∶1，Rf＝0.7处有产物点生成。分离采用制备型HPLC提纯，得8.8mg，产率94.6％。条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：0.1％TFA和CH3CN，100％TFA(5min)，梯度洗涤0％-8％ CH3CN(5min)，8％-50％CH3CN(50min)；紫外检测器：293nm和546nm，收集41min出产物峰。
1H NMR(MeOH，400MHz)：δ1.26-1.31(m，12H)，2.70(t，J＝7.2Hz，2H)，3.53(t，J＝6.8Hz，2H)，6.97(d，J＝2.4Hz，2H)，7.04(dd，J＝2.4Hz，J＝9.6Hz，2H)，7.13(d，J＝9.2Hz，2H)，7.81(d，J＝1.2Hz，1H)，8.19(dd，J＝1.6Hz，J＝8.4Hz，1H)，8.39(d，J＝8.4Hz，1H).
在上述合成中，加入的半胱胺可以为0.19～0.95mmol中的任一值，DTT可以为0.76～1.33mmol中的任一值。
1.6 化合物dUTP-T的合成
取5mg RDM-SH(5mg，0.01mmol)于10ml单口瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹；取dUTP(AP3)-SPDP(22mg，0.02mmol)于10mL单口瓶，加入2ml Na3PO4-EDTA缓冲液和乙腈0.5ml，搅拌溶解后注入RDM-SH反应瓶中；室温搅拌，分析型HPLC检测反应。条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，5％ CH3CN(5min)，梯度洗涤5％-35％ CH3CN(60min)；紫外检测器：293nm和546nm；在49.74min时有产物峰生成。10h后停止反应，制备型HPLC分离纯化。得2.76mg.条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，5％ TEAA(5min)，梯度洗涤5％-25％ CH3CN(45min)；80％ CH3CN(10min)，紫外检测器：293nm和546nm。收集51min处产物峰。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ1.31(s，12H)，2.15-2.26(m，1H)，2.27-2.41(m，1H)，2.61-2.66(m，2H)，3.73-3.80(m，2H)，3.89(s，2H)，4.14-4.18(m，3H)，6.05-6.09(m，1H)，6.71-6.74(m，2H)，6.88-6.95(m，2H)，7.23(dd，J＝9.6Hz，J＝13.6Hz，2H)，7.85(s，1H)，7.91(s，1H)，8.01(d，J＝6.8Hz，1H)，8.09-8.12(m，1H).ESI-HRMS：calc for C42H47N6O19P3S2[M+Na+2H]3+ 1121.1604，found 1121.1655。
在上述合成中，加入的dUTP-SPDP可以为0.01～0.02mmol中任意值。
实施例2
本实施例的可逆终端的结构式如下式(II)所示：
其对应的合成路线如图5所示；具体包括如下步骤：
2.1化合物F2、F3的合成同实施例1
2.2化合物G1的合成
取23mg F3(0.06mmol)于10mL的单口瓶，加入1mL甲醇溶解，加入0.1mL浓氨水(6mmol)，室温搅拌过夜。TLC板监测：DCM∶MeOH＝3∶1，产物G1 Rf＝0.15。分离采用TLC板层析，MeOH∶EA∶NH3＝6∶6∶1，收集Rf＝0.6紫外显色区域。ESI-HRMS：cals for C12H15N3O5[M]281.1012，found 281.1015.
在上述合成中，加入的氨水可以为3～6mmol中任意值。
2.3化合物G2的合成
取8.5mg G1(0.03mmol)，用0.5mL甲醇溶解；取9.4mg SPDP(0.03mmol)，用0.5mL无水乙腈溶解后加入上述G1的甲醇溶液，室温搅拌10h。TLC板监测：MeOH∶EA＝1∶6，产物Rf＝0.55。停止反应，旋出溶剂，板层析得9.5mg产物。ESI-HRMS：cals for C20H22N4O6S2[M]478.0981，found 478.0974.
在上述合成中，加入的SPDP可以为0.03～0.06mmol中任意值。
2.4 化合物G3的合成
取6.8mg RDM-SH(0.013mmol，其合成同实施例1)于10mL单口瓶，抽真空氮气保护，铝箔包裹；另取9mg G2(0.019mmol)于10ml单口瓶中，用0.5ml CH3CN，没有完全溶解，再加1ml甲醇，溶解完全，将之注入到上述反应瓶中，室温搅拌9h。分析型HPLC检测反应，条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：H2O和CH3OH，梯度洗涤0％-10％ CH3OH(5min)，10％-70％ CH3OH(55min)；紫外检测器：293nm和546nm；在49min时有产物峰生成。制备HPLC分离得5mg产物。
1H NMR(MeOD，400MHz)：δ1.33(s，12H)，2.11-2.42(m，3H)，2.25-2.33(m，1H)，2.61(t，J＝6.4Hz，2H)，3.68(s，3H)，3.71-3.76(m，3H)，3.92(d，J＝3.2Hz，1H)，4.01(d，J＝2.4Hz，2H)，4.36-4.40(m，1H)，6.17-6.23(m，1H)，6.93(d，J＝2.4Hz，2H)，7.00-7.09(m，2H)，7.29(dd，J＝6.4Hz，J＝9.6Hz，2H)，7.84(d，J＝1.6Hz，1H)，8.13(dd，J＝1.6Hz，J＝8.0Hz，1H)，8.18(d，J＝8.0Hz，1H)，8.21(s，1H)。
在上述合成中，加入的G2可以为0.016～0.026mmol中任意值。
2.5 化合物dUTP-T的合成
化合物dUTP-T的合成具体如图6所示，图6中各步骤对应的反应条件为：i)DMF，tributylamine ii)DMF，G3 iii)I2，Py，H2O iV)NH3。
在手套箱中分别称取化合物G3 6mg(0.007mmol)、三正丁胺焦磷酸盐7.7mg(0.014mmol)、2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮2.8mg(0.014mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.15mL无水DMF中，再加入0.15mL新蒸的三正丁胺，搅拌半小时。把2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.15mL无水DMF中，激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液，搅拌半小时。然后将该混合液注入到G3中，搅拌1.5h。加入1mL 3％碘(9∶1Py/H2O)溶液。15min后加入1mL水，搅拌2h。加入0.5mL 3M NaCl溶液，再加入9mL无水乙醇，-20℃冷冻过夜，离心(3200r/min，25℃)20min。倾去上清液，得沉淀，抽干溶剂，得dUTP-T。用分析型HPLC进行分析，条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，5％ CH3CN(5min)，梯度洗涤5％-35％ CH3CN(60min)；紫外检测器：293nm和546nm；在49.7min时有产物峰生成。10h后停止反应，制备型HPLC分离纯化。条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，5％TEAA(5min)，梯度洗涤5％-25％ CH3CN(45min)；80％ CH3CN(10min)，紫外检测器：293nm和546nm。收集51min处产物峰。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ1.31(s，12H)，2.15-2.26(m，1H)，2.27-2.41(m，1H)，2.61-2.66(m，2H)，3.73-3.80(m，2H)，3.89(s，2H)，4.14-4.18(m，3H)，6.05-6.09(m，1H)，6.71-6.74(m，2H)，6.88-6.95(m，2H)，7.23(dd，J＝9.6Hz，J＝13.6Hz，2H)，7.85(s，1H)，7.91(s，1H)，8.01(d，J＝6.8Hz，1H)，8.09-8.12(m，1H).ESI-HRMS：calc for C42H47N6O19P3S2[M+Na+2H]3+ 1121.1604，found 1121.1655。
由实施例1、2可知，实施例1、2对应着同一种可逆终端，均是选用一种荧光素分别标记含一种核苷酸(U)的可逆终端；具体地，从化学结构及合成方法方面，首先用荧光素TAMRA标记dUTP可逆终端，用两种不同的合成路线合成了该可逆终端。其中，实施例1的合成方法在第二步反应就引入三磷酸，所以从这步起就必须使用反向制备HPLC分离纯化产物，造成合成过程繁琐、效率低；而实施例2的合成方法先接上荧光素，在最后步反应才接上三磷酸，所以只有在最后一步的反应产物才必须使用HPLC分离纯化。
实施例3
本实施例的可逆终端的结构式如式(III)所示：
其对应的合成路线如图7所示，具体步骤如下：
3.1化合物N-1的合成
取一100ml单口瓶，加入半胱胺盐酸盐0.75g(6.6mmol)，用4ml甲醇溶解，冰水浴搅拌下，滴加2-羟乙基二硫化物2.04g(6.6mmol，50％水溶液，溶于3ml甲醇中)和1.85mlTEA(13.2mmol)的混合液，30min后撤去冰水浴，室温搅拌。TLC跟踪反应进程，24h后停止反应，旋出溶剂，板层析，MeOH∶EA＝1∶1，得44mg产物，为黄色油状液体。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ2.92(t，J＝6.0Hz，2H)，3.00(t，J＝6.4Hz，2H)，3.40(t，J＝6.4Hz，2H)，3.87(t，J＝6.0Hz，2H)。
在上述合成中，加入的2-羟乙基二硫化物可以为6.6～13.2mmol中任意值，TEA可以为13.2～19.8mmol中任意值。
3.2 化合物N-2的合成
在10mL的单口瓶中加入2mL无水DMF，再加入22mg(84μmol)化合物N-1，避光，室温下搅拌，将20mg(38μmol)TAMRA(5/6))溶于4mL无水DMF，注入，再加入80μL(570μmol)三乙胺。室温下搅拌反应，TLC跟踪至原料消失。待反应结束后，减压下除去DMF，以3∶1 DCM/MeOH为展开剂，TLC板分离纯化得产物20mg。ESI-HRMS：cals forC29H31N3O5S2[M]565.1705，found 565.1717.
在上述合成中，加入的N-1可以为38～152μmol中任意值，三乙胺可以为380～570μmol中任意值。
3.3 化合物N-3的合成
在反应瓶中加入化合物N-2 9.6mg(0.017mmol)，氮气保护下注入0.5mL无水乙腈及20μL三乙胺，室温下搅拌。氮气保护下在另一反应瓶中加入N，N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)27mg(0.105mmol)，再将上述混合液合并，室温下搅拌反应。TLC跟踪反应至原料消失。原料消失后，停止反应，不经处理直接用于下步反应。ESI-HRMS：calsfor C34H34N4O9S2[M]706.1767，found 706.1761.
在上述合成中，加入的DSC可以为0.068～0.105mmol中任意值，三乙胺可以为0.085～0.255mmol中任意值。
3.4化合物N-4的合成
化合物dUTP-NH2的合成同实施例1。
将化合物dUTP-NH2(25.9mg，0.028mmol)溶于0.5mL NaHCO3/Na2CO3(pH为8.73)的缓冲溶液中，再将N-3的反应液(起始原料化合物N-3 9.6mg(0.014mmol))加入到上述缓冲溶液中，室温下搅拌反应。分析型HPLC检测反应k。条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，5％ CH3CN(5min)，梯度洗涤5％-35％ CH3CN(60min)；紫外检测器：293nm和546nm；在49.1min时有产物峰生成。条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：100mMTEAA和CH3CN，5％ TEAA(5min)，梯度洗涤5％-25％ CH3CN(45min)；80％ CH3CN(10min)，紫外检测器：293nm和546nm。收集53min处产物峰。ESI-HRMS：cals for C42H43N6O20P3S2 4-[M+2H]1110.1186，found 1110.1180.
在上述合成中，加入的dUTP-NH2可以为0.014～0.028mmol中任意值。
在本实施例中，首先合成连接单元N-2，然后N-2直接与购买的荧光素活性酯反应，避免了使用价格较高且容易发生副反应的SPDP，再接着与DSC以及新合成的dUTP-NH2反应，即可得到预期产物；这种方法得到的反应产物在结构上与实施例1、2得到的产物在结构上是不一样的，经生物学评价这两种含二硫键的不同结构的可逆终端在DNA测序的评价中都能很好地应用于DNA测序。
实施例4
本实施例的可逆终端的结构式如下式(V)所示：
其合成路线如图9所示，具体步骤如下：
4.1 Na2Se2碱性水溶液的合成
2g(50mmol)NaOH固体溶于25ml水中，后加入3.95g(50mmol)硒粉和100mg十六烷基三甲基溴化铵。另称取0.25g(6.6mmol)NaBH4和0.2gNaOH固体，冰浴冷却下加入5ml水溶解，在N2保护下，将此溶液在搅拌下滴加到上述硒溶液中，室温反应1h，后在90℃下反应半小时使反应趋向完全，得到具有特征棕红色的Na2Se2碱性水溶液，此溶液不需处理即可用于下一步二硒化物的合成。
在上述合成中，加入的硒粉可以为46.2～52.8mmol中任意值，NaOH可以为52.8～59.4mmol中任意值。
4.2 二羟基乙基二硒化物(化合物D-1)的合成
取一10ml烧瓶，加入0.25g溴乙醇(2.0mmol)、2mlTHF，抽真空，氮气保护下，加入新制备的Na2Se2碱性水溶液2.4ml(2.0mmol)，油浴50℃搅拌。TLC跟踪反应进程，搅拌过夜。待反应结束后，旋出溶剂，柱层析，PE∶EA＝1∶1，得104mg纯品。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.34(s，2H)，3.10(t，J＝6.0Hz，4H)，3.92(t，J＝6.0Hz，4H)。
在上述合成中，加入的Na2Se2可以为2.0～4.0mmol中任意值。
4.3 化合物D-2、D-3的合成
以二甲苯作溶剂，化合物100mg D-1(0.40mmol)与过量的HBr(162mg，2.0mmol)在室温下搅拌6h，然后加入过量浓氨水(2.3ml，30mmol)，室温搅拌，硅胶板分离纯化，得黄色液体。
在上述合成中，加入的HBr可以为1.6～2.4mmol中任意值，氨水可以为20～40mmol中任意值。
4.4 化合物D-4的合成
在10mL的单口瓶中加入2mL无水DMF，再加入26mg化合物D-3(104μmol)，避光，室温下搅拌，将20mg(38μmol)TAMRA(5/6))溶于4mL无水DMF，注入，再加入80μL(570μmol)三乙胺。室温下搅拌反应，TLC跟踪至原料消失。待反应结束后，减压下除去DMF，以3∶1 DCM/MeOH为展开剂，TLC板分离纯化得产物21mg。ESI-HRMS：cals forC29H31N3O5Se2 [M+H]662.0594，found 662.0582.
在上述合成中，加入的D-3可以为38～152μmol中任意值，三乙胺可以为380～570μmol中任意值。
4.5 化合物D-5的合成
在反应瓶中加入化合物D-4 11mg(17μmol)，氮气保护下注入0.5mL无水乙腈及20μL三乙胺(143μmol)，室温下搅拌。氮气保护下在另一反应瓶中加入N，N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)22mg(85μmol)，再将上述混合液合并，室温下搅拌反应。TLC跟踪反应至原料消失。原料消失后，停止反应，反应产物直接用于下一步反应。
在上述合成中，加入的DSC可以为68～102μmol中任意值，三乙胺可以为85～255μmol中任意值。
4.6 化合物D-6的合成
将化合物19mg dUTP-NH2(20μmol)溶于0.5mL NaHCO3/Na2CO3(pH为8.73)的缓冲溶液中，再将上述合成的全部D-5的反应液(起始原料化合物D-4 11mg(17μmol))加入到上述缓冲溶液中，室温下搅拌反应。分析型HPLC检测反应。条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，5％ CH3CN(5min)，梯度洗涤5％-35％ CH3CN(60min)；紫外检测器：293nm和546nm；在49.1min时有产物峰生成。条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：100mMTEAA和CH3CN，5％ TEAA(5min)，梯度洗涤5％-25％ CH3CN(45min)；80％ CH3CN(10min)，紫外检测器：293nm和546nm。收集产物峰。ESI-HRMS：cals for C42H43N6O20P3Se2 4-[M+H]1202.95，found 1202.87.
在上述合成中，加入的dUTP-NH2可以为17～34μmol中任意值。
实施例5
本实施例的可逆终端的结构式如下式(IV)所示：
其合成路线如图8所示，具体步骤如下：
5.1 化合物T-1的合成
以L-谷氨酸为原料，加入盐酸，在冰浴搅拌下滴加亚硝酸钠溶液，滴加完毕后，继续在冰浴下反应3～5h，然后移至室温下过夜；反应结束后，减压蒸去水，加入乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂得T-1，所述步骤具体为：
在500mL单口瓶中加入10.00g(68mmol)L-谷氨酸，再加入盐酸溶液(14mL浓盐酸溶于28mL水)将固体溶解。反应液于冰水浴下搅拌30min，然后保持温度滴加亚硝酸钠水溶液(7.00g，100mmol，溶于30mL水)，滴加过程中有红棕色的气体产生。滴加完毕后，继续在冰水浴下搅拌3h，然后升至室温搅拌过夜。减压蒸去水，出现白色固体和淡黄色油状液体，加入150mL乙酸乙酯溶解，滤去不溶的白色固体，滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得9.52g淡黄色油状液体，不经纯化直接用于下一步反应。
在上述合成中，加入的盐酸可以为102～136mmol中任意值，亚硝酸钠可以为102～136mmol中任意值。
5.2 化合物T-2的合成
取T-1，以无水四氢呋喃做溶剂，氮气保护，在冰水浴下缓慢滴加硼烷/二甲硫醚溶液，滴加完毕后，继续在室温下反应4～5h；反应结束后，加入甲醇淬灭反应，旋去溶剂，再加入甲醇，旋干得T-2，所述步骤具体为：
取9.52g(68mmol)化合物T1-1(粗品)置于500mL两口瓶中，氮气保护下注入150mL无水四氢呋喃，室温下搅拌使T1-1完全溶解。在冰水浴下，4h内缓慢向反应体系中滴加9mL 10M硼烷/二甲硫醚溶液。滴加完毕后，继续在室温下搅拌4h，然后加入100mL甲醇淬灭反应。减压蒸去溶剂，再加入100mL甲醇，旋去溶剂得8.30g黄色油状液体。取少量，硅胶柱层析分离，20∶1 DCM/MeOH为淋洗剂，得纯品用于1H NMR分析。其余的不经纯化直接用于下一步反应。
1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ4.58-4.66(m，1H)，3.89(dd，J1＝3.0，J2＝12.6Hz，1H)，3.63(dd，J1＝4.5，J2＝12.6Hz，1H)，2.46-2.68(m，2H)，2.11-2.29(m，2H)。
在上述合成中，加入的硼烷可以为102～340mmol中任意值。
5.3 化合物T-3的合成
取T-2，以二氯甲烷做溶剂，加入咪唑，氮气保护下和TBSCl在室温下反应17～20h；反应结束后，加入二氯甲烷稀释，分别用2mol/L盐酸、水和饱和碳酸氢钠洗涤反应液，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析得T-3纯品，所述步骤具体为：
取化合物T-2粗品8.30g(68mmol)置于250mL两口瓶中，加入5.90g(86mmol)咪唑。氮气保护下注入100mL二氯甲烷。将二甲基叔丁基氯硅烷(TBSCl)16.51g(110mmol)溶于50mL二氯甲烷中，注射到上述体系中，室温下搅拌反应17h。反应完毕后加入二氯甲烷稀释，依次用2M HCl、水和饱和NaHCO3溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得12.49g黄色油状液体。硅胶柱层析分离，15∶1石油醚/乙酸乙酯淋洗，得淡黄色化合物T-3 4.32g。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ4.54-4.59(m，1H)，3.84(dd，J1＝3.2，J2＝11.2Hz，1H)，3.67(dd，J1＝3.2，J2＝11.2Hz，1H)，2.40-2.61(m，2H)，2.14-2.26(m，2H)，0.87(s，9H)，0.05(d，J＝4.0Hz，6H)。
在上述合成中，加入的TBSCl可以为102～170mmol中任意值。
5.4 化合物T-4的合成
以二氯甲烷做溶剂，T-3在氮气保护及冰盐浴下和DIBAL-H反应，TLC跟踪至反应完全.反应结束后，加入15％氢氧化钠溶液淬灭反应，无水硫酸钠干燥，过滤旋转蒸发除去溶剂得T-4，所述步骤具体为：
取化合物T-3 4.32g(19.0mmol)于两口烧瓶中，N2保护下注入45mL二氯甲烷，搅拌溶解，冰盐浴下(-15℃)，缓慢注入30.0mL二异丁基氢化铝(DIBAL-H)(1M/L在甲苯中，30.0mmol)。搅拌30min后，TLC监测显示原料已消失。停止搅拌，加入120mL 0.2M HCl淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和NaHCO3溶液洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得无色液体3.44g，产率78％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ5.38-5.56(m，1H)，4.25-4.29(m，1H)，3.80(dd，J1＝2.8，J2＝10.4Hz，1H)，3.57(dd，J1＝2.8，J2＝10.8Hz，1H)，2.16(s，2H)，1.92-1.98(m，2H)，0.92(s，9H)，0.11(s，6H)。
在上述合成中，加入的DIBAL-H可以为28.5～47.5mmol中任意值。
5.5 化合物T-6的合成
T-4在A-15催化剂下与溴乙醇胺得到T-6，所述步骤具体为：
取化合物T-4 1.07g(4.6mmol)于单口烧瓶中，加入溴乙醇1.15g(9.2mmol)、A-15催化剂230mg，加热回流搅拌，2h后，TLC检测显示原来已消失。停止搅拌，过滤除去A-15，旋出溶剂，柱层析得T-6-1 100mg，T-6-2 70mg。
T-6-1：1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ5.18(d，J＝4.8Hz，1H)，4.16-4.19(m，1H)，3.92-3.96(m，1H)，3.73-3.76(m，1H)，3.61(d，J＝4.4Hz，2H)，3.46-3.50(m，2H)，1.89-2.08(m，3H)，1.69-1.73(m，1H)，0.89(s，9H)，0.06(d，J＝2.0Hz，6H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ104.67，79.02，67.29，65.41，32.08，31.10，25.93，25.31，18.36，-5.26，-5.31。
HRMS：calc for C13H27O3SiBrNa[M+Na]+ 361.0811，found 361.0835。
IR(KBr，cm-1)：2954，2929，2858，1465，1254，1102，839，777。
T-6-2：1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ5.13(d，J＝4.0Hz，1H)，4.11-4.14(m，1H)，3.92-3.97(m，1H)，3.68-3.75(m，2H)，3.57-3.61(m，1H)，3.44-3.50(m，2H)，1.93-2.01(m，3H)，1.78-1.80(m，1H)，0.90(s，9H)，0.07(s，6H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ104.36，81.26，67.21，67.19，32.82，30.97，26.24，25.93，18.36，-5.25，-5.28。
HRMS：calc for C13H27O3SiBrNa[M+Na]+ 361.0811，found 361.0836。
IR(KBr，cm-1)：2928，2858，1465，1254，1098，840，777。
在上述合成中，加入的溴乙醇可以为6.9～13.8mmol中任意值。
5.6.1 化合物T-7-1的合成
在四丁基氟化胺TBAF作用下，T-6-1在室温下脱羟基保护，得到T-7-1，所述步骤具体为：
取上一步得到的化合物T-6-1 110mg(0.32mmol)，加入5mL THF，搅拌10min，然后加入0.64mL(0.64mmol，1M in THF)四丁基氟化铵(TBAF)溶液。室温下搅拌60min，TLC跟踪反应进程，待反应结束后，减压蒸干溶剂，直接硅胶柱层析分离，5∶1PE/EA为淋洗剂，得到油状产物化合物T-7-1 60mg，产率83.3％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ5.19(d，J＝4.8Hz，1H)，4.20-4.26(m，1H)，3.93-3.96(m，1H)，3.69-3.76(m，2H)，3.44-3.52(m，3H)，1.95-2.06(m，3H)，1.64-1.68(m，1H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ104.59，78.62，67.34，64.78，32.41，30.94，24.87。HRMS：calc for C7H13BrO3Na[M+Na]+ 246.9946，found 246.9929。
IR(KBr，cm-1)：3449，2924，1189，1104，1028。
在上述合成中，加入的四丁基氟化胺可以为0.48～0.64mmol中任意值。
5.6.2 化合物T-7-2的合成
在四丁基氟化胺TBAF作用下，T-6-2在室温下脱羟基保护，得到T-7-2，所述步骤具体为：
取上一步得到的化合物T-6-2 70mg(0.21mmol)，加入5mL THF，搅拌10min，然后加入0.41mL(0.41mmol，1M in THF)四丁基氟化铵(TBAF)溶液。室温下搅拌40min，TLC跟踪反应进程，待反应结束后，减压蒸干溶剂，直接硅胶柱层析分离，5∶1PE/EA为淋洗剂，得到化合物T-7-2 42mg，产率87.9％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ5.15(d，J＝4.4Hz，1H)，4.26-4.32(m，1H)，3.99-4.02(m，1H)，3.74-3.81(m，2H)，3.55(dd，J1＝5.2，J2＝12.0Hz，1H)，3.49(t，J＝6.0Hz，2H)，1.92-2.07(m，4H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ104.74，81.55，67.93，65.61，33.25，30.79，24.33。
HRMS：calc for C7H13BrO3Na[M+Na]+ 246.9946，found 246.9938。
IR(KBr，cm-1)：3448，2930，1197，1058，1028。
在上述合成中，加入的四丁基氟化胺可以为0.32～0.42mmol中任意值。
5.7.1 化合物T-8-1的合成
把T-7-1溶于过量的氨水，室温下反应，得到T-8-1，所述步骤具体为：
取上一步得到的化合物T-7-1 40mg(0.18mmol)，溶于2mL氨水，室温下搅拌40h，TLC跟踪反应进程，待反应结束后，加适量乙醇，减压蒸干溶剂，得化合物T-8-1粗品28mg，产率97％。
1H NMR(CD3OD，400MHz)：δ5.20-5.22(m，1H)，4.17-4.23(m，1H)，3.87-3.95(m，1H)，3.64-3.78(m，1H)，3.56-3.61(m，1H)，3.47-3.53(m，1H)，3.15(t，J＝4.8Hz，1H)，1.91-2.10(m，3H)，1.64-1.70(m，1H)。
13C NMR(CD3OD，100MHz)：δ104.72，79.11，63.87，62.95，39.53，31.54，24.86。
HRMS：calc for C7H16NO3[M+H]+ 162.1130，found 162.1135。
IR(KBr，cm-1)：3382，2951，1607，1497，1459，1194，1097，1056，1021，829。
在上述合成中，加入的氨水可以为9～18mmol中任意值。
5.7.2 化合物T-8-2的合成
把T-7-2溶于过量的氨水，室温下反应，得到T-8-1，所述步骤具体为：
取上一步得到的化合物T-7-2 136mg(0.60mmol)，溶于5mL氨水，室温下反应60h，TLC跟踪反应进程，待反应结束后，加适量乙醇，减压蒸干溶剂，得化合物T-8-2粗品90mg，产率93％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ5.15(d，J＝4.0Hz，1H)，4.22-4.23(m，1H)，3.97-4.02(m，2H)，3.89(dd，J1＝2.4，J2＝12.0Hz，1H)，3.67(dd，J1＝4.8，J2＝12.0Hz，1H)，3.38-3.44(m，1H)，3.19-3.25(m，1H)，1.97-2.05(m，3H)，1.81-1.87(m，1H)。
13C NMR(CD3OD，100MHz)：δ105.02，81.38，64.01，63.49，39.78，32.68，24.20。
HRMS：calc for C7H16NO3[M+H]+ 162.1130，found 162.1128。
IR(KBr，cm-1)：3416，2925，1619，1499，1458，1195，1094，1057，1021，815。
在上述合成中，加入的氨水可以为30～60mmol中任意值。
在本实施例中，对于这两种非对应异构体，选择其中的一种非对应异构体T-8-2作为以下合成所用。
5.8 化合物T-9-2的合成
T-8-2与荧光素发生取代反应，得化合物T-9-2，所述具体步骤为：
在10mL的单口瓶中加入2mL无水DMF，再加入30mg(84μmol)化合物T-8-2，避光，室温下搅拌，将20mg(38μmol)TAMRA(5/6)溶于4mL无水DMF，注入，再加入80μL(570μmol)三乙胺(TEA)。室温下搅拌反应，TLC跟踪至原料消失。待反应结束后，减压下除去DMF，以3∶1 DCM/MeOH为展开剂，TLC板分离纯化得产物20mg，产率96％。
1H-NMR(CD3OD，400M)：δ8.13(d，1H，J＝8.0Hz)，8.08(dd，1H，J1＝1.6，J2＝8.0Hz)，7.73(d，1H，J＝1.2Hz)，7.25(dd，2H，J1＝1.6，J2＝9.6Hz)，6.99(dd，2H，J1＝2.0，J2＝9.2Hz)，6.89(d，2H，J＝2.4Hz)，5.10(d，1H，J＝1.6Hz)，4.07～4.11(m，1H)，3.78～3.85(m，1H)，3.46～3.61(m，5H)，3.26(s，12H)，1.87～1.95(m，3H)，1.68～1.76(m，1H)。ESI-HRMS：calc for[C32H35N3O7+H]574.2553，found 574.2531；calc for[C32H35N3O7+Na]596.2373，found 596.2340。
在上述合成中，加入的T-8可以为114～228μmol中任意值，TEA可以为190～760μmol中任意值。
5.9 化合物F-2的合成
三氟乙酸甲酯与丙炔胺在有机溶剂中反应得到化合物F-2，所述步骤具体为：
向一单口瓶中加入15ml甲醇，冰水浴下搅拌，加入丙炔胺E-2(30mmol，1.65g)，搅拌20分钟后缓慢加入三氟乙酸甲酯E-1(39mmol，4.99g)，10分钟后撤去冰水浴，室温下反应24小时。反应用TLC板进行监测。反应结束后，减压蒸干溶剂，加入30ml氯仿，饱和NaHCO3溶液洗涤两次(2×30ml)，饱和NaCl溶液洗涤(30ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，减压蒸馏得产品F-2 3.02g，产率66.6％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：2.32(t，1H，J＝2.7Hz)，4.14(2H，dd，J1＝2.7，J2＝5.4Hz)，6.92(s，1H)。
5.10 化合物F-3的合成
化合物F-2与5-碘-2’-脱氧尿苷F1在碘化亚铜作用下发生偶联反应得到化合物F-3，所述步骤具体为：
向一单口瓶中加入5-碘-2’-脱氧尿苷F-1(0.7mmol，247.9mg)，8mL DMF，搅拌溶解，避光。加入碘化亚铜(0.14mmol，26.7mg)，氮气保护，搅拌20分钟使碘化亚铜充分溶解。依次加入0.25mL TEA、三氟乙酰丙炔胺F-2(2.8mmol，423.0mg)、Pd(PPh3)4(0.07mmol，80.9mg)，室温下反应过夜。反应用TLC板监测。减压蒸干溶剂，柱层析，DCM∶MeOH＝20∶1为洗脱剂，得产品F-3 158mg，产率60％。
1H NMR(300MHz；DMSO-d6)：2.11(2H，t，J＝5.4Hz)，3.56～3.58(2H，m)，3.79(1H，m)，4.21(3H，d，J＝5.4Hz)，5.08(1H，t，J＝4.3Hz)，5.23(1H，d，J＝3.7Hz)，6.09(1H，t，J＝6.4Hz)，8.18(1H，s)，10.05(1H，t，J＝5.3Hz)，11.63(1H，s)。
5.11 化合物dUTP-NH2的合成
化合物F-3与三正丁胺焦磷酸盐E-4，2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮E-3在DMF溶剂中，三乙胺和碘存在下反应得到化合物F-4，然后去保护，得到化合物dUTP-NH2，所述步骤具体为：
在手套箱中称取化合物F-3(一)60mg(0.16mmol)，三正丁胺焦磷酸盐E-4(二)150mg(0.32mmol)，2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮E-3(三)66mg(0.32mmol)，分别置于三个反应管中。将(一)溶于0.5ml无水DMF中，再加入0.6ml新蒸的三正丁胺，搅拌半小时。把(二)溶于0.5ml无水DMF中，在激烈搅拌下，把(一)注射入(二)中，搅拌半小时。把上述混合液注入(三)中，搅拌1.5h。加入5ml 3％碘(py/H2O，9/1)，15min中后加入4ml水，搅拌2h。加入0.9ml 3M NaCl溶液，再加入30ml无水乙醇，零下20℃冷冻过夜，离心(3200r/min，25℃)20min。倾去上清液，抽干溶剂。再加入1ml 1M的TEAB溶液，加入4ml浓氨水，室温搅拌过夜。减压蒸干溶剂，出现白色固体。先用分析型HPLC进行分析，条件：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAAc和乙醇，0min 20mM TEAAc，35min 20％乙醇；紫外检测器：260nm。制备HPLC分离，得26mg白色固体，产率18％。柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：6mL/min；流动相：20mM TEAAc和乙醇，0min 20mM TEAAc，40min 5％乙醇；紫外检测器：260nm。
1H NMR(400MHz，D2O)：1.27(Et3N-CH3，t，J＝8.0Hz)，2.33～2.48(2H，m)，3.18(Et3N-CH2，q，J＝8.0Hz)，4.03(2H，s)，4.20～4.26(3H，m)，4.58～4.64(1H，m)，6.27(1H，t，J＝8.0Hz)，8.38(s，1H)。
31P NMR(162MHz，D2O)：-22.22(1P)，-11.45(1P)，-9.90(1P)。
ESI-HRMS：calc for[C12 H18 N3 O14 P3+H]522.0080，found 522.0070；calc for[C12 H18 N3 O14 P3+Na]543.9899，found 543.9883。
5.12 化合物T-10-2的合成
化合物T-9-2与DSC在碱性条件下反应得化合物T-10-2，所述步骤具体为：
在一反应瓶中加入化合物T-9-2 10mg(0.017mmol)，抽真空，氮气保护，用注射器注入0.5ml无水乙腈，加入20μl三乙胺，室温下搅拌。在另一反应瓶中加入N，N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)27mg(0.105mmol)，抽真空，氮气保护，将上述混合液注入，室温下搅拌反应。TLC跟踪反应至原料消失。原料消失后，停止反应，直接用于下一步。
在上述合成中，加入的DSC可以为0.085～0.136mmol中任意值。
5.13 化合物T-11-2的合成
化合物T-10-2与化合物dUTP-NH2在碱性条件下发生取代反应得化合物T-11-2，所述步骤具体为：
把化合物dUTP-NH2(22mg，0.024mmol)溶于0.5ml NaHCO3/Na2CO3(pH为8.73)的缓冲溶液中，把化合物T-10-2的反应液(起始原料化合物T-9-2(7mg，0.012mmol))加入化合物dUTP-NH2的缓冲溶液中，室温下搅拌反应。反应结束后首先用TLC大板分离未反应的化合物T-10-2，然后用制备HPLC分离，得化合物T-11-2纯品4.5mg，产率33.3％。tR为28.5min.条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mM TEAAc和甲醇，0min 0％甲醇，10min 0％甲醇，30min 50％甲醇，50min 50％甲醇；紫外检测器：546nm。分析tR为32.8min。条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAAc和甲醇，0min 0％甲醇，10min 0％甲醇，30min 50％甲醇，50min 50％甲醇；紫外检测器：260nm，546nm。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.13(d，1H，J＝4.0Hz)，8.00(d，1H，J＝8.0Hz)，7.95(s，1H)，7.87(s，1H)，7.18～7.26(m，2H)，6.93～7.01(m，2H)，6.81(s，1H)，6.76(s，1H)，6.14(t，1H，J＝4.0Hz)，5.25(s，1H)，4.45～4.56(m，2H)，4.29～4.38(m，2H)，4.13～4.27(m，4H)，4.64～4.80(m，5H)，3.30(s，12H)，3.22(Et3N-CH2，q)，2.26～2.90(m，1H)，2.09～2.11(m，3H)，1.67～1.72(m，2H)，1.31(Et3N-CH3，t)。
31P NMR(162MHz，D2O)：-20.63(1P)，-10.92(1P)，-8.32(1P)。
ESI-HRMS：calc for[C45H51N6O22P3 -H]1119.2191，found 1119.2216；calc for[C45H51N6O22P3 -PO3H2]- 1039.2528，found 1039.2551；calc for[C45H51N6O22P3 +Na-2H]-1141.2010，found 1141.1981。
在上述合成中，加入的dUTP-NH2可以为0.018～0.036mmol中任意值。
实施例6、对合成的可逆终端的生物学评价
为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序，本实施例检测了实施例1～5的可逆终端两个方面的特性：
1)是否可以被DNA聚合酶所识别，作为DNA聚合酶的底物参与DNA的延伸反应；
2)参与DNA链延伸后能否去掉该可逆终端所携带的荧光基团，以便下一轮的延伸反应。
这两方面是高通量合成测序(sequencing by synthesis)的核心。因此配制DNA延伸反应体系：将可逆终端与DNA模板、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合，30℃静置15分钟，75℃处理10分钟以灭活klenow DNA聚合酶活性，然后针对酸敏感可逆终端和二硫键可逆终端分别检测了不同酸性条件下(pH2.0、pH1.7、pH1.5、Dowex 50Wx酸性树脂)以及不同浓度还原剂条件下这两种不同类型的可逆终端所携带的荧光基团是否可以断裂。具体如下：
6.1酸敏感可逆终端在DNA链延伸反应及其pH2.0条件下的断裂测试(实施例5的可逆终端)
1)按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：10×Klenowbuffer 10uL，BSA(10mg/mL)1uL，DMSO 20uL，NaCl(1M)25uL，Klenow(exo-)pol(5U/uL)1.32uL，dUTP(10uM)6uL，模板DNA(853ng/uL)1.25uL，ddH2O 35.43uL，总体积100uL。
将反应体系置于30℃水浴箱中处理15分钟，再置于75℃水浴中处理10分钟以灭活DNA聚合酶。将反应产物用于后续的可逆终端荧光基团的断裂反应。
2)酸敏感可逆终端荧光基团的断裂反应
在DNA链延伸反应体系中加入13.5uL 0.24M HCl，调节pH至2.0，室温处理30分钟，再用1M Tris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图10所示，由图10可知，酸敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，但是在pH2.0和pH2.2的酸性条件下，可逆终端所携带的荧光基团断裂效果不佳，还需进一步调整断裂条件。
6.2含有酸敏感可逆终端的DNA链延伸产物在pH1.7酸性条件下的断裂测试(实施例5的可逆终端)
按照6.1中的方法设立DNA链延伸反应，在DNA链延伸反应体系中加入9uL 0.48M HCl，调节pH至1.7，室温处理30分钟，再用1M Tris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图11所示，由图11可知，含有可逆终端的DNA链延伸产物，在pH1.7条件下断裂效果比pH2.0要好，约50％左右的延伸产物荧光基团被断裂，但仍有相当部分没有断裂，因而有待于进一步优化。
6.3含有酸敏感可逆终端的DNA链延伸产物在Dowex 50Wx8环境下的断裂测试(实施例5的可逆终端)
按照6.1中的方法设立DNA链延伸反应，在DNA链延伸反应体系中经Dowex 50Wx8调节，使得反应体系的pH分别为pH 1.9和pH 1.5，室温处理30分钟，再用1M Tris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图12所示，由图12可知，含有可逆终端的DNA链延伸产物，在pH1.5酸性条件下可逆终端所携带的荧光基团断裂效果比pH2.0和pH1.9都要好，大部分荧光基团被断裂，虽然不完全，但可以用于测序。
6.4二硫键可逆终端在DNA链延伸反应及其在不同DTT浓度下的断裂测试(实施例1、2、3的可逆终端)
1)按照如下体系在eppendorf管里设立含二硫键可逆终端的DNA链延伸反应：10×Klenow buffer10uL，BSA(10mg/mL)1uL，DMSO 20uL，NaCl(1M)25uL，Klenow(exo-)pol(5U/uL)1.32uL，dUTP(10uM)6uL，模板DNA(853ng/uL)1.25uL，ddH2O 35.43uL，总体积100uL。
将反应体系置于30℃水浴箱中处理15分钟，再置于75℃水浴中处理10分钟以灭活DNA聚合酶。将反应产物用于后续的可逆终端荧光基团的断裂反应。
2)二硫键可逆终端荧光基团的断裂反应
在室温下分别用10uM、8mM以及10mM的DTT处理含有二硫键可逆终端的DNA链延伸反应产物，作用时间从10分钟至2小时。取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图13所示，由图13可知，酸敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸。10uM DTT处理DNA链延伸产物，不能有效断裂二硫键可逆终端；而8mM和10mM DTT室温下分别作用10分钟至2小时，均能有效断裂二硫键可逆基团，说明其完全可以应用于高通量测序反应。
6.5含有二硫键可逆终端的DNA链延伸产物分别在10mM、20mM和30mM DTT不同作用时间下的断裂测试
测试的是实施例1、2、3的可逆终端，这两种结构的可逆终端的评价方法及效果完全一样；具体如下：
为了进一步优化含有二硫键可逆终端的DNA链延伸产物的断裂条件，缩短断裂时间，分别测试了不同浓度DTT在不同处理时间下的断裂效果：
1)10mM DTT室温下分别作用3分钟至15分钟，并检测断裂效果：按照6.4中的方法设立DNA链延伸反应，在DNA链延伸反应体系中加入终浓度为10mM的DTT分别处理不同时间，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图14所示，由图14可知，含有二硫键可逆终端的DNA链延伸产物在10mM的DTT室温作用3min、5min、8min后荧光扫描结果显示仍有荧光信号，说明这个浓度下DTT不能完全将二硫键断裂；作用10min后有微弱的荧光信号，15min后荧光信号基本检测不到，显示10mM的DTT处理15分钟时断裂二硫键效果较好。
2)20mM和30mM DTT室温下分别作用3至8分钟，并检测断裂效果：按照上述方法设立DNA链延伸反应，在DNA链延伸反应体系中分别加入终浓度为20mM和30mM的DTT分别处理不同时间，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图15所示，由图15可知，含有二硫键可逆终端的DNA链延伸产物在20mM的DTT室温作用3min、5min、8min后荧光扫描结果检测不到荧光信号，说明20mM的DTT作用3min就能完全将含有可逆终端二硫键断裂。类似的，30mM DTT室温作用3min、5min也能完全将可逆终端的二硫键断裂。对于二硒键可逆终端同样可以在还原剂DTT作用下断裂，只是断裂需要的DTT浓度更大，时间也会更长。
实施例4可逆终端的生物学评价与实施例1、2、3相同，只是还原剂DTT的用量需要增加到10倍；其结果同样说明其合成的可逆终端可以应用于DNA测序。
综上所述，本发明为采用荧光素标记含核苷酸U的可逆终端。实施例6的测试结果进一步验证了本发明的可逆终端已完成满足高通量测序的生化反应要求，具备较好的实用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (11)
1.一种可逆终端，其结构式如式(I)所示：
其中R1为荧光素，R2为连接单元。
2.如权利要求1所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(II)所示：
3.如权利要求2所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的：
A、化合物F2的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0∶(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F2
B、化合物F3的合成：在CuI、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，化合物F2和F1 
反应，得化合物F3 
所述F1、F2、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；
C、化合物dUTP-NH2的合成：化合物F3与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dUTP-NH2 
所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮和F3的摩尔比为2∶2∶1；
D、化合物dUTP-SPDP的合成：在TEA存在的条件下，化合物dUTP-NH2在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中，与以无水乙腈为溶剂的SPDP
反应，得化合物dUTP-SPDP所述的dUTP-NH2和SPDP的摩尔比为1∶(1.5～3)；
E、化合物RDM-SH的合成：在DTT存在的条件下，半胱胺在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中与化合物TAMRA(5/6)
避光反应，得化合物RDM-SH
所述TAMRA(5/6)、半胱胺和DTT的摩尔比为1∶(10～50)∶(40～70)；
F、化合物dUTP-T的合成：以Na3PO4-EDTA缓冲液和乙腈为溶剂，化合物dUTP-SPDP与RDM-SH反应，得化合物dUTP-T；所述RDM-SH、dUTP-SPDP的摩尔比为1∶(1～2)；所述化合物dUTP-T即具有式(II)所示结式的可逆终端。
4.如权利要求2所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的：
A、化合物F2的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0∶(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F2 
B、化合物F3的合成：在CuI、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，化合物F1 
和F2反应，得化合物F3 所述F1、F2、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；
C、化合物G1的合成：以甲醇为溶剂，化合物F3与浓氨水反应，得化合物所述F3和氨水的摩尔比为1∶(50～100)；
D、化合物G2的合成：以甲醇和无水乙腈作溶剂，化合物G1与SPDP
反应，得化合物
所述G1和SPDP的摩尔比为1∶(1～2)；
E、化合物RDM-SH的合成：在DTT存在的条件下，半胱胺在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中与化合物TAMRA(5/6)
避光反应，得化合物RDM-SH
所述TAMRA(5/6)、半胱胺和DTT的摩尔比为1∶(10～50)∶(40～70)；
F、化合物G3的合成：以甲醇和乙腈作为溶剂，化合物RDM-SH在铝箔包裹氮气保护下与G2反应，得化合物G3 
所述RDM-SH和G2的摩尔比为1∶(1.2～2)；
G、化合物dUTP-T的合成：化合物G3与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dUTP-T；所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮和G3的摩尔比为2∶2∶1；所述化合物dUTP-T即具有式(II)所示结式的可逆终端。
5.如权利要求1所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(III)所示：
6.如权利要求5所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的：
A、化合物N-1的合成：以甲醇为溶剂，在TEA存在的条件下，半胱胺盐酸盐在冰浴搅拌条件下与2-羟乙基二硫化物
反应，得化合物N-1
所述半胱胺盐酸盐、2-羟乙基二硫化物和TEA的摩尔比为1∶(1～2)∶(2～3)；
B、化合物N-2的合成：以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物N-1与TAMRA(5/6)
避光反应，得化合物N-2
所述TAMRA(5/6)、N-1和TEA的摩尔比为1∶(1～4)∶(10～15)；
C、化合物N-3的合成：以无水乙腈为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物N-2在氮气保护条件下与DSC反应，得化合物N-3
所述N-2、DSC和TEA的摩尔比为1∶(4～6)∶(5～15)；
D、化合物N-4的合成：以NaHCO3/Na2CO3的缓冲溶液为溶剂，化合物dUTP-NH2 
与N-3反应，得化合物N-4；所述N-3和dUTP-NH2的摩尔比为1∶(1～2)；所述化合物N-4即具有式(III)所示结式的可逆终端。
7.如权利要求1所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(IV)所示：
8.如权利要求7所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的：
A、化合物T-1的合成：在盐酸存在的条件下，L-谷氨酸在冰浴搅拌条件下与亚硝酸钠反应，得化合物T-1
所述L-谷氨酸、盐酸和亚硝酸钠的摩尔比为1∶(1.5～2)∶(1.5～2)；
B、化合物T-2的合成：以无水四氢呋喃做溶剂，化合物T-1在氮气保护及冰水浴下与溶于二甲硫醚的硼烷反应，得化合物T-2
所述T-1和硼烷的摩尔比为1∶(1.5～5)；
C、化合物T-3的合成：以二氯甲烷做溶剂，在咪唑存在的条件下，化合物T-2在氮气保护下和TBSCl反应，得化合物T-3
所述T-2和TBSCl的摩尔比为1∶(1.5～2.5)；
D、化合物T-4的合成：以二氯甲烷做溶剂，化合物T-3在氮气保护及冰盐浴下和DIBAL-H反应，得化合物T-4
所述T-3和DIBAL-H的摩尔比为1∶(1.5～2.5)；
E、化合物T-6的合成：在A-15催化剂存在的条件下，化合物T-4与溴乙醇胺反应，得化合物T-6
所述T-4和溴乙醇胺的摩尔比为1∶(1.5～3)；
F、化合物T-7的合成：在四丁基氟化胺存在的条件下，化合物T-6在室温下脱羟基保护，得化合物T-7
所述T-6和四丁基氟化胺的摩尔比为1∶(1.5～2)；
G、化合物T-8的合成：化合物T-7与过量的氨水反应，得化合物
所述T-7和氨水的摩尔比为1∶(50～100)；
H、化合物T-9的合成：以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物T-8与TAMRA(5/6)
反应，得化合物T-9所述TAMRA(5/6)、T-8和TEA的摩尔比为1∶(3～6)∶(5～20)；
I、化合物T-10的合成：化合物T-9在DSC存在的条件下得化合物T-10
所述T-9和DSC的摩尔比为1∶(5～8)；
J、化合物T-11的合成：化合物T-10与dUTP-NH2 
反应，得化合物T-11；所述T-10和dUTP-NH2的摩尔比为1∶(1.5～3)；所述化合物T-11即结构式(IV)所示的可逆终端。
9.如权利要求1所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(V)所示：
10.如权利要求9所述的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的：
A、Na2Se2碱性水溶液的制备：冰浴冷却下，将NaBH4固体加水溶解形成NaBH4溶液；将NaOH固体溶于水后加入硒粉和十六烷基三甲基溴化铵，在N2保护下，再加入所述NaBH4溶液，室温反应0.5～1.5h后在85～95℃下反应0.5～1h，得Na2Se2碱性水溶液；所述NaBH4、硒粉和NaOH的摩尔比为1∶(7～8)∶(8～9)；
B、化合物D-1的合成：以THF为溶剂，氮气保护下溴乙醇与Na2Se2碱性水溶液油浴45～55℃搅拌反应，得化合物D-1
所述溴乙醇和Na2Se2的摩尔比为1∶(1～2)；
C、化合物D-2的合成：以二甲苯为溶剂，化合物D-1与HBr反应，得化合物
所述D-1和HBr的摩尔比为1∶(4～6)；
D、化合物D-3的合成：化合物D-2与浓氨水反应，得化合物D-3
所述D-2和氨水的摩尔比为1∶(50～100)；
E、化合物D-4的合成：以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物D-3与TAMRA(5/6)避光反应，得化合物D-4
所述TAMRA(5/6)、D-3和TEA的摩尔比为1∶(1～4)∶(10～15)；
F、化合物D-5的合成：以无水乙腈为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物D-4在氮气保护下与DSC反应，得化合物D-5
所述D-4、DSC和TEA的摩尔比为1∶(4～6)∶(5～15)；
G、化合物D-6的合成：以NaHCO3/Na2CO3的缓冲溶液为溶剂，化合物dUTP-NH2 
和D-5反应，得化合物D-6；所述D-5和dUTP-NH2的摩尔比为1∶(1～2)；所述化合物D-6即结构式(V)所示的可逆终端。
11.一种如权利要求1～10所述的可逆终端在DNA合成测序中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310015235.3A CN103087131B (zh) | 2013-01-15 | 2013-01-15 | 可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310015235.3A CN103087131B (zh) | 2013-01-15 | 2013-01-15 | 可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103087131A true CN103087131A (zh) | 2013-05-08 |
| CN103087131B CN103087131B (zh) | 2015-07-08 |
Family
ID=48200304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310015235.3A Active CN103087131B (zh) | 2013-01-15 | 2013-01-15 | 可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103087131B (zh) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103588838A (zh) * | 2013-10-30 | 2014-02-19 | 上海交通大学 | 碱基修饰核苷酸的合成方法及其用途 |
| CN103601778A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-02-26 | 上海交通大学 | 7-去氮-7-取代鸟嘌呤核苷的合成方法 |
| CN103819523A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-28 | 上海交通大学 | 7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法 |
| CN105131064A (zh) * | 2015-07-09 | 2015-12-09 | 上海交通大学 | 基于四氢呋喃修饰核苷酸及其在dna测序中的用途 |
| CN105256003A (zh) * | 2015-09-14 | 2016-01-20 | 上海交通大学 | 一种基于酸敏感修饰核苷酸的dna测序方法 |
| WO2016020691A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotide linkers |
| CN106083676A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-11-09 | 上海交通大学 | 硫代缩酮连接单元及其合成方法、用途 |
| CN106434866A (zh) * | 2016-07-25 | 2017-02-22 | 东南大学 | 一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法 |
| CN106588722A (zh) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | 上海交通大学 | 硫代缩酮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 |
| CN108822173A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-11-16 | 合肥华纳生物医药科技有限公司 | 一种荧光标记可剪切核苷酸、合成方法及其在dna测序中的用途 |
| CN109762129A (zh) * | 2019-01-10 | 2019-05-17 | 陕西科技大学 | 一种光可逆的自愈合无溶剂聚氨酯组合物、合成革贝斯及制备方法 |
| WO2021031109A1 (zh) * | 2019-08-20 | 2021-02-25 | 深圳华大智造极创科技有限公司 | 一种基于发光标记物光信号动力学及二次发光信号对多核苷酸进行测序的方法 |
| CN114250282A (zh) * | 2020-11-25 | 2022-03-29 | 深圳铭毅基因科技有限公司 | 一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1617937A (zh) * | 2001-12-04 | 2005-05-18 | 索雷克萨有限公司 | 标记过的核苷酸 |
| WO2005084367A2 (en) * | 2004-03-03 | 2005-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry |
| WO2008069973A2 (en) * | 2006-12-01 | 2008-06-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| CN101935702A (zh) * | 2010-08-10 | 2011-01-05 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 带可去除标记的核苷酸及制备方法和用于基因测序的方法 |
| CN102675262A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-19 | 上海交通大学 | 四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途 |
-
2013
- 2013-01-15 CN CN201310015235.3A patent/CN103087131B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1617937A (zh) * | 2001-12-04 | 2005-05-18 | 索雷克萨有限公司 | 标记过的核苷酸 |
| WO2005084367A2 (en) * | 2004-03-03 | 2005-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry |
| WO2008069973A2 (en) * | 2006-12-01 | 2008-06-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| CN101935702A (zh) * | 2010-08-10 | 2011-01-05 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 带可去除标记的核苷酸及制备方法和用于基因测序的方法 |
| CN102675262A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-19 | 上海交通大学 | 四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GERARDO TURCATTI等: "A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 36, no. 4, 29 February 2008 (2008-02-29) * |
| KRZYSZTOF SOBCZAK等: "RNA structure analysis assisted by capillary electrophoresis", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 30, no. 22, 31 December 2002 (2002-12-31) * |
Cited By (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103601778A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-02-26 | 上海交通大学 | 7-去氮-7-取代鸟嘌呤核苷的合成方法 |
| CN103588838A (zh) * | 2013-10-30 | 2014-02-19 | 上海交通大学 | 碱基修饰核苷酸的合成方法及其用途 |
| CN103819523B (zh) * | 2014-01-22 | 2016-02-10 | 上海交通大学 | 7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法 |
| CN103819523A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-28 | 上海交通大学 | 7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法 |
| US11230734B2 (en) | 2014-08-08 | 2022-01-25 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotide linkers |
| WO2016020691A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotide linkers |
| US11773438B2 (en) | 2014-08-08 | 2023-10-03 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotide linkers |
| RU2699993C2 (ru) * | 2014-08-08 | 2019-09-12 | Иллумина Кембридж Лимитед | Модифицированные нуклеотидные линкеры |
| JP2022000435A (ja) * | 2014-08-08 | 2022-01-04 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 修飾ヌクレオチドリンカー |
| JP2017525695A (ja) * | 2014-08-08 | 2017-09-07 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 修飾ヌクレオチドリンカー |
| CN111704643A (zh) * | 2014-08-08 | 2020-09-25 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 修饰的核苷酸连接基 |
| AU2015298469B2 (en) * | 2014-08-08 | 2018-12-06 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotide linkers |
| US10190157B2 (en) | 2014-08-08 | 2019-01-29 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotide linkers |
| CN105131064B (zh) * | 2015-07-09 | 2018-04-20 | 上海交通大学 | 基于四氢呋喃修饰核苷酸及其在dna测序中的用途 |
| CN105131064A (zh) * | 2015-07-09 | 2015-12-09 | 上海交通大学 | 基于四氢呋喃修饰核苷酸及其在dna测序中的用途 |
| CN105256003A (zh) * | 2015-09-14 | 2016-01-20 | 上海交通大学 | 一种基于酸敏感修饰核苷酸的dna测序方法 |
| CN106588722B (zh) * | 2015-10-20 | 2018-08-03 | 上海交通大学 | 硫代缩酮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 |
| CN106588722A (zh) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | 上海交通大学 | 硫代缩酮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 |
| CN106083676A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-11-09 | 上海交通大学 | 硫代缩酮连接单元及其合成方法、用途 |
| CN106434866B (zh) * | 2016-07-25 | 2020-02-07 | 东南大学 | 一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法 |
| CN106434866A (zh) * | 2016-07-25 | 2017-02-22 | 东南大学 | 一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法 |
| CN108822173A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-11-16 | 合肥华纳生物医药科技有限公司 | 一种荧光标记可剪切核苷酸、合成方法及其在dna测序中的用途 |
| CN108822173B (zh) * | 2018-06-26 | 2021-04-02 | 合肥华纳生物医药科技有限公司 | 一种荧光标记可剪切核苷酸、合成方法及其在dna测序中的用途 |
| CN109762129A (zh) * | 2019-01-10 | 2019-05-17 | 陕西科技大学 | 一种光可逆的自愈合无溶剂聚氨酯组合物、合成革贝斯及制备方法 |
| WO2021031109A1 (zh) * | 2019-08-20 | 2021-02-25 | 深圳华大智造极创科技有限公司 | 一种基于发光标记物光信号动力学及二次发光信号对多核苷酸进行测序的方法 |
| CN114250282A (zh) * | 2020-11-25 | 2022-03-29 | 深圳铭毅基因科技有限公司 | 一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103087131B (zh) | 2015-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103087131B (zh) | 可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 | |
| CN103484106B (zh) | 四色荧光标记可逆终端及其在dna测序中的用途 | |
| CN102675262B (zh) | 四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途 | |
| CN110845556A (zh) | 一种靶向肿瘤β-半乳糖苷酶近红外荧光探针及其制备方法 | |
| CN106749362B (zh) | 一种锰和铜双离子响应的荧光探针及其制备方法 | |
| CN105111415B (zh) | 一种侧链含萘基团的聚噻吩衍生物及其制备方法和应用 | |
| CN112898190B (zh) | 一种大麻二酚衍生物及其制备方法 | |
| Li et al. | Coumarin-based novel fluorescent zinc ion probe in aqueous solution | |
| CN104292117B (zh) | 酸敏感连接单元的合成及其在dna测序中的用途 | |
| Zhou et al. | Ratiometric fluorescent Zn2+ chemosensor constructed by appending a pair of carboxamidoquinoline on 1, 2-diaminocyclohexane scaffold | |
| CN103539697A (zh) | 还原敏感偶氮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 | |
| Feng et al. | Highly stable pseudo [2] rotaxanes co-driven by crown ether–ammonium and donor–acceptor interactions | |
| CN104478823B (zh) | 赖氨酸修饰的苯并呋咱化合物及合成方法、应用、回收方法以及检测铜离子浓度的方法 | |
| CN115583920B (zh) | 一种四嗪类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN106432312A (zh) | 一种线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN104003902B (zh) | 三氮烯连接单元的合成及其在dna测序中的用途 | |
| CN106928295B (zh) | 一类具有环状结构的蒽醌糖缀合物及其制备方法和在环境检测中的应用 | |
| CN111072694B (zh) | 一种硫化氢识别检测荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN104725453B (zh) | 基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途 | |
| CN104693258B (zh) | 基于分子胶的荧光标记核苷酸及其在dna测序中的用途 | |
| CN113999218B (zh) | 黄酮醇类化合物及制备方法与其在检测生物硫醇中的应用 | |
| CN103012375A (zh) | 吡啶基三氮唑甲基取代的吖啶衍生物及其制备方法和应用 | |
| CN101293959A (zh) | 超支化共轭聚合物传感材料及其制备方法和用途 | |
| CN116217655A (zh) | 一种连接基药物偶联物的中间体的制备方法 | |
| Ossowski et al. | Synthesis of lysine derivatives containing aza-crown ethers and a chromophore unit |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |