CN1030616C - 发酵生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产L-赖氨酸的方法，它包括在一种营养基中培养属于短杆菌属或棒杆菌属并具苯丙氨酸类似物抗性的产L-赖氨酸菌株，然后在所述培养基中产生并积累L-赖氨酸，并从所述培养基中收集L-赖氨酸。

Description

发酵生产L—赖氨酸的方法

本发明涉及一种通过发酵生产L—赖氨酸的方法，更具体地说，本发明涉及一种利用属于短杆菌属和棒杆菌属并具苯丙氨酸类似物抗性的产L—赖氨酸菌株生产L—赖氨酸的方法。

以前所知的发酵产生赖氨酸的方法，一种是利用S—(2—氨乙基)—L—半胱氨酸(此后称作AEC)抗性细菌(公开于日本专利申请55213/1967号公告中)，一种是利用具AEC抗性并具L—亮氨酸、L—高丝氨酸、L—脯氨酸、L—精氨酸或L—丙氨酸缺陷型的变种(公开于日本专利申请36888/1974和80289/1974号中，及日本专利申请21078/1976号的公告中)，一种是利用具AEC抗性并具亮氨酸类似物抗性如β—羟基亮氨酸(此后称作HL)等的变种(公开于日本专利申请1833/1978号公告中)，一种利用具α—氯代己内酰胺(此后称作CCL)抗性的变种(公开于日本专利申请43591/1978号公告中)，一种利用γ—甲基赖氨酸(此后称作ML)抗性的变种(公开于日本专利申请19235/1981号的公告中)，一种利用氟代丙酮酸(此后称作FP)敏感性变种的方法(公开于日本专利申请9783/1980号中)，一种利用具还原型丙酮酸激酶活性的变种(公开于日本专利申请170487/1983号的公告中)，一种利用具过氧化物歧化酶活性的变种(公开于日本专利申请282092/1986号中)，等等。

本发明要解决的问题是建立一种低成本发酵生产L—赖氨酸的方法。

为解决上述问题，本发明者作了大量的研究，以通过改进的产L—赖氨酸菌株提高发酵产率，结果发现通过将丙氨酸类似物抗性赋予产L—赖氨酸菌株，便可大大提高细菌的L—赖氨酸生产率，并基于这一发现完成了本发明。

本发明者首先得到的这一发现，便是当具丙氨酸类似物抗性的菌株用于发酵生产L—赖氨酸时，L—赖氨酸产率显著提高。

用于本发明的菌株可通过下述方法得到：对属于短杆菌属和棒杆菌属并具产L—赖氨酸能力的细菌进行变异处理，然后从得到的变种中选择具苯丙氨酸类似物抗性的菌株。

任何细菌都可以用作获得本发明变种的亲本菌株，而无需考虑其品种和株系，只要它们属于短杆菌属或棒杆菌属就行。但优选下列被称作为产L—谷氨酸的杆状细菌：叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020黄色短杆菌(B.flavum)ATCC 14067乳酵短杆菌(B.lactofermentum)ATCC 13869玫瑰色短杆菌(B.roseum)ATCC 13825嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

             ATTC 13870百合棒杆菌(C.lilium)ATCC 15990

除了这些野生型菌株外，还可利用在产生赖氨酸方面有优势的变种，例如，具有如AEC抗性、CCL抗性、ML抗性、高丝氨酸缺陷型、丙氯酸缺陷型、氟代丙酮酸敏感型、苏氨酸敏感型、甲硫氨酸敏感型等性质的变种。

为了利用属于短杆菌属和棒杆菌属并具产赖氨酸优势的细菌获得本发明的变种，可利用常规的方法诱导细菌变异，如照紫外光、照X射线、用诱变剂处理等。用诱变剂处理的例子包括在30℃下用250μg/ml的N—硝基—N′—甲基—N—亚硝基胍处理20分钟。

本发明便是从由此得到的变种中选择和收集苯丙氨酸类似物的抗性菌株。

作为苯丙氨酸类似物，化学物质如间—三氟甲基—DL—苯丙氨酸、S—苄基—L—高半胱氨酸、DL—对—氯代苯丙氨酸等较为有效。

抗这类化学物质的菌株可用收集寻常化学物质抗性菌株的方法收集。例如，将一变种接种干含有亲本菌株不能生长的浓度的上述任何化学物质的琼脂培养基上，在培养基中培养，收集长成的菌落。培养基中化学物质的浓度根据化学物质的类型不同而不同，如果是间—三氟甲基—苯丙氨酸，则浓度约为1.0m/ml，如果是S—苄基—L—高半胱氨酸或DL—多氯代苯丙氨酸，则浓度约为2.0mg/ml。

如果使用其它化学物质，不必说需预先进行培养试验，以确定一适当的浓度。

此外，具提高的赖氨酸产率的菌株还可通过下述方法获得：对属于短杆菌属和棒杆菌属的野生型菌株进行变异处理，在所得到的变种中选出苯丙氨酸类似物的抗性菌株，然后赋予这些抗性菌株以产赖氨酸优势的性质，例如，具如AEC抗性、高丝氨酸缺陷型、CCL抗性、ML抗性、氟代丙酮酸敏感性等性质的变种。

可用于本发明微生物的例子包括：

乳酵短杆菌AJ 12437 FERMBP-2297和嗜乙酰乙酸棒杆菌AJ 12436F ERM BP-2296，这两个菌株均已于1990年3月7日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号分别为CCTCCM90007和M90009。

下面是获得这些微生物的一个实例。

乳酵短杆菌AJ 12435(FERM BP-2294)和嗜乙酰乙酸棒杆菌AJ 12415(FERM BP-2295)用作亲本菌株，这两个菌株均已于1990年3月7日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号分别为CCTCCM90006和M9000g。

将这些菌株在肉汤斜面中培养24小时，所得到的菌株在30℃下用250μg/ml N—硝基—N′—甲基—亚硝基胍处理20分钟。

向由2g/dl葡萄糖、1g/dl(NH₄)₂SO₄、0.1g/dl KH₂PO₄、0.04g/dl MgSO₄·7H₂O、0.001g/dl FeSO₄·7H₂O、0.001g/dl MnSO₄·4H₂O、0.2g/dl脲、50μg/l生物素、100μg/l维生素B₁·HCl和2g/dl琼脂组成的培养基中添力10μg/ml m—三氟甲基苯丙氨酸或20μg/mlp—氯代苯丙氨酸。将pH调至7.0后，培养基在120℃下灭菌15分钟以制备琼脂培养基。

将上述变种接种在此琼脂培养基上，在31.5℃下培养48小时。收集所形成的菌落并从中收集抗化学物质的菌株。从间—三氟甲基—苯丙氨酸抗性菌株和列—氯代苯丙氨酸抗性菌株分别得到AJ12437，FEMR BP—2297和AJ 12436，FERM BP—2296。

亲本菌株和变种的抗性程度示于表1。

表1化学物质       (μg/ml)    菌株相对生长程度

                    AJ 12435  AJ 12437间—三氟甲基—       1        100       100苯丙氨酸          5        35        85

              10       0         20化学物质         (μg/ml)       菌株相对生长程度

                          AJ 12415    AJ 12436对—氯代苯丙氨酸    5            100         100

               10            40          70

               20            0           20

为了利用这些微生物产生和积累L—赖氨酸，可使用用于L—赖氨酸发酵的常规方法。

作为培养基，可用含有普通碳源、氮源、无机离子和其它营养物的普通培养基。作为碳源，可用甜玉米或甜菜的糖汁或废糖蜜、糖类物质如淀粉水解产物等或有机酸如乙酸等等。

作为氮源，可用铵盐、氨水、脲等。此外，还根据需要适当地使用无机离子如磷酸根离子、镁离子等，维生素如硫胺素等。

当使用需特殊物质培养的菌株如营养缺陷型时，可直接将这些物质加入培养基，或者，用加有含有这些物质的蛋白水解物、蛋白胨、玉米浆、肉汤提取物、酵母提取物等的培养基。

培养条件可以是常规的，如在pH6～8范围内，在30～40℃下通气培养，不必说，从发酵液中收集L—赖氨酸可以常规方式进行。

下面将通过实例说明本发明。

实例1

制备一种培养基，它含有36mg/ml葡萄糖、20mg/ml氯化铵、1mg/ml KH₂PO₄、0.4mg/ml MgSO₄·7H₂O、10μg/dl FeSO₄·7H₂O、8μg/dl MnSO₄·4H₂O、1mg/ml大蛋白的酸解物(以氮计)、0.1μg/ml硫胺素盐酸盐及0.3μg/ml生物素。从培养基中每次取出30ml，加入500ml体积的振荡锥型瓶中，然后加热至115℃灭菌10分钟。将预先干热灭菌过的碳酸钙(1g)加入锥型瓶中。将表1所示的细菌株接种于培养基上，分别在31.5℃下用往返摇床培养。48小时后完成发酵，测定在发酵液中积累的L—赖氨酸。所有化学物质抗性菌株有效积累L—赖氨酸(以氯化氢计)的结果示于表2。

实例2

制备一种培养基(pH7.0)，其组成为：80mg/ml废糖蜜作为糖、1mg/ml KH₂PO₄、1mg/ml MgSO₄·7H₂O、1mg/ml大豆水解物(以氮计)及5mg/ml硫酸胺。从培养基中每次取20ml，加入500ml体积的振荡锥型瓶中，然后加热灭菌。将预先灭过菌的碳酸钙(1g)加入锥型瓶中。将下列菌株分别接种于培养基上，然后在31.5℃下用往返摇床培养。

72小时后完成发酵，测定在发酵液中积累的L—赖氨酸。所有化学物质抗性菌株有效积累L—赖氨酸(以氯化氢计)的结果示于表3。

表2菌株      L—赖氨酸HCl(g/l)     基于糖的产率(％)AJ 12435    9.4                   26.0AJ 12415    6.9                   19.2AJ 12437    16.1                  44.9AJ 12436    14.5                  40.3

表3菌株      L—赖氨酸^HCl(g/l)   基于糖的产率(％)AJ 12435    20.6                       25.8AJ 12415    17.1                       21.4AJ 12437    33.0                       41.2AJ 12436    31.0                       38.7

Claims (1)

1.一种生产L-赖氨酸的方法，它包括在一种营养培养基中培养选自乳酵短杆菌(Brevibacterium lacto-formentum)CCTCC M90007和嗜乙酰乙酸棒杆菌(C.acetocieo-philum)CCTCC M90009并具苯丙氨酸类似物抗性的产L—赖氨酸菌株，在所述培养基中产生并累积L—赖氨酸，从所述培养基中收集L—赖氨酸。