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CN103025879B - 人造多纤维素酶体及其用于酶分解弹性底物的用途 - Google Patents

人造多纤维素酶体及其用于酶分解弹性底物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于酶分解弹性底物的体外生产的人造多纤维素酶体。特别是，本发明提供了一种在如结晶纤维素的弹性底物上具有增强活性的复合物。该体外形成的复合物包含：主链支架，所述主链支架具有至少四个能够结合酶成分的结合位点，其中，所述结合位点中的至少两个具有本质上相同的结合特异性；和与所述至少四个结合位点随机结合的至少三种不同的酶成分。本发明还提供制备所述复合物的方法以及所述复合物用于酶分解弹性底物的用途。

Description

人造多纤维素酶体及其用于酶分解弹性底物的用途
技术领域
本发明提供了一种用于酶分解弹性底物（resilientsubstrates）的人造多纤维素酶体（cellulosome）。特别是，本发明提供了一种复合物，其包含：具有至少四个能够结合酶成分的结合位点的主链支架（backbonescaffold），其中，所述结合位点中的至少两个具有本质上相同的结合特异性；和与所述至少四个结合位点随机结合的至少三种不同的酶成分。另外，本发明涉及一种用于制备所述复合物的方法。此外，本发明涉及所述复合物以及所述不同酶成分用于酶分解如纤维素的弹性底物的用途。
背景技术
对于生物技术而言，纤维素是一种丰富的可再生能源，生产生物燃料和化工用构造块。随着即将来临的第二代白色生物技术的到来，来自木质纤维素生物质的纤维素将成为用于工业规模发酵的最大糖源。目前，用于工业发酵的葡萄糖主要由淀粉产生。在糖生产中使用纤维素将使农产品的每公顷产量至少加倍。另外，耕地面积可能会增加，这是因为将会种植大量能源植物，包括那些在恶劣的气候条件下以及在干燥、潮湿、寒冷或富盐环境中在普通土壤中生长的植物。
然而，纤维素是一种难生物降解材料，同时耐酶降解和化学物理降解。纤维素由没有分枝的线性分子的长纤维组成。从化学角度上讲，它是形成Iα和Iβ1型正方晶的高度均质的β-1,4-葡聚糖。然而，晶体结构不是完美的–它们或多或少地被非晶质区有规则地中断。因此，纤维素的结构特征众多，并且需要各种方式分解的酶。
当今的用于酶水解纤维素的技术必须使用大量的用于降解纤维素物质的酶，通常为真菌来源的酶。这些酶通常不能被重复利用。由于下述多个原因，水解相当不充分：物质的不均一性，与半纤维素、胶质和木质素的复合，纤维素的结晶性，因细胞壁和晶体中的紧密包装而缺乏酶可达性，等等。这就增加了降解所需要的不同酶活性的数目以及降低了反应速度而由此降低了该过程的效率。通过升高反应温度，可以提高反应速度，但是以酶稳定性为代价。这对于纤维素酶酶家族（其属于必须对付晶体，即不溶性底物的本质上缓慢反应的酶）来说是特别复杂的。纤维素酶对纤维素作用的多样性解释了纤维素酶复合物中包含的不同酶的多重性：纤维素纤维的结构不均一性(结晶或非结晶，边或面等)，晶体类型(Iα或Iβ)，行为方式(进行性（processive）外-葡聚糖酶或纤维二糖水解酶、进行性或非进行性内-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶)。尽管这些酶都切割相同的β-1,4-糖苷键，但是，它们必须协同作用以有效地降解结晶底物，。
通常用于白色生物技术的商购纤维素酶包含真菌来源的可溶性酶的混合物。其中，最成功的生产者是长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(T.reesei(＝Hypocreajecorina))、绿色木霉(T.viride(＝哈茨木霉(T.harzianum)或Hypocreaatroviridis))、黑曲霉(Aspergillusniger)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Chrysosporiumlucknowense和微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)。一些纤维素酶混合物由如长枝木霉(T.longibrachiatum)和黑曲霉(A.niger)或者如长枝木霉(T.longibrachiatum)和里氏木霉(T.reesei)的两种微生物制备。这些真菌在其培养液中生产大量胞外蛋白质，部分是在通过筛选以及通过遗传工程进行深入的菌株开发之后。纤维素酶包括内-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶(外-葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶，在一些菌株中还包括许多半纤维素酶。
对于这项新技术，预计对用于水解可持续生产的可再生糖源(如木质纤维素物质)的酶制品的需求急剧增加。纤维素酶利用的其它部门主要是食品、纺织品、洗涤剂、造纸工业以及动物饲料添加剂。虽然纤维素酶已经具有庞大市场，但是对于在生物燃料和大批化学生物技术部门中新出现的和潜在的生物质降解这一大的多的市场来说，未来应用领域通常预计被纤维素酶生产所支配。
然而，纤维素晶体的不同结构特性及它们的不溶性性质要求同时存在几种不同活动，如进行性和非进行性纤维素酶。如果单独存在，则单一活动具有较低的活性；只有在组合的情况下，酶才显示出高活性。混合物中单一酶和多种酶的不同被称为协同作用，其中，混合物的活性要比单个活动的总和高。然而，这种协同是通过未复合(即，通过吸附聚集在一起)的单个酶的可溶性混合物中的真菌酶施行的，或者在可溶性单个酶之间的多肽协同排除了在底物的一个位点上至少两个同时工作的活动的存在。在可溶性系统中，在混合物中的酶具有高浓度的情况下这是唯一的可能。真菌纤维素酶的局限性的例子是酶水解所需的相对高浓度、有限的热稳定性以及极易失败的结合率。为了更高的性能，这些局限性必须被克服。
商购的纤维素酶被真菌酶支配。然而，细菌酶系统也已被深入研究。Thermomonosporabispora的可溶性酶或其它嗜热需氧细菌的可溶性酶已被讨论作为真菌纤维素酶混合物的添加剂。一些厌氧细菌已被描述哪种细胞外酶系统对纤维素具有更高的比活和加工能力。后者大部分产生大的细胞外酶复合物，该复合物在主链支架(所谓的支架蛋白(scaffoldin)或Cip(多纤维素酶体整合蛋白))上结合单个酶。这些复合物通过物种特异的强蛋白质-蛋白质相互作用结合在一起。这些复合物被称为多纤维素酶体。已知的是，只有相对很少的细菌产生多纤维素酶体。迄今，它们的名单包括：
在硬壁菌门中：
毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)–溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(R.albus)；
梭菌科(Clostridiaceae)–食纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)、产纤维二糖梭菌(C.cellobioparum)、溶纸梭菌(C.papyrosolvens)、约氏梭菌(C.josui)、解纤维素梭菌(C.Cellulolyticum)、热解纤维梭菌(C.thermocellum)、C7梭菌(C.sp.C7)、P-1拟杆菌(Bacteroidessp.P-1)、溶纤维素拟杆菌(B.cellulosovens)、解纤维醋弧菌(AcetivibrioCellulolyticus)；
在放线菌门中：
拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)–褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)、褐色高温单孢菌(Thermonosporafusca)；
在丝状杆菌门中：
纤维杆菌科（Fibrobacteriaceae）–产琥珀酸丝状杆菌长亚种(Fibrobactersuccinogenes)。
使用严格厌氧嗜热细菌热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)（其是一种在难生物降解底物结晶纤维素上具有最快生长速率的微生物）能够实现多纤维素酶体效率分析的一些改进，这是因为其具有最有效的酶促纤维素降解系统之一3。在不受任何理论限制的情况下，积累了一些证据：这种相对于其它纤维素分解系统较高的效率是由于巨大的酶复合物的形成，但这种酶复合物不能以工业数量生产。该复合物的直径为~18nm并且其分子量超过2x106Da4。针对酶的活性克隆已通过筛选热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)的基因组文库而或多或少地意外克隆了大约30种包含坞因子(dockerin)的多纤维素酶体相关基因5，6。另外，已经识别了支架蛋白CipA，支架蛋白CipA包含9个I型黏附因子组件(cohesinmodule)，依靠其I型坞因子组件7，酶和其它蛋白质成分特异性地被引入坞。II型黏附因子-坞因子(cohesin-dockerin)相互作用使CipA蛋白锚定到细胞壁结合的蛋白质OlpB或SdbA，也可能到其它地方8，9。非酶的成分CspP被推测参与巨大的复合物的结构形成10。然而，关于复合物的结构及其如何装配知之甚少。从其它细菌研究出的多纤维素酶体也包含支架蛋白，常常具有不同的架构。
在热解纤维梭菌ATCC2740512的基因组序列11中识别了72个多纤维素酶体基因。通过所分离的多纤维素酶体的蛋白质组分析以及通过mRNA分析识别了最普遍的多纤维素酶体成分。然而，这决不意味着哪些成分是纤维素分解所必需的以及复合物形成能够起到什么作用是清楚的。
迄今，只有通过构建与两种重组产生的酶成分结合的迷你支架蛋白的小型三级复合物而局部重建多纤维素酶体是可行的，并且显示了明显的协同效应14。另一个研究团队分离的突变体，称作AD2，并不吸附到纤维素上，但是并没有表征其分子机制、纤维素降解能力和多纤维素酶体形成15,16。从热解纤维梭菌的诱变处理培养物中分离出了非多纤维素酶体形成（non-cellucosome-forming）突变体，其不吸附到结晶纤维素上17。
其它团队用例如用于相同数目的不同酶成分的靶向等摩尔结合的三种不同黏附因子组件构建了主链支架(例如在WO=2010057064中)。使用构建的“酵母聚生体(yeastconsortium)”在酵母细胞表面上装配了复合多纤维素酶体结构。和本发明的复合物相反，预期只能发生非统计性的(有序的)结合，并且不能调节成分比例，而本发明是可以的。
在WO=2010012805中，使用碳水化合物结合组件和来自多纤维素酶体支架蛋白的X-组件来在重组体宿主中更好地生产和分泌蛋白质。在这种情况下，将纤维素酶基因遗传上地融合到多肽链上，其中，使用CBM和X组件作为“辅助”组件用于表达，而目的不是用于最优化纤维素分解。
在US20090035811中，由酵母细胞在体内生产包含黏附因子的蛋白质和酶促纤维素酶并且将其保持连接到细胞表面上。这会导致在相对较大细胞表面上负载过多的酶复合物。其中没有显示如何控制酶成分的组成及其比例。所述生产多纤维素酶体的微生物(酵母)不能容易地用于适于另一种底物的组成。
和本发明的非细胞结合的系统相反，现有技术中所述的酵母-细胞结合多纤维素酶体的缺点是取决于所要工程改造的微生物而与一种特异性产品结合。效率不能通过改变成分比例而优化。此外，天然多纤维素酶体，如酵母-细胞结合的多纤维素酶体，不能以工业规模进行生产。
全部三种方法均不能致使纤维素酶活性高于天然多纤维素酶体，这可能是由于不能适应底物需要的欠佳复合物组成。
体外装配多纤维素酶体及其单个成分将仍然是在纤维素分解和纤维降解中研究单个基因的作用所必需的。但是，迄今为止，这些尝试都失败了，这是因为在其天然状态下分开所述成分具有不能克服的困难–所述复合物中的紧密结合使得使用温和的非变性方法不能容易地分开。
不溶性结晶物质(如结晶纤维素和非均质的半纤维素)的酶分解依然是低效和缓慢的，并且需要高的酶浓度，这使得使用当今的酶制品的工业开发昂贵且相对低效。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种新的酶制品，其能够更加高度有效地对弹性底物(如结晶纤维素和非均质的半纤维素)进行酶分解。
本发明的另一个目的是提供一种新的酶制品以及经济有效的体外方法和这些酶制品的用途，所述酶制品克服了现有技术中的酶混合物的缺点，特别是，酶分解需要较低的酶浓度，增强了酶制品的热稳定性，并且提高了酶的结合率。
发明概述
根据本发明，通过在下文中更加详细说明的本发明复合物可以实现活性的强劲增强。在此证明了这种酶系统活性的增强是造成连锁催化事件或在弹性底物(包括但不限于结晶纤维素和非均质的半纤维素)上协同作用的原因。令人惊讶地，本发明人能够显示，与从细菌中分离的天然多纤维素酶体相比，本发明的复合物，在体外重建时，显示出更高的对结晶纤维素的活性。
本发明人分离了一种热解纤维梭菌的突变体，所述热解纤维梭菌不形成复合物而是分泌天然的非复合形式的多纤维素酶体成分。这些蛋白质最初用于重建具有增强活性的人造多纤维素酶体。使用这种突变体，通过复合物的体外重建，现在可以首次研究协同作用的作用。
因此，本发明提供了一种颗粒结合的或无颗粒的复合物，其包含：(a)主链支架，所述主链支架包含至少四个结合位点，其中，所述结合位点中的至少两个具有本质上相同的结合特异性；和(b)与所述四个结合位点的每一个体外结合的酶成分，其中，所述酶成分中的至少三种是不同的酶成分。所述复合物包含的在主链支架(a)中的黏附因子组件与含有坞因子的酶成分(b)的总和的摩尔比为1:1。所述至少三种酶成分(b)优选彼此在主链支架上以1:1至1:50、1:1.5至1:30、优选1:1.8至1:15的摩尔比存在于所述复合物中。
在一个优选的实施方式中，所述复合物是无颗粒的或分离的复合物；其不与活细胞结合，特别优选的是不与酵母细胞结合。
优选地，所述酶成分在体外随机地结合到所述至少四个结合位点上。
本文所用术语“体外”指的是从活细胞或有机体中分离出来。
本文所用术语“复合物”或“酶复合物”指的是通过化学或生物相互作用连接的多种成分的配位体或联合体。如在下文中将更加详细说明的，所述复合物可以连接在一起形成更高级的有序复合物(本文中同义使用“人造多纤维素酶体”或“纤维素酶复合物”)，其由一种或多种包含黏附因子的主链支架(优选包含黏附因子的支架蛋白(本文中又称为“迷你支架蛋白（mini-scaffoldin）”))和一种或多种包含坞因子的酶或非酶成分组成。或者，所述人造多纤维素酶体由一种或多种包含坞因子的主链支架(优选包含坞因子的支架蛋白(本文中又称为“迷你支架蛋白”))和一种或多种包含黏附因子的酶或非酶成分组成。相反，本文所用术语“酶混合物”涉及工业生产的可溶性酶。
本文所用术语“颗粒结合的”复合物指的是本发明的复合物与用作载体物质的颗粒结合。例如，合适的颗粒有纳米颗粒。在该项技术中使用的纳米颗粒小于2000nm，优选平均直径小于100nm。它们可以由有机或无机材料(如硅、金属氧化物、金、聚苯乙烯和其它有机聚合物)，以及其它非生命材料组成，或由不同材料的杂化物(如核壳纳米颗粒)组成。优选地，使用表现出超顺磁性的铁磁性纳米颗粒。更优选地，它们的核用聚合物壳(如聚苯乙烯)包覆，并且对颗粒表面进行化学修饰以允许进行生物分子的化学偶联。优选地，所述修饰是游离羧基(COOH)或游离氨基(NH2)，用于与交联剂进行偶联反应以偶联蛋白质或化学主链分子。
或者，所述纳米颗粒表面，优选用胺官能团或羧基官能团修饰，可如本领域中所述分别通过戊二醛(胺修饰)或EDC/Sulfo-NHS(羧基修饰)优选被共价交联到异双官能团分子(如基于聚乙二醇的接头)上并最终被共价交联到到次氨基三乙酸(NTA)上。通过使用本领域中所述的镍亲和技术，将迷你支架蛋白主链分子经由其蛋白质末端(优选6xHis标记的)上的多组氨酸融合连接到NTA残基上。
如在复合物的重建中所述的，将所述用主链支架包覆的纳米颗粒与酶混合。
本文中所用术语“无颗粒的”指的是本发明的复合物分别是非细胞结合的或者是分离的。
本文中所用术语“主链支架”涉及用作复合物的主链的支撑体，其提供合适的用于酶或非酶蛋白质成分的结合位点。所述主链可为具有多个结合位点的主链蛋白质、支架主链（scaffoldingbackbone）或聚合物有机分子。所述支架主链可由一种或多种迷你支架蛋白组成。
在提到用于酶成分的结合位点时使用的术语“具有本质上相同的结合特异性”指的是在黏附因子组件和坞因子组件之间的结合特异性，由此只有完全相同结合特异性的黏附因子-坞因子对彼此结合。例如，可以通过使一对蛋白质混合并在非变性凝胶电泳中评估运动行为（runningbehaviour）来对其进行测试。
在一个实施方式中，本发明涉及本文中限定的复合物，其中，主链支架是线性的。所述线性主链支架可为合成来源的或生物来源的。合成的主链支架可为，例如，具有能够结合蛋白质的官能团的合成聚合物载体或线性有机聚合物。所述蛋白质可为将要在复合物中包含的酶，或者含有参与黏附因子-坞因子相互作用的一种或多种组件(其结合酶成分)的蛋白质。生物主链支架可为具有用于天然或者通过对所述酶成分或结合组件进行遗传工程而融合的坞因子的天然产生结合位点(黏附因子)的蛋白质。
在本发明的又一个实施方式中，通过黏附因子-坞因子相互作用使酶成分与线性主链支架结合。在本发明的一个优选的实施方式中，本发明的复合物的主链支架具有至少四个用于坞因子的黏附因子结合位点。
优选地，本发明复合物的主链由一种或多种蛋白质组成，其中，所述一种或多种蛋白质是通过化学相互作用或者通过结合特异性与在主链酶相互作用中的结合特异性不同的黏附因子-坞因子相互作用连接在一起的主链蛋白质，由此所述连接相互作用的结合特异性与酶的结合特异性不同。更优选地，所述一种或多种蛋白质通过结合特异性与结合酶成分的黏附因子-坞因子相互作用的结合特异性不同的黏附因子-坞因子相互作用而被连接。
本文中所用术语“黏附因子-坞因子相互作用”指的是在黏附因子和坞因子之间的相互作用。坞因子是在多纤维素酶体的成分中发现的一种蛋白质组件，优选为在多纤维素酶体的各酶成分中的一种。坞因子的结合搭档是黏附因子组件，黏附因子组件通常是多纤维素酶体中的主链支架蛋白质的重复组件部分。这种相互作用对多纤维素酶体复合物的构造是必需的。对于不同酶成分与复合物的结合，本发明的复合物中使用相同的黏附因子-坞因子系统。本发明的一种或多种主链支架蛋白质可以通过黏附因子-坞因子相互作用而被连接；由此，与用于结合酶成分的黏附因子-坞因子对相比，该黏附因子-坞因子对具有不同的结合特异性。正如本领域技术人员已知的，除了别的方法以外，所述成分与多糖的结合可以通过在非变性凝胶电泳中蛋白质带的阻滞或者通过在将液体部分与含有纤维素颗粒的固体部分分开之后使用蛋白质浓度测定用标准技术测量蛋白质的数量来确定。
在还一个实施方式中，本发明的复合物的主链支架得自来自形成分解纤维素的多纤维素酶体的微生物的非催化支架蛋白或其遗传修饰衍生物。
在本文中提到的所述“形成分解纤维素的多纤维素酶体的微生物”涉及形成细胞外复合物(称作多纤维素酶体)的那些细菌或真菌，其中，酶通过黏附因子-坞因子相互作用而与主链支架结合。此外，可以在本发明中使用的形成分解纤维素的多纤维素酶体的微生物是：细菌，如解纤维醋弧菌(AcetivibrioCellulolyticus)、溶纤维素拟杆菌(Bacterioidescellulosolvens)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、解纤维素梭菌(C.Cellulolyticum)、食纤维梭菌(C.cellulovorans)、产纤维二糖梭菌(C.cellobioparum)、约氏梭菌(C.josui)、溶纸梭菌(C.papyrosolvens)、热解纤维梭菌(C.thermocellum)、C7梭菌(C.sp.C7)、P-1梭菌(C.sp.P-1)、产琥珀酸丝状杆菌长亚种(Fibrobactersuccinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、生黄瘤胃球菌(R.flavefaciens)；以及真菌微生物，如Piromycessp.E2。
在又一个实施方式中，所述主链支架得自来自热解纤维梭菌的非催化支架蛋白CipA或其遗传修饰衍生物。
本文中所用术语“遗传修饰衍生物”指的是本发明的复合物的主链支架蛋白质是遗传修饰的，例如，所述主链支架是由热解纤维梭菌的CipA蛋白质进行遗传修饰的衍生物，或者所述主链支架被遗传上地与坞因子组件或His标签序列融合，或者改变(CipA中的)天然产生组件的数目或顺序，或者改变核苷酸序列以引入或除去限制位点，以适应密码子选择，或者改变特定位置的氨基酸残基。
在优选的实施方式中，本发明复合物的主链支架包含如SEQIDNO:24中所示的CBM-c1-c1-d3，如SEQIDNO:22所示的c3-c1-c1-d2，如SEQIDNO:26所示的c2-c1-c1，或它们在其黏附因子组件中具有超过60%的氨基酸序列同一性的衍生物。
本领域技术人员已知的术语“序列同一性”表示在两种或更多种核苷酸或多肽分子之间的亲缘关系程度，其由序列之间的一致性确定。考虑到缺口或其它序列特征，“同一性”百分比由在两个或更多个序列中完全相同区域的百分比得到。
可以通过已知步骤确定彼此相关的多肽的同一性。通常，使用具有考虑特殊要求的算法的专门的计算机程序。用于确定同一性的优选步骤首先在所研究的序列之间产生最大一致。用于确定两个序列之间的同源性的计算机程序包括，但不限于，GCG程序包，其包括GAP(DevereuxJetal.,(1984);GeneticsComputerGroupUniversityofWisconsin,Madison(WI);BLASTP，BLASTNandFASTA(AltschulSetal.,(1990))。BLASTX程序可以得自美国国家生物技术信息中心(NCBI)以及其它来源(BLASTHandbook,AltschulSetal.,NCBNLMNIHBethesdaMD20894;AltschulSetal.，1990)。还可以使用众所周知的SmithWaterman算法用于确定序列同一性。
用于序列比较的优选的参数包括下列：
算法：NeedlemanS.B.和Wunsch,C.D.(1970)
比较矩阵(Comparisonmatrix)：BLOSUM62，来自HenikoffS.和HenikoffJ.G.(1992).
空位罚分(Gappenalty)：12空位长度罚分：2
GAP程序也适合用于具有上述参数的应用。对于氨基酸序列比较，上述参数是标准参数(缺省参数)，其中，末端空位不会降低同一性值。对于与参考序列相比非常小的序列，可以进一步地需要将预期值增加到最高至100,000，并且在一些情况下，将字长(字号)减至2。
此外，可以使用更多的模型算法、空位开放罚分(gapopeningpenalties)、空位拓展罚分(gapextensionpenalties)和比较矩阵，包括在ProgramHandbook,WisconsinPackage,Version9,September1997中命名的那些。选择将取决于将要进行的比较，并且进一步地取决于比较是否要在序列对之间进行(其中，GAP或BestFit是优选的)，还是要在一个序列与庞大序列数据库之间进行(其中，FASTA或BLAST是优选的)。使用前述算法测定的60%的一致性被描述为60%同一性。同样适用于更高程度的同一性。
在优选的实施方式中，根据本发明的变体，衍生物在其黏附组件中具有超过60%的氨基酸序列同一性、优选超过70%的氨基酸序列同一性、更优选超过80%或90%的氨基酸序列同一性。
在本发明的又一优选实施方式中，本发明的复合物的主链支架包含碳水化合物结合组件(carbohydratebindingmodule，CBM)。优选地，所述碳水化合物结合组件是来自热解纤维梭菌的cipA基因的根据CAZy数据库(http://www.cazy.org/Carbohydrate- Binding-Modules.html)分类的CBM3家族的碳水化合物结合组件，所述碳水化合物结合组件被整合到或附加到线性主链支架上。
本文中所用术语“碳水化合物结合组件(CBM)”指的是具有碳水化合物结合活性的连续的氨基酸序列。既可以将CBM引入到本发明的复合物(“迷你支架蛋白”)中，又可以使CBM存在于酶成分中，或者还可以使CBM经由融合到蛋白质成分上而与迷你支架蛋白遗传上地结合。不同的CBM可以识别不同的多糖或多糖结构。CBM还可以通过遗传修饰或者与主链支架的官能团进行化学反应而与迷你支架蛋白结合。CBM引出“靶向作用”，即，增强在复合物与底物之间的结合，这对不溶性底物尤为有利。CBM被定义为与多糖或复杂碳水化合物结合的离散折叠的非催化多肽组件。它们还可被发现或遗传工程改造成以组件形式融合到酶或支架蛋白上，或者经由黏附因子-坞因子相互作用或其它手段成为与主链支架结合的遗传融合。在优选的实施方式中，它们与结晶纤维素结合并且属于CBM第3家族(CBM3)。(见：http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)。除了别的方法以外，可以通过蛋白质在非变性凝胶电泳(其中多糖均匀地分布在凝胶中)中的阻滞来测定与多糖的结合。
在又一个实施方式中，本发明涉及一种如在此所定义的复合物，其中，所述酶成分至少包含坞因子组件和酶的催化组件。
术语“组件”描述在多肽内分离地折叠的部分，其可以利用遗传工程或自然重组用类似“Lego”的方式装配具有新特性的蛋白质。本文中所用的“酶的催化组件”指的是使多肽具有催化活性的蛋白质组件。多纤维素酶体的所有酶都是多组件(multimodular)酶，并且由催化组件和非催化组件组成，至少由催化组件和坞因子组件组成。非催化组件可为坞因子、黏附因子、CBM、S-层同源组件，或者具有尚未知功能的组件(通常称作X-组件)。
在又一个实施方式中，本发明涉及一种如在此所定义的复合物，其中，所述酶成分选自：来自多糖分解或糖分解微生物的进行性或非进行性内-β-1,4-葡聚糖酶、进行性外-β-1,4-葡聚糖酶和糖苷酶或它们遗传修饰的衍生物。
除了别的以外，与本发明的复合物结合的酶成分包含：来自热解纤维梭菌的多纤维素酶体的纤维素酶，例如，嗜热细菌热解纤维梭菌的成分CbhA、CelA、CelE、CelJ、CelK、CelR、CelS或CelT；或者热稳定的β-糖苷酶，例如，来自嗜热细菌那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的β-葡萄糖苷酶BglB。
其它活性酶交换、去掉或加入酶成分或者改变它们的摩尔比可以扩展或增强所述复合物对其它底物的活性。新成分可以包括β-葡萄糖苷酶，半纤维素酶(木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖-酯酶等)，果胶酶，果胶裂合酶，淀粉酶和其它用于木质纤维素生物质水解的酶、其它多糖，或者用于生物化学合成途径的酶的组合。
本文中所用的“多糖分解微生物”指的是能够降解多糖的水解微生物，如淀粉分解微生物、胶质分解微生物、纤维素分解微生物或半纤维素分解微生物。本文中所用的“糖分解微生物”指的是使用碳水化合物作为主要碳源和能源的微生物。
在又一个实施方式中，本发明涉及一种如在此所定义的复合物，其中，所述至少三种酶成分选自来自其它微生物的纤维素分解酶和半纤维素分解酶。
多糖的实例为acetan、琼脂、藻酸盐、支链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、羧甲基纤维素、纤维素、几丁质、壳聚糖、金藻昆布多糖、凝胶多糖、环槐多糖(cyclosophoran)、葡聚糖、糊精、emulsan、果聚糖、半乳聚糖、半乳甘露聚糖、胶凝糖、α-葡聚糖、β-葡聚糖、葡萄糖酸聚糖(glucuronan)、葡糖醛酸木聚糖、糖原、N-乙酰-肝糖(N-acetyl-heparosan)、羟乙基纤维素、糖苷、菊粉、开菲尔多糖(kefiran)、昆布多糖、蘑菇多糖、果聚糖、地衣淀粉、地衣多糖、羽扇豆、甘露聚糖、茯苓聚糖、果胶半乳聚糖、果胶、戊聚糖、糙皮侧耳多糖(pleuran)、聚半乳糖醛酸、芽霉菌糖、鼠李聚糖半乳糖醛酸、裂殖菌多糖、硬葡聚糖、淀粉、琥珀酰聚糖、韦兰胶(welan)、黄原胶、木质葡聚糖(xyloglucan)、酵母聚糖。
纤维素分解微生物的实例为：细菌，如解纤维醋弧菌(AcetivibrioCellulolyticus)，溶纤维醋弧菌(A.cellulosolvens)，Anaerocellumthermophilum，溶纤维素拟杆菌(Bacterioidescellulosolvens)，溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)，解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus)，产乳酸乙酸热解纤维素菌(Cs.lactoaceticus)，Cs.Kristjansonii，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，阿氏梭菌(C.aldrichii)，快生梭菌(C.celerescens)，产纤维二糖梭菌(C.cellobioparum)，纤维素发酵梭菌(C.cellulofermentas)，解纤维素梭菌(C.Cellulolyticum)，纤维素梭菌(C.cellulosi)，噬细胞梭菌(C.cellulovorans)，解纸梭菌(C.chartatabidum)，食植物梭菌(C.herbivorans)，C.hungatei，约氏梭菌(C.josui)，溶纸梭菌(C.papyrosolvens)，C7梭菌(C.sp.C7)，P-1梭菌(C.spP-1)，粪堆梭菌(C.stercorarium)，热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)，C.thermocopriae，嗜热解纸莎草梭菌(C.thermopapyrolyticum)，产琥珀酸丝状杆菌长亚种(Fibrobactersuccinogenes)，解纤维真杆菌(EubacteriumCellulolyticum)，白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)，生黄瘤胃球菌(R.flavefaciens)，R.succinogenes，Achromobacterpiechaudii，Actinoplanesaurantiaca，环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)，巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)，短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，Caldibacilluscellulovorans，Cellulomonasbiazotea，Cm.cartae，Cm.cellasea，Cm.cellulans，Cm.fimi，Cm.flavigena，Cm.gelida，Cm.iranensis，Cm.persica，Cm.uda，Cellvibriofulvus，Cv.Gilvus，混合纤维弧菌(Cv.Mixtus)，Cv.vulgaris，Curtobacteriumfalcumfaciens，噬纤维菌(Cytophagasp.)，Flavobacteriumjohnsoniae，双孢小双孢菌(Microbisporabispora)，Micromonosporamelonosporea，AL-1粘球菌(Myxobactersp.AL-1)，萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，门多萨假单胞菌(Ps.mendocina)，Streptomycesalboguseolus，抗生素链霉菌(Sm.antibioticus)，金黄色链霉菌(Sm.aureofaciens)，解纤维素链霉菌(Sm.Cellulolyticus)，黄灰链霉菌(Sm.flavogriseus)，Sm.lividans，硝孢链霉菌(Sm.nitrosporeus)，产橄榄色链霉菌(Sm.olivochromogenes)，网链霉菌(Sm.reticuli)，娄彻链霉菌(Sm.rochei)，热普通链霉菌(Sm.thermovulgaris)，绿孢链霉菌(Sm.viridosporus)，拟粘球生孢噬纤维菌(Sporocytophagamyxcoccoides)，XY热放线菌(Thermoactinomycessp.XY)，白色喜热裂孢菌(Thermobifidaalba)，解纤维素喜热裂孢菌(Tb.cellulolytica)，褐色喜热裂孢菌(Tb.fusca)，弯曲高温单孢菌(Thermonosporacurvata)，黄单包杆菌(Xanthomonassp.)；真菌，如Anaeromycesmucronatus，黑曲霉(Aspergillusniger)，Caesomycescomunis，Cyllamycesaberensis，Hypocreasp.，Neocallimastixfrontalis，Orpinomycessp.，Phanerochaetechrysosporium，Piptoporuscinnabarinus，Piromycessp.，Piromycesequi，Piromycessp.E2，匍茎根霉菌(Rhizopusstolonifer)，Serpulalacrymans，Sporotrichumpulverulentum，Trichoderma(＝Hypocrea)harzianum，T.koningii，长枝木霉(T.longibrachiatum)，T.pseudokoninii，里氏木霉(T.reesei)，绿色木霉(T.viride)。
在又一个实施方式中，本发明的复合物包含至少三种酶成分，所述至少三种酶成分得自热解纤维梭菌的含有坞因子的成分，或者得自具有被融合到其中的坞因子的海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的成分。本发明的复合物还可以来自其它细菌的包含含有坞因子的酶成分或者具有被融合到其中的坞因子的酶成分。
在优选的实施方式中，所述酶成分包含如SEQIDNO:8中所示的CelK-d1，如SEQIDNO:10中所示的CelR-d1，如SEQIDNO:14中所示的CelT-d1，如SEQIDNO:16中所示的CelE-d1，如SEQIDNO:6中所示的CelS-d1，以及如SEQIDNO:4中所示的BglB-d1，或它们的衍生物，或来自其它细菌的具有超过50%，优选超过60%、超过70%，更优选超过80%，更优选超过90%且最优选超过97%的氨基酸序列同一性的相关基因。
在又一个实施方式中，本发明的复合物包含含有如SEQIDNO:24中所示的CBM-c1-c1-d3蛋白质，如SEQIDNO:22中所示的c3-c1-c1-d2蛋白质，如SEQIDNO:26中所示的c2-c1-c1蛋白质的主链支架以及含有如SEQIDNO:8中所示的CelK-d1，如SEQIDNO:10中所示的CelR-d1，如SEQIDNO:14中所示的CelT-d1，如SEQIDNO:16中所示的CelE-d1，如SEQIDNO:6中所示的CelS-d1和如SEQIDNO:4中所示的BglB-d1的酶成分。
本发明还提供了一种制备如在本文中所定义的复合物的的方法，该方法包括以下步骤：
a)重组生产如在本文中所定义的至少三种酶成分；
b)重组生产权利要求1-8中任一项所述的主链支架；
c)在体外混合a)和b)的纯化的、部分纯化的或未纯化的成分；和
d)使酶成分与主链支架随机地结合。
在又一个实施方式中，制备如在本文中所定义的复合物的方法包括使重组生产的主链支架或酶颗粒与载体颗粒结合的步骤。适合的颗粒包括如上所述的纳米颗粒，优选聚苯乙烯包覆的纳米颗粒，例如，聚苯乙烯包覆的铁磁性纳米颗粒，或者化学官能化的超顺磁性纳米颗粒，或其它小纳米颗粒，优选地，直径为10至2000nm，更优选30至50nm，优选颗粒表面上附加有羧基或氨基。
所述酶成分的重组生产可以通过本领域众所周知的基因克隆和修饰技术进行，例如，工程酶成分可被融合到坞因子、黏附因子和/或其它非催化组件中，非必需地随后用蛋白质工程改造所述成分以提高重组生产，例如，通过使分泌信号最优化，改变减少成功表达或分泌的蛋白质片段，或改变密码子选择。在进一步的步骤中，本发明的主链支架(“迷你支架蛋白”)由重组生产，非必需地融合黏附因子组件，并且通过混合酶成分和主链支架自发地组合以形成复合物。所述成分可为纯化的、部分纯化的或未纯化的，优选为部分纯化的或未纯化的。优选地，在酶-主链支架混合物中黏附因子组件与坞因子组件的摩尔比是1:1。所述至少三种酶成分以1:1至1:50、1:1.5至1:30、优选1:1.8至1:15的摩尔比在体外被混合在一起。
所述酶成分因此与所述主链支架随机地结合。如本文中所述的黏附因子-坞因子相互作用的坞因子组件和黏附因子组件是可互换的，即是说，黏附因子组件既可存在于主链支架中，又可以存在于酶成分中，并且坞因子组件反之亦然。
优选地，多纤维素酶体成分中的至少三种，例如，嗜热细菌热解纤维梭菌的成分CbhA、CelA、CelE、CelJ、CelK、CelR、CelS或CelT，或者热稳定的β-糖苷酶，例如，来自嗜热细菌那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的β-葡萄糖苷酶BglB，被组合在主链分子上，优选地，BglB、CbhA、CelE、CelJ或CelT的各部分的摩尔比为0.05至1.5，CelK和CelR的各部分的摩尔比为0.1至3.0，以及CelA和CelS的各部分的摩尔比为0.2至6.0。在另一个实施方式中，BglB、CbhA、CelE、CelJ或CelT的各部分的摩尔比为0.1至1.0，CelK和CelR的各部分的摩尔比为0.2至1.0，以及CelA和CelS的各部分的摩尔比为0.5至1.0。在最优选的实施方式中，BglB、CbhA、CelE、CelJ或CelT的各部分的摩尔比为0.06至1.6，CelK和CelR的各部分的摩尔比为0.1至1.8，以及CelA和CelS的各部分的摩尔比为0.3至2.0。
在又一个实施方式中，本发明提供了一种制备如在本文中上述所定义的复合物的方法，其中，步骤c)中主链支架的总量和酶成分的总量以1黏附因子组件与1酶成分的摩尔比被混合在一起，以及所述至少三种酶成分彼此以1:1至1:50、1:1.5至1:30，优选1:1.8至1:15、优选1:1至1:15的摩尔比在体外被混合在一起。
在又一个实施方式中，本发明提供了使用如在本文中所述的方法制成的复合物。
就“摩尔比”而言，其涉及主链支架与酶成分的比例，计算为1结合位点(优选在主链支架中包含的黏附因子组件)与1结合位点(优选在酶成分中包含的坞因子组件)的摩尔比。
在又一个实施方式中，本发明提供了一种酶水解多糖底物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使本发明的复合物与不溶性纤维素混合；和非必需地
b)分离降解产物。
使本发明的复合物与不溶性纤维素混合优选地在最适或接近最适pH和温度下的水环境中进行。所述最适或接近最适pH是6.5±0.5。所述最适温度是在25-65°C、优选30-65°C的范围内；最优选大约55°C。
在又一个实施方式中，本发明提供了本发明所述的复合物用于酶水解多糖底物的用途。
在本发明的优选实施方式中，如在本文中所述的多糖底物是结晶纤维素或者含有结晶纤维素的底物。
附图说明
图1显示选定的热解纤维梭菌不吸附培养物的菌落。在混浊的琼脂表面上，可见由水解了的纤维素的黑色(=清除)光圈围绕的菌落。标尺显示1cm和2cm标记。
图2显示重组支架蛋白构成物的大约3D结构(curtesyH.Gilbert)。热解纤维梭菌的CipA蛋白质的衍生物(首行：c1=黏附因子1等；CBM=碳水化合物结合组件)。
图3显示具有来自突变体SM1的天然可溶性多纤维素酶体成分(SM901)的复合物、具有迷你支架蛋白的复合物以及具有热解纤维梭菌的完整天然支架蛋白CipA的复合物的比活[mU/mg葡萄糖当量]。对照：来自热解纤维梭菌的天然多纤维素酶体。对0.5%微晶粉末纤维素(Avicel)的活性测定(T=60°C,pH6.0)。(Coh：黏附因子,CBM：碳水化合物结合组件)。
图4显示纳米颗粒-接头-支架蛋白-纤维素酶复合物(NLSC)。为了简单，只用2个黏附因子(而非9个)显示支架蛋白。纳米颗粒和各种分子未按照比例尺绘制。
图5显示各种复合物在使用纳米颗粒结合及不使用纳米颗粒结合的情况下的活性。SM901：没有支架蛋白的突变体多纤维素酶体成分。
图6比较游离酶(SM901)和与纳米颗粒结合的酶(NP+SM901)的pH稳定性。
图7比较游离酶(SM901)和与纳米颗粒结合的酶(NP+SM901)的温度稳定性。
图8显示由可溶性(CMC)和不溶性(结晶)纤维素(微晶粉末纤维素)作为底物的水解产物的薄层色谱图。显示了可溶性酶(SM901)、人造复合物和天然多纤维素酶体的比较。
图9显示重组多纤维素酶体成分与支架蛋白质的各种混合物的活性。使用结晶纤维素作为底物。
图10显示可溶性多纤维素酶体成分(SM901)、以复合物(与支架蛋白)形式的相同的酶、具有重组成分(SM901+CipA+内+外[NTC])的合成混合物、商购的里氏木霉(Trichodermareesei)酶制品以及来自热解纤维梭菌的天然多纤维素酶体的比活。结晶纤维素(0.5%w/v)作为底物。活性以葡萄糖当量按照μmol/min计算。
图11显示主链支架CBM-c1-c1-d3、c3-c1-c1-d2、c2-c1-c1以及酶成分CelK-d1、CelR-d1、CelT-d1、CelE-d1、CelS-d1和BglB-d1的核苷酸序列和氨基酸序列。
图12显示优选的纳米颗粒的示意图。
图13显示使用强圆盘式磁体因颗粒的超顺磁性从溶液中分离的颗粒。可以以93%以上的回收率容易地移除反应溶液。
实施例
将通过下列实施例进一步地解释本发明，实施例的目的纯粹是示例性地显示本发明，而不应当以任何方式构成对本发明的限制。
实施例显示了用与蛋白质载体(一种模仿支架蛋白CipA(多纤维素酶体整合蛋白质)的主链支架)结合的6种重组表达纤维素酶系统进行的水解纤维素降解。主链支架携带与形成酶成分的C末端的坞因子组件紧密地且特异地结合的黏附因子结合组件。这是一种体外装配的复合物，类似嗜热厌氧细菌热解纤维梭菌的多纤维素酶体。黏附因子和坞因子自发地彼此结合。这种复合物，在以正确的比例与正确的成分体外重建时，在结晶纤维素上表现出比从细菌中分离的天然多纤维素酶体高的活性。
实施例1：不形成多纤维素酶体的突变体的分离
从热解纤维梭菌的诱变处理培养物中分离突变体(图1)。随机选择在菌落周围的纤维素中形成清晰色圈的能力下降或丧失的六个菌落。热解纤维梭菌突变体之一，SM1，完全丧失了生产支架蛋白CipA或活性黏附因子的能力。在大麦β-葡聚糖、CMC(双对照)和微晶纤维素MN300上测试来自野生型的酶(具有多纤维素酶体)和来自突变体SM1的酶(没有多纤维素酶体；游离酶)。对于两个菌株，在大麦β-葡聚糖和CMC上的酶活性分别为约8.5和1.0Umg-1蛋白质(表1)。相反，在突变体SM1中，在结晶纤维素上的比活急剧下降，与野生型相比下降了高达15倍。
除了完全消失的CipA成分(支架蛋白CipA)以外，突变体产生的多纤维素酶体成分的数量与野生型相比大致相同。在突变体中超分子复合物完全消失。这说明突变体不能适当地形成多纤维素酶体。大约50种多纤维素酶体蛋白质成分因此以分散的、可溶性的、非复合蛋白质出现，所产生的蛋白质的数量和分布类似于在野生型中观察到的。
表1：突变体SM1和野生型的浓缩培养物上清液在大麦β-葡聚糖、CMC(二者均是可溶性的)和MN300纤维素(结晶)上的酶活性。
SM1(Umg-1蛋白质) Wt(Umg-1蛋白质)
β-葡聚糖 7.9±1.1 9.5±0.9
CMC 1.1±0.1 1.2±0.1
MN300(x100) 0.3±0.1 4.4±0.1
实施例2：多纤维素酶体的重建
A：酶成分的制备
选择突变体SM1和突变体上清液蛋白质(SM901)来重建人造多纤维素酶体。另外，克隆编码纤维素酶成分的基因并且表征在它们的生化参数(如pH和温度最适度)以及在不同底物上的活性。从以前的关于多纤维素酶体组成的数据11中选择五种最突出的具有纤维素酶活性的酶成分。另外，生化表征得自大量嗜热糖分解细菌的β-葡萄糖苷酶。来自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的β-葡萄糖苷酶BglB因其高热稳定性和在纤维糊精上的高活性而被选择。将该基因融合到热解纤维梭菌纤维素酶CelA的下游坞因子组件上。确定最佳表达条件。用CelK-d1、CelR-d1、CelT-d1、CelE-d1、CelS-d1和BglB-d1在此表示由此形成的包含含有坞因子组件的催化和非催化组件的酶。在SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16中显示CelK-d1、CelR-d1、CelT-d1、CelE-d1、CelS-d1和BglB-d1的氨基酸序列。
为了易于纯化，将其克隆上N末端His标签从而通过亲和色谱法容易纯化。本领域中的现有技术用于将扩增的读框中的DNA片段克隆到启动子-操纵基因序列和6xHis序列的限制酶切位点下游(例如，Quiagen的pQE载体)。
通过计算黏附因子和坞因子的数目使所述成分的摩尔化学计量保持平衡。
B：主链支架的制备
通过组合来自热解纤维梭菌的CipA基因的、来自热解纤维梭菌多纤维素酶体成分的以及来自约氏梭菌(C.josui)的黏附因子、坞因子和CBM序列构建下文中所述的迷你支架蛋白。针对大肠杆菌(E.coli)的密码子选择，对所述序列进行最优化，例如，将用于表达不足的tRNA基因argU、ileY和leuW(识别AGA/AGG、AUA和CUA密码子)的最稀有密码子用同义密码子置换。根据现有技术，合成由此得到的序列并将其在大肠杆菌(E.coli)质粒载体(如pQE)中表达。在一个实施方式中，使用来自cipA的黏附因子3-4(I型)和CBM3，也可以使用来自热解纤维梭菌的olpB的黏附因子c3(II型)和坞因子d3或者来自约氏梭菌(Clostridiumjosui)的多纤维素酶体成分的cipAc2和坞因子d2。用CBM-c1-c1-d3、c3-c1-c1-d2、c2-c1-c1在此表示在实施例中使用的主链支架。在SEQIDNO:22、SEQIDNO:24和SEQIDNO:26中显示了CBM-c1-c1-d3、c3-c1-c1-d2、c2-c1-c1的氨基酸序列。
C：坞因子-酶成分的表达、纯化和富集
酶成分最初由突变体SM1产生。然而，热解纤维梭菌因其厌氧生活方式中的能量限制只能生产有限数量的胞外蛋白质。即使菌株开发也不会致使胞外蛋白质数量显著增加。为了用人造纤维素酶混合物替代超过30种成分的天然酶混合物，由重组体宿主制备主要的多纤维素酶体成分。为了实验方便，使用大肠杆菌(E.coli)作为宿主。其它细菌也会很好地适用于低成本、高产率地生产重组蛋白质。任何用于给定蛋白质的具有高产率的工业生产者菌株都将是适合的。
从重组体宿主中分离酶成分，并用His标签亲和色谱法纯化，或者通过加热沉淀大肠杆菌蛋白质进行富集，因此重组蛋白质留在可溶相中。按照现有技术，通过将蛋白质溶液加热到65°C10min以及通过离心去除沉淀的大肠杆菌(E.coli)蛋白质来进行加热沉淀。也通过超滤(截断10.000道尔顿)成功地进行富集。
D：具有主链支架的酶成分的复合
然后将它们与由带有或不带有碳水化合物结合组件的各种黏附因子组成的重组主链迷你支架(例如CBM-c1-c1)结合。通过在钙存在下(在一个实施方式中20mMCaCl2)简单化学计量地加入酶成分混合物(在混合物中存在每个黏附因子组件一个具有坞因子的成分)。图2中描绘了重组迷你支架蛋白构成物的模型结构。复合作用的出现是通过使坞因子-酶成分与由各种黏附因子组成的迷你支架蛋白经由黏附因子-坞因子相互作用自发地结合。然后，在使用天然酶或者使用从重组体宿主中分离的酶的情况下，将它们用于测量复合作用的效果。
实施例3：人造多纤维素酶体复合物的活性
现将这种具有和不含CBM的复合物的混合物通过最优化的脂肪族接头分子结合在聚苯乙烯纳米颗粒表面上。图3中示意性地显示了这种结构。尽管由于纳米颗粒的密集覆盖引起空间位阻和酶成分的自由度的必然损失，在结晶纤维素水解时各种迷你支架蛋白复合物的结合亦会致使活性增加(图3,4)。另外，如果将蛋白质与颗粒结合，则酶的pH范围会更宽(图5)。这对纤维素酶的温度稳定性也适用(图6)。这两种结果对于技术应用来说都是重要优点。
为了测试这种方法的可行性，将一部分SM901成分混合物用一种或多种重组纤维素酶替代。尽管混合物中的SM901成分减少了，但是结果显示在加入一种重组生产成分时，复合物在结晶纤维素上的活性略有增加。在加入重组酶的混合物时，所述活性会显著地增加(图9)。在某些混合物中，合成混合物的活性比天然多纤维素酶体的活性高。通过完全替代和适当地平衡的化学计量，该合成复合物显示出甚至更高的活性。
游离酶(SM901)、人造复合物和天然多纤维素酶体的产物(葡萄糖和纤维糊精)图案对于可溶性以及不溶性纤维素完全相同(图11)。在不溶性纤维素作为底物的情况下，主要产物是纤维二糖，同时具有一些葡萄糖作为次要产物。纤维二糖必须通过向复合物中加入β-葡萄糖苷酶而进一步降解成葡萄糖。来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的β-葡萄糖苷酶基因，遗传上地融合到坞因子组件，被成功地使用并且将还原糖的生产量提高了大约2倍。
多纤维素酶体的重建因此是可行的。因此，可以第一次证明的是，成分的顺序似乎是随机地沿着支架蛋白，并且体外重建的多纤维素酶体的活性至少等同于天然多纤维素酶体的活性。天然多纤维素酶体不能以工业数量进行生产。
结果
结果清楚地显示，不同的黏附因子平等地结合成分并且在包含不同坞因子组件的多纤维素酶体成分之间没有差异。与黏附因子的结合是随机的。黏附因子和坞因子之间的装配是快速且自发的。一旦结合，所述成分即被牢固地固定到支架蛋白上。通过利用黏附因子-坞因子相互作用连接各个主链支架蛋白质而在主链支架中增加黏附因子的数目确实提高了在结晶纤维素上的活性(图6)。进一步地，图6显示，将某些类型的CBM加入到复合物中提高了活性(图6)。此外，形成重建的多纤维素酶体的“完整”支架蛋白具有最高活性，比天然多纤维素酶体的活性高(甚至在系统最优化之前)。
实施例4：非必需地与纳米颗粒结合
选择具有超顺磁性特征的铁磁核和聚苯乙烯包覆层的平均直径为0.110±0.007μm的纳米颗粒，以化学方法对表面进行官能化处理以具有COOH-残基。将异双官能团接头分子化学偶联到结合了所选主链支架的表面上；在所述支架的黏附因子上，可以通过具有被附加在酶成分上的坞因子的蛋白质-蛋白质相互作用(非共价黏附因子-坞因子相互作用)加载酶。在图12中显示了优选的纳米颗粒的示意图。
为了将接头分子结合到纳米颗粒的表面上，使官能团(游离COOH-)活化。使用水溶性化合物N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，水溶性碳化二亚胺1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)形成具有羧酸根基团的活性酯基。EDC与羧酸根基团反应形成活性酯(O-酰基异脲（O-acylisourea）)离去基团。Sulfo-NHS酯是迅速地与靶分子上的胺反应的亲水性活性基团18。然而，在能够攻击酯的羰基的胺亲核物质存在下，sulfo-NHS基团迅速离去，与胺形成稳定的酰胺键。向EDC加入sulfo-NHS的优点在于提高活性中间体的稳定性，该活性中间体最终与攻击胺发生反应。EDC与羧酸根基团的反应产物在水溶液中在数秒内水解。由sulfo-NHS上的羟基与EDC活性酯复合物反应形成sulfo-NHS酯中间体使活化的羧酸根的半速率(half-rate)延至数小时19。对于在纳米颗粒表面上结合分子的结构参见图4。
A.活化
通过使用强NdFeB圆盘式磁体(1.41-1.45特斯拉)分离，在玻璃瓶中将20mg的羧基修饰的纳米颗粒于2m1活化缓冲液(50mMMES,0.5MNaCl,pH6.0)中洗涤三次。通过分别加入新鲜制备的EDC溶液和sulfo-NHS溶液至终浓度为2mM和5mM来活化颗粒的修饰表面。在室温下使混合物反应15分钟。
B.与接头偶联
通过从液体中磁分离，将颗粒用2ml反应缓冲液(0.lM磷酸钠,0.5MNaCl,pH7.2)洗涤两次。在氮保护气氛下将5mg的O-(2-氨乙基)-O-(2-羧乙基)-聚乙二醇3000盐酸盐(NH2-PEG-COOH)溶于100μl反应缓冲液中并且将其加入到活化颗粒中。在RT下在3小时内发生活化颗粒与基于PEG的接头的氨基之间的共价连接。将缓冲液改为2m1活化缓冲液，并且使用如上所述的EDC和sulfo-NHS活化在共价结合的接头的末端的羧酸根基团。在用2ml反应缓冲液两次洗涤步骤之后，加入10mg的Nα,Nα-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(NTA)。在RT下在3小时内发生NTA与接头的活化羧酸根基团的偶联。将颗粒用2ml蒸馏水洗涤三次。加入1ml的1MNiSO4。通过NTA的羧酸根基团复合游离Ni2+离子并且形成NTA-Ni。5分钟后，将颗粒用2ml蒸馏水洗涤两次，并且额外地，用2ml的50mMMOPS,0.1MNaCl,5mMCaCl2,pH6.0洗涤两次。
C.His标记的蛋白质载体的结合
通过在2ml的50mMMOPS,0.1MNaCl,5mMCaCl2,pH6.0中孵育上述颗粒与1至1.5mg蛋白质使主链支架蛋白质与修饰的纳米颗粒结合。
将使用和不使用碳水化合物结合组件(CBM)的具有不同数目的黏附因子的主链支架(CBM-c1-c1和c1-c1)固定在表面修饰的纳米颗粒上。在交联之前和交联之后通过分光光度测量蛋白质含量的光吸收(590nm,Bradford测定法)来确定蛋白质与纳米颗粒的偶联效率。从反应溶液中磁分离负载蛋白质的纳米颗粒。通过从最初应用蛋白质的量减去反应溶液中剩余蛋白质的量来计算偶联效率。
通过3.5-二硝基水杨酸方法20，在反应的线性范围内至少重复三次定量还原糖，假定1个单位的酶每分钟释放1μmol的葡萄糖同等物。
结果
表面结合(固定)已常常被显示为使酶及其活性稳定。使用纤维素酶的实验已经证明，在纳米颗粒表面上直接固定水解酶(来自热解纤维梭菌的纤维素酶)减少了其比活。这表明，直接共价偶联到表面上会影响酶的活性域或结构域。因此，选择在多纤维素酶体主链支架上定向特异偶联以保持酶活性。
使用2mmolEDC,5mmolSulfo-NHS获得了所测试的全部反应的偶联的最好结果。可以实现80μg/mg纳米颗粒的偶联效率。这相当于计算的平均数为每个颗粒~1300个主链支架分子。在羧基修饰的颗粒之间没有观察到交联。此外，由于游离羧基和所得到的亲水性表面，COOH-珠非常充分地重悬浮。图13中显示了分离。
为了磁铁矿纳米颗粒的再生，在室温下将颗粒用EDTA(10mM)洗涤三次以除去复合的Ni2+离子并且在相同溶液中悬浮过夜。在用去离子水三次洗涤步骤之后，使颗粒重新加载Ni2+和6xHis标记的主链支架蛋白质(计算的等摩尔比的主链支架蛋白质与酶成分)。1mg的新鲜的COOH修饰的纳米颗粒可以加载~80μg蛋白质主链支架蛋白质。在该实验中，相同数量的再循环纳米颗粒能够结合~50μg(62.5%回收)的支架蛋白质，两次再循环的纳米颗粒能够固定~25μg(31.2%回收)的蛋白质。
在主链支架-纳米颗粒化合物上通过黏附因子-坞因子识别固定纤维素酶。使颗粒负载SM901突变体酶，并且在如在别处所述的使用二硝基水杨酸试剂产生还原糖的过程中测定它们对可溶性非结晶纤维素和不溶性纤维素的比活。降解效率取决于底物的类型。对于水解来说，最易受影响的是大麦β-葡聚糖、可溶性β-1,3-1,4-葡聚糖。SM901突变体酶的β-葡聚糖酶对大麦β-葡聚糖的比活是大约8U/mg蛋白质。对羧甲基纤维素的降解的比活是大约1.1U/mg蛋白质。非结晶纤维素(磷酸溶胀纤维素)是较易受降解影响的，所产生的比活是大约2.8U/mg蛋白质。与未与纳米颗粒结合的较小复合物相比显示，对于全部测试底物来说，通过多纤维素酶体型主链支架固定水解酶对降解速率没有负面作用。
在结晶纤维素(MN300或微晶粉末纤维素(Avicel))上，游离的突变体酶分别显示了30和12mU/mg的比活。具有9个黏附因子和碳水化合物结合组件的纯化了的天然多纤维素酶体表现出423mU/mg的比活(使用MN300作为底物)以及198mU/mg的比活(使用微晶粉末纤维素(Avicel)作为底物)。SM901突变体酶与含有数目增加的黏附因子的主链支架的复合作用使水解活性分别被提高到63和28mU/mg的比活。相对于游离酶，活性的增强是2.1倍和2.3倍。如果使用具有三个黏附因子和第3家族碳水化合物结合组件的复合物，则与非结合的水解酶相比，降解速率将增加4.9倍和3.7倍(图5)。
为了比较，使用未使用CBM的主链支架蛋白质或包含CBM的主链支架蛋白质(c1-c1与CBM-c1-c1)。如果在主链支架中存在CBM，则在使用MN300作为底物的情况下比活从62mU/mg增加至102mU/mg，而在使用微晶粉末纤维素(Avicel)作为底物的情况下比活从44mU/mg增加至108mg/mU。
在纳米颗粒结合的迷你支架蛋白上固定水解酶对可溶性底物和不溶性底物的降解速率没有负面作用。然而，pH稳定性和温度稳定性被显著提高(分别见图6和7)。
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Claims (13)

1.一种复合物，其不与酵母细胞结合，所述复合物包含：
a)线性主链支架，所述线性主链支架由一种或多种蛋白质组成，其中，所述一种或多种蛋白质通过黏附因子-坞因子相互作用被连接在一起，所述线性主链支架包含碳水化合物结合组件(CBM)和至少四个用于坞因子的黏附因子结合位点，其中，所述黏附因子结合位点中的至少两个具有本质上相同的结合特异性，以及由此连接相互作用的结合特异性与酶的结合特异性不同；和
b)包含与所述四个黏附因子结合位点的每一个结合的坞因子的酶成分，其中，所述酶成分中的至少三种是不同的酶成分，
由此，所述黏附因子、坞因子和CBM序列选自热解纤维梭菌cipA基因的黏附因子、坞因子和CBM序列以及来自约氏梭菌的黏附因子、坞因子和CBM序列。
2.权利要求1所述的复合物，其中，所述线性主链支架得自来自形成分解纤维素的多纤维素酶体的微生物的非催化支架蛋白或其遗传修饰的衍生物。
3.权利要求1所述的复合物，其中，所述线性主链支架得自来自热解纤维梭菌的非催化支架蛋白CipA或其遗传修饰的衍生物。
4.权利要求1所述的复合物，其中，所述碳水化合物结合组件是被整合到或附加到线性主链支架上的来自热解纤维梭菌cipA基因的碳水化合物结合组件(CBM3)。
5.权利要求1所述的复合物，其中，所述酶成分包含坞因子组件和酶的催化组件。
6.权利要求1所述的复合物，其中，所述酶成分包含如SEQIDNO:8中所示的CelK-d1，如SEQIDNO:10中所示的CelR-d1，如SEQIDNO:14中所示的CelT-d1，如SEQIDNO:16中所示的CelE-d1，如SEQIDNO:6中所示的CelS-d1，以及如SEQIDNO:4中所示的BglB-d1，或它们的衍生物，所述衍生物在其坞因子组件中具有超过50％的氨基酸序列同一性。
7.一种制备根据权利要求1至6中任一项所述的复合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)由重组体生产权利要求1和5-6任一项中所述的酶成分；
b)由重组体生产权利要求1-3任一项中所述的主链支架；
c)在体外混合a)和b)的纯化的、部分纯化的或未纯化的成分；和
d)使所述酶成分与主链支架随机地结合。
8.权利要求7所述的方法，其中，步骤c)中主链支架的总量和酶成分的总量以1黏附因子组件与1酶成分的摩尔比被混合在一起，以及所述至少三种酶成分彼此以1:1至1:15的摩尔比被混合在一起。
9.一种使用权利要求7或8所述的方法制成的复合物。
10.一种酶水解多糖底物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使权利要求1至5中任一项所述的复合物与不溶性纤维素混合；和非必需地
b)分离降解产物。
11.权利要求10所述的方法，其中，所述多糖底物是结晶纤维素或者含有结晶纤维素的底物。
12.权利要求1至6中任一项所述的复合物用于酶水解多糖底物的用途。
13.权利要求12所述的用途，其中，所述多糖底物是结晶纤维素或者含有结晶纤维素的底物。
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