CN101041841A - 一种利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法，该方法首先用反向悬浮交联法制备的多核结构磁性壳聚糖微球作为纤维素酶的固定化载体，将纤维素酶固定在磁性壳聚糖微球上成为固定化酶，然后用固定化酶水解壳聚糖，根据需要控制水解反应时间即可得到所需壳低聚糖或壳寡糖。这种制备壳低聚糖或壳寡糖的方法利用固定化酶技术，提高了酶对温度和pH的稳定性，实现了酶的重复使用，并且产物中几乎不含糖与酶蛋白的复合物，不会引起热原反应，特别适用于食品、医药等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法，属再生资源化学生物学领域。
背景技术
壳低聚糖和壳寡糖由N-乙酰-D-氨基葡萄糖或D-氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接起来的杂聚低聚糖，是甲壳素和壳聚糖经水解生成的一类低聚物。近年来，随着研究的深入，特别是分子量低于一万的低聚糖，更表现出其独特的生理活性和物化性质。目前，制备壳低聚糖的方法多为酶解法，壳聚糖和纤维素有相似的化学结构，因此纤维素酶常作为非专一性壳聚糖水解酶来降解壳聚糖。但由于酶是由蛋白质组成，其高级结构对所处的环境十分敏感，稳定性差，反应条件苛刻，且不能重复使用。另外水解产物中含有一定的糖与酶蛋白的复合物，可引起热原反应，不宜将其应用于食品、医药等领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法，该方法将纤维素酶固定在磁性壳聚糖微球上，提高了酶对温度和pH的稳定性，避免了产物与酶蛋白复合物的产生，实现了酶的重复使用。
实现本发明目的的技术方案为：首先用反向悬浮交联法制备粒径20～30um的多核结构磁性壳聚糖微球作为纤维素酶的固定化载体，将纤维素酶固定在磁性壳聚糖微球上成为固定化酶，然后用固定化酶水解壳聚糖，根据需要控制水解反应时间即可得到所需壳低聚糖或壳寡糖。
(1)其具体步骤如下：将0.1-1.0mol/L的FeSO4·7H2O与0.1-1.0mol/L的FeCl3·6H2O以摩尔比1∶3-1∶1的比例混合，加入3-10mol/L的NaOH，剧烈搅拌至得到油状的磁流体悬浮液，以悬浮液状态保存；
(2)将壳聚糖溶于体积百分比浓度为1-5％的乙酸溶液，配成重量体积比为3-5％的壳聚糖溶液，加入与其体积比为1∶5-20的磁流体悬浮液，搅拌均匀，然后加入到与壳聚糖溶液同体积的油相分散介质液体石蜡，滴入乳化剂span80，高速搅拌使体系呈乳液状，继续搅拌至形成均匀的油包水的分散体系，再加入体积为分散体系1-4％的戊二醛作为交联剂，在35-45℃下反应充分后倒入5-10倍体积的NaOH/乙醇混合液中，维持搅拌一段时间，弃去油层和水层，洗去颗粒表面的吸附物，得到黑色的多核结构磁性壳聚糖微球，所用NaOH/乙醇混合液中的NaOH和乙醇的体积比为1∶2-2∶1；
(3)将与固定化载体重量比为0.1-0.5∶1的纤维素酶溶于0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在此酶溶液中加入磁性壳聚糖微球，室温下充分振荡，过滤除去酶溶液，再用缓冲溶液洗至无蛋白质检出，获得固定在磁性壳聚糖微球上的纤维素酶，即固定化酶；
(4)将固定化酶加入到pH5.0-6.0的壳聚糖溶液中，加入的酶蛋白为壳聚糖质量的5-10％，在50-60℃反应至所需时间，过滤收集水解产物，得到壳低聚糖或壳寡糖。
而且，将水解产物真空浓缩后用1-5mol/L氢氧化钠调至pH 8-9，冷冻干燥，可获得分子量在1.8万～2100的壳低聚糖或壳寡糖。
而且，将滤出的固定化酶用0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤，除去固定化酶上吸附的水解产物，固定化酶即能重复使用。
磁性高分子微球是指内部含有金属或金属氧化物而具有磁响应性的高分子微球，磁性材料已经广泛应用于酶与细胞的固定化及其他生物技术领域，磁性材料作为固定化酶的载体，除具有一般载体的优点外，还有更易分离，操作成本低等特点，而壳聚糖来源丰富，具有机械性能较好、化学性质较为稳定、与蛋白质亲和力高，且无毒、无抗原性等优点，是固定化酶的优良载体。本发明用反向悬浮交联法制备了粒径20～30um的多核结构磁性壳聚糖微球，用于纤维素酶的固定化，固定化的纤维素酶在重复使用过程中酶活损失较小，实验显示连续水解壳聚糖60小时仍保持其最初活力的78.6％。使用固定化酶制备壳低聚糖或壳寡糖，产物中几乎不含糖与酶蛋白的复合物，不会引起热原反应，特别适用于食品、医药等领域。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明提供的利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法作详细说明。
实施例1：首先将0.5mol/L的FeSO4·7H2O与0.5mol/L的FeCl3·6H2O以摩尔比1∶2的比例混合，加入5mol/L的NaOH，剧烈搅拌至得到油状的磁流体悬浮液。将壳聚糖溶于体积百分比浓度为1-5％的乙酸溶液，配成重量体积比为3％的壳聚糖溶液，在50mL该壳聚糖溶液中，加入3mL该磁流体，搅拌均匀，加入50mL液体石蜡，滴入乳化剂span80，高速搅拌使体系呈乳液状，加入体积为体系体积1％的戊二醛作为交联剂，将在35-45℃下反应充分后的乳液倒入其5倍体积的NaOH/乙醇(1∶1)混合液中，维持搅拌一段时间，弃去油层和水层，洗去颗粒表面的吸附物，得到粒径20～30um、粒度较均匀的黑色磁性壳聚糖微球。将固定化载体黑色磁性壳聚糖微球和与其重量比为0.1的纤维素酶溶于0.2mol/L，pH为5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，室温下充分振荡，过滤除去酶溶液，再用缓冲溶液洗至无蛋白质检出，获得固定在磁性壳聚糖微球上的纤维素酶。将固定化酶加入到pH5.6的1％壳聚糖溶液中，加入的酶蛋白为壳聚糖质量的5％，在60℃反应1h，过滤收集水解产物，真空浓缩后用10％氢氧化钠调pH 8-9，冷冻干燥，可获得分子量1.8万的壳低聚糖。将滤出的固定化酶用0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤，除去固定化酶上吸附的水解产物，固定化酶即能重复使用。
实施例2：首先将0.25mol/L的FeSO4·7H2O与0.25mol/L的FeCl3·6H2O以摩尔比1∶2的比例混合，加入5mol/L的NaOH，剧烈搅拌至得到油状的磁流体悬浮液。将壳聚糖溶于体积百分比浓度为1-5％的乙酸溶液，配成重量体积比为4％的壳聚糖溶液，在50mL该壳聚糖溶液中，加入10mL磁流体，搅拌均匀，加入50mL液体石蜡，滴入乳化剂span80，高速搅拌使体系呈乳液状，加入体积比为3％戊二醛作为交联剂，在35-45℃下反应充分后的乳液倒入5倍体积的NaOH/乙醇(1∶1)混合液中，维持搅拌一段时间，弃去油层和水层，洗去颗粒表面的吸附物，得到粒度较均匀的黑色磁性壳聚糖微球。将与固定化载体重量比为0.2的纤维素酶溶于0.2mol/L，pH为5.6的HAc-NaAc缓冲溶液，室温下振荡8h，过滤除去酶溶液，再用缓冲溶液洗至无蛋白质检出，获得固定在磁性壳聚糖微球上的纤维素酶。将固定化酶加入到pH5.6的1％壳聚糖溶液中，加入的酶蛋白为壳聚糖质量的5％，在60℃反应2h，过滤收集水解产物，真空浓缩后用10％氢氧化钠调pH 8-9，冷冻干燥，可获得分子量8300的壳低聚糖。将滤出的固定化酶用0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤，除去固定化酶上吸附的水解产物，固定化酶即能重复使用。
实施例3：首先将1mol/L的FeSO4·7H2O与1mol/L的FeCl3·6H2O以摩尔比1∶2的比例混合，加入5mol/L的NaOH，剧烈搅拌30min，得到油状的磁流体悬浮液。50mL 4％(w/v)的壳聚糖溶液，混入3mL磁流体，搅拌均匀，加入50mL液体石蜡，滴入乳化剂span80，高速搅拌使体系呈乳液状，加入体积比4％戊二醛作为交联剂，在35-45℃下反应充分后的乳液倒入10倍体积的NaOH/乙醇(1∶1)混合液中，维持搅拌一段时间，弃去油层和水层，洗去颗粒表面的吸附物，得到粒度较均匀的黑色磁性壳聚糖微球。将与固定化载体重量比为0.3的纤维素酶溶于0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的HAc-NaAc缓冲溶液，室温下充分振荡，过滤除去酶溶液，再用缓冲溶液洗至无蛋白质检出，获得固定在磁性壳聚糖微球上的纤维素酶。将固定化酶加入到pH5.6的1％壳聚糖溶液中，加入的酶蛋白为壳聚糖质量的8％，在55℃反应4h，过滤收集水解产物，真空浓缩后用5-10％氢氧化钠调pH 8-9，冷冻干燥，可获得分子量3500的壳低聚糖。将滤出的固定化酶用0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤，除去固定化酶上吸附的水解产物，固定化酶即能重复使用。
实施例4：首先将0.5mol/L的FeSO4·7H2O与0.5mol/L的FeCl3·6H2O以摩尔比1∶2的比例混合，加入5mol/L的NaOH，剧烈搅拌10min，得到油状的磁流体悬浮液。50mL 5％(w/v)的壳聚糖溶液，混入10mL磁流体，搅拌均匀，加入50mL液体石蜡，滴入乳化剂span80，高速搅拌使体系呈乳液状，加入体积比为5％戊二醛作为交联剂，在40℃下反应充分后的乳液倒入10倍体积的NaOH/乙醇(1∶1)混合液中，维持搅拌一段时间，弃去油层和水层，反复洗涤，得到粒度较均匀的黑色磁性壳聚糖微球。将与固定化载体重量比为0.5的纤维素酶溶于0.2mol/L，pH为5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，室温下振荡12h，过滤除去酶溶液，再用缓冲溶液洗至无蛋白质检出，获得固定在磁性壳聚糖微球上的纤维素酶。将固定化酶加入到pH5.6的1％壳聚糖溶液中，加入的酶为壳聚糖质量的10％，在55℃反应6h，过滤收集水解产物，真空浓缩后用10％氢氧化钠调pH 8-9，冷冻干燥，可获得分子量2100的壳寡糖。将滤出的固定化酶用0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤，除去固定化酶上吸附的水解产物，固定化酶即能重复使用。
Claims (4)
1.一种利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法，其特征在于：首先用反向悬浮交联法制备粒径20～30um的多核结构磁性壳聚糖微球作为纤维素酶的固定化载体，将纤维素酶固定在磁性壳聚糖微球上成为固定化酶，然后用固定化酶水解壳聚糖，根据需要控制水解反应时间即可得到所需壳低聚糖或壳寡糖，所采用的具体步骤如下：
(1)将0.1-1.0mol/L的FeSO4·7H2O与0.1-1.0mol/L的FeCl3·6H2O以摩尔比1∶3-1∶1的比例混合，加入3-10mol/L的NaOH，剧烈搅拌至得到油状的磁流体悬浮液，以悬浮液状态保存；
(2)将壳聚糖溶于体积百分比浓度为1-5％的乙酸溶液，配成重量体积比为3-5％的壳聚糖溶液，加入与其体积比为1∶5-20的磁流体悬浮液，搅拌均匀，然后加入到与壳聚糖溶液同体积的油相分散介质液体石蜡，滴入乳化剂span80，高速搅拌使体系呈乳液状，继续搅拌至形成均匀的油包水的分散体系，再加入体积为分散体系1-4％的戊二醛作为交联剂，在35-45℃下反应充分后倒入5-10倍体积的NaOH/乙醇混合液中，维持搅拌一段时间，弃去油层和水层，洗去颗粒表面的吸附物，得到用作固定化载体的黑色多核结构磁性壳聚糖微球，所用NaOH/乙醇混合液中的NaOH和乙醇的体积比为1∶2-2∶1；
(3)将与固定化载体重量比为0.1-0.5∶1的纤维素酶溶于0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在此酶溶液中加入磁性壳聚糖微球，室温下充分振荡，过滤除去酶溶液，再用缓冲溶液洗至无蛋白质检出，获得固定在磁性壳聚糖微球上的纤维素酶，即固定化酶；
(4)将固定化酶加入到pH5.0-6.0的壳聚糖溶液中，加入的酶蛋白为壳聚糖质量的5-10％，在50-60℃反应至所需时间，过滤收集水解产物，得到壳低聚糖或壳寡糖。
2.根据权利要求1所述的利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法，其特征在于：将水解产物真空浓缩后用1-5mol/L氢氧化钠调至pH 8-9，冷冻干燥，可获得分子量在1.8万～2100的壳低聚糖或壳寡糖。
3.根据权利要求1所述的利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法，其特征在于：制得的黑色多核结构磁性壳聚糖微球的粒径在20～30um之间。
4.根据权利要求1所述的利用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法，其特征在于：将滤出的固定化酶用0.05-0.4mol/L，pH为4.6-5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤，除去固定化酶上吸附的水解产物，固定化酶即能重复使用。
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