CN103018371A - 黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，本发明通过液相色谱的分离技术，借助一测多评方法，计算校正因子，对黄蜀葵花中的7个黄酮成分含量进行计算。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材及其制剂的质量控制方法，具体涉及黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法。
背景技术
黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵的干燥花，味甘、辛，性凉，具有利尿通淋、活血止血、消肿解毒的功效。
“一测多评”是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式，它利用有效化学成分间内在的函数和比例关系，只测定1个成分(对照品可得到者)来实现对多个成分(对照品没有或难以得到者)的同步监控，克服对照品短缺这一问题，即只测定某个代表性成分(易得、廉价、有效)，同时可计算出其他待测有效成分的含量。
目前2010版《中国药典》仅以指标性成分金丝桃苷的含量来控制黄蜀葵花药材质量，但异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷等黄酮类成分亦是其主要活性成分且含量较高，因此仅通过单一指标性成分控制药材及其制剂质量有失偏颇，而目前因槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷等对照品难以获得、分析成本过高等原因，限制了外标法进行多指标成分质量控制的实际应用。因此为了控制好黄蜀葵花药材及其提取物及其制剂的临床安全性，维护患者的利益，很有必要在现有技术的基础之上研究设计出能准确检测多种有效成分的检测方法。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，采用高效液相色谱分离，通过一测多评技术，以金丝桃苷为内标物，建立其与芦丁、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素的相对校正因子，并计算多种黄酮含量的方法。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其包括以下步骤：
(1)样品溶液的制备
精密称取黄蜀葵花药材、黄蜀葵花药材提取物或黄蜀葵花制剂，加入浓度为50%~100%的甲醇，超声或加热回流提取，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，得样品溶液；
(2)对照品溶液的制备
分别精密称定芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷和槲皮素7种对照品适量，置于量瓶中，用浓度为50%～100%甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液；然后分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，于4℃保存，备用；
(3)校正因子fkm的计算
取步骤(2)制备得到的混合对照品溶液，分别进样10，5，2，1，0.5μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选取金丝桃苷为内标化合物，分别计算金丝桃苷对芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子fkm；
(4)样品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的样品溶液注入高效液相色谱进行测定，获得色谱图，按公式计算芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的质量；
以上所述的公式为：Wm=(Wk×Am)/(fkm×Ak)，式中Ak为金丝桃苷内标物峰面积，Wk为金丝桃苷内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子。
作为优选方案，以上所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，步骤(3)和步骤(4)所述的高效液相色谱测定的条件为：
色谱柱：反相C18色谱柱；
流动相：浓度0.05%~0.5%甲酸水--乙腈、浓度0.05%~0.5%磷酸水--乙腈或浓度0.05%~2%冰醋酸水--乙腈；
流速：0.4～1.0mL/min；
检测波长：365nm±10nm；
洗脱程序：梯度洗脱。
作为更优选方案，以上所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，所述的检测流动相浓度0.05%~0.5%甲酸水(A)--乙腈(B)的梯度洗脱程序为：
| 时间/分钟 | 0 | 2 | 5 | 6 | 9 | 11 | 12 | 13 |
| 浓度0.05%~0.5%甲酸水（%） | 88 | 85 | 84 | 83 | 70 | 20 | 5 | 88 |
| 乙腈（%） | 12 | 15 | 16 | 17 | 30 | 80 | 95 | 12 |
本发明根据黄蜀葵花药材或提取物中各成分的理化性质，由于黄酮类化合物极性接近，在色谱柱上难以分离，本发明通过大量实验筛选流动相的组成，实验结果表明，采用本发明优选的梯度洗脱程序能很好的将7个黄酮类化合物及其它杂质化合物分离。
作为优选方案，以上所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，，当检测黄蜀葵花药材或其提取物的活性成分时，流动相浓度0.05%~2%冰醋酸水(A)--乙腈(B)的梯度洗脱程序为：
| 时间/分钟 | 0 | 18 | 29 | 42 | 45 | 50 |
| 浓度0.05%~2%冰醋酸水/百分比 | 84 | 84 | 73 | 50 | 84 | 84 |
| 乙腈/百分比 | 16 | 16 | 27 | 50 | 16 | 16 |
本发明根据黄蜀葵花药材提取物（如水或者乙醇提取物）中各成分的理化性质，由于黄酮类化合物极性接近，在色谱柱上难以分离，本发明通过大量实验筛选流动相的组成和洗脱顺序，实验结果表明，采用本发明优选的梯度洗脱程序能很好的将7个黄酮类化合物及其它杂质化合物分离。
作为优选方案，以上所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，检测流动相为浓度0.05%~2%磷酸水--乙腈的梯度洗脱程序为：
| 时间/分钟 | 0 | 15 | 24 | 38 | 45 | 60 |
| 浓度0.05%~2%磷酸水/百分比 | 89 | 84 | 80 | 60 | 60 | 85 |
| 乙腈/百分比 | 11 | 16 | 20 | 40 | 40 | 15 |
作为更优选方案，所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，步骤(1)样品溶液的制备方法为：精密称取黄蜀葵花药材、黄蜀葵花药材提取物或黄蜀葵花制剂，加入6~10倍浓度为50%~100%的甲醇，超声或加热回流提取2~3次，每次1~2小时，合并提取液，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，得样品溶液。
本发明采用一测多评方法，即通过测定一个成分，实现对多个成分定量的方法。依据一定的线性范围内成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比，即：W=f×A。以黄蜀葵花中某一典型组分(（如金丝桃苷)为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，通过校正因子计算其他组分的含量。
如黄蜀葵花中含有i个组分，则存在
Wi/Ai=fi(i=1,2,…,k,…,m)
式中Ai为组分i的峰面积；Wi为i组分的量。
选取其中金丝桃苷k为内标，建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子，有：
相对校正因子fkm=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)
由此可导出定量计算公式：
Wm=(Wk×Am)/(fkm×Ak)
式中Ak为内标物峰面积，Wk为内标物量；Am为组分m的峰面积，Wm为组分m的量，fkm为相对校正因子。
1、本发明针对黄蜀葵花成分，通过全波长扫描和3D等高线观察，确定黄酮类有效成分在365nm处有较大的吸收，灵敏度高，因此本发明采用365nm作为检测波长，可以准确灵敏的检测到各有效化合物。
2、黄蜀葵花黄酮类化合物的羟基质子易电离成离子状态，导致分离和洗脱效果差，本发明对流动相的组成进行了大量筛选，确定采用优选的酸性洗脱液，可以保证在色谱柱上达到很好的分离效果，不会出现峰重叠或拖尾现象，而且能保证在色谱柱上有很好的分离度。
3、同时本发明对色谱柱的柱温进行了筛选，考察了色谱柱在20℃、25℃、28℃、30℃和35℃条件下化合物的分离效果，实验结果表明，色谱柱在30℃条件下分离效果最好，分离重复性和稳定性最好。因此本发明采用色谱柱的柱温为30℃。
有益效果：本发明提供的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法和现有技术相比具有以下优点：
本发明根据黄蜀葵花中活性成分和杂质成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱等分析条件，经多次实验验证表明。
本发明采用一测多评技术，以金丝桃苷为内标物，建立其与芦丁、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素的相对校正因子，并计算多种黄酮含量的方法。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。
附图说明
图1为混合对照品（A）和样品（B）的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
（1）样品溶液的制备
精密称取黄蜀葵花药材0.1g，加浓度为70%甲醇20ml，超声提取30min，补足称重，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，1μL进样。
（2）对照品溶液的制备
分别精密称定芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素对照品各适量置量瓶中，以70%甲醇配成浓度分别为10μg/mL、235μg/mL，110μg/mL、250μg/mL、50μg/mL、101μg/mL、16μg/mL的对照品溶液，分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，于4℃保存备用。
（3）液相色谱图的获取
取步骤（1）样品溶液和步骤（2）制备得到的混合对照品进行高效液相色谱检测，获得色谱图（如图1所示），所用高效液相色谱参数设置如下：
仪器：超高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱；
流动相：浓度0.05%甲酸水(A)--乙腈(B)；
流速：0.4mL/min；
进样量：1μL；
检测器：二极管阵列检测器(PDA)，扫描范围190-400nm；
检测波长：365nm；
流动相的梯度洗脱程序：如表1所示：
表1梯度洗脱程序表
| 时间（min） | 0 | 2 | 5 | 6 | 9 | 11 | 12 | 13 |
| 0.05%甲酸水（%） | 88 | 85 | 84 | 83 | 70 | 20 | 5 | 88 |
| 乙腈（%） | 12 | 15 | 16 | 17 | 30 | 80 | 95 | 12 |
(4)校正因子fkm的计算
取步骤(2)制备得到的混合对照品溶液，进样10，5，2，1，0.5μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选取金丝桃苷为内标化合物，分别计算金丝桃苷对芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子fkm的平均值分别为0.829，1.311，0.492，0.989，1.605，1.513；
(5)样品中黄酮活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的样品溶液注入高效液相色谱进行测定，获得色谱图，按公式计算有效成分含量为：芦丁0.072%、异槲皮苷0.46%、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷0.41%、杨梅素0.22%、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷2.25%、槲皮素0.043%，与外标一点法测得值比较RSD＜5%。
以上所述的公式为：Wm=(Wk×Am)/(fkm×Ak)，式中Ak为金丝桃苷内标物峰面积，Wk为金丝桃苷内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子。
实施例2
(1)样品溶液的制备
精密称取黄蜀葵花提取物0.1g，加浓度90%甲醇50ml，超声提取30min，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，10μL进样。
(2)对照品溶液的制备
分别精密称定金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、芦丁和槲皮素对照品适量，置量瓶中，以90%甲醇配成浓度分别为87μg/mL、401μg/mL，264μg/mL、462μg/mL、450μg/mL、751μg/mL、103μg/mL的对照品溶液。分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，于4℃保存备用。
(3)液相色谱图的获取
取步骤(1)样品溶液和步骤(2)混合对照品溶液，进行高效液相色谱检测，获得色谱图，所用高效液相色谱参数设置如下：
仪器：高效液相色谱仪；
固定相：Hedera ODS-2(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱；
流动相：2%冰醋酸水(A)-乙腈(B)；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测器：二极管阵列检测器(DAD)，扫描范围190-400nm；
检测波长：365nm；
梯度洗脱程序：建立分离度好、时间短的洗脱程序，如表2所示。
表2梯度洗脱程序表
| 时间/分钟 | 0 | 18 | 29 | 42 | 45 | 50 |
| 浓度0.05%~2%冰醋酸水/百分比 | 84 | 84 | 73 | 50 | 84 | 84 |
| 乙腈/百分比 | 16 | 16 | 27 | 50 | 16 | 16 |
(4)校正因子fkm的计算
将步骤(2)混合对照品溶液按步骤(3)分析条件，进样40，20，10，5，2，1μL测定，获得的色谱图并进行峰面积积分。分别计算金丝桃苷对芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子0.826，1.313，0.495，0.991，1.611，1.519。
(5)计算其它6种黄酮成分的含量
取步骤(1)制备得到的样品溶液按步骤(3)分析条件，注入高效液相色谱进行测定，获得色谱图，按公式计算有效成分含量为：芦丁0.133%、异槲皮苷0.769%、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷0.481%、杨梅素0.195%、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷2.036%、槲皮素0.263%，与外标一点法测得值比较RSD＜5%。
以上所述的公式为：Wm=(Wk×Am)/(fkm×Ak)，式中Ak为金丝桃苷内标物峰面积，Wk为金丝桃苷内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子。
本发明提供的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，灵敏度高，稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确地评价黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量，并且采用液相色谱分离，通过一测多评技术，以金丝桃苷为内标物，建立其与芦丁、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素的相对校正因子并计算7种黄酮含量的方法，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制黄蜀葵花药材及其制剂质量的问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品溶液的制备
精密称取黄蜀葵花药材、黄蜀葵花药材提取物或黄蜀葵花制剂，加入浓度为50%~100%的甲醇，超声或加热回流提取，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，得样品溶液；
(2)对照品溶液的制备
分别精密称定芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷和槲皮素7种对照品置于量瓶中，用浓度为50%~100%甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液；然后分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，于4℃保存，备用；
(3)校正因子fkm的计算
取步骤(2)制备得到的混合对照品溶液，进样10，5，2，1，0.5μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选取金丝桃苷为内标化合物，分别计算金丝桃苷对芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子fkm；
(4)样品中活性成分的测定
取步骤(1)制备得到的样品溶液注入高效液相色谱进行测定，获得色谱图，按公式计算芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的质量；
以上所述的公式为：Wm=(Wk×Am)/(fkm×Ak)，式中Ak为金丝桃苷内标物峰面积，Wk为金丝桃苷内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、杨梅素、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素的校正因子。
2.根据权利要求1所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其特征在于，
步骤(3)和步骤(4)所述的高效液相色谱测定的条件为：
色谱柱：反相C18色谱柱；
流动相：浓度0.05%~2%甲酸水--乙腈、浓度0.05%~2%磷酸水--乙腈或浓度0.05%~2%冰醋酸水--乙腈；
流速：0.4~1.0mL/min；
检测波长：365nm±10nm；
洗脱程序：梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其特征在于，检测的流动相为浓度0.05%~2%甲酸水--乙腈的梯度洗脱程序为：
4.根据权利要求2所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其特征在于，流动相为浓度0.05%~2%冰醋酸水--乙腈的梯度洗脱程序为：
5.根据权利要求2所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其特征在于，浓度0.05%~2%磷酸水--乙腈的梯度洗脱程序为：
6.根据权利要求1所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其特征在于，
步骤(1)样品溶液的制备方法为：精密称取黄蜀葵花药材、黄蜀葵花药材提取物或黄蜀葵花制剂，加入6~10倍浓度为50%~100%的甲醇，超声或加热回流提取2~3次，每次1~2小时，合并提取液，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，得样品溶液。
7.根据权利要求1所述的黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法，其特征在于，步骤(1)所述的黄蜀葵花药材提取物为黄蜀葵花药材的水提取物或者乙醇提取物。
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