CN103012193A - 隐色孔雀石绿半抗原、人工抗原及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其制备方法，保留孔雀石绿的特征结构，在孔雀石绿结构的不同化学位点衍生出具有不同电子云密度、不同碳链长度以及适合与大分子载体偶联的活性手臂。所述的活性手臂为带有末端为氨基或羧基的酰胺键。由隐色孔雀石绿半抗原制备得到孔雀石绿人工抗原，应用于检测隐色孔雀石绿和孔雀石绿的残留量时具有很高的特异性和灵敏度，准确度高，回收率高，同时方法简单，成本低廉，建立出快速、灵敏、经济、高效的孔雀石绿免疫检测方法。

Description

隐色孔雀石绿半抗原、人工抗原及制备方法

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，涉及抗原的制备，具体地涉及一种隐色孔雀石绿半抗原、人工抗原及制备方法。 

背景技术

孔雀石绿（Malachite Green，MG），别名中国绿、苯胺绿、碱性孔雀石绿、品绿、盐基块绿等，是一种有毒的三苯甲烷类化合物，过去常作为外用驱虫剂、杀真菌剂、杀菌剂等用于治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染。但是孔雀石绿也是潜在的致癌剂、致突变剂、致畸变剂，目前世界上许多国家都已经将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。隐色孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG）是孔雀石绿的无发色团还原产物，是孔雀石绿在鱼体及其他生物体内的主要代谢产物和存在形式，其不溶于水，在体内残留时间更长，危害亦比孔雀石绿更大。孔雀石绿和隐色孔雀石绿具有如式（Ⅰ）所示的结构： 

式（Ⅰ） 

但是，由于部分生产者和商贩缺乏有关科学知识和法律意识，特别是受到经济利益的驱使，在水产养殖过程中还是会经常用到防治水霉病效果好且价格低廉的孔雀石绿。2005年，我国福建、江西、安徽等省出口欧盟、日本、韩国 的鳗鱼产品先后被检出孔雀石绿残留。2006年，上海市场上的多宝鱼和香港市场上的桂花鱼，均被检出孔雀石绿残留。孔雀石绿的非法使用，严重威胁了人民的身体健康，严重影响了我国水产品在国际上的竞争力，同时造成了重大的经济损失。然而在巨大经济利益的趋势下，短期内很难真正做到杜绝孔雀石绿在水产养殖中的应用，这就使得快速准确地检测出水产品中残留的孔雀石绿和隐色孔雀石绿成为当务之急。 

以往对于孔雀石绿和隐色孔雀石绿的残留检测主要是采用气相色谱法和液相色谱法，但是需要使用昂贵的设备仪器且操作繁琐，不适用于现场快速检测。免疫分析检验技术是近年来在环境、食品安全检测领域逐渐广泛应用的一种快速、高通量、低成本的检测技术，已逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，也为孔雀石绿和隐色孔雀石绿的检测提供了新的途径。 

CN 101245032A公开了一种隐色孔雀石绿半抗原，其保留隐色孔雀石绿的特征结构，在隐色孔雀石绿结构的不同化学位点上衍生出具有不同电子结构性质、不同碳链长度以及适合与大分子载体偶联的活性手臂，所述活性手臂为R基团、芳香胺、末端羧基直链烷基醚或带有直链末端羧基结构的酰胺键；由隐色孔雀石绿半抗原制备得到隐色孔雀石绿人工抗体，应用于检测隐色孔雀石绿和孔雀石绿的残留量。 

CN 101149375A公开了一种对隐色孔雀绿和孔雀石绿进行免疫测定的方法和试剂盒，提供半抗原、包含与赋予抗原性的载体材料偶联的所述半抗原的免疫原、包含与标记物结合的所述半抗原的偶联物、以及对抗这样的免疫原并能与隐色孔雀绿和孔雀石绿结合的抗体。 

CN 101451999A公开了一种检测隐性孔雀石绿直接竞争ELISA试剂盒。所提供的酶联免疫试剂盒包括隐性孔雀石绿多克隆抗体、隐性孔雀石绿半抗原及 完全抗原和酶标抗原。 

但是以上各发明与现有技术一样，其抗体特异性与灵敏度较弱，检测时回收率太低，不能满足现有需要。 

发明内容

本发明目的之一在于提供一种隐色孔雀石绿半抗原。 

本发明提供一种隐色孔雀石绿的半抗原，通过修饰其不同化学位点，使其具有不同的空间构象、不同的电子云密度，然后通过半抗原的活性手臂与大分子载体偶联，制成隐色孔雀石绿人工抗原。 

半抗原的设计：在免疫分析方法研究中，制备高质量的抗体是关键，二抗体质量的优劣很大程度上取决于半抗原的结构（宏观立体机构与微观电子机构）是否合理。因此，设计合理的半抗原机构及选择合适的偶联蛋白方式非常重要。文献研究经验表明：制备高特异性抗体所需半抗原及人工抗原应能最大限度的保持药物分子的特征结构。从隐色孔雀石绿的结构看，电子云密度较高的二甲氨基取代的两个苯环系统可能是产生特异性抗体的决定性特征结构区。因此，半抗原设计中采取了避免在该药物特征结构区衍生化偶联手臂的策略。同时，为了研究半抗原的构效，考察不同衍生化方法及偶联微点对抗体特性的影响，分别在非取代苯环结构的间对位引入吸电子性质的羧基或偶联蛋白后扩大共轭体系的氨基活性基团。进一步的模拟计算结果表明：羧基衍生的半抗原偶联蛋白保持了药物分子的微观特征电子结构，可能有利于高特异性抗体的产生；氨基衍生物的半抗原偶联蛋白后，较小程度的改变了药物分子特征电子机构，对产生高特异性抗体产生的影响也较小。 

所述隐色孔雀石绿半抗原，为隐色孔雀石绿的衍生物，其特征在于，在隐色孔雀石绿未被取代的苯环的对位或间位引入可与蛋白质反应的基团。 

优选地，所述可与蛋白质反应的基团为氨基或羧基。 

优选地，所述隐色孔雀石绿半抗原的结构如式（I）、式（II）、式（III）或式（IV）所示： 

其中，R₁为取代或未取代的C1-C20直链烷基、取代或未取代的C1-C20支链烷基、取代或未取代的C2-C20不饱和烃基中的任意1种；R₂为取代或未取代的C1-C20直链烷基、取代或未取代的C1-C20支链烷基、取代或未取代的C2-C20不饱和烃基中的任意1种。 

所述R₁的碳原子数可以为2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个、11个、12个、15个、18个、19个等。 

优选地，所述R₁为取代或未取代的C1-C10直链烷基、取代或未取代的C1-C10支链烷基，进一步优选为未取代的C1-C6直链烷基或未取代的C1-C6支链烷基，特别优选为未取代的C1-C4直链烷基。 

所述R₁可以含有烯基、炔基或苯基，优选地，所述R₁为含有至少1个苯基的C2-C20不饱和烃基，进一步优选为含有2个苯基的C2-C20不饱和烃基，更优选为含有2个对位取代的苯基的C2-C15不饱和烃基，特别优选为式（V）所示结构： 

所述R₂的碳原子数可以为2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个、11个、12个、15个、18个、19个等。 

优选地，所述R₂为取代或未取代的C1-C10直链烷基、取代或未取代的 C1-C10支链烷基，进一步优选为未取代的C1-C6直链烷基或未取代的C1-C6支链烷基，特别优选为未取代的C1-C4直链烷基。 

所述隐色孔雀石绿半抗原的结构如式（VI）、式（VII）、式（VIII）或式（IX）所示： 

其中，R₃为未取代的C1-C4直链烷基。 

本发明目的之二在于提供一种所述隐色孔雀石绿半抗原的制备方法。 

所述隐色孔雀石绿半抗原的制备方法包括以下步骤： 

（1）对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸与N,N-二甲基苯胺反应，得到式（X）所示化合物； 

其中，R₄为COOH，R₅为H，或R₄为H，R₅为COOH； 

（2）式（X）所示化合物与二胺反应得到式（I）或式（II）的化合物； 

优选地，步骤（1）所述反应在酸体系中进行，特别优选在浓盐酸体系中进行；该反应会放出大量HCl，具有腐蚀性。 

优选地，步骤（1）所述反应以ZnCl₂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在乙醇体系中以ZnCl₂为催化剂进行反应；该方法产率不是很高。 

优选地，步骤（1）所述反应以Amberlyst15树脂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在甲苯体系中以Amberlyst15树脂为催化剂进行反应；特别优选该方法；该方法既能保证产率反应，条件也较温和。 

优选地，步骤（1）所述反应温度为70~110℃，特别优选为80~100℃。 

优选地，步骤（1）所述反应时间为至少16小时，进一步优选为20~48小时，特别优选为24小时。 

优选地，步骤（1）所述反应中对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和催化剂的物质的量比为1:(1.8~2.2):(0.06~1)，进一步优选为1:(1.9~2.1):(0.08~0.5)，特别优选为1:2:0.1。 

所述隐色孔雀石绿半抗原的制备方法包括以下步骤： 

（1）式（XI）化合物与N,N-二甲基苯胺反应，然后还原，得到式（XII）所示化合物； 

其中，R₆为CONH₂，R₇为H，R₈为CH₂NH₂，R₉为H，或R₆为H，R₇为CONH₂，R₈为H，R₉为CH₂NH₂； 

（2）式（XII）所示化合物与二酸反应得到式（III）或式（IV）的化合物： 

优选地，步骤（1）所述反应在酸体系中进行，特别优选在浓盐酸体系中进行；该反应会放出大量HCl，具有腐蚀性。 

优选地，步骤（1）所述反应以ZnCl₂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在乙醇体系中以ZnCl₂为催化剂进行反应；该方法产率不是很高。 

优选地，步骤（1）所述反应以Amberlyst15树脂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在甲苯体系中以Amberlyst15树脂为催化剂进行反应；特别优选该方法；该方法既能保证产率反应，条件也较温和。 

优选地，步骤（1）所述反应温度为70~110℃，特别优选为80~100℃。 

优选地，步骤（1）所述反应时间为至少16小时，进一步优选为20~48小时，特别优选为24小时。 

优选地，步骤（1）所述反应中对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和催化剂的物质的量比为1:(1.8~2.2):(0.06~1)，进一步优选为1:(1.9~2.1):(0.08~0.5)，特别优选为1:2:0.1。 

为了保证所合成的隐色孔雀石绿半抗原的机构稳定性，采用萃取及减压柱层析手段对合成的隐色孔雀石绿进行分离纯化，并通过LCMS（液质联用）和1H-NMR(核磁1H谱）进行了鉴定，确保合成的半抗原结构准确。 

本发明目的之三在于提供一种隐色孔雀石绿人工抗原的制备方法。 

所述隐色孔雀石绿人工抗原的制备方法为采用本发明上文所述隐色孔雀石绿半抗原与载体蛋白偶联，得到隐色孔雀石绿人工抗原。 

本发明目的之四在于提供一种隐色孔雀石绿人工抗原。 

所述隐色孔雀石绿人工抗原由上述隐色孔雀石绿人工抗原的制备方法制备。 

本发明目的之五在于提供一种所述隐色孔雀石绿人工抗原的用途。 

所述隐色孔雀石绿人工抗原可经动物免疫、细胞融合的生化过程制备得到所述隐色孔雀石绿的人工抗体，进而应用于检测食品、农产品或者环境样品中隐色孔雀石绿的残留量。 

在说明书和权利要求书中使用的所有表示工艺参数、组分含量、反应条件等在所有情况下都应当被理解为加上术语“约”的修饰。因此，除非相反指出，在说明书和权利要求书中所给出的数值都可以根据本发明所希望得到的性质的不同而变化。在最低限度，并不用于将等价物原则的应用限定为权利要求的范围，每个数值都应当至少依照所报道的有效数字的值通过使用普通的舍入方法进行解释。而且，所有在此公布的范围都应当被理解为包含范围的起点和终点值，包含任意和所有包含在其中的小范围。例如，一定的范围“1-10”应当被认为包含最小值1和最大值10之间(包括在内)的任何和所有小范围；即所有以大于或等于1的最小值起始，而且以小于或等于10的最大值结束的所有小范围，例如5-10，3.3-6.7，或1.5-8.8。在此文件中所提到的所有参考文献都应当被理解为全部包括进来用于参考。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

（1）本发明通过设计合成隐色孔雀石绿半抗原，经载体蛋白偶联得到人工抗原，可通过生化方法生产出特异性抗体及单克隆抗体。 

（2）本发明的隐色孔雀石绿半抗原化合物的化学合成方法，关键在于采用了一些成本低廉的原料、高效的催化剂以及简单方便的操作，使其成为一种高效的合成方法。其第一步反应优选采用Amberlyst15树脂作为催化剂，反应产率高。这种合成方法使得检测隐色孔雀石绿的成本降低。 

（3）通过本发明可建立隐色孔雀石绿的快速免疫检测方法和实验室标准检测方法，在检测分析食品、农产品、环境土壤和水样中隐色孔雀石绿残留时，能够具有很高的特异性和灵敏度，准确度高。同时，操作方法也简单快捷，检测效率高，对操作人员要求低，方便现场监控。 

（4）本发明成功合成出具有不同活性基团、不同化学位点、不同手臂长度的隐色孔雀石绿半抗原，通过偶联大分子载体成功制备出人工抗原，通过抗原的构效关系分析为免疫学机理定量分析奠定基础，提供了新的思路。 

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的权利范围以权利要求书为准。 

具体实施方式

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下： 

实施例1 

取N,N-二甲基苯胺2.5g（20mmol）于50mL两口烧瓶中，再缓慢加入20mL的5%Amberlyst15树脂的甲苯溶液，磁力搅拌几分钟，在搅拌状态下，加入1.50g对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸，与80~100℃搅拌过夜。待反应结束后过滤催化剂并向反应体系中加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9.0，用二氯甲烷萃取。水相用稀盐酸调节pH至2.0，用乙酸乙酯萃取，有机相旋蒸旋干得到粗产物。 然后加2g的HATU，0.5g的乙二胺，2mlDIPEA，用20mLDMF溶解，磁力搅拌50℃反应2h，加水淬灭用乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，最后用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需产物。 

在如下反应中，化合物（a）其波谱数据为：+ESI-MS m/z：417[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ2.90（s，12H），3.10（s，2H），3.46（s，2H），4.44（s，2H），5.20（s，1H），6.21（d，J=8.4，2H），6.32（d，J=8.3，4H）6.60（d，J=8.2，6H），7.19（s，2H），7.60（s，2H）；化合物（b）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：417[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ2.91（s，12H），3.01（s，2H），3.22（s，2H），4.46（s，2H），5.13（s，1H），6.25（d，J=8.4，2H），6.38（d，J=8.2，4H）6.69（d，J=8.1，6H），6.91~6.96（m，5H，H）。 

半抗原的合成路线如下所示。 

实施例2 

取N,N-二甲基苯胺2.5g（20mmol）于50mL两口烧瓶中再缓慢加入20mL的5%Amberlyst15树脂的甲苯溶液，磁力搅拌几分钟，在搅拌状态下，加入1.50g式（XI）化合物（其中，R₆为CONH₂，R₇为H，或R₆为H，R₇为CONH₂），与80~100℃搅拌过夜。待反应结束后过滤催化剂并向反应体系中加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9.0，用乙酸乙酯萃取，有机相旋蒸旋干得到粗产物。然后用10mL四氢呋喃溶解，再加1.5g四氢铝锂，0℃下磁力搅拌反应2h，用氯化铵溶液淬灭，调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，最后用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需化合物。然后用20mL的DMF溶解，再加0.5g的丁二酸，2gHATU，2mLDIPEA，磁力搅拌50℃反应3h。反应结束后用稀盐酸pH至6.0，然后用乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，用减压硅胶柱层析法分离纯化得 到所需产物。 

在以下反应中，化合物（c）其波谱数据为：+ESI-MS m/z：460[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ2.45（s，2H），2.56（s，2H），2.90（s，12H），5.20（s，1H），6.32（d，J=8.4，4H）6.60（d，J=8.3，4H），7.24（d，J=8.4，2H），7.99（d，J=8.1，2H）；化合物（d）的波谱数据为：+ESI-MSm/z：460[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ2.40（s，2H），2.51（s，2H），2.96（s，12H），5.30（s，1H），6.34（d，J=8.4，4H）6.60（d，J=8.2，4H），7.40（d，J=8.1，2H），7.82（d，J=8.4，2H）。 

半抗原的合成路线如下所示。 

实施例3 

取N,N-二甲基苯胺2.5g（20mmol）于50mL两口烧瓶中，再缓慢加入20mL的5%Amberlyst15树脂的甲苯溶液，磁力搅拌几分钟，在搅拌状态下，加入1.50g对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸，与80~100℃搅拌过夜。待反应结束后过滤 催化剂并向反应体系中加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9.0，用二氯甲烷萃取。水相用稀盐酸调节pH至2.0，用乙酸乙酯萃取，有机相旋蒸旋干得到粗产物。然后加2g的HATU，2g的式（g）的化合物，2mL的DIPEA，用20mLDMF溶解，磁力搅拌50℃反应2h，加水淬灭用乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，最后用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需产物。 

在如下反应中，化合物（e）其波谱数据为：+ESI-MS m/z：541[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-DMSO，TMS)：δ2.85（s，12H），2.90（s，4H），5.34（s，1H），5.9（s，2H），6.41（d，J=8.4，2H），6.47（d，J=8.3，4H），6.87（d，J=8.1，6H），7.10（d，J=8.2，2H），7.24（d，J=8.0，2H），7.59（d，J=8.4，2H），7.59（d，J=8.4，2H），7.83（d，J=8.2，2H），13.22（s，1H）；化合物（f）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：541[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-DMSO，TMS)：δ2.86（s，12H），3.1（s，4H），5.40（s，1H），6.01（s，2H），6.46（d，J=8.2，6H），6.89（d，J=8.3，7H），7.12（d，J=8.3，1H），7.30（d，J=8.2，2H），7.44（d，J=8.1，2H），7.90（d，J=8.2，2H），12.13（s，1H）。 

半抗原的合成路线如下所示。 

实施例4 

类似于实施例1，取22mmol N,N-二甲基苯胺于50mL两口烧瓶中，再缓慢加入0.6mmol的5%Amberlyst15树脂的甲苯溶液，磁力搅拌几分钟，在搅拌状态下，加入10mmol对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸，与70~110℃搅拌反应至少16小时。待反应结束后过滤催化剂并向反应体系中加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9.0，用二氯甲烷萃取。水相用稀盐酸调节pH至2.0，用乙酸乙酯萃取，有机相旋蒸旋干得到粗产物。然后加2g的HATU，1g的化合物H₂N-(CH₂)₂₀-NH₂，2mL的DIPEA，用20mLDMF溶解，磁力搅拌50℃反应2h，加水淬灭用乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，最后用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需产物（h）、（i），见下式。 

在反应中，化合物（h）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：670[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CDCl₃，TMS)：δ1.29（s，32H），1.57（s，4H），δ2.90（s，12H），3.10（s，2H），3.46（s，2H），4.44（s，2H），5.20（s，1H），6.21（d，J=8.4，2H），6.32（d，J=8.3，4H）6.60（d，J=8.2，6H），7.19（s，2H），7.60（s，2H）；化合物（f）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：670[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ1.29（s，32H），1.57（s，4H），δ2.91（s，12H），3.01（s，2H），3.22（s，2H），4.46（s，2H），5.13（s，1H），6.25（d，J=8.4，2H），6.38（d，J=8.2，4H）6.69（d，J=8.1，6H），6.91~6.96（m，5H，H）。 

实施例5 

类似于实施例1，取18mmol N,N-二甲基苯胺于50mL两口烧瓶中，再缓慢加入10mmol的5%Amberlyst15树脂的甲苯溶液，磁力搅拌几分钟，在搅拌状态下，加入10mmol对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸，与70~110℃搅拌反应20小时。待反应结束后过滤催化剂并向反应体系中加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9.0，用二氯甲烷萃取。水相用稀盐酸调节pH至2.0，用乙酸乙酯萃取，有机相旋蒸旋干得到粗产物。然后加2g的HATU，0.4g的化合物H₂N-CH₂-NH₂，2mL的DIPEA，用20mLDMF溶解，磁力搅拌50℃反应2h，加水淬灭用乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，最后用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需产物（j）、（k），见下式。 

在反应中，化合物（j）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：403[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CDCl₃，TMS)：δ1.57（s，4H），δ2.90（s，12H），3.10（s，2H），3.46（s，2H），4.44（s，2H），4.65（s，2H），5.20（s，1H），6.21（d，J=8.4， 2H），6.32（d，J=8.3，4H）6.60（d，J=8.2，6H），7.19（s，2H），7.60（s，2H）；化合物（k）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：403[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ1.57（s，4H），δ2.91（s，12H），3.01（s，2H），3.22（s，2H），4.46（s，2H），4.65（s，2H），5.13（s，1H），6.25（d，J=8.4，2H），6.38（d，J=8.2，4H）6.69（d，J=8.1，6H），6.91~6.96（m，5H，H）。 

实施例6 

类似于实施例2，取19mmol N,N-二甲基苯胺于50mL两口烧瓶中再缓慢加入1mmol的5%Amberlyst15树脂的甲苯溶液，磁力搅拌几分钟，在搅拌状态下，加入10mmol式（XI）化合物（其中，R₆为CONH₂，R₇为H，或R₆为H，R₇为CONH₂），与80~100℃搅拌过夜。待反应结束后过滤催化剂并向反应体系中加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9.0，用乙酸乙酯萃取，有机相旋蒸旋干得到粗产物。然后用10mL四氢呋喃溶解，再加1.5g四氢铝锂，0℃下磁力搅拌反应2h，用氯化铵溶液淬灭，调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，最后用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需化合物。然后用20mL的DMF溶解，再加1.2g的HOOCCH₂COOH，2gHATU，2mLDIPEA，磁力搅拌50℃反应3h。反应结束后用稀盐酸pH至6.0，然后用乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需产物（l）、（m），见下式。 

在反应中，化合物（l）其波谱数据为：+ESI-MS m/z：446(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ3.12（s，2H），2.90（s，12H），5.20（s，1H），6.32（d，J=8.4，4H）6.60（d，J=8.3，4H），7.24（d，J=8.4，2H），7.99（d，J=8.1，2H）；化合物（m）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：446[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ3.15（s，2H），2.96（s，12H），5.30（s，1H），6.34（d，J=8.4，4H）6.60（d，J=8.2，4H），7.40（d，J=8.1，2H），7.82（d，J=8.4，2H）。 

实施例7 

取21mmol N,N-二甲基苯胺于50mL两口烧瓶中再缓慢加入5mmol的5%Amberlyst15树脂的甲苯溶液，磁力搅拌几分钟，在搅拌状态下，加入10mmol式（XI）化合物（其中，R₆为CONH₂，R₇为H，或R₆为H，R₇为CONH₂），与80~100℃搅拌过夜。待反应结束后过滤催化剂并向反应体系中加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9.0，用乙酸乙酯萃取，有机相旋蒸旋干得到粗产物。然后用10mL四氢呋喃溶解，再加1.5g四氢铝锂，0℃下磁力搅拌反应2h，用氯化铵溶液淬灭，调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，最后用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需化合物。然后用20mL的DMF溶解，再加2g的HOOC(CH₂)₂₀COOH，2gHATU，2mLDIPEA，磁力搅拌50℃反应3h。反应结束 后用稀盐酸pH至6.0，然后用乙酸乙酯萃取，将有机相旋干，用减压硅胶柱层析法分离纯化得到所需产物（n）、（o），见下式。 

在反应中，化合物（n）其波谱数据为：+ESI-MS m/z：713[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ1.29（s，32H），1.56（s，4H），2.18（s，2H），2.23（s，2H），2.90（s，12H），5.20（s，1H），6.32（d，J=8.4，4H）6.60（d，J=8.3，4H），7.24（d，J=8.4，2H），7.99（d，J=8.1，2H）；化合物（o）的波谱数据为：+ESI-MS m/z：713[(M+H)⁺]；1H-NMR(400MHz，d₆-CD₃OD，TMS)：δ1.29（s，32H），1.57（s，4H），2.20（s，2H），2.29（s，2H），2.96（s，12H），5.30（s，1H），6.34（d，J=8.4，4H）6.60（d，J=8.2，4H），7.40（d，J=8.1，2H），7.82（d，J=84，2H）。 

实施例8 人工抗原的合成、纯化及鉴定 

人工抗原的合成采用活泼酯法和重氮法。带羧基的半抗原采用活泼酯法合成，含有氨基的半抗原采用重氮法合成。 

活泼酯法合成人工抗原的步骤：称取1mmol的半抗原和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1mmol溶于1.0mLDMF中。将1mmol N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）溶于1.0mLDMF中，磁力搅拌下逐滴加入到含半抗原的溶液中，室温搅拌4h。再将制得的溶液逐滴加入到BSA溶液中，并同时搅拌，4℃下用0.9%的生理盐水透析3天，每6h换一次透析液。紫外扫描透析液无小分子吸收峰时可将透析得到的产物分装与离心管中，-20℃保存。 

合成包被人工抗原步骤同上，将BSA换成OVA即可制得包被抗原。 

重氮法合成人工抗原步骤：称取1mmol半抗原于10mL称量皿中，加入1mL1M的盐酸溶液，随后称取1mmolNaNO₂加入到称量皿中，冰浴搅拌0.5h。将得到的液体逐滴加入到BSA溶液中，4℃下用0.9%的生理盐水透析3天，每6h换一次透析液。紫外扫描透析液无小分子是可将透析得到的产物分装于离心管中，-20℃保存。 

合成包被人工抗原步骤同上，将BSA换成OVA即可得到包被抗原。 

按照上述方法分别由半抗原（a）~（o）制得免疫原，如下所示。 

其中，n=1~20。 

人工抗原的鉴定 

按照合成隐色孔雀石绿免疫原和包被原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行200~400nm紫外扫描分析。偶联物与半抗原及载体的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明这几种人工抗原的合成是成功的。 

半抗原与载体的结合比如表1所示。 

表1 

免疫抗原

a-BSA

b-BSA

c-BSA

d-BSA

e-BSA

f-BSA

h-BSA

结合比

32:1

38:1

28:1

25:1

36:1

32:1

31:1

免疫抗原

i-BSA

j-BSA

k-BSA

l-BSA

m-BSA

n-BSA

o-BSA

结合比

32:1

31:1

35:1

25:1

29:1

28:1

28:1

对人工抗原进行阳性单克隆阻断复检实验 

实验步骤： 

（1）直接ELISA； 

（2）包被二抗：驴抗鼠二抗用0.01M PBS（pH7.4）稀释至0.030mg/mL，每孔加入100μL，37℃孵育2h； 

（3）洗板：用0.01M PBST（含0.5%TWEEN-20）洗板三遍； 

（4）封闭：用0.01M PBS（pH7.4）将猪血清稀释为5%（v/v）浓度，每孔加入360μL，37℃孵育1h； 

（5）洗板：用0.01M PBST（含0.5%TWEEN-20）洗板三遍； 

（6）加抗体：每孔加入30μL 0.01M PBS（pH7.4）及85μL细胞培养上清，同一个细胞培养上清液样品平行加入两孔，其中一孔将作为0抑制孔对照孔，另一孔将作为标品抑制孔。留六孔作为对照孔，阳性/阴性对照孔分别加入100μL阳性血清和100μL阴性血清（阳性/阴性对照血清均用0.01M PBS稀释1000倍），空白对照孔加入100μL PBS，37℃孵育1h； 

（7）洗板：用0.01M PBST（含0.5%TWEEN-20）洗板四遍； 

（8）加标品/酶标抗原：标品用0.2M醋酸钠（pH 6.0）缓冲液稀释至20ng/mL，酶标抗原用0.2M醋酸钠（pH 6.0）缓冲液稀释至5μg/mL，0抑制孔加入50μL 0.2M醋酸钠（pH 6.0）缓冲液及50μL酶标抗原稀释液，标品抑制孔加入50μL标品稀释液及50μL酶标抗原稀释液，阳性/空白/阴性对照孔各两孔中的一孔加入与零抑制孔相同的缓冲液及酶标抗原稀释液，另一孔加入与标品抑制孔相同的标品稀释液及酶标抗原稀释液。37℃孵育30min； 

（9）洗板：用0.01M PBST（含0.5%TWEEN-20）洗板五遍； 

（10）显色：科卫TMB A/B液1：1混合后，每孔加入100μL，37℃孵育30min； 

（11）终止：加入50μL 0.2M H₂SO₄，测定OD450。 

结果如表2所示： 

表2 

三次细胞上清检测实验均证明，4株目标阳性克隆具有亲和力高和灵敏度好等特点，待其生长至一定数量时进行保种冻存。 

Claims (10)

1.一种隐色孔雀石绿半抗原，其特征在于，所述隐色孔雀石绿半抗原为在隐色孔雀石绿未被取代的苯环的对位或间位引入可与蛋白质反应的基团。

2.如权利要求1所述的隐色孔雀石绿半抗原，其特征在于，所述可与蛋白质反应的基团为氨基或羧基；

优选地，所述隐色孔雀石绿半抗原的结构如式（I）、式（II）、式（III）或式（IV）所示：

其中，R₁为取代或未取代的C1-C20直链烷基、取代或未取代的C1-C20支链烷基、取代或未取代的C2-C20不饱和烃基中的任意1种；R₂为取代或未取代的C1-C20直链烷基、取代或未取代的C1-C20支链烷基、取代或未取代的C2-C20不饱和烃基中的任意1种。

3.如权利要求2所述的隐色孔雀石绿半抗原，其特征在于，所述R₁为取代或未取代的C1-C10直链烷基、取代或未取代的C1-C10支链烷基，进一步优选为未取代的C1-C6直链烷基或未取代的C1-C6支链烷基，特别优选为未取代的C1-C4直链烷基；

优选地，所述R₁为含有至少1个苯基的C2-C20不饱和烃基，进一步优选为含有2个苯基的C2-C20不饱和烃基，更优选为含有2个对位取代的苯基的C2-C15不饱和烃基，特别优选为式（V）所示结构：

优选地，所述R₂为取代或未取代的C1-C10直链烷基、取代或未取代的C1-C10支链烷基，进一步优选为未取代的C1-C6直链烷基或未取代的C1-C6支链烷基，特别优选为未取代的C1-C4直链烷基。

4.一种如权利要求1-3任一项所述隐色孔雀石绿半抗原的制备方法，包括以下步骤：

（1）对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸与N,N-二甲基苯胺反应，得到式（X）所示化合物；

其中，R₄为COOH，R₅为H，或R₄为H，R₅为COOH；

（2）式（X）所示化合物与二胺反应得到式（I）或式（II）的化合物；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述反应在酸体系中进行，特别优选在浓盐酸体系中进行；

优选地，步骤（1）所述反应以ZnCl₂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在乙醇体系中以ZnCl₂为催化剂进行反应；

优选地，步骤（1）所述反应以Amberlyst15树脂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在甲苯体系中以Amberlyst15树脂为催化剂进行反应；

优选地，步骤（1）所述反应温度为70~110℃，特别优选为80~100℃；

优选地，步骤（1）所述反应时间为至少16小时，进一步优选为20~48小时，特别优选为24小时；

优选地，步骤（1）所述反应中对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和催化剂的物质的量比为1:(1.8~2.2):(0.06~1)，进一步优选为1:(1.9~2.1):(0.08~0.5)，特别优选为1:2:0.1。

6.一种如权利要求1-3任一项所述隐色孔雀石绿半抗原的制备方法，包括以下步骤：

（1）式（XI）化合物与N,N-二甲基苯胺反应，然后还原，得到式（XII）所示化合物；

其中，R₆为CONH₂，R₇为H，R₈为CH₂NH₂，R₉为H，或R₆为H，R₇为CONH₂，R₈为H，R₉为CH₂NH₂；

（2）式（XII）所示化合物与二酸反应得到式（III）或式（IV）的化合物：

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，步骤（1）所述反应在酸体系中进行，特别优选在浓盐酸体系中进行；

优选地，步骤（1）所述反应以ZnCl₂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在乙醇体系中以ZnCl₂为催化剂进行反应；

优选地，步骤（1）所述反应以Amberlyst15树脂为催化剂，特别优选，步骤（1）所述反应在甲苯体系中以Amberlyst15树脂为催化剂进行反应；

优选地，步骤（1）所述反应温度为70~110℃，特别优选为80~100℃；

优选地，步骤（1）所述反应时间为至少16小时，进一步优选为20~48小时，特别优选为24小时；

优选地，步骤（1）所述反应中对甲酰基苯甲酸或间甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和催化剂的物质的量比为1:(1.8~2.2):(0.06~1)，进一步优选为1:(1.9~2.1):(0.08~0.5)，特别优选为1:2:0.1。

8.一种隐色孔雀石绿人工抗原的制备方法，包括：采用如权利要求1-3任一项所述隐色孔雀石绿半抗原与载体蛋白偶联，得到隐色孔雀石绿人工抗原。

9.一种隐色孔雀石绿人工抗原，其特征在于，所述隐色孔雀石绿人工抗原由权利要求8所述方法制备。

10.一种如权利要求9所述隐色孔雀石绿人工抗原的用途，其特征在于，所述隐色孔雀石绿人工抗原用于检测食品、农产品或者环境样品中隐色孔雀石绿的残留量。