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CN107083368B - 一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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CN107083368B CN201710227939.5A CN201710227939A CN107083368B CN 107083368 B CN107083368 B CN 107083368B CN 201710227939 A CN201710227939 A CN 201710227939A CN 107083368 B CN107083368 B CN 107083368B
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Abstract

本发明提供了一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株F‑3‑1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13806。此细胞株分泌的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体灵敏度高、特异性好、抗干扰性好，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为0.046μg/L，与AFB2的交叉反应率为110％，与AFG1的交叉反应率为96％，与AFG2的交叉反应率为78％，对中药中可能存在的真菌毒素、农药、重金属、炮制过程中使用的辅料及污染菌等均具有较好的抗干扰性，为中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的免疫检测提供了条件，具有实际应用价值。

Description

一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
中药材从生产、采收、加工、运输、贮藏等过程均有可能因自身性质与外界因素的影响而污染真菌，进而发生霉变并污染真菌毒素。霉变不仅会影响中药材的质量，使药材失去原有的药用价值，造成巨大的经济损失，而且在霉变过程中，产生的多种真菌毒素会对患者的肝、肾、神经和造血系统等造成严重的损害，甚至可能诱发癌症。同时，随着当今中医药保健养生观念的普及，越来越多“药食同源”的大宗中药材被用于人们日常的饮食和保健当中，市场的需求量大，若这些中药材受到真菌毒素的污染，则势必会危害更多的人群的健康，加重个人和医疗系统的经济负担，更有可能进一步影响社会的和谐和稳定。
黄曲霉毒素(Aflatoxins，简称AFs)主要是由黄曲霉A.flavus和寄生曲霉A.parasiticus产生的一类具有生物活性的有毒次生代谢产物，目前已经证实有17种AFs相关的衍生物，包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)和G2(AFG2)，而其中又以AFB1的毒性最强，因此1993年世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构(IARC)将其划定为Ⅰ类致癌物，而另外三种黄曲霉毒素AFB2、AFG1和AFG2先后也被划分为2B类致癌物。鉴于AFs具有极强的毒性作用，且对人和动物的危害性大，世界各国及相关组织纷纷制定了严苛的限量标准。《中华人民共和国药典》(2015版)要求对部分中药材如远志、大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁等必需开展黄曲霉毒素检测，并规定AFG2、AFG1、AFB2、AFB1总量不得超过10μg/kg。
目前中药中黄曲霉毒素的检测方法主要是仪器分析方法，包括薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。薄层色谱法检测方便，但检测限高，不能很好地定量；高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等检测准确、检测限低，但需要复杂的样品前处理过程、专门的仪器以及专业的人员培训。仪器分析方法的这些先天性不足，使其在实际应用中受到了很大的限制。
免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株制备的单克隆抗体对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2均具有较好的特异性和较高的检测灵敏度，对中药中可能存在的真菌毒素、农药、重金属、炮制过程中使用的辅料及污染菌等均具有较好的抗干扰性，为建立中药中黄曲霉毒素总量的免疫学检测方法奠定基础。
本发明的技术方案，一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为抗总黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F-3-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13806，保藏日期为2017年03月08日。
抗总黄曲霉毒素单克隆抗体，其是由保藏编号为CGMCC No.13806的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F-3-1分泌产生的，所述抗总黄曲霉毒素单克隆抗体应用于中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的分析检测。
本发明提供F-3-1细胞株的基本制备过程：
(1)AFs半抗原合成及鉴定：在25mL圆底烧瓶中加入100mg黄曲霉毒素B1和5mL N,N-二甲基甲酰胺，机械搅拌溶解，0℃条件下缓慢滴加147.3mg三氯氧磷，升温至40℃，并在磁力搅拌下反应2h，再升温至80℃继续搅拌反应3h，反应结束后，自然冷却，缓慢倒入冰水中，加入w(NaOH)＝10％的水溶液调节溶液pH＝7～8，用乙酸乙酯30mL，萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥蒸干。无水乙醇重结晶，得黄色固体醛基黄曲霉毒素B1 103mg，即为AFs半抗原，收率95.37％，核磁共振氢谱鉴定结果；
(2)完全抗原合成：将AFs半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联得到免疫抗原(AFs-BSA)和包被抗原(AFs-OVA)；
(3)动物免疫：取健康的6～8周雌性Balb/c小鼠10只(分为A与B两组，每组5只)，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下多点注射，每只小鼠免疫剂量为200μg AFs-BSA；之后加强免疫每两周颈背部皮下多点注射一次，乳化用弗氏不完全佐剂；最后一次免疫使用生理盐水代替弗氏不完全佐剂，采用腹腔注射，注射剂量和前面几次相同；通过间接ELISA检测血清效价；
(4)细胞融合与细胞株筛选：加强免疫后第三天，通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过完全培养液培养，利用间接ELISA法检测分泌AFB1的细胞株，利用间接竞争ELISA法测定该细胞株的抑制效果，筛选对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2均有抑制的阳性细胞株进行三次亚克隆，最终获得杂交瘤细胞株F-3-1；
(5)抗体制备纯化及特性鉴定：将液体石蜡注射6～8周Balb/c小鼠，500μL/只；10天后每只小鼠0.5mL杂交瘤细胞CGMCC No.13806注射到腹腔，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，SDS-PAGE凝胶电泳法分析纯化效果，获得的单克隆抗体进行效价、亚型、交叉反应性、抗干扰性测定，置于-20℃保存；
(6)抗体的应用：将杂交瘤细胞株F-3-1分泌的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体用于制备黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒，以用于中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的分析检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的杂交瘤细胞株F-3-1可以用于制备高效价抗总黄曲霉毒素单克隆抗体，抗总黄曲霉毒素小鼠腹水抗体ELISA法测得的效价≥9×106。
(2)本发明提供的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体灵敏度高、特异性好、抗干扰性好，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为0.046μg/L，与AFB2的交叉反应率为110％，与AFG1的交叉反应率为96％，与AFG2的交叉反应率为78％，对中药中可能存在的真菌毒素、农药、重金属、炮制过程中使用的辅料及污染菌等均具有较好的抗干扰性。
(3)本发明提供的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体可应用于测定中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量。
生物材料样品保藏：一株分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年03月08日，保藏编号为CGMCCNo.13806。
附图说明
图1黄曲霉毒素半抗原合成路线图
图2黄曲霉毒素半抗原核磁共振氢谱图
图3抗总黄曲霉毒素单克隆抗体SDS-PAGE电泳结果图
图4黄曲霉毒素竞争ELISA标准曲线图
图5黄曲霉毒素竞争ELISA Logit/Log标准曲线图
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：杂交瘤细胞株F-3-1的筛选
1.半抗原合成及鉴定
AFs半抗原的合成路线如附图1所示。
在25mL圆底烧瓶中加入100mg黄曲霉毒素B1和5mL N,N-二甲基甲酰胺，机械搅拌溶解，0℃条件下缓慢滴加147.3mg三氯氧磷，升温至40℃，并在磁力搅拌下反应2h，再升温至80℃继续搅拌反应3h，反应结束后，自然冷却，缓慢倒入冰水中，加入w(NaOH)＝10％的水溶液调节溶液pH＝7～8，用乙酸乙酯30mL，萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥蒸干。无水乙醇重结晶，得黄色固体醛基黄曲霉毒素B1 103mg，即为AFs半抗原，收率95.37％。
取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，结果见附图2。1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：10.36(1H,s,-CHO)，6.78(1H,s,-CH-)，6.22(1H,d,C＝C)，4.82(1H,dd,C＝C)，4.31(1H,dd,-CH-)，3.83(3H,s,-OCH3)，2.98(2H,dd,CH2)，2.07(2H,t,CH2)。图谱中，化学位移δ＝10.36的为引入的醛基氢共振吸收峰，除原药本身具有的特征氢吸收峰外，该氢吸收峰的存在，证明间隔臂偶联成功，AFs半抗原结构正确。
2.完全抗原合成
免疫抗原合成——AFs半抗原与BSA偶联
取AFs半抗原12mg，加N,N-二甲基甲酰胺0.5mL溶解，得到A液；另取50mg BSA，加pH5.4 0.05mol/L醋酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，4℃搅拌过夜，加5mg硼氢化钠，继续搅拌2h，0.05mol/L磷酸盐缓冲液透析三天，每天换液3次，封装，-20℃保存备用。
包被抗原合成——AFs半抗原与OVA偶联
取AFs半抗原6mg，加二甲基亚砜0.5mL溶解，得到A液；另取50mg OVA，加pH5.40.05mol/L醋酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，4℃搅拌过夜，加3mg硼氢化钠，继续搅拌2h，0.05mol/L磷酸盐缓冲液透析三天，每天换液3次，封装，-20℃保存备用。
3.动物免疫
取健康的6～8周雌性Balb/c小鼠10只(分为A与B两组，每组5只)，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下多点注射，每只小鼠免疫剂量为200μg AFs-BSA；之后加强免疫每两周颈背部皮下多点注射一次，乳化用弗氏不完全佐剂；最后一次免疫使用生理盐水代替弗氏不完全佐剂，采用腹腔注射，注射剂量和前面几次相同。具体免疫步骤见表1。
表1小鼠免疫程序
Figure BDA0001265750860000041
第三次、四次、加强免疫后7d，对小鼠断尾取血，ELISA方法测定小鼠血清效价，具体步骤如下：
(1)用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原(AFs-OVA)做1:1000稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以PBST洗涤1次，拍干；
(2)每孔加入150μL封闭液，37℃反应2h后倾去封闭液，拍干；
(3)每孔加入50μL以PBS倍比稀释的抗血清，25℃反应30min后倾去反应液，以PBST洗涤3～5次，每次间隔30s，拍干；
(4)加PBS稀释的酶标二抗(1:1000)100μL/孔，25℃反应30min，以PBST洗涤3～5次，每次间隔30s，拍干；
(5)每孔加入底物显色液A液和B液各50μL，25℃避光反应15min，每孔加入50μL2mol/L的H2SO4溶液终止反应；
(6)酶标仪测定波长在450nm的OD值，以样品孔OD450接近于1的稀释倍数作为阳性血清的效价。
4.细胞融合
(1)饲养细胞制备：断颈处死8～10周龄Balb/c小鼠，浸泡在75％酒精中5min，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mL RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，轻轻抽回注射器，晃动小鼠腿部和尾部几次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。如此反复操作3～4次。1000r/min离心10min，弃上清。用20～50mL完全培养液重悬细胞，100μL/孔滴加到培养板，置培养箱备用。
(2)脾细胞制备：加强免疫后3d，取免疫Balb/c小鼠，眼眶采血后脱臼处死，在75％酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50mL离心管中，加RPMI-1640至30mL，1500～2000r/min离心5min，弃上清，加RPMI-1640至30mL，计数待用。
(3)骨髓瘤细胞制备：取3瓶生长状态良好的(活细胞数>95％)骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50mL离心管中，加RPMI-1640至30mL，1500～2000r/min离心5min，弃上清，加RPMI-1640至30mL，计数待用。
(4)细胞混合：脾细胞:骨髓瘤细胞＝8:1，混合，1500～2000r/min离心5min。
(5)细胞融合：将混合好的细胞离心，倒干上清，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1min内加入1mL融合剂，融合剂为聚乙二醇(PEG)4000，作用2min，并轻轻搅拌细胞，在随后4min内加入20mL无血清的PEG营养液，1000r/min离心10min，弃上清。用20～50mL完全培养液重悬细胞，铺种于含饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μL，置培养箱中。
5.细胞株筛选
待细胞长至孔底的1/2～1/3时，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用AFB1、AFB2、AFG1、AFG2为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准品均具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的细胞株F-3-1。该细胞株已于2017年03月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13806。
实施例2：抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的制备纯化和特性鉴定
1.腹水制备
将液体石蜡注射6～8周Balb/c小鼠，500μL/只。10天后将处于对数生长期的杂交瘤细胞CGMCC No.13806用RPMI-1640基础培养基收集，用血球计数板和显微镜计数，细胞浓度在1.0×106～1.5×106个/mL范围内。每只小鼠0.5mL杂交瘤细胞CGMCC No.13806注射到腹腔。注意观察在一周后小鼠腹部膨大，用无菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到小鼠自然死亡。4℃下5000r/min离心5min，收集上清，并去掉腹水上层漂浮的脂肪和蛋白质膜。
2.抗体纯化
单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵方法纯化，具体步骤如下：
(1)将腹水从-20℃冰箱拿出室温解冻。腹水用双层滤纸过滤，初步除去脂肪片、细胞碎片及其他杂质。12000r/min离心15min，取上清，弃沉淀。精确量腹水体积；
(2)1份体积的腹水与3份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCl调pH至4.5～4.8；
(3)磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，1mL腹水加33μL正辛酸，加完后室温磁力搅拌30min，后置4℃静置2h；
(4)12000r/min离心5min，取上清，双层滤纸过滤，收集滤液；
(5)量取滤液体积，加入1/10体积的0.1mol/L pH7.4的PBS，用2mol/L NaOH(记录NaOH体积)调pH至7.4；
(6)将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4℃过夜；
(7)12000r/min离心15min，弃上清。用一定体积的0.01mol/L PBS溶解沉淀。用PB透析两天后换0.01mol/L PBS透析两天，收集透析液，12000r/min离心15min，取上清，置-20℃保存；
(8)纯化的抗体用SDS-PAGE凝胶电泳法分析纯化效果，结果见附图3，抗体在变性SDS-PAGE电泳后，目的蛋白带大小与预期一致。抗体会解离成两个亚基，一个大亚基(重链，45kD)和一个小亚基(轻链，25kD)，说明纯度良好。
3.抗体效价测定
采用间接ELISA方法测定，具体步骤为：
(1)用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原(AFs-OVA)做1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以PBST洗涤1次，拍干；
(2)每孔加入150μL封闭液，37℃反应2h后倾去封闭液，拍干；
(3)用PBS将单克隆抗体做1:105、1:3×106、1:9×106、1:2.7×107、1:8.1×107梯度稀释，同时将酶标二抗稀释1000倍，稀释好的抗体与酶标二抗做10:1混合，每孔加入100μL，置25℃温箱中孵育45min，每个浓度做一个重复，以PBST洗涤3～5次，每次间隔30s，拍干；
(5)每孔加入底物显色液A液和B液各50μL，25℃避光反应15min，每孔加入50μL2mol/L的H2SO4溶液终止反应；
(6)酶标仪测定波长在450nm的OD值，结果见表2。
表2效价测定结果
Figure BDA0001265750860000071
Figure BDA0001265750860000081
由表2可知，运用棋盘法检测，以OD值大于1.0的抗体浓度作为效价，结果显示在抗原分别包被1:1000、1:2000、1:4000、1:8000时，5批抗体的效价分别为1:1:2.7×107、1:1:2.7×107、1:9×106、1:9×106(第1批)，1:1:2.7×107、1:1:2.7×107、1:9×106、1:9×106(第2批)，1:1:2.7×107、1:1:2.7×107、1:9×106、1:9×106(第3批)，1:1:2.7×107、1:1:2.7×107、1:9×106、1:9×106(第4批)，1:1:2.7×107、1:1:2.7×107、1:9×106、1:9×106(第5批)，可见，抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的效价≥9×106。
4.抗体亚型鉴定
用市售SIGMA亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株F-3-1分泌的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的亚型为IgG1型。
5.抗体交叉反应性测定
采用间接竞争ELISA方法测定，具体步骤为：
(1)用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原(AFs-OVA)做1:1000稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以PBST洗涤1次，拍干；
(2)每孔加入150μL封闭液，37℃反应2h后倾去封闭液，拍干；
(3)每孔先加入50μL系列稀释的黄曲霉毒素标准工作液(浓度分别为0、0.05、0.15、0.45、1.35μg/L)，然后加入50μL以PBS做1:20000稀释的单克隆抗体，25℃反应30min后倾去反应液，以PBST洗涤3～5次，每次间隔30s，拍干；
(4)加PBS稀释的酶标二抗(1:1000)100μL/孔，25℃反应30min，以PBST洗涤3～5次，每次间隔30s，拍干；
(5)每孔加入底物显色液A液和B液各50μL，25℃避光反应15min，每孔加入50μL2mol/L的H2SO4溶液终止反应；
(6)酶标仪测定波长在450nm的OD值。
以黄曲霉毒素浓度的对数值为横坐标，以百分吸光度值(各浓度标准品OD值与不加标准品孔OD值的百分比)为纵坐标绘制标准曲线。以各曲线50％百分吸光度值的质量浓度(IC50)按下式计算交叉反应率，结果见表3，交叉反应率越小，抗体特异性越高。
Figure BDA0001265750860000091
式中：
Si——交叉反应率，％；
y——AFB1标准工作液曲线的IC50值；
z——AFB1以外黄曲霉毒素标准工作液曲线的IC50值。
表3交叉反应测定结果
Figure BDA0001265750860000092
由表3可知，抗总黄曲霉毒素单克隆抗体对四种黄曲霉毒素均有交叉反应，说明该抗体可以用于测定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的总量。
6.抗体抗干扰性测定
根据5.交叉反应性的测定步骤绘制黄曲霉毒素B1的标准曲线，同时分别将以下干扰物质用标准品缓冲液稀释至表格所列的添加值用于分析，根据药物显色对应的OD值，结合标准曲线分析出的回收值算出交叉反应率(交叉反应率＝回收值/添加值×100％)，结果见表4。
表4对中药中常见的其他物质的抗干扰性数据
Figure BDA0001265750860000093
Figure BDA0001265750860000101
Figure BDA0001265750860000111
由表4可知，中药中可能存在的真菌毒素、农药、重金属、炮制过程中使用的辅料及污染菌对抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的性质没有干扰。
实施例3：抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的应用
将杂交瘤细胞株F-3-1分泌的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体用于制备黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒，以用于中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的分析检测。
1.酶联免疫试剂盒的组成
(1)包被抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的酶标板；
(2)酶标黄曲霉毒素抗原：实施例1中所述的包被抗原与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联制备获得，并用酶标抗原稀释液稀释至最佳工作浓度；
(3)黄曲霉毒素B1标准品：标准品溶液浓度分别为0μg/L、0.03μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.6μg/L；
(4)底物显色液：由A液和B液组成，A液为2％过氧化脲的水溶液，B液为1％四甲基联苯胺的水溶液；
(5)终止液：2mol/L硫酸溶液；
(6)洗涤液：每1L洗涤液按照如下方法配制：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为7.4；
(7)复溶液：每1L复溶液按照如下方法配制：将12g酪蛋白用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为7.4。
2.试剂盒组分的制备
(1)包被抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的酶标板的制备
用包被缓冲液将抗总黄曲霉毒素单克隆抗体稀释至最佳工作浓度，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，37℃孵育2h，甩掉包被液，用洗涤液洗涤1次，每次30s，拍干，然后在每孔加入150μL封闭液，37℃孵育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；
封闭液：每1L封闭液按照如下方法配制：将5mL马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为7.2。
(2)酶标黄曲霉毒素抗原的制备
取实施例1中所述的包被抗原15mg，加入300μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入碳化二亚胺10mg和N-羟基琥珀酰亚胺10mg，活化反应0.5h；用0.05mol/L、pH9.0的CB缓冲液0.5mL，溶解辣根过氧化物酶20mg，加入2mL水，然后加入上述活化液300μL，加入1mol/L氢氧化钠30μL，室温反应4h；用0.02mol/L PBS透析2天，每天换液4次，取出得到透析液2.8mL；加入BSA保护蛋白，万分之五防腐剂，并用酶标抗原稀释液稀释至最佳工作浓度，分装保存。
酶标抗原稀释液：每1L酶标抗原稀释液按照如下方法配制：将8g牛血清白蛋白用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为7.2。
3.试剂盒检测方法
(1)样品前处理
称取1.0g粉碎的中药样本至50mL离心管中，加入10mL甲醇，振荡5min，3000g室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；取2mL至10mL干净离心管中，于20-30℃(68-86℉)水浴氮气流下吹干；加入2mL去离子水涡动1min，再加入6mL三氯甲烷振荡5min，3000g室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；去掉上层水相，取下层3mL于20-30℃(68-86℉)水浴氮气流下吹干；加入1mL正己烷涡动2min，再加入1mL复溶液涡动3min，3000g室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；去掉上层有机相，取下层进行分析。
(2)用试剂盒检测
向板孔中加入AFB1标准品溶液/样本液20μL/孔，酶标黄曲霉毒素抗原80μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应45min，倒出孔内液体，每孔加入洗涤液250μL，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液A液和B液各50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min；每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔的吸光度值。
(3)结果计算
计算百分吸光度值：用所获得的标准品溶液或样本液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见下式：
Figure BDA0001265750860000131
式中：W——百分吸光度值，％；
A——标准品溶液或样本液的平均吸光度值；
A0——空白溶液(浓度为0μg/L的标准品溶液)的平均吸光度值。
绘制标准曲线：以计算的百分吸光度值(％)为纵坐标，标准品溶液浓度的对数值(log10)为横坐标绘制标准曲线。
样本结果计算：将样本液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度后，样本中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的总量按下式计算：
X＝C×n
式中：X——样本中黄曲霉毒素的总量，μg/kg；
C——从标准曲线上查得的样本中黄曲霉毒素的浓度，μg/L；
n——样本稀释倍数。
也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。
注：计算结果扣除空白值，所得结果保留一位小数。
4.检测效果评价
(1)线性关系
标准溶液浓度分别为0、0.03、0.1、0.2、0.6μg/L，测定的OD值见表5。以百分吸光度值(W，％)为纵坐标，标准溶液浓度的对数值(log10)为横坐标绘制标准曲线(见附图4)。以logitW为纵坐标，标准溶液浓度的对数值为横坐标，将附图4转换后可知，在0.03μg/L～0.6μg/L浓度范围内，logitW与黄曲霉毒素B1浓度对数呈现良好的线性关系(见附图5)，得回归方程Y＝－2.852X－3.142，R2＝0.980。
表5标准溶液的OD值测定结果
Figure BDA0001265750860000141
(2)方法检测限和定量限
参照《中华人民共和国药典》2015年版9101药品质量标准分析方法验证指导原则，方法检测限LOD＝3.3δ/S，定量限LOQ＝10δ/S，式中δ：测定空白值的标准偏差；S：标准曲线的斜率。
根据上述(1)可知，δ＝0.033，S＝2.852，因此确定检测限LOD为0.038μg/L，定量限LOQ为0.116μg/L。
(3)样本检测限
采用不同来源的空白麦芽、桃仁、酸枣仁、胖大海、僵蚕、蜈蚣、薏苡仁、全蝎、水蛭、莲子、使君子、陈皮、远志、决明子、大枣、槟榔、地龙、柏子仁样品各20份进行测定，检测限以测定平均值加3倍标准偏差确定，结果见表6。
表6样本检测限结果
样品 检测限/(ng/kg) 样品 检测限/(ng/kg) 样品 检测限/(ng/kg)
麦芽 244.7 桃仁 329.4 酸枣仁 253.4
胖大海 240.9 僵蚕 270.2 蜈蚣 430.6
薏苡仁 223.7 全蝎 494.9 水蛭 294.1
莲子 293.5 使君子 282.6 陈皮 277.0
远志 451.1 决明子 578.6 大枣 392.5
槟榔 272.5 地龙 341.4 柏子仁 590.6
(4)准确度(回收率)与精密度(重复性)
以不含黄曲霉毒素的僵蚕、莲子、酸枣仁、薏苡仁、桃仁、水蛭为空白样品基质，进行三个浓度水平的添加回收试验，分别用三批次试剂盒测定，计算样品添加回收率和批内、批间变异系数，结果见表7。
表7样本准确度与精密度结果
Figure BDA0001265750860000142
Figure BDA0001265750860000151
结果表明，僵蚕、莲子、酸枣仁、薏苡仁、桃仁、水蛭6种基质的添加回收率在60％～120％，批内、批间变异系数均＜15％。
(4)试剂盒保存期
试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、AFs添加回收率均在正常范围内。考虑到运输和使用过程中会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃下放置8天进行加速老化实验，结果该试剂盒的各项指标完全符合要求；考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒在-20℃冰箱中放置8天，结果该试剂盒的各项指标也完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少保存12个月以上。

Claims (3)

1.一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为抗总黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F-3-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13806，保藏日期为2017年03月08日，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是通过AFs半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫抗原后免疫小鼠制备并筛选得到的；所述AFs半抗原的合成方法为：在25mL圆底烧瓶中加入100mg黄曲霉毒素B1和5mL N,N-二甲基甲酰胺，机械搅拌溶解，0℃条件下缓慢滴加147.3mg三氯氧磷，升温至40℃，并在磁力搅拌下反应2h，再升温至80℃继续搅拌反应3h，反应结束后，自然冷却，缓慢倒入冰水中，加入NaOH质量分数为10%的水溶液调节溶液pH=7~8，用乙酸乙酯30mL，萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥蒸干，无水乙醇重结晶，得黄色固体醛基黄曲霉毒素B1 103mg，即为AFs半抗原。
2.一种抗总黄曲霉毒素单克隆抗体，其特征在于：它是由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.13806的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株F-3-1分泌产生的。
3.权利要求2所述抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的应用，其特征在于：用于中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的分析检测。
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