CN102998460A

CN102998460A - 一种口蹄疫病毒抗体的elisa试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN102998460A
Application number: CN2012104273102A
Authority: CN
Inventors: 李其昌; 陈善真; 李中圣; 刘小琴; 罗均; 赵焱; 陈克宏; 王贵平
Original assignee: GUANGDONG MODERN AGRICULTURE GROUP RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: GUANGDONG MODERN AGRICULTURE GROUP RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2032-10-31
Also published as: CN102998460B

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种口蹄疫病毒（FMDV）抗体的ELISA试剂盒及其制备方法，利用非蛋白多聚体定向偶联FMDV人工合成多肽作为抗原快速检测口蹄疫病毒。本发明采用非蛋白多聚体定向偶联多肽抗原作为包被液，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高。本发明的口蹄疫病毒抗体ELISA检测试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA检测试剂盒检测口蹄疫病毒抗体，包被抗原用量可减至10ng/mL，降低了检测成本，有利于推广使用。

Description

一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种口蹄疫病毒（FMDV）抗体的ELISA试剂盒及其制备方法，利用非蛋白多聚体定向偶联FMDV人工合成多肽作为抗原快速检测口蹄疫病毒。

背景技术

口蹄疫由口蹄疫病毒(FMDV)所致急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，以发热、口腔黏膜及蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征，是国际兽疫局规定的A类传染病，易通过空气传播，传染性强，流行迅速，偶尔感染人，主要发生在与患畜密切接触的人员，多为亚临床感染。

对畜牧产业来讲，口蹄疫是一个相当大的经济威胁，这种高传染性疾病影响所有的偶蹄类动物，并且在世界上广泛传播。FMD 的病原为口蹄疫病毒( Foot- and- mouth disease virus，FMDV) 。口蹄疫病毒（FMDV）属于小RNA毒科口蹄疫病毒属，有A、O、C、Asial、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型，各血清型间无交叉免疫保护，这种血清型可以用传统的血清学方法诊断。

FMDV基因组为单股正链RNA，长约8.5Kb。基因组的中部是一个大的开放阅读框（ORF），编码病毒的多聚蛋白，该聚蛋白经裂解后形成L前导蛋白、P1区结构蛋白、P2区和P3区非结构蛋白。FMDV P1区结构蛋白最终成熟裂解为4种结构蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4。研究发现FMDV抗原位点几乎都集中在P1区，其中VP1、VP2、VP3、位于抗原蛋白衣壳表面，VP4位于衣壳内部，4种结构蛋白都具有免疫原性。现已证明，对于O 型口蹄疫，有3 个中和性抗原位点在VP1 上，位于21~ 40、141~ 160、200~ 213 位氨基酸，其中141 ~ 160 位及200 ~ 213 位氨基酸为B 细胞表位，引发体液免疫反应。从病毒衣壳蛋白分离的VP1 可诱导动物产生针对该表位的中和性抗体。

目前世界各地对病毒类疾病的诊断方法主要有病毒分离、分子生物学诊断(RT-PCR)和基于血清学试验的免疫过氧化物酶细胞单层测定法(IPMA)，中和试验(SN)，间接免疫荧光试验(ILFT)，和酶联免疫吸附试验(ELISA)等等。与其他方法与相比，ELISA 检测操作简便，易于标准化，快速敏感，非常适合进行大规模流行病调查和疫病监测。ELISA检测又分为间接ELISA和竞争ELISA。传统的ELISA法检测中，包被抗原的用量大，一般需要5～10μg/mL。由于抗原的使用量大，使得其检测成本也较为高昂，不利于该方法的推广使用。目前市面上销售的产品主要为荷兰赛迪诊断公司的口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒，它只能检测O型口蹄疫病毒，不能检测其他血清型，且价格昂贵。

近年来，人们已经开始尝试利用衣壳蛋白上的抗原表位设计重组基因工程抗原，或者使用人工合成的特异免疫活性多肽来检测和预防FMD。如能将合成多肽更广泛地用于疾病诊断的试剂中，可以缩短产品的研发时间，简化生产程序，降低生产成本。但是合成多肽成功地用于疾病的诊断的成功例子很少。这是由于保持包被多肽在固相（ELISA板）上正确方向性的技术问题一直未解决，从而严重影响了多肽与目标抗体的结合，导致多肽ELISA的灵敏度偏低，非特异背景读值偏高。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测口蹄疫病毒（FMDV）抗体的ELISA试剂盒，利用非蛋白多聚体定向偶联FMDV人工合成反应原性多肽作为抗原，以获得灵敏度高、特异性高、操作简单、并快速检测口蹄疫病毒的ELISA检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种口蹄疫病毒（FMDV）抗体的ELISA试剂盒的制备方法。

为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：

一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，包括非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的酶标板；阳性血清和阴性血清各1管，其中阳性血清为FMDV标准阳性血清稀释液，阴性血清为FMDV标准阴性血清稀释液；用辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液的酶标二抗1瓶；抗体稀释液1瓶；底物显色液1瓶；终止液1瓶。

所述非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液是非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原用包被液按照0.01μg/mL- 5μg/mL浓度稀释；偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原是通过以下方法制备得到的：

1）选取反应原性多肽溶解，得到多肽溶液；

2）取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；

3）在多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；

4）将多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使多肽偶联到非蛋白多聚体上；

5）用透析袋去除未参与结合的偶联剂及游离多肽，纯化，冻干，得到偶联多肽；

其中口蹄疫病毒反应原性多肽为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:18系列多肽中的一种或几种。

优选的，所述偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺（EDC）、N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚基胺盐酸盐（EEDQ）、戊二醛中的一种或两种以上混合。

优选的，所述非蛋白多聚体为具有可偶联基团的多糖，可偶联基团为氨基（-NH2），羧基 (-COOH)，巯基（-SH）中的至少一种。

本发明中通过DNAStar、Genebank、ProtScale等分析软件对猪口蹄疫病毒蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇（epitopes）。使用ELISA检测不同多肽与猪口蹄疫病毒抗血清的反应，最后选出具有良好反应的口蹄疫病毒反应原性多肽。

本发明中所述偶联多肽抗原包被液包被的酶标板是用非蛋白多聚体定向偶联多肽抗原包被液包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜包被，包被浓度为0.01μg/mL- 5μg/mL，用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2-4次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；所述包被液为1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL。

本发明中所采用的酶标板为至少8孔的酶标板，优选的为48孔或96孔的酶标板。

本发明中所述的辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液是用HRP保护液按照辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG与HRP保护液体积比为1﹕2000-10000的比例稀释，酶标二抗每瓶量为12mL；所述HRP保护液为0.1% BSA, 1.0g BSA， 0.25% EDTA, 2.5g EDTA，加PBS至 1000mL。

本发明中所述的FMDV标准阳性血清稀释液是用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阳性血清稀释，每管量为1mL ；FMDV标准阴性血清稀释液用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阴性血清稀释，每管量为1mL。

本发明中所述的抗体稀释液为0.1%BSA, 1.0g BSA加入PBS至 1000mL；每瓶量为12mL。

本发明中所述的底物显色液为50mg TMB，10mL DMSO，9.8g柠檬酸和1.2mL 30% H₂O₂ 加蒸馏水定容至1000mL；每管量为12mL。

本发明中所述的终止液包括双蒸水178.3mL和98%的浓硫酸21.7mL，每管量为6mL。

本发明所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒还包括1瓶洗涤液，所述洗涤液为0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，0.5mL Tween-20（0.05% V/V），加双蒸水定容至100mL，pH值为7.4。

一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒的制备方法，包括以下步骤

1）用非蛋白多聚体偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被酶标板：将非蛋白多聚体偶联多肽抗原用包被液稀释，然后将稀释的偶联多肽抗原包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜包被，包被浓度为0.01μg/mL- 5μg/mL，次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2-4次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；

2）抗体稀释液（AD）配制：称取 1.0g BSA（0.1%），加PBS至 1000mL，4℃保存；

3）底物液显色液配制：4mL TMB（50mg TMB 溶于10mL DMSO中），9.8g柠檬酸，1.2mL 30% H₂O₂加蒸馏水定容至1000mL，4℃避光保存；

4）终止液配制：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL；

5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:16-1:64稀释，1mL/管分装，4℃保存；

6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:2000-1:10000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4℃保存；

7）试剂盒的组装：将非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被的酶标板1块、1mL/管的阴阳性血清各1管、12mL/瓶的抗体稀释液1瓶、12mL/瓶的酶标二抗1瓶、12mL/瓶的底物显色液1瓶、6mL/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。

上述制备方法中所述的包被液为1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明采用非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原作为包被抗原，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，本发明的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA检测试剂盒检测口蹄疫病毒抗体，包被抗原用量可减至10ng/mL，降低了检测成本，有利于推广使用。

下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

本发明中所采用的偶联多肽的制备方法如下：

1）口蹄疫病毒反应原性多肽的筛选

有效多肽段的选择和确定，通过DNAStar、Genebank、ProtScale等分析软件对猪口蹄疫病毒蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇（epitopes），使用ELISA检测不同多肽与猪口蹄疫病毒抗血清的反应，最后选出具有良好反应的口蹄疫病毒反应原性多肽，本发明中采用以下筛选出来的多肽如下：

P1：Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Arg Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Thr Ser Ser Asn Tyr ；

P2：Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Ala Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；

P3：His Gln Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe；

P4：Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe；

P5：Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn ThrVal Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe；

P6： Lys Tyr Asp Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P7：Lys Tyr Ala Glu Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P8：Lys Tyr Ala Gly Gly Pro Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Arg Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P9：Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P10：Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Pro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P11：Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P12：Lys Tyr Gly Lys Ser Pro Val Ala Asn Ala Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr Pro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P13：Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Ala Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr Pro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P14：Ser Lys Tyr Gly Asp Ala Ser Ala Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Thr Glu Lys Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe；

P15：Lys Tyr Ser Ser Lys Ala Val Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Asn Val Leu Glu Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P16：Val Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Asn Val Leu Glu Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P17：Tyr Ala Glu Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

P18：Lys Tyr Gly Lys Ser Pro Val Ala Asn Ala Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr Pro Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr；

2）口蹄疫病毒反应原性偶联多肽的制备

称取 10mg 的上述任一种反应原性多肽，加50μL DMSO溶解，然后加入10mL双蒸水，称取 1mg 的聚葡萄糖胺，加1mL PBS溶解，在多糖溶液内加10 mg 偶联剂EDC 混匀，然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3 小时。使用透析袋（孔径MWCO 10000 -12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC）及游离对肽，纯化、冻干，得到偶联多肽。

实施例1

一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，通过以下方法制备：

1）选择上述任一种偶联多肽抗原用包被液按照5μg/mL的浓度稀释（包被液为1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL），然后将稀释的偶联多肽抗原包被96孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤3次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；

3）底物液显色液配制：4mL TMB（50mg TMB 溶于10mL DMSO中），9.8g柠檬酸，1.2mL 30% H₂O₂ 加蒸馏水定容至1000mL，4℃避光保存；

4）终止液配制（2 mol/L H₂SO₄）：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL；

5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:16稀释，1mL/管分装，4℃保存；

6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:2000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4℃保存；

7）试剂盒的组装：将偶联多肽抗原包被的96孔酶标板1块、1mL/管的阴阳性血清各1管、12mL/瓶的抗体稀释液1瓶、12mL/瓶的酶标二抗1瓶、12mL/瓶的底物显色液1瓶、6mL/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA检测试剂盒。

实施例2

一种口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，通过以下方法制备：

1）选择上述任一种偶联多肽抗原用包被液按照1μg/mL的浓度稀释（包被液为1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL），然后将稀释的偶联多肽抗原包被96孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤4次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；

5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:64稀释，1mL/管分装，4℃保存；

6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:4000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4℃保存；

7）试剂盒的组装：将偶联多肽抗原包被的96孔酶标板1块、1mL/管的阴阳性血清各1管、12mL/瓶的抗体稀释液1瓶、12mL/瓶的酶标二抗1瓶、12mL/瓶的底物显色液1瓶、6mL/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。

实施例3

一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，通过以下方法制备：

1）选择上述任一种偶联多肽抗原用包被液按照0.1μg/mL的浓度稀释（包被液为1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL），然后将稀释的偶联多肽抗原包被96孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤4次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；

5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:32稀释，1mL/管分装，4℃保存；

6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:8000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4℃保存；

应用实施例1：

利用本发明的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒检测抗体的使用方法如下：

1）偶联多肽抗原包被液包被的96孔板中每孔内加入100μL已经稀释好的各样本，每个样品必须使用一个独立的枪头，每块板中阴阳性对照血清各设两孔室温下孵育30分钟，再将各孔的液体弃入废液缸内；

2）用微量移液器取洗涤液，洗涤96孔板，约250μL/孔，洗涤6次，最后一次加入洗涤液后浸泡洗涤5min，再将板中残留的洗涤液弃入废液缸内，然后用力扣拍到吸水材料上，注意应避免包被板孔干燥；

3）然后在每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体，室温下孵育30分钟，并重复该步骤；

4）每孔加入100μL TMB底物液，避光显色10分钟，每孔加入50μL终止液，使反应终止，轻震酶标板，使板内液体混匀；

5）使用酶标仪测定并记录样本和对照样本的A450吸收值，10min完成测定；

本实验结果应符合下列条件：

FMD阳性对照的平均值（P）减去阴性对照的平均值（N）必须大于0.15，阴性对照平均值（N）必须小于或等于0.15，FMD抗体的阳性/阴性通过计算样品与阳性对照（S/P）的比值进行判定，具体计算方法如下:

Figure 2012104273102100002DEST_PATH_IMAGE001

如果S/P值小于0.20，样品应判定为FMD抗体阴性（-）。

如果S/P值在0.20-0.25之间判定为样品FMD可疑（+/-），如果S/P值大于0.25，则判定为样品FMD抗体阳性（+）。

性能测试：

1.敏感性试验

A、用不同浓度抗原包被检测，由下结果（表1）可知，FMD多肽在0.125μg/mL包被时仍有很高的OD值，说明即使低浓度包被该方法都有很高的敏感性。

表1：不同抗原浓度包被及不同血清稀释度检测敏感性比较

血清稀释度	抗原浓度1μg/mL	抗原浓度0.5μg/mL	抗原浓度0.25μg/mL	抗原浓度0.125μg/mL
					阳性1/32	1.083	0.957	0.792	0.662
阴性1/32	0.088	0.078	0.065	0.083
					阳性1/64	0.885	0.784	0.588	0.534
阴性1/64	0.076	0.071	0.077	0.068

B、确定最佳包被浓度后，用实施例中的3批试剂盒（不同时间包被），检测已知阳性样品。对阳性样品进行系列稀释（1:10、1:100、1:1000、1:10000）确定最低检出限量，并设阴性对照。由表2结果可知：在血清1:1000稀释时仍能检出，且不同批次试剂盒之间具有良好的重复性，说明该多肽抗原有很好的敏感性和稳定性。

表2：不同批次试剂盒的敏感性比较

2．特异性试验

用实施例中的3批试剂盒对经公认方法检测的其他疾病，如猪瘟（HCV）、伪狂犬（PRV）、圆环病毒2型（PCV2）、细小病毒（PPV）、蓝耳病毒（PRRSV）的阳性样品进行检测。表3结果说明，FMD多肽具有良好的特异性，不与其他疾病的阳性血清发生反应。

表3：不同批次试剂盒的特异性检验

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：包括非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的酶标板；阳性血清和阴性血清各1管，其中阳性血清为FMDV标准阳性血清稀释液，阴性血清为FMDV标准阴性血清稀释液；用辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG的稀释液1瓶；抗体稀释液1瓶；底物显色液1瓶；终止液1瓶。

2.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液是非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原用包被液按照0.01μg/mL- 5μg/mL浓度稀释，偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原是通过以下方法制备得到的：

1）选取反应原性多肽溶解，得到反应原性多肽溶液；

2）取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；

3）在反应原性多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；

4）将反应原性多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上；

5）用透析袋去除未参与结合的偶联剂及游离多肽，纯化，冻干，得到多聚体偶联反应原性多肽；

3.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的酶标板是用非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的至少8孔的酶标板，每孔100μL，4℃过夜包被，包被浓度为0.01μg/mL- 5μg/mL，用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2-4次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；所述包被液为1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL。

4.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液是用HRP保护液按照辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG与HRP保护液体积比为1﹕2000-10000的比例稀释，酶标二抗每瓶量为12mL；所述HRP保护液为0.1%BSA1.0g，0.25%EDTA2.5g，加PBS至 1000mL。

5.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述FMDV标准阳性血清稀释液是用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阳性血清稀释，每管量为1mL ；FMDV标准阴性血清稀释液用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阴性血清稀释，每管量为1mL。

6.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗体稀释液为0.1%BSA，1.0g BSA加入PBS至 1000mL；每瓶量为12mL。

7.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液为50mg TMB ，10mL DMSO，9.8g柠檬酸和1.2mL 30% H₂O₂ 加蒸馏水定容至1000mL；每管量为12mL。

8.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述终止液包括双蒸水178.3mL和98%的浓硫酸21.7mL，每管量为6mL。

9.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：其还包括1瓶洗涤液，所述洗涤液为0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，0.5mL Tween-20（0.05% V/V），加双蒸水定容至100mL，pH值为7.4。

10.一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤

1）用非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被酶标板；

2）抗体稀释液配制；

3）底物液显色液配制；

4）终止液配制；

5）阴阳性血清稀释；

6）酶标二抗配制；

7）试剂盒的组装：将非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被的酶标板1块、阴阳性血清各1管、抗体稀释液1瓶、酶标二抗1瓶、底物显色液1瓶、终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA检测试剂盒。