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CN102994600A - 甘精胰岛素前体的酶切转化方法 - Google Patents

甘精胰岛素前体的酶切转化方法 Download PDF

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CN102994600A
CN102994600A CN2012105328738A CN201210532873A CN102994600A CN 102994600 A CN102994600 A CN 102994600A CN 2012105328738 A CN2012105328738 A CN 2012105328738A CN 201210532873 A CN201210532873 A CN 201210532873A CN 102994600 A CN102994600 A CN 102994600A
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CN
China
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insulin glargine
precursor
enzyme
lantus
insulin
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CN2012105328738A
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Inventor
赵志全
熊继元
于锋臣
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LUNAN NEW ERA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
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LUNAN NEW ERA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，包括如下步骤：将甘精胰岛素前体溶解于pH8～11的缓冲液中，控制反应体系的温度为0～37℃，按胰蛋白酶与甘精胰岛素前体的质量比为1：1000～10000加入胰蛋白酶，反应2～40小时。本发明涉及的酶切转化方法能使产生的甘精胰岛素量显著增加，同时显著减少副产物，酶切收率高，所得的酶切液后续纯化容易，适合于工业生产上的应用。

Description

甘精胰岛素前体的酶切转化方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，特别涉及一种利用胰蛋白酶将甘精胰岛素前体酶切使转化成甘精胰岛素的方法。
背景技术
甘精胰岛素(glycine-arginine insulin)是一种通过基因重组技术获得并用于治疗Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的长效胰岛素类生物制品，其持续控制血糖的原理为：皮下注射后甘精胰岛素分子立即聚合，因而溶解度降低，形成甘精胰岛素沉淀物，机体吸收延迟，其降糖作用的时间也被延长。重组甘精胰岛素是当前治疗Ⅰ、Ⅱ型糖尿病十分方便和有效的药物。国外由Aventis公司生产的重组甘精胰岛素商品名为来得时（Lantus），国内由甘李药业有限公司生产的重组甘精胰岛素注射液商品名为长秀霖。
甘精胰岛素（glycine-arginine insulin,简称Glargine）的设计结构为21A-Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰岛素，即将人胰岛素A链的21位Asn替换成Gly，在B链的30位氨基酸后加入2个Arg而成。完整的重组甘精胰岛素由A链和B链共53个氨基酸组成，其中A链含有21个氨基酸，B链含有32个氨基酸。甘精胰岛素在大肠杆菌中以包涵体形式表达，表达产物为融合形式的重组甘精胰岛素前体，前体的结构设计为在B链和A链之间加入C肽（由33个氨基酸组成），组成的融合甘精胰岛素前体蛋白，线性序列为B（32）-C(33)-A(21)。该C肽保证了A链和B链的正确折叠，可通过胰蛋白酶酶切切除。
甘精胰岛素前体蛋白的氨基酸序列中有4个精氨酸和2个赖氨酸（Arg23，Arg 31，Arg 32，Arg 65；Lys29，Lys 64），都是胰蛋白酶的酶切位点。因此，采用胰蛋白酶将前体蛋白中的Arg 32和Arg 65羧基端切断，即可去除C肽后得到甘精胰岛素。然而，由于其他酶切位点的存在，胰蛋白酶作用于前体蛋白时不仅仅使Arg 32和Arg 65羧基端断裂，而且还可能将Arg23，Lys29和Lys 64位点切断，从而产生酶切副产物，降低了酶切收率，给后续纯化带来困难。
中国专利CN 1052332中公开了制备脱（64，65）胰岛素原的方法，即用胰蛋白酶处理人胰岛素原，产生的物质中包括（65-A1裂开）HPI，用羧肽酶B处理提纯的（65-A1裂开）HPI，可得到脱（64，65）胰岛素原。然而，在已公开文献中鲜有关于重组甘精胰岛素酶切工艺及参数的报道。
发明内容
本发明的目的在于通过优化酶切工艺参数，提供一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，即用胰蛋白酶酶切甘精胰岛素前体，使之转化生成甘精胰岛素的方法。该方法能最大程度地降低副产物的生成，给后续纯化工作带来了极大方便。
本发明的目的是通过采用下述技术方案来实现的：
一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，包括如下步骤：将甘精胰岛素前体溶解于pH8～11的缓冲液中，控制反应体系的温度为0～37℃，按胰蛋白酶与甘精胰岛素前体的质量比为1：1000～10000加入胰蛋白酶，反应2～40小时；所述缓冲液选自碳酸氢铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸或磷酸盐的缓冲液。
上述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其中所述缓冲液优选为20～100mM 碳酸氢铵，pH8～10；或20～100 mM Tris-CL，pH9～11；或20～100mM 甘氨酸，pH9～11。
上述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，优选将甘精胰岛素前体按5～10 g/L的浓度溶解于所述缓冲液中。
所述胰蛋白酶为未经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）处理或经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理的来自猪或牛的胰蛋白酶。
进一步优选地，所述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其中用于甘精胰岛素前体酶切转化的反应温度为4～25℃。
进一步优选地，所述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其中用于甘精胰岛素前体酶切转化的反应时间为5～30小时。
与现有技术相比，本发明涉及的酶切转化方法用于甘精胰岛素前体的酶切转化生成甘精胰岛素，能使产生的甘精胰岛素量显著增加，同时显著减少副产物，酶切收率高，所得的酶切液后续纯化容易，适合于工业生产上的应用。
具体实施方式
本发明实施例在酶切过程中用于检测酶切收率(%)的公式经推导如下：
一摩尔的甘精胰岛素前体经酶切得到一摩尔的甘精胰岛素，因此，
M1/Mr1=M2/Mr2
M2= M1×Mr2÷Mr1
=6063 M1÷10300
其中，M2为酶切后甘精胰岛素的量（g），Mr2为甘精胰岛素的分子量（6063道尔顿）；M1为酶切前甘精胰岛素前体的量（g），Mr1为甘精胰岛素前体的分子量（10300道尔顿）。
因此理论上，1克甘精胰岛素前体可产生0.59克甘精胰岛素。
酶切收率（%）=实际得到的甘精胰岛素的量（g）÷理论上应得的甘精胰岛素的量（g）×100%
由于甘精胰岛素前体在胰蛋白酶的酶切过程中，除了生成甘精胰岛素，还会产生其它的副产物，甚至生成的甘精胰岛素还会被进一步酶切成不希望得到的副产物，因此实际得到的甘精胰岛素的量往往小于理论上应得的甘精胰岛素的量。
现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
实施例1 甘精胰岛素前体的酶切转化
室温下，将甘精胰岛素前体（由大肠杆菌通过重组DNA技术制得）1克溶解于100 ml 20 mM 碳酸氢铵缓冲液，pH为8.0中，使前体的蛋白浓度约为10 g/L。控制溶液温度为4℃，接着加入牛胰蛋白酶，使酶：底物=1：1000，开始酶切反应。维持反应温度为4℃不变。
5小时后，加入6 mol/L 盐酸溶液调pH为3.5停止该反应。取酶切液10 μl经HPLC分析检测，根据甘精胰岛素的峰面积按峰面积归一化法计算酶切后实际得到的甘精胰岛素的量M2，因此甘精胰岛素的酶切收率经计算约为86%。
实施例2 甘精胰岛素前体的酶切转化
室温下，将甘精胰岛素前体（由大肠杆菌通过重组DNA技术制得）1克溶解于200 ml 100 mM 碳酸氢铵缓冲液，pH为10中，使前体的蛋白浓度约为5 g/L。控制溶液温度为25℃，接着加入TPCK处理的牛胰蛋白酶，使酶：底物=1：10000，开始酶切反应，维持反应温度为25℃不变。
30小时后，加入6 mol/L 盐酸溶液调pH为3.5停止该反应。取酶切液10μl经HPLC分析检测，根据甘精胰岛素的峰面积计算酶切后实际得到的甘精胰岛素的量M2，因此甘精胰岛素的酶切收率经计算约为83%。
实施例3 甘精胰岛素前体的酶切转化
室温下，将甘精胰岛素前体（由大肠杆菌通过重组DNA技术制得）1克溶解于200 ml 20 mM Tris-CL缓冲液，pH为9.0中，使前体的蛋白浓度约为5 g/L。控制溶液温度为4℃，接着加入猪胰蛋白酶，使酶：底物=1：10000，开始酶切反应，维持反应温度为4℃不变。
30小时后，加入6 mol/L 盐酸溶液调pH为3.5停止该反应。取酶切液10μl经HPLC分析检测，根据甘精胰岛素的峰面积计算酶切后实际得到的甘精胰岛素的量M2，因此甘精胰岛素的酶切收率经计算约为87%。
实施例4 甘精胰岛素前体的酶切转化
室温下，将甘精胰岛素前体（由大肠杆菌通过重组DNA技术制得）1克溶解于100 ml 100 mM Tris-CL缓冲液，pH为11.0中，使前体的蛋白浓度约为10 g/L。控制溶液温度为25℃，接着加入TPCK处理的猪胰蛋白酶，使酶：底物=1：1000，开始酶切反应，维持反应温度为4℃不变。
5小时后，加入6 mol/L 盐酸溶液调pH为3.5停止该反应。取酶切液10μl经HPLC分析检测，根据甘精胰岛素的峰面积计算酶切后实际得到的甘精胰岛素的量M2，因此甘精胰岛素的酶切收率经计算约为84%。
实施例5 甘精胰岛素前体的酶切转化
室温下，将甘精胰岛素前体（由大肠杆菌通过重组DNA技术制得）1克溶解于100 ml 20mM 甘氨酸缓冲液，pH为9.0中，使前体的蛋白浓度约为10 g/L。控制溶液温度为4℃，接着加入牛胰蛋白酶，使酶：底物=1：10000，开始酶切反应，维持反应温度为4℃不变。
30小时后，加入6 mol/L盐酸溶液调pH为3.5停止该反应。取酶切液10μl经HPLC分析检测，根据甘精胰岛素的峰面积计算酶切后实际得到的甘精胰岛素的量M2，因此甘精胰岛素的酶切收率经计算约为88%。
实施例6 甘精胰岛素前体的酶切转化
室温下，将甘精胰岛素前体（由大肠杆菌通过重组DNA技术制得）1克溶解于200 ml 20mM 甘氨酸缓冲液，pH为11.0中，使前体的蛋白浓度约为5 g/L。控制溶液温度为25℃，接着加入TPCK处理的牛胰蛋白酶，使酶：底物=1：1000，开始酶切反应，维持反应温度为25℃不变。
5小时后，加入6 mol/L 盐酸溶液调pH为3.5停止该反应。取酶切液10μl经HPLC分析检测，根据甘精胰岛素的峰面积计算酶切后实际得到的甘精胰岛素的量M2，因此甘精胰岛素的酶切收率经计算约为85%。

Claims (6)

1.一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，包括如下步骤：将甘精胰岛素前体溶解于pH8～11的缓冲液中，控制反应体系的温度为0～37℃，按胰蛋白酶与甘精胰岛素前体的质量比为1：1000～10000加入胰蛋白酶，反应2～40小时；所述缓冲液选自碳酸氢铵、Tris、甘氨酸或磷酸盐的缓冲液。
2.根据权利要求1所述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其特征在于：所述缓冲液为20～100mM 碳酸氢铵，pH8～10；或20～100 mM Tris-CL，pH9～11；或20～100mM 甘氨酸，pH9～11。
3.根据权利要求1所述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其特征在于：将甘精胰岛素前体按5～10 g/L的浓度溶解于所述缓冲液中。
4.根据权利要求1所述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其特征在于：所述胰蛋白酶为未经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理或经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理的来自猪或牛的胰蛋白酶。
5.根据权利要求1所述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其特征在于：用于甘精胰岛素前体酶切转化的反应温度为4～25℃。
6.根据权利要求1所述甘精胰岛素前体的酶切转化方法，其特征在于：用于甘精胰岛素前体酶切转化的反应时间为5～30小时。
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