CN102993284B - 一种集胞藻蛋白在改良水稻性状中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种集胞藻蛋白在改良水稻性状中的新用途。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。本发明还提供了序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。本发明将slr1512基因导入水稻的转基因实验证明，转入slr1512基因的水稻叶绿素含量和抽穗率明显提高，说明slr1512基因及其编码产物对于培育光合作用增强的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农业高产植物品种的培育。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种集胞藻蛋白在改良水稻性状中的新用途。
背景技术
近年来，由于能源短缺，发展以粮食为基础的替代能源加剧了粮食紧缺。2008年末，世界谷物库存已降至4.05亿吨，是近25年来的最低水平。海地、菲律宾和埃及等37个国家曾因粮食价格急剧上涨引发抗议和骚乱。因此，提高作物产量、保障粮食供给与价格稳定，对维护世界的和平与安定，具有十分重要的战略意义。在我国，可耕地面积日益减少，因此提高主要农作物单位面积产量，是解决我国粮食问题最现实、最有效、最根本的途径。由于作物中90％以上的干物质来源于光合作用，因此，作物产量的高低很大程度上取决于其光合效率。
蓝藻是古老的光合生物，具有特有的二氧化碳浓缩机制(CCM)。通过该机制能够提高CO2同化的关键酶Rubisco活性部位周围的CO2浓度，克服自身Rubisco对CO2的低亲和力，有效的同化CO2，从而提高光合作用效率。集胞藻(Synechocystis PCC6803)是蓝藻生物学研究的模式藻种。过去的研究发现，将集胞藻与CCM机制相关基因转入高等植物拟南芥，能够提高其光合效率并且改善水分利用效率。这一作用机制在以水稻为代表的单子叶植物中是否有效仍不清楚。
发明内容
本发明的一个目的是提供序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。
本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
本发明的另一个目的是提供序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。
本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
本发明的又一个目的是提供含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。
本发明提供了含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻；
所述重组表达载体为在pH7WG2D，1载体的att R位点插入了序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比叶绿素含量和/或抽穗率提高。
所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因是通过含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体导入目的植物中的。
所述含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体为在pH7WG2D，1载体的att R位点插入了序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
序列表中序列2所示的蛋白在提高植物光合作用能力中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明从集胞藻(Synechocystis PCC 6803)中克隆了一个与集胞藻碳酸氢钠转运相关的蛋白复合体基因slr1512。将该基因导入水稻的转基因实验证明，转入slr1512基因的水稻叶绿素含量和抽穗率明显提高，说明slr1512基因及其编码产物对于培育光合作用增强的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农业高产植物品种的培育。
附图说明
图1为重组表达载体pH7WG2D，1-slr1512的示意图。
图2为T0代转slr1512基因水稻植株的PCR检测结果。
图3为转基因T1代萌发种子的GFP荧光检测。
图4为转slr1512基因水稻T1代叶绿素含量和抽穗率分析结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、过表达slr1512基因提高转基因水稻的叶绿素含量和抽穗率
一、slr1512过表达水稻植株的获得和鉴定
1、过表达slr1512基因载体的构建
提取对数生长期的集胞藻(Synechocystis PCC 6803)(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Zhang LF et al.Proteomic analysis of plasmamembranes of cyanobacterium Synechocystis sp.Strain PCC 6803 in response to high pHstress.J Proteome Res.2009)细胞的DNA，以其为模板，通过PCR进行扩增基因slr1512，该基因在转基因受体植物水稻中未发现高同源性基因。将PCR扩增产物经电泳分离回收后，连接到基因克隆载体pMD18并转化大肠杆菌，对获得的单克隆菌落的质粒测序分析。
扩增引物：上游引物F：5’-ATGGATTTTTTGTCCAATTTCTTGACG-3’，下游引物R：5’-TTAACCTGCACCAAGGGTCTG-3’。反应体系：DNA(1μg/μL)1.0μL，上游引物F和下游引物R(10μM)各1.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，ddH2O 37.5μL，rTaq0.5μL(Takara公司)，10×PCR buffer(Mg2+Plus)5μL。反应程序：94℃ 4min，(94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min)30cycles，72℃ 10min。PCR产物纯化回收(TIANgen MidiPurification Kit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。
将上述回收产物与克隆载体pMD18(Takara pMD18-T VECTOR试剂盒)连接后转化大肠杆菌进行测序。测序结果表明该PCR产物与NCBI数据库中slr1512基因(GeneID：954687)序列相同。slr1512基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示，该基因的编码区为序列表中序列1自5’末端第1-1125位核苷酸，该序列所编码的Slr1512蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
将回收得到的PCR产物连接到PCR8/GW/TOPO载体(PCR8/GW/TOPO TACLONING KIT购买于Invitrogen公司，目录号：K252002)att L位点上，连接后转化大肠杆菌进行测序，测序结果表明，在PCR8/GW/TOPO载体的att L位点上插入了序列表中序列1所示的核苷酸序列。利用LR ClonaseTMII(购买于Invitrogen公司，目录号：11791-020)，通过位点特异重组将目的基因整合到表达载体pH7WG2D，1(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Zhubo Dai et al，Cloningand characterization of a novel 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genefrom S alvia miltiorrhiza involved in diterpenoid tanshinone accumulation.Journal of PlantPhysiology[J].2011)的att R位点，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌后，挑取单克隆进行PCR检测(上游引物F：CGGAAGATAATCGGGTCAAA，下游引物R：GGCAGATGGGATACCTGCTC)，获得了407bp的扩增产物。同时，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pH7WG2D，1的attR位点插入了序列表中序列1所示的slr1512基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pH7WG2D，1-slr1512(图1，p35S：启动子，T35S：终止子，HygB：潮霉素抗性基因，Sm/SpR：壮观霉素抗性基因，EgfpER：绿色荧光蛋白基因，prolD：来自农杆菌的根表达启动子)。重组载体pH7WG2D，1-slr1512是以组成性表达的35S为启动子，增强型的绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，具有潮霉素和壮观霉素抗性基因，可通过潮霉素和壮观霉素进行筛选。
2、含目的基因的农杆菌的获得
提取验证正确的克隆中的重组质粒pH7WG2D，1-slr1512，通过电击转化法，把重组质粒pH7WG2D，1-slr1512转入农杆菌(A.tumefaciens)菌株EHA105(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Y.-M.Bi et al.Resistance toBotrytis cinerea in scented geranium transformed with a gene encoding the antimicrobialprotein Ace-AMP1.Plant Cell Reports[J].1999)。具体方法如下：
取2mL农杆菌(A.tumefaciens)EHA105菌液转接于100mL LB液体培养基(含50μg/mL链霉素)中，28℃250rpm振荡培养至OD600在0.5到1之间。将农杆菌菌液转入无菌50mL离心管中，4℃、4000rpm离心5min，去上清液。用20mL预冷的HEPES(1mM，pH7.0)重悬，4℃、4000rpm离心5min，去上清液，重复2～3次。用2mL预冷的10％甘油重悬。每管100μL分装于1.5mL无菌Eppendorf管中。加入2μL重组载体pH7WG2D，1-slr1512质粒于上述Eppendorf管中，用枪头轻轻搅拌混匀。取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(-20℃预冷)，在2500V 5ms下电击。取出电击杯，加入500μL预冷的LB培养基，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5mL离心管中，28℃，200rpm培养2h。将菌液涂布于平板上(链霉素50μg/mL，潮霉素50μg/mL、壮观霉素50μg/mL)28℃2天，挑取单克隆进行PCR检测(上游引物F：CGGAAGATAATCGGGTCAAA，下游引物R：GGCAGATGGGATACCTGCTC)。将正确的菌株用于水稻的转化。
3、转基因水稻的获得
水稻(中花11)(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：朱旭东.水稻中花11辐射突变体的分离与鉴定.中国水稻科学[J].2003)种子去壳用30％NaClO浸15min，用1mL枪将残留的溶液吸干净。重复该步骤，无菌水冲洗3-5次。用1mL枪将残留的水吸干净。将灭菌后的种子接种于N6D培养基上，32℃持续光照培养一周左右。去除芽和残留胚乳继代培养的很小的颗粒愈伤(10-20天)用于转化。将转入pH7WG2D，1-slr1512载体的农杆菌EHA105菌株，在YEB+Rif(25-50mg/L)+Kan(50mg/L)培养基上28℃暗培养2～3天。挑单菌落于3～5mL YEB+Kan+Rif培养基中，28℃暗培养约24h。取500μL接于50mL AAM培养基中，过夜培养至OD600约0.1。将上述去除芽和残留胚乳进行继代培养的愈伤组织浸于农杆菌菌液中，立即用镊子取出置于无菌滤纸上吸去多余菌液，吹干。愈伤接于N6D-As培养基(N6D培养基中含有10mg/mL乙酰丁香酮)，培养基上预先垫一层浸有AAM(0.5mL即可)的无菌滤纸。用保鲜膜将培养皿包好置于25℃暗培养3天。共培养后的愈伤先用无菌水冲洗2-3次，再用含500mg/L羧苄的无菌水冲洗2-3次，并用之浸泡30min左右(若浸染愈伤的菌液浓度OD600＞0.1，可将浸泡时间增加到1h左右，30min左右更换一次)。无菌滤纸上吸去水分，并吹干。接种于含50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄的N6D-S培养基(用于选择阳性克隆，N6D培养基中加入50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄)上32℃持续光照培养两周。将生长旺盛的愈伤转移到含50mg/L潮霉素B和250mg/L羧苄的再生培养基上32℃持续光照培养诱导分化。转移分化出的幼苗至含50mg/L潮霉素B和200mg/L羧苄的MS-HF(在MS培养基中加入30g/L蔗糖)培养基上诱导生根，从而得到T0代转基因水稻株系。共侵染270个愈伤组织，得到了50个带有报告基因的愈伤组织。
按照获得转slr1512基因水稻的方法，用空载体pH7WG2D，1转化水稻植株，得到转空载体对照水稻T0代植株。同时，设水稻(中花11)为野生型对照。
提取T0代转基因水稻株系的基因组DNA并通过PCR对外源基因进行分子检测(上游引物F：CGGAAGATAATCGGGTCAAA，下游引物R：GGCAGATGGGATACCTGCTC)，检测结果见图2(图2中泳道M：D2000，泳道CK：转空载体水稻，泳道wt：中花11，泳道1-泳道25：转基因水稻株系)，从图2中可见，与转空载体对照水稻T0代植株和野生型对照水稻相比，T0代转基因水稻植株中均获得了407bp的目的基因片段，说明泳道1-泳道25均为阳性转基因植株，共获得阳性转基因植株25株。
将上述25株T0代转基因水稻进行自交获得其种子(即T1代转基因水稻)。对19个株系T1代幼苗的报告基因GFP进行检测，检测方法如下：将T0代种子(即T1代)置于30℃，黑暗条件下萌发后，用400nm激发波激发并在470nm发射波下，观察是否有绿色荧光。结果如图3所示(图3中，A：转入基因水稻，B：中花11)，在转基因水稻中观察到绿色荧光蛋白所发出的绿色，而野生型对照水稻中花11中未观察到绿色。选取遗传性状分离比为3∶1的株系(表1)，并将该株系中有报告基因GFP表型的T1代转基因水稻苗的成活幼苗移至温室培养。结果共获得了16株T1代转slr1512基因阳性株系。
表1转基因T1代分离比及拷贝数分析
4、检测转slr1512基因水稻与光合作用相关的表型
将上述步骤中获得的转slr1512基因阳性植株中取20株T1代转基因水稻、未转基因的野生型水稻和转空载体对照水稻栽培在温度为30℃，12h光照/12h黑暗，保持水分的条件下，测定抽穗率和叶绿素含量。抽穗率＝抽穗数/分蘖数×100％。叶绿素含量用分光光度计测定，测定结果为叶绿素a和叶绿素b的总量。实验共设三次重复，结果取平均值。结果如图4所示(图4中，CK：转空载体水稻，wt：野生型对照水稻，slr1512：转slr1512基因水稻)，图4中A为转slr1512基因水稻T1代叶绿素含量分析结果，从图中可见，转slr1512基因水稻叶绿素含量为2.1mg/g FW，而未转入外源基因的野生型对照水稻和转空载体对照水稻叶绿素含量分别为1.5mg/g FW和1.6mg/g FW，转slr1512基因水稻比野生型对照水稻和转空载体对照水稻叶绿素含量分别高40％和31.25％。图4中B为转slr1512基因水稻T1代抽穗率分析结果，从图中可见，转slr1512基因水稻的抽穗率为77％，而未转入外源基因的野生型对照水稻和转空载体对照的抽穗率为分别为42％和56％。转slr1512基因水稻抽穗率比未转入外源基因的野生型水稻和转入空载体的水稻高35％和12％。以上结果表明，slr1512基因过量表达植株的叶绿素含量和抽穗率明显高于未转基因的野生型对照水稻和转空载体对照水稻。
Claims (5)
1.序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用；
所述植物为水稻。
2.序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用；所述蛋白的编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子；
所述植物为水稻。
3.含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用；
所述植物为水稻。
4.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比叶绿素含量和/或抽穗率提高；
所述目的植物为水稻。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因是通过含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体导入目的植物中的。
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