CN102949717A - 一种含poly I:C佐剂的新型乙肝疫苗制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含poly I:C佐剂的新型乙肝疫苗制剂。所属技术领域：1.生物技术2.基因工程疫苗。本发明涉及一种乙型肝炎疫苗的新配方，该疫苗的主要成分为基因工程乙型肝炎病毒表面抗原、铝佐剂、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(poly I:C)等。以该配方制备的乙型肝炎疫苗的免疫原性优于目前使用的单纯铝佐剂疫苗，该乙型肝炎疫苗可用于成人、肾移植病人、肾透析病人等的免疫，以预防乙型肝炎病毒的感染，该乙型肝炎疫苗亦可用于慢性乙型肝炎患者的免疫治疗。

Description

一种含poly I:C佐剂的新型乙肝疫苗制剂

技术领域  本发明涉及一种新的乙肝疫苗制剂，为采用Poly I:C和铝佐剂的乙型病毒性肝炎(以下简称乙肝)疫苗，属于生物技术领域。 

背景技术  我国有50-70％的人群感染过乙型肝炎病毒(HBV)，10％的人群(约1.3亿人)为病毒携带者。目前还缺乏根治乙肝的有效方法，接种乙肝疫苗是预防肝炎最为经济有效的措施。随着近年对治疗性疫苗研究的深入，防治结合的乙肝疫苗将具有更为广阔的前景[1-4]。 

乙型肝炎病毒(HBV)是一种具有噬肝性的DNA病毒，只对人和猩猩易感，可引起肝组织损伤，导致乙型病毒性肝炎。HBV病毒结构由外壳和核心组成，外壳所含的乙肝表面抗原(HBsAg)又包含S抗原，前S1和前S2抗原，作为病毒识别和侵入宿主细胞的主要结合蛋白，HBV表面抗原是目前HBV疫苗研发针对的主要靶点。目前临床所使用的基因工程疫苗以及血源性疫苗，都是由乙肝表面抗原主蛋白(S)组成[5，6]。自1985年在我国广泛接种以来，产生了非常良好的疾病防控效果，HBV的感染和发病率得到有效控制[4，7]。然而，庞大的人口基数决定了我国HBV的防控任务依然严峻，特别是HBV的抗病毒治疗成本高昂且疗效有限，易耐药，故而研发具有治疗性效果的HBV疫苗非常必要[8]。 

目前中国大量使用的乙肝疫苗中，主要采用HbsAg作为抗原，0.5-1mg的铝佐剂进行增强，这种配伍诱发的体液免疫水平较低，而且在细胞免疫方面存在缺陷。该类疫苗存在约有10％左右的人群对其无免疫反应或反应低下，且存在部分免疫逃逸的突变株等缺点[9]。 

聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-polycytidylic acid，Poly I:C)是一种人工合成的双链RNA，可被免疫细胞上的Toll样受体-3(Toll-like receptor 3，TLR-3)所识别，从而诱导宿主细胞产生干扰素α和β，具有抗病毒和调节免疫的多重功效[10-12]。目前Poly I:C主要作为免疫刺激剂、肿瘤治疗药物，用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎、带状疱疹、各种疣类和呼吸道感染等。临床成人用量为每次1-2mg肌肉注射，主要副作用为注射后少数病人可发生一过性低热，其作为人用疫苗佐剂的应用存在安全问题的可能性较低[13-14]。 

目前尚无采用乙肝表面抗原加Poly I:C和铝佐剂的双佐剂配伍应用于乙型肝炎疫苗的报道。 

发明内容：

本发明提供一种新的乙型肝炎疫苗制剂，该疫苗的组成除包括HbsAg和铝佐剂外，还包括Poly I:C。 

本发明的乙型肝炎疫苗利用聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-polycytidylic acid，简写为Poly I:C)免疫佐剂的作用，Poly I:C可有效地激活免疫细胞，诱导产生以一型干扰素为主的多种免疫激活因子，在试验动物中能诱生高水平的抗原特异性体液和细胞免疫反应。采用此种特定类型的免疫佐剂可以进行各种类型的HBV感染的免疫治疗及对免疫抑制药物使用者进行有效的免疫，可将目前较难治疗的无症状HBV表面抗原(HBsAg)携带者转阴并出现抗-HBs， 亦有可能使受损的肝脏获得一定程度的再生修复。 

本发明中使用的乙型肝炎表面抗原为基因工程重组抗原或其片段或含pre S1成分的抗原，而不是来源于乙型肝炎病人血浆的乙型肝炎表面抗原。由酵母菌或CHO细胞表达的基因工程表面抗原由226个氨基酸组成。重组酵母菌或CHO细胞表达的HBsAg均可形成22nm的VLP颗粒，应用于人群免疫多年，临床证明具有良好的预防效果和安全性。 

本发明的乙型肝炎疫苗每剂中各主成分的含量范围如下Poly I:C 0.2-1.2mg、HBsAg5-125ug、铝佐剂(按铝离子计算)0.2-1.2mg。 

优选的范围如下： 

Poly I:C 0.5-1.0mg、HBsAg 10-100ug、氢氧化铝佐剂(按Al³⁺计算，1mg/ml)0.5-1.0mg。 

最优选的范围如下： 

Poly I:C 0.5-1.0mg、HBsAg 25-75ug、氢氧化铝佐剂(按Al³⁺计算，1mg/ml)0.5-1.0mg。 

以上说述每剂是指每一疫苗制剂，如每一注射针剂，或每支注射剂，或每次使用量的注射用药剂。 

本发明的疫苗使用方法与现有的乙型肝炎疫苗使用方法相同。 

本发明的乙型肝炎疫苗可以通过以下方法制备： 

组成： 

聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C) 

乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗) 

氢氧化铝佐剂 

制备： 

乙型肝炎病毒表面抗原中加入氢氧化铝佐剂，混匀后，加入Poly I:C溶液，混匀，即得疫苗液，该疫苗液经过分装可制成单位剂量的注射用的疫苗制剂。 

本发明的疫苗制剂中还可含有其它可提高机体免疫的人体或微生物蛋白质、多糖或小分子化合物。 

本发明的疫苗制剂可作为成人、肾透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群的免疫治疗的药物。也可作为慢性乙型肝炎病人的免疫治疗的药物。 

本发明的疫苗还可与其他含铝佐剂的疫苗制剂组成联合疫苗。 

本发明的乙型肝炎疫苗与现有乙型肝炎疫苗的不同之处在于，加入了免疫增强剂PolyI:C，将Poly I:C加入到疫苗中，可有效的刺激机体产生高水平体液免疫及细胞免疫，该疫苗将会给慢性乙型肝炎的治疗带来光明的前景。 

动物实验的结果表明，本发明疫苗明显优于现有的乙型肝炎疫苗。应用于人体后将可大辐度的提高人体抗乙型肝炎病毒的体液免疫和细胞免疫，可用于慢性乙型肝炎病人的治疗。 

动物试验表明该新型乙型肝炎疫苗是安全的，对试验动物无可见的毒性。可有效的刺激动物产生高滴度的特异性抗体。 

本发明的乙型肝炎疫苗采用的配方，可诱导机体产生较强的免疫反应。该疫苗可用于成人、其它类型乙型肝炎疫苗免疫失败者、肾透析病人、器官移植病人的免疫，以及慢性乙型 肝炎病人的免疫治疗。 

附图说明

图1为ELISA检测蛋白抗原免疫后小鼠血清抗S特异性IgG抗体图。利用ELISA检测1.25μg乙型肝炎病毒表面抗原配合佐剂刺激BALB/c小鼠说产生S特异性IgG的结果。F1代表单纯疫苗组，F2代表疫苗加氢氧化铝佐剂组，F3代表疫苗加Poly I:C佐剂组，F4代表疫苗加氢氧化铝加Poly I:C双佐剂，NS代表单纯生理盐水组。在第一次免疫后第2周，采用含Poly I:C佐剂组的小鼠均出现明显抗体阳转，第二次免疫后第2周(6week)检测时佐剂组强于未加佐剂组(p＜0.05)，第二次免疫后第8周(12week)检测氢氧化铝佐剂组滴度为10^3.38±0.31，双佐剂组抗体滴度分别为10^3.78±0.48，均强于其他两组(p＞0.05)。该结果说明双佐剂与单纯氢氧化铝协同蛋白抗原在诱导产生S特异性抗体的作用相当，且都能长时间维持。 

图2为ELISA检测蛋白抗原免疫后小鼠血清抗S特异性IgG抗体图。利用ELISA检测1.25μg乙型肝炎病毒表面抗原配合佐剂刺激BALB/c小鼠说产生S1特异性IgG的结果。F1代表单纯疫苗组，F2代表疫苗加氢氧化铝佐剂组，F3代表疫苗加Poly I:C佐剂组，F4代表疫苗加氢氧化铝加Poly I:C双佐剂，NS代表单纯生理盐水组。在第一次免疫后第2周，各组小鼠均出现抗体阳转，第二次免疫后第2周(6week)检测时各组抗体滴度无明显差异(p＞0.05)，第二次免疫后第8周(12week)检测氢氧化铝佐剂组滴度为10^4.18±0.38，双佐剂组抗体滴度分别为10^4.25±0.75，均强于单纯蛋白组(p＞0.05)。该结果说明双佐剂与单纯氢氧化铝协同蛋白抗原在诱导产生S1特异性抗体的作用相当，且都能长时间维持。 

图3为ELISA检测Adv加强免疫后小鼠血清抗S特异性IgG抗体图。利用ELISA检测表达乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒载体疫苗(rAdv)对经蛋白疫苗配合不同佐剂免疫小鼠的S特异性IgG的增强效果。F1+代表单纯疫苗+rAdv组，F2+代表疫苗加氢氧化铝佐剂组+rAdv组，F3+代表疫苗加Poly I:C佐剂组+rAdv组，F4+代表疫苗加氢氧化铝加Poly I:C双佐剂+rAdv组，rAdv代表单纯生理盐水组+rAdv组。在加强免疫后第2周，采血检测抗S特异性抗体，抗体滴度分别为F1+:10^2.99±0.13，F2+:10^3.42±0.59，F3+:10^3.15±0.46，F4+:10^3.68±0.56F2+组与F4+组明显大于F1+组(p＜0.05)。该结果再次说明采用该免疫方案下，双佐剂与单纯氢氧化铝协同蛋白抗原进行早期免疫，诱导产生S特异性抗体的作用相当。 

图4为ELISA检测Adv加强免疫后小鼠血清抗S特异性IgG抗体图。利用ELISA检测表达乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒载体疫苗(rAdv)对经蛋白疫苗配合不同佐剂免疫小鼠的S1特异性IgG的增强效果。F1+代表单纯疫苗+rAdv组，F2+代表疫苗加氢氧化铝佐剂组+rAdv组，F3+代表疫苗加Poly I:C佐剂组+rAdv组，F4+代表疫苗加氢氧化铝加Poly I:C双佐剂+rAdv组，rAdv代表单纯生理盐水组+rAdv组。在加强免疫后第2周，采血检测抗S1特异性抗体，抗体滴度分别为F1+:10^3.59±0.61，F2+:10^3.89±0.54，F3+:10^3.89±0.26，F4+:10^4.38±0.66仅F4+组明显强于F1+组(p＜0.05)。该结果说明采用该免疫方案下，双佐剂协同蛋白抗原进行早期免疫经腺病毒载体 疫苗增强后，在诱导产生S 1特异性抗体方面具有一定优势。 

图5为ELISPOT检测Adv加强免疫后小鼠S特异性T细胞免疫反应。利用ELISPOT检测表达乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒载体疫苗(rAdv)对经蛋白疫苗配合不同佐剂免疫小鼠的S特异性T细胞免疫的增强效果。F1+代表单纯疫苗+rAdv组，F2+代表疫苗加氢氧化铝佐剂组+rAdv组，F3+代表疫苗加Poly I:C佐剂组+rAdv组，F4+代表疫苗加氢氧化铝加Poly I:C双佐剂+rAdv组，rAdv代表单纯生理盐水组+rAdv组。在加强免疫后第2周，无菌取脾进行S特异性ELIPOT检测，结果显示双佐剂组别所诱导产生的点数明显多于其他各组(p＜0.05)。该结果说明采用双佐剂协同蛋白抗原进行早期免疫经腺病毒载体疫苗增强后，能诱导产生较其余参照佐剂组更强的S特异性细胞免疫应答，为疫苗的治疗性应用奠定基础。 

图6为ELISPOT检测Adv加强免疫后小鼠S1特异性T细胞免疫反应。利用ELISPOT检测表达乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒载体疫苗(rAdv)对经蛋白疫苗配合不同佐剂免疫小鼠的S1特异性T细胞免疫的增强效果。F1+代表单纯疫苗+rAdv组，F2+代表疫苗加氢氧化铝佐剂组+rAdv组，F3+代表疫苗加Poly I:C佐剂组+rAdv组，F4+代表疫苗加氢氧化铝加Poly I:C双佐剂+rAdv组，rAdv代表单纯生理盐水组+rAdv组。在加强免疫后第2周，无菌取脾进行S1特异性ELIPOT检测，结果显示双佐剂组别所诱导产生的点数明显多于其他各组(p＜0.05)。该结果说明采用双佐剂协同蛋白抗原进行早期免疫经腺病毒载体疫苗增强后，能诱导产生较其余参照佐剂组更强的S1特异性细胞免疫应答，为疫苗的治疗性应用奠定基础。 

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。 

实施例1 

乙型肝炎疫苗注射剂的制备方法 

原料及来源： 

CHO细胞表达乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗干粉)：为华北制药股份有限公司产品，用注射用生理盐水配制成200μg/ml，。 

氢氧化铝佐剂：1.0mg/ml(按Al³⁺计算，1mg/ml)。 

聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C)：购自美国SIGMA公司。用注射用生理盐水配制成2mg/ml，以0.22μm的除菌滤膜过滤除菌，冻存于-20℃。 

疫苗的制备方法：取CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原5.0ml于无菌玻璃瓶内，加入氢氧化铝佐剂10ml充分混匀后，加入Poly I:C溶液5.0ml，混匀后即为20ml疫苗溶液。所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50ug、铝佐剂0.5mg(按Al³⁺计算，1mg/ml)、Poly I:C 0.5mg，该溶液分装后，制成20瓶每瓶1ml的疫苗注射剂。 

实施例2 

比较研究本发明的疫苗制剂和常用的氢氧化铝佐剂配伍制剂在两针单纯蛋白免疫中的作用， 

实验如下： 

制备疫苗的原料及来源如下： 

CHO细胞表达乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)：为华北制药股份有限公司产品，用注射用生理盐水配制成200μg/ml，。 

氢氧化铝佐剂：1.0mg/ml(按Al³⁺计算，1mg/ml)。 

聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C)：购自美国SIGMA公司。用注射用生理盐水配制成2mg/ml，以0.22μm的除菌滤膜过滤除菌，冻存于-20℃。 

疫苗的制备方法：取CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原5.0ml于无菌玻璃瓶内，加入氢氧化铝佐剂10ml充分混匀后，加入Poly I:C溶液5.0ml，混匀后即为20ml疫苗溶液。所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50ug、铝佐剂0.5mg(按Al³⁺计算，1mg/ml)、Poly I:C0.5mg。 

其他各对照组疫苗的配方如下(表1)，制备方法同上。 

表1、动物实验用乙型肝炎疫苗的配制 

对比实验的方法： 

动物免疫：雌性SPF级BALB/c小鼠，体重16-18克，每组12只。于第0、28天肌肉注射，免疫剂量0.1ml。 

每次免疫后两周以及第二针免疫后第8周取血，每次经眼眶取血0.1ml，分离血清，测定前冻存于-20℃。 

免疫保护效果检测： 

1.小鼠血清中S特异性IgG的ELISA测定：乙型肝炎病毒表面抗体(抗S)诊断试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。为双抗原夹心法测定抗-HBS滴度的试剂盒。以1∶25倍稀释的铝佐剂组鼠血清A450/650值的平均值的2.1倍作为(Cut off)界值，同时以中国药品生物制品检定所提供的抗-HBs定量测定标准品制作标准曲线，待检血清A450/650值高于界值的计算血清抗-S抗体含量。各组实验动物血清抗-S的几何平均滴度比较见图1。 

2.小鼠血清中S1特异性IgG的ELISA测定：乙型肝炎病毒前S1抗体(抗S1)诊断试剂盒购自上海阿尔法生物技术有限公司。为双抗原夹心法测定抗-HBS滴度的试剂盒。以1∶25倍稀释的铝佐剂组鼠血清A450/650值的平均值的2.1倍作为(Cut off)界值，同时以中国药品生物制品检定所提供的抗-HBs定量测定标准品制作标准曲线，待检血清A450/650值高于界值的计算血清抗-S抗体含量。各组实验动物血清抗-S 1的几何平均滴度比较见图2。 

实施例3 

比较研究本发明的疫苗制剂和常用的氢氧化铝佐剂配伍制剂在蛋白初免腺病毒加强免疫中的作用，实验如下： 

第一二针免疫用疫苗的原料及来源如下： 

CHO细胞表达乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)：为华北制药股份有限公司产品，用注射用生理盐水配制成200μg/ml，。 

氢氧化铝佐剂：1.0mg/ml(按Al³⁺计算，1mg/ml)。 

聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C)：购自美国SIGMA公司。用注射用生理盐水配制成2mg/ml，以0.22μm的除菌滤膜过滤除菌，冻存于-20℃。 

疫苗的制备方法：取CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原5.0ml于无菌玻璃瓶内，加入氢氧化铝佐剂10ml充分混匀后，加入Poly I:C溶液5.0ml，混匀后即为20ml疫苗溶液。所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50ug、铝佐剂0.5mg(按Al³⁺计算，1mg/ml)、Poly I:C0.5mg。 

其他各对照组疫苗的配方如下(表1)，制备方法同上。 

表1、动物实验用乙型肝炎疫苗的配制 

第三针免疫用疫苗的原料与来源： 

腺病毒载体疫苗rAdv：由本单位自制，包含HBV包膜蛋白S及S1基因，可有效表达S及S1。注射用生理盐水配置成1x10⁹vp/ml 

对比实验的方法： 

动物免疫：雌性SPF级BALB/c小鼠，体重16-18克，每组12只。于第0、28天肌肉注射蛋白疫苗，免疫剂量0.1ml。第98天时采用Ad-SS1免疫，免疫剂量0.1ml，肌肉注射。 

末次免疫后两周取血摘眼球取血，分离血清，测定前冻存于-20℃。将小鼠脱颈处死后无菌取脾，研磨分离获得脾细胞悬液，计数调整细胞浓度后立即用于ELISPOT检测。 

免疫保护效果检测： 

1.小鼠血清中S特异性IgG的ELISA测定：乙型肝炎病毒表面抗体(抗S)诊断试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。为双抗原夹心法测定抗-HBS滴度的试剂盒。以1∶25倍稀释的铝佐剂组鼠血清A450/650值的平均值的2.1倍作为(Cut off)界值，同时以中国药品生物制品检定所提供的抗-HBs定量测定标准品制作标准曲线，待检血清A450/650值高于界值的计算血清抗-HBs含量。各组实验动物血清抗-S的几何平均滴度见图3。 

2.小鼠血清中S1特异性IgG的ELISA测定：乙型肝炎病毒前S1抗体(抗S1)诊断试剂盒购 自上海阿尔法生物技术有限公司。为双抗原夹心法测定抗-HBS滴度的试剂盒。以1∶25倍稀释的铝佐剂组鼠血清A450/650值的平均值的2.1倍作为(Cut off)界值，同时以中国药品生物制品检定所提供的抗-HBs定量测定标准品制作标准曲线，待检血清A450/650值高于界值的计算血清抗-HBs含量。各组实验动物血清抗-S1的几何平均滴度见图4。 

3.S特异性细胞免疫测定：小鼠γ-IFN细胞因子ELISPOT试剂购自BD公司。按说明书操作，在包被抗用抗γ-IFN抗体后，每孔加入100ul含S抗原多肽的脾细胞培养悬液，每孔脾细胞数为5X105个，37℃5％CO2静置培养24h；弃去培养液后，分步加入检测抗体和显色液显色，Bioreader4000斑点分析仪计数斑点形成数(SFC)。根据斑点数的多少判断特异性杀伤T细胞的数量，该数量的多少与细胞免疫强度呈正相关。结果见图5。 

4.S1特异性细胞免疫测定：小鼠γ-IFN细胞因子ELISPOT试剂购自BD公司。按说明书操作，在包被抗用抗γ-IFN抗体后，每孔加入100ul含S1抗原多肽的脾细胞培养悬液，每孔脾细胞数为5X105个，37℃5％CO2静置培养24h；弃去培养液后，分步加入检测抗体和显色液显色，Bioreader4000斑点分析仪计数斑点形成数(SFC)。根据斑点数的多少判断特异性杀伤T细胞的数量，该数量的多少与细胞免疫强度呈正相关。结果见图6。 

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Claims (6)

1.一种乙型肝炎疫苗制剂，其特征在于，该制剂中含有乙肝表面抗原，氢氧化铝佐剂，以及聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸(polyinosine-polycytidylic acid，poly I:C)。

2.权利要求1的疫苗制剂，其特征在于，其中乙型肝炎表面抗原为重组CHO细胞制造的乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或含preS1的抗原。

3.权利要求1的疫苗制剂，其特征在于，每剂疫苗中PolyI:C的含量为0.2-1.2mg，乙肝表面抗原的含量为5-125ug，氢氧化铝佐剂(以铝离子的量计算)0.2-1.2mg。

4.权利要求1的疫苗制剂，还可含有其它已知的可提高机体免疫的人体或微生物蛋白质及多糖或小分子化合物。

5.权利要求1的疫苗制剂在制备用于成人、肾透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群免疫的药物以及制备慢性乙型肝炎病人的免疫治疗药物中的应用。

6.权利要求1的疫苗制剂和其他的慢性乙型肝炎病人治疗用的化学合成药物联合应用。

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